Summary
我们提出了一个详细的协议,以生成静脉畸形的杂音异种模型。该模型基于患者衍生的内皮细胞的皮下注射,这些内皮细胞含有超激活的 TIE2 和/或 PIK3CA 基因突变。异种移植病变密切回顾VM患者组织组织组织病理学特征。
Abstract
静脉畸形 (VM) 是一种血管异常,由静脉网络发育受损而引起,导致静脉扩张且经常功能失调。本文的目的是仔细描述一个模拟人类VM并且能够反映患者异质性的Murine异种移植模型的建立。在内皮细胞(EC)中超活化非遗传(体细胞 )TEK(TIE2) 和 PIK3CA 突变被确定为VM中病理血管增大的主要驱动因素。以下协议描述了患者衍生的EC表达突变 TIE2 和/或 PIK3CA 的隔离、纯化和扩展。这些EC被注射到免疫缺陷的脑膜小鼠的背部,以产生分血管通道。TIE2 或 PIK3CA 突变 EC 产生的病变在注射后 7~u20129 天内明显血管化,并重述 VM 患者组织组织组织组织病理学特征。此 VM 异种移植模型为研究驱动 VM 形成和扩展的细胞和分子机制提供了一个可靠的平台。此外,该模型将有助于转化研究,测试新药候选药物在防止人类VM中异常血管增大的疗效。
Introduction
血管发育中的缺陷是许多疾病的根本原因,包括静脉畸形(VM)。VM是一种先天性疾病,其特征是血管异常形态和扩张。关于VM组织和内皮细胞(EC)的重要研究已经确定了两个基因的功能增益突变:TEK,编码酪氨酸激酶受体TYE2,和PIK3CA,编码PI3-激酶(PI3K)的p110+(催化亚基)等构形式2,32,3,4,5。,4,5这些体细胞突变导致关键血管生成/生长信号通路(包括PI3K/AKT)的配体独立超活化,从而导致扩张的肠黄静脉3。尽管这些重要的基因发现,随后的细胞和分子机制触发异常血管生成和扩大血管通道的形成仍然没有完全了解。
在正常和病理血管生成期间,新血管从预先存在的血管网络发芽,EC经历一系列重要的细胞过程,包括增殖、迁移、细胞外基质(ECM)重塑和流明形成6。EC 的二维和三维 (2D/3D) 体外培养物是单独研究每个细胞特性的重要工具。然而,显然需要用鼠标模型在宿主微环境内重述病理血管的扩大,同时为转化研究的目标药物提供有效的临床前评估平台。
到目前为止,尚未报告与 TIE2 功能增益突变相关的 VM 转基因喃生基因模型。目前的转基因VM小鼠模型依赖于激活突变PIK3CA p.H1047R3,5的无所不在或组织受限的表达。这些转基因动物提供了对这个热点PIK3CA突变的全身或组织特异性效应的显著洞察。这些模型的局限性是形成高度病理的血管网络,导致早期杀伤力。因此,这些小鼠模型不能充分反映突变事件的零星发生和VM病理学的局部性质。
相反,患者衍生的异种移植模型是基于移植或注射病理组织或细胞从患者衍生到免疫缺陷小鼠7。Xenograft模型是一个强大的工具,以扩大有关疾病开发和发现新的治疗剂8的知识。此外,使用患者衍生细胞允许科学家重新综述突变异质性,以研究患者表型的光谱。
在这里,我们描述了一个协议,其中患者衍生的VM EC,表示一个突变的组成活性形式的 TIE2 和/或PIK3CA被注射皮下在脂肪裸鼠的背部。注射的血管细胞悬浮在ECM框架中,以促进血管生成,如以前的血管异种移植模型9,10,1110,所述。9这些VM EC经历显著形态生成,在没有支撑细胞的情况下产生扩大的、充满的病理血管。VM 的异种移植模型为靶向药物的临床前评估提供了一个有效的平台,用于抑制不受控制的流明扩张的能力。
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Protocol
患者组织样本是在辛辛那提儿童医院医疗中心(CCHMC)、癌症和血液疾病研究所根据机构政策经批准的机构审查委员会(IRB)获得组织样本和肿瘤和血管异常患者组织样本和数据收集和储存的知情同意后,经临床调查委员会批准的。以下所述的所有动物程序都经过 CCHMC 机构动物护理和使用委员会的审查和批准。
1. 材料和库存解决方案的准备
- 完整内皮细胞生长介质的准备(EGM)
- 补充内皮基底介质 (EBM) 与以下生长因子存在于套件中 (见材料 表): 人类纤维细胞生长因子 - beta (hFGF-α), 血管内皮生长因子 (VEGF), 长 Arg3 胰岛素样生长因子 - I (R3-IGF-I), 抗坏血酸, 表皮生长因子 (EGF), 硫酸绅士霉素和安培霉素 - B, 和肝素.加入1%青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺(PSG)溶液和20%胎儿牛血清(FBS)。
注:我们不建议添加氢皮质松。 - 无菌过滤下层流罩下溶液,通过0.2 μm瓶顶过滤器进入自 <3>化玻璃瓶和等分培养基到50 mL锥形管中,在4°C至一周或-20°C下储存长达一年。
- 补充内皮基底介质 (EBM) 与以下生长因子存在于套件中 (见材料 表): 人类纤维细胞生长因子 - beta (hFGF-α), 血管内皮生长因子 (VEGF), 长 Arg3 胰岛素样生长因子 - I (R3-IGF-I), 抗坏血酸, 表皮生长因子 (EGF), 硫酸绅士霉素和安培霉素 - B, 和肝素.加入1%青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺(PSG)溶液和20%胎儿牛血清(FBS)。
- 准备胶原酶 A 库存溶液
- 在 1x 磷酸盐缓冲盐 (PBS) 中准备 50 mg/mL 胶原酶 A 库存溶液。
- 无菌过滤溶液下层流罩与0.2 μm过滤器和注射器,并储存100μL等分在-20°C。
- 准备组织收集介质(缓冲器 A)
- 加入0.927g氯化钙二水合物 (CaCl2 .2H 2O) 和21 g 硫酸镁六水合物 (MgSO4 .7H2 O) 至 500 mL 蒸馏水,准备 Ca 2° /Mg2°库存溶液。无菌通过 0.2 μm 瓶顶过滤器将溶液过滤到自 <3>起玻璃瓶中,并在室温 (RT) 下储存。
- 补充杜尔贝科的修改鹰介质 (DMEM) 与 10% Ca2+/Mg2+ 溶液和 2% FBS.
- 无菌过滤溶液下层流罩下 0.2 μm 过滤器和注射器,并在 -20 °C 下储存 5 mL 的等同。
- 组织培养板的纤维素涂层
- 通过溶解500 mL脱离子水中5.3克碳酸钠(Na2CO3; 0.1 M)来准备涂层缓冲液(缓冲液B)。使用 1 M 盐酸 (HCl) 将缓冲液的 pH 调整为 9.4。在层流罩下通过 0.2 μm 瓶顶过滤器过滤到自 <3>起玻璃瓶中,并存放在 RT。
- 对于涂层,移液器 2 mL/5 mL/10 mL 的缓冲B每 60 mm/100 mm/145 mm 组织培养板,分别。加入1μg/cm2 人体血浆纤维素纯化蛋白溶液,轻轻将液体分配到板上。
- 孵育板在37°C,5%CO22220分钟。2
- 吸气缓冲液B,在培养细胞之前用PBS清洗板。
2. 从VM患者组织分离内皮细胞
- 将EC与固体VM组织隔离
注:VM组织通过除雾手术12,13,13根据 IRB 批准的协议被修复。- 在 PBS 中,洗涤 VM 组织(组织样本重量通常介于 0.5 g 和 1.5 g 之间)的 5% PSG 中。
- 将组织转移到100毫米细胞培养皿中,使用无菌手术解剖工具将肉末组织样品转移到小块,并转移到50 mL锥形管中。
- 将100μL的胶原酶 A 库存溶液加入 5 mL 的缓冲液 A 中,最终浓度为 1 mg/mL,然后将其添加到组织中,并在 37°C 下消化切碎的组织 30 分钟,同时每 5 分钟摇动一次内容。
- 在RT下小心地研磨在RT的消化组织,在50 mL锥形管内使用6毫米光滑表面的软孔研磨机。
- 继续仔细研磨消化的组织使用害虫,同时添加5 mL的冷PBS补充0.5%牛血清白蛋白(BSA)和2%PSG。重复此步骤四次。
- 通过 100 μm 细胞过滤器将溶液过滤到 50 mL 锥形管中,以去除组织碎片。
- 在RT下,在400 x g下将离 心电池悬浮 5分钟,继续执行步骤2.3。
- 从患者治疗获得的病变血液中分离VM EC
- 根据 IRB 批准的方案,从治疗性肺病获得人类病变 Vm 血。
- PBS 中稀释病变血(样本体积通常介于 0.5 mL 和 5 mL 之间),最终体积为 40 mL。
- 在RT的200 x g下,离心电池悬 架 5分钟。
- 初始细胞电镀
- 丢弃上一液,在1mL的EGM中重新暂停单细胞颗粒。
- 将 9 mL 的完整 EGM 添加到纤维素涂层 (1 μg/cm2) 100 mm 板和种子 1 mL 的细胞悬浮液上。
- 在37°C的加湿5%CO2大气中孵育 细胞。
- 每隔一天去除2 mL的介质,并添加2 mL的无菌过滤FBS。
- 一旦细胞培养达到 40\u201250% 的汇合,介质将更改以完成 EGM。细胞通常需要 2\u20123 周才能达到这种汇合。
- 每天观察EC殖民地的外观。它们可以被典型的"鹅卵石样"形态所识别(图1A)。在每个样本中出现 3\u20125 EC-菌落。
- 每隔一天更换一次介质 5\u20127 天,直到各个 EC 殖民地开始互相接触。
- 手动隔离单个EC菌落
- 要收获EC菌落,用5 mL的PBS清洗板,用血清移液器手动吸气。
- 将板放在显微镜前,使用盖子和底部的标记笔圈出多个 EC 菌落的位置,然后再将板返回到层流罩。
- 通过移液 50 μL 的 0.05% trypsin-EDTA 溶液在标记区域分离 EC 菌落。
- 使用小细胞刮刀或移液器尖端,轻轻地刮取板中的细胞。
- 将板倾斜到最近的边缘,每个标记区域用 1 mL 的 EGM 冲洗并收集细胞。
- 使用血细胞计或自动细胞计数器计算细胞数。
- 将收集的EC菌落以1 x 104细胞 /cm2 的密度镀到含有新鲜EGM的纤维素涂层(1 μg/cm2)细胞培养皿上。第二天,更改介质以完成 EGM。
- 每隔一天更换一次的EGM,为期2\u20123周,直到细胞达到80%的汇合。
- 在37°C下,每100毫米菜用2 mL预加热0.05%的尝试EC,2分钟,通过加入4 mL的EGM来中和尝试。
- 将电池悬浮液收集到一个 15 mL 锥形管中,在 RT 时以 400 x g 的离心机进行 5 分钟。在EGM的2mL中吸升和再增的细胞。
- 使用血细胞计或自动细胞计数器计算细胞数。获得的典型细胞数是每60毫米细胞培养板1 x 106 细胞或每100毫米组织培养板2x 10 6 细胞。
- 在RT下以400xg离心,将细胞g吸进5分钟,吸进上经。继续执行步骤 3.2.1。
3. 内皮细胞选择和扩展
- 制备防CD31结合磁珠
- 30 s 含有抗CD31结合磁珠的小瓶漩涡。所需的珠数为 8 x 106 珠/2 x 106 个细胞。
- 在 1.5 mL 微离心管中用含有 PBS 中 0.1% BSA 的 1 mL 洗涤溶液,清洗所需数量的防 CD31 结合磁珠。
- 将微离心管放在细胞隔离磁铁中 1 分钟。
- 吸上一道,重复洗涤步骤。
- 内皮细胞纯化和电镀
- 在 500 μL 洗涤溶液中获得的 2.4.12 中重新暂停细胞颗粒,其中含有 PBS 中的 0.1% BSA。
- 将细胞溶液加入含有磁珠的微离心管,并彻底重新悬浮。
- 在4°C下孵育20分钟,轻轻倾斜。
- 在 PBS 中加入 500 μL 0.1% BSA,混合均好。
- 将管子放在细胞隔离磁铁上 1 分钟。
- 轻轻吸气所有液体,其中含有CD31阴性细胞的分数,而不接触珠子。
- 在PBS中用1mL0.1%BSA清洗含有CD31阳性细胞分数的珠子颗粒,并重复磁分离。
- 重复洗涤和磁分离步骤至少3次,以纯化CD31阳性细胞分数。
- 将纯化内皮细胞重新放入 15 mL 锥形管中,在 RT 的 400 x g 下 旋转 5 分钟。
- 在 1 mL 的 EGM 中去除上心和重新暂停的细胞颗粒。
- 将 9 mL 的完整 EGM 添加到纤维素涂层 (1 μg/cm2) 100 mm 板和种子 1 mL 的细胞悬浮液上。请注意,在此初始播种步骤中,一些磁珠仍附着在细胞上。大多数珠子在细胞膨胀过程中会洗掉,但少量的珠子可能在早期通道中持续存在。
- 在37°C的加湿5%CO2大气中孵育 细胞。
- 每隔一天改变一次介质,直到细胞达到80%的汇合(图1B)。
- 内皮细胞膨胀
- 一旦细胞达到80%的汇合,在37°C下每100毫米培养皿中分离2mL的0.05%的尝试素-EDTA,2分钟。
- 通过加入4 mL的EGM和收集细胞到一个15mL锥形管中和中和尝试素。
- 在RT下以400 x g 离心5分钟。
- 在 2 mL 的 EGM 中吸升清液、再增殖细胞,并计算带血细胞计的细胞数量或通过自动细胞计数。
- 种子细胞密度为1 x 104 细胞/cm2到145毫米纤维素涂层(1μg/cm2)组织培养板。
- 继续通过单元格,直到达到所需的细胞号。考虑汇合 145 mm 组织培养板包含约 8\u20129 x 106 细胞,需要的细胞数量是 2.5 x 106 细胞每注射。只有通道3和8之间的细胞应考虑为异种移植。
4. VM 患者衍生异种移植协议
注意:在该协议中,我们使用5\u20126周大,男性免疫缺陷,无名小食裸体Foxn1nu 小鼠。
所有动物程序必须经过机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。
- 注射前一天的材料准备
- 在 -20°C 冷冻室中隔夜预冷注射器、针头和移液技巧。
- 在4°C的冰桶上缓慢解冻地下室膜外细胞基质(BMEM),以避免凝胶粘度增加。
- 为注射准备细胞悬浮液
- 在 37 °C 下,每 145 mm 盘以 5 mL 预热 0.05% trypsin-EDTA 的 EC 试穿 EC,使用 2 分钟。
- 通过加入5 mL的EGM和收集细胞到一个15mL锥形管中和中和。
- 在RT下以400 x g 离心5分钟。
- 在 EGM 的 3 mL 中吸升清液、再增的细胞,并使用血细胞计或自动细胞计数器计算细胞数。
- 确定所有计划注射所需的细胞总数。
注:建议每注射细胞数为2.5 x 106 个细胞。对于技术重复项,通常在每个鼠标中总共执行 2 次注射。有必要计算10%的细胞数过剩,以说明在转移到注射器期间的损失。 - 在RT下以400 x g 离心,将含有计算细胞数的体积转移到新的50 mL锥形管和颗粒细胞中,使用5分钟。
- 吸升液,留下小体积(约50μu201270μL)来松开颗粒。
- 注射器制备
- 计算 20 μL/注射的过量体积,以考虑在转移到注射器期间的损失。在冰上注射220μL的BMEM,重新注入细胞颗粒。每个病变的细胞悬浮液的注射量将为200μL。
- 将细胞悬浮液彻底混合在冰上,获得同质细胞悬浮液,避免产生气泡。
- 使用 1 mL 移液器和 1 mL 注射器,同时通过吸力将 BMEM 细胞混合物通过吸力进入注射器开口,同时拉动注射器柱塞。
- Luer 将 26G x 5/8 英寸无菌针头锁定在注射器上,并在注射前将准备好的注射器平放在冰上。
- 皮下注射到小鼠
- 使用异氟兰蒸发器以 1 L/min 的流速对小鼠进行麻醉。用 5% 异氟兰/氧混合物进行麻醉。确保动物适当给静静的静种(例如,对手趾捏无反应)。通过连续给制1.5%的异氟兰/氧气通过鼻锥输送来保持麻醉。
- 将小鼠放在胃部,露出进行移植的后部区域,用70%乙醇对注射区域进行消毒。
- 轻轻滚动准备好的注射器,以重新注入任何已结算的细胞。将气泡轻拂到注射器的针端,并排出一小卷细胞悬浮液,以确保清除所有气泡。
注:每只鼠标可以进行两次注射 – 鼠标背面的左侧和右侧。 - 用拇指和食指捏合并创建"帐篷状"结构,并将针头皮下插入皮肤下。通过释放捏捏的皮肤,确保针头只有皮肤深,以防止注射到肌肉组织。
- 以 45° 角度保持针头小心地注入 200 μL 的细胞悬架,以形成小球形质量(图 1C)。
- 用刻度记录鼠标重量,用耳朵标记鼠标,然后返回到笼子。
- 监测反应后小鼠,以确保它们恢复正常活动。
- 病变生长监测
- 使用卡钳测量每个插头的长度和宽度(图1D)。
- 每隔一天记录测量,直到病变收集。
5. 组织收集和加工
- 在CO2室植入9天后对小鼠实施安乐死, 并检查生命体征以确认死亡。对小鼠进行宫颈脱位,作为对小鼠实施安乐死的辅助方法。
- 使用手术钳和剪刀从小鼠侧翼采集异种移植病变/塞。
注:为了防止塞内充满血液的血管破裂,避免使用解剖工具接触病变塞,并留下过多的周围组织,如贴在塞上的皮肤。 - 将被切除的病变浸入PBS中进行清洗。
- 使用相机设置摄像机舞台。用尺子将插头对齐到切割板上。以所有插头的图像记录病变的血管性(图1E)。
- 在 RT 过夜时将 10% 的正式设备淹没,修复插头。
- 第二天在PBS中清洗插头,将其移入70%乙醇中。
- 石蜡嵌入的工艺病变塞(病理核心)。
6. 病变剖切
- 使用微切切切从收集的穆林病变的5μm部分到带正充电的幻灯片上。
注:对于后续分析,插头中央的部分(约50μu201270μm进入组织)非常重要。 - 在染色前,在60°C下融化石蜡1小时。
- 在化学烟流罩下按顺序去除石蜡和再水合组织。因此,在二甲苯中孵育滑动 10 分钟,100% 乙醇 (EtOH) 5 分钟,90% EtOH 3 分钟,80% EtOH 3 分钟。
- 在去水中冲洗幻灯片 5 分钟。
7. 血氧林和青霉素(H&E)
- 在血氧林中孵育部分2分钟。
- 将幻灯片放在染色罐中,然后用源源不断的自来水冲洗水槽,直到水清澈。
- 通过按顺序在 70% EtOH 中孵育组织 1 分钟、80% EtOH 为 1 分钟、90% EtOH 为 1 分钟、100% EtOH 为 1 分钟、新鲜 100% EtOH 为 1 分钟而将脱水合物滑动,在 1 分钟内在 100% EtOH 中孵育。
- Eosin Y 中的污渍部分为 30 s。
- 在新鲜 100% EtOH 中冲洗,直到溶液清澈。
- 在 Xylenes 中孵育幻灯片 2 分钟。让幻灯片在烟罩下干燥 5\u201210 分钟。
- 将一滴永久的非水性安装介质在异种移植部分上,并在顶部放置盖玻片。
- 在成像前,让幻灯片在一夜之间干燥。
8. 免疫化学
- 通过称重 0.6 g Tris 基和 1 mL 的 0.5 M EDTA 到 500 mL 的去观水来准备抗原检索缓冲液 (Tris-EDTA)。使用 1 M HCl 将 pH 调整为 9.0,加入 250 μL 的 Tween-20。
- 在带抗原检索缓冲液的烧杯中孵育去石蜡化组织幻灯片(见步骤6.2\u20126.3),在加热块上搅拌,在95°C下搅拌20分钟。
- 从加热块中拆下烧杯,让溶液冷却至 35°C,然后在 PBS 中清洗 3 分钟。
- 在RT中,在PBS中阻断5%正常马血清中的组织部分30分钟。
- 在PBS中5%的正常马血清中稀释20μg/mL的生物素化UEA-I,制备生物素化的 Ulex europaeus 凝糖素-I (UEA-I) 工作溶液。
- 管道 50°u2012100 μL 的 UEA-I 工作溶液每节,并在加湿室的 RT 中孵育 1 小时。
- 在 PBS 中清洗幻灯片两次 3 分钟。
- 在RT下用3%过氧化氢淬火滑动部分5分钟。
- 在 PBS 中清洗幻灯片两次 3 分钟。
- 在PBS中5%的正常马血清中制备5μg/mL的Streptavidin马萝卜过氧化物酶结合。
- 每个组织滑动的管道 50°u2012100 μL,并在加湿室的RT中孵育1小时。
- 在 PBS 中清洗幻灯片两次 3 分钟。
- 根据制造商的说明准备 3,3'Diaminobenzidine (DAB) 解决方案,每节添加 50μ u2012100 μL。
- 孵育部分为10\u201215分钟,检查和监测每2\u20125分钟染色的发展。
- 在 PBS 中清洗幻灯片三次 3 分钟。
- 加入一滴血氧林,孵育3分钟。
- 将幻灯片放在染色罐中,然后用源源不断的自来水冲洗水槽,直到水清澈。
- 连续孵育幻灯片在 80% Etoh 1 分钟, 90% Etoh 为 1 分钟, 100% Etoh 为 1 分钟, 二甲苯为 2 分钟。
- 让幻灯片在烟罩下干燥 5\u201210 分钟。
- 将一滴永久的非水性安装介质在异种移植部分上,并在顶部放置盖玻片。
- 在成像前,让幻灯片在一夜之间干燥。
9. 人源血管分析
注:通过测量血管面积和血管密度来量化VM病变的血管性。只有 UEA-I 阳性、人源血管通道才考虑进行定量。
- 以 20 倍的放大倍率(高功率场 [HPF])的明亮场显微镜拍摄每个病变部分 4 到 5 张图像。在病变部分内以 x 平面图案拍摄 HPF 图像,以避免重叠(图 1F-H)。在拍摄的图像上包含比例条。
- 打开图像 J 中的 HPF 图像(文件>打开)。校准比例栏的像素,如下所示。使用直线工具并遍及比例图条。要将测量的像素转换为毫米,请单击"分析>设置比例"。
- 单击" 分析 > 设置测量值", 然后 选择"区域 " 和"添加到叠加"。
- 使用分析 > 测量测量 HPF 中 的总字段 区域。在步骤 9.8 中保存此测量值以进行量化。
- 使用徒手选择工具,手动勾勒出 UEA-I+ 血管通道。
注:血管通道被定义为任何与 UEA-I+ - EC 衬砌的可能含有血细胞的区域。 - 单击" 分析 > 测量 "以量化勾勒出的 UEA-I+ 血管面积(mm2/HPF)。
- 对一个插头中的所有五个 HPF 重复此测量。
- 平均所有五个 HPF 的总血管面积。获得的每个 HPF 血管面积随后除以 HPF 场面积(以 mm2为单位,步骤 9.5),以百分比 (%)表示。
- 要量化血管密度,请计算每个 HPF 的 UEA-I+ 血管通道数。血管密度是每个 HPF 区域计数的 UEA-I+ 血管通道的平均数量(血管/mm2)。
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Representative Results
该协议描述了基于皮肤注射患者衍生的EC到免疫缺陷裸鼠背部的VM的murine异种移植模型的过程。内皮细胞菌落可以在从VM组织或病变血中分离后4周内收获(图1A,B)。注射后的第二天,异种移植病变塞覆盖面积约80\u2012100 mm2。在我们的手中,带 TIE2/PIK3CA 突变EC的病变塞在注射14、15(图1C-E)后7~u20129天内明显15血管化并内插管。然而,病变生长的程度是可变的,并反映在患者和样本异质性。
病变塞紧密概括人体VM组织组织组织病理学特征:由一层薄薄的内皮细胞衬里扩大的血管通道(图1F+u2012H)。这些血管结构通常含有红细胞,确认功能性神经与宿主小鼠血管(图1F+u2012H)。使用人类特异性lectin UEA-I进行免疫组织化学染色可以确认血管病变的细胞来自人类植入细胞,而不是小鼠血管(图1H)。图2中介绍了一个方案,总结了从VM-EC分离到病变塞解剖的步骤。
图1:代表性结果。
(A) 在EC选择前三周与VM组织分离后,原发性混合细胞培养的代表性图像。典型的内皮细胞群(EC)和污染成纤维细胞(FB)。(B) 来自VM患者衍生组织的纯化(CD31珠选择)内皮细胞培养的图像。比例线 = 200 μm. (C) 病变将形成球形结构。血管化是可见的,由于蓝色通过裸体老鼠的皮肤。(D) 虚线显示如何使用卡钳测量长度 (L) 和宽度 (W) 来重新编码病变大小。(E) 第9天明显血管化、异种移植病变的照片。比例线 = 1 厘米 . (F) 病变塞段的代表性图像.在 x 平面模式中,使用五个高功率场图像进行定量,由白色虚线框表示。比例线 = 1000 μm. (G+u2012H) VM 病变插头部分的代表性图像。(G) 血氧林和Eosin染色和 (H) 人体特异性乳胶UEA-I的免疫基础化学.比例线 = 100 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图 2:生成患者派生的 VM 的工作流的示意图。
(A) 从患者VM病变分离的内皮细胞固体组织或病变血被镀,当达到80%的汇合时,由抗CD31结合免疫磁珠选择并扩大。(B) 对于EC的皮下注射,在第0天,用食指和拇指捏住鼠标背面的皮肤,形成帐篷般的结构。病变在第1天测量,然后每隔一天(红色箭头)使用卡钳通过实验第9天测量。对病变进行解剖处理,进行组织学分析。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这里,我们描述了一种生成患者派生的 VM 异种移植模型的方法。这个 Murine 模型提供了一个优秀的系统,使研究人员能够更深入地了解病理流明的增大,并将有助于开发更有效和有针对性的治疗 VM。这可以很容易地适应调查其他类型的血管异常,如毛细血管淋巴静脉畸形16。有几个步骤对于成功生成可重复的血管病变至关重要。首先,患者衍生的内皮细胞必须是纯的(没有其他细胞类型),并在注射时呈指数级增长。污染成纤维细胞或其他中层非EC可以很容易地通过拉长形态识别。在极少数情况下,即使使用抗CD31抗体结合磁珠进行纯化,也有可能在培养中保留少量非EC。这些培养物需要进一步纯化与内皮特异性细胞表面标记。作为一种替代方法,单细胞克隆细胞的内皮细胞扩张是可能的。这将重新确保突变EC的同质性,因为一个培养体内的所有细胞都来自一个细胞。然而,这种方法不建议为VM衍生的EC,因为细胞往往顶其增殖能力,并转化为一个衰老的表型后,9\u201210通道。在通道3\u20128之间使用细胞进行异种移植实验,以及在注射前一天不通过细胞至关重要。
可以修改异种移植模型,以调查携带不同激活突变的其他血管异常。此外,由于一些实验室难以获取患者组织样本,因此可以使用EC来适应异种移植模型,例如人类脐带血内皮细胞(HUVEC),基因工程可以表达已知导致血管生长功能失调的突变。17。,17
推荐用于异种移植注射的细胞数量为 2.5 x 106 6 μL的 BMEM。但是,如果细胞号不足,可以将每个动物的注射次数减少至一次,或将注射量至少降低至 100 μL。然而,对于后者,保持细胞密度比(例如,1.25 x 106 6细胞/100 μL BMEM)非常重要。使用 BMEM 时,必须在冰上执行所有步骤,以避免注射前细胞悬浮液凝固。在注射过程中,重要的是,针头入45°的角度直接下皮肤和远离肌肉组织,因为注射到肌肉阻碍病变的可重复性,使病变解剖困难。每只小鼠总共可以进行两次注射,一次在右侧,一只在动物的左侧。同一鼠标中的第二次注射可以用作技术复制。不建议在背部注射更多的药物,因为病变会随着时间而增长,并且可能会相互干扰。对于临床前研究的统计分析,比较治疗过的异种移植插头与未经治疗的(仅车辆)小鼠,我们建议每个研究组至少使用5只动物(10个异种移植插头)。如果可用,第二次注射也可以用作使用非突变EC的"内部控制"。我们使用原发非突变EC,如HUVEC,作为控制,并表明这些细胞形成了微不足道的小通道14,15。14,此外,在这些HUVEC控制病变塞,我们注意到渗透的穆林衍生血管通道进入插头后,第9天。如果实验设计需要更长的孵育时间,这些渗透通道可以很容易地排除在分析之外,通过染色的人特异性标记,如人特异性CD31抗体或 Ulex europaeus 胶粘蛋白 I (UEA-I), 不与小鼠交叉反应.
为了确保病变不会成为动物健康和福祉的负担,重要的是观察病变大小,每天记录小鼠体重,并注意任何侧并发症,如出血和淤青。如果病变体积超过500 mm3,实验必须终止。
当血管病变扩大和传播时,在解剖过程中必须格外注意,以避免损伤破裂。避免使用解剖工具接触病变塞,并留下过多的周围组织(如皮肤)附着在塞上,这一点很重要。这样可以防止异种塞内血管结构崩溃,从而干扰准确的分析。
最后,为了保持一致性,初始组织学分析必须从插头中心(约 50°u201270 μm 到组织)开始,而不是出现在可能存在血管分析的边框区域。强烈建议用人特异性EC标记(如UEA-I)或不会与小鼠交叉反应的替代人类特异性抗体来染色组织部分,以确认血管结构是由人源性EC而不是入侵小鼠EC形成的。
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Disclosures
作者没有利益冲突要披露。
Acknowledgments
作者要感谢诺拉湖校对。本手稿中报告的研究得到了国家心脏、肺和血液研究所的支持,该学会获得国家健康研究院的一部分,其奖项编号为 R01 HL117952(E.B.)。内容完全由作者负责,不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | Subcutaneous injection |
Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) | Vector Laboratories | B-1065 | Histological anlaysis |
Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) | Thermo Fisher | 974106 | Cell culture |
Bovine Serum Albumin (BSA) | BSA | A7906-50MG | Cell culture; Histological analysis |
Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma | C7902-500G | Cell culture |
Caliper | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | Lesion plug measurment |
CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) | Life Technologies | 11155D | EC separation |
Cell strainer (100 μM) | Greiner | 542000 | Cell culture |
Collagenase A | Roche | 10103578001 | Cell culture |
Conical Tube; polypropylene (15 mL) | Greiner | 07 000 241 | Cell culture |
Conical Tube; polypropylene (50 mL) | Greiner | 07 000 239 | Cell culture |
Coplin staining jar | Ted Pella | 21029 | Histological anlaysis |
Coverglass (50 X 22 mm) | Fisher Scientific | 12545E | Histological anlaysis |
DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) | Vector Laboratories | SK-4105 | Histological anlaysis |
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-027-CV | Cell culture |
DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | EC separation |
Ear punch | VWR | 10806-286 | Subcutaneous injection |
EDTA (0.5M, pH 8.0) | Life Technologies | 15575-020 | Histological anlaysis |
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) | Lonza | CC-3162 | Cell culture |
Eosin Y (alcohol-based) | Thermo Scientific | 71211 | Histological anlaysis |
Ethanol | Decon Labs | 2716 | Histological anlaysis |
Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | Cell culture |
Filter tip 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | Multiple steps |
Filter tip 20 μL | VWR | 10017-064 | Multiple steps |
Filter tip 200 μL | VWR | 10017-068 | Multiple steps |
Formalin buffered solution (10%) | Sigma | F04586 | Lesion plug dissection |
Hemacytometer (INCYTO; Disposable) | SKC FILMS | DHCN015 | Cell culture |
Hematoxylin | Vector Hematoxylin | H-3401 | Histological anlaysis |
Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) | Sigma | FC010-10MG | Cell culture |
Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) | Sigma | H1009 | Histological anlaysis |
ImageJ Software | Analysis | ||
Isoflurane, USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | Subcutaneous injection |
magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma | M1880-500G | Cell culture |
Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) | Corning | 356237 | Subcutaneous injection |
Microcentrifuge tube (1.5 mL) | VWR | 87003-294 | EC separation |
Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) | Fisher Scientific | 1255015-CS | Histological anlaysis |
Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | Subcutaneous injection |
Normal horse serum | Vector Laboratories | S-2000 | Histological anlaysis |
Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) | Corning | 30-009-CI | Cell culture |
Permanent mounting medium (VectaMount) | Vector Laboratories | H-5000 | Histological anlaysis |
Pestle Size C, Plain | Thomas Scientific | 3431F55 | EC isolation |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | Cell culture |
Scale | VWR | 65500-202 | Subcutaneous injection |
Serological pipettes (10 ml) | VWR | 89130-898 | Cell culture |
Serological pipettes (5ml) | VWR | 89130-896 | Cell culture |
Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma | 223530 | Cell culture |
Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC | Vector Laboratories | SA-5004 | Cell culture |
Syringe (60ml) | BD Biosciences | 309653 | Cel culture |
SYRINGE FILTER (0.2 µM) | Corning | 431219 | Cell culture |
Syringes (1 mL with Luer Lock) | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | Subcutaneous injection |
Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) | Greiner | 664160 | Cell culture |
Tissue culture-treated plate (145X20 mm) | Greiner | 639160 | Cell culture |
Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
Tris-base (Trizma base) | Sigma | T6066 | Histological anlaysis |
Trypan Blue Solution (0.4 %) | Life Technologies | 15250061 | Cell culture |
Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) | Corning | 25-052-Cl | Cell culture |
Tween-20 | Biorad | 170-6531 | Histological anlaysis |
Wheaton bottle | VWR | 16159-798 | Cell culture |
Xylenes | Fisher Scientific | X3P-1GAL | Histological anlaysis |
References
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