Summary
静脈奇形のマウス異種移植片モデルを生成するための詳細なプロトコルを提示する。このモデルは、超活性化TIE2および/またはPIK3CA遺伝子変異を含む患者由来内皮細胞の皮下注射に基づいている。異種移植病変はVM患者組織の組織病理学的特徴を密接に再現する。
Abstract
静脈奇形(VM)は、拡張され、しばしば機能不全の静脈をもたらす静脈ネットワークの発達障害から生じる血管異常である。本稿の目的は、ヒトVMを模倣し、患者の異質性を反映することができるマウス異種移植片モデルの確立を慎重に説明することである。内皮細胞(EC)における非遺伝性(体性 )TEK(TIE2) および PIK3CA 突然変異を超活性化することは、VMにおける病理学的血管拡大の主な要因として同定されている。以下のプロトコルは、変異体TIE2および/またはPIK3CAを発現する患者由来ECの分離、精製および拡張について説明する。これらのECは、免疫不全性の高胸腺マウスの後部に皮下に注入され、神経血管チャネルを生成する。TIE2またはPIK3CA変異株ECで発生した病変は、VM患者組織の注射および再構成の7\u20129日以内に目に見えて血管化される。このVM異種移植モデルは、VMの形成と拡張を推進する細胞および分子メカニズムを調査するための信頼性の高いプラットフォームを提供します。また、このモデルは、ヒトVMに見られる異常な血管拡大を防止する新規薬剤候補の有効性をテストする翻訳研究に役立つ。
Introduction
血管系の発達における欠陥は静脈奇形(VM)を含む多くの疾患の根本的な原因である。VMは、静脈の異常な形態形成および拡張を特徴とする先天性疾患である。VM組織および内皮細胞(EC)に関する重要な研究は、チロシンキナーゼ受容体TIE2をコードするTEKとPIK3CAの2つの遺伝子における機能獲得変異を同定2,3,4,した。これらの体細胞変異は、PI3K/AKTを含む主要な血管新生/増殖シグナル伝達経路のリガンド非依存性ハイパー活性化をもたらし、それによって拡張された拡張静脈3をもたらす。これらの重要な遺伝的発見にもかかわらず、異常な血管新生を引き起こすその後の細胞および分子メカニズムと拡大した血管チャネルの形成はまだ完全には理解されていない。
正常および病理学的血管新生の間に、既存の血管ネットワークおよびECから新しい血管が芽生える、増殖、移動、細胞外マトリックス(ECM)リモデリングおよび管腔形成6を含む重要な細胞プロセスの配列を受ける。ECの2次元および3次元(2D/3D)インビトロ培養は、これらの細胞特性を個別に調査するための重要なツールです。それにもかかわらず、宿主微小環境内で病理学的血管の拡大を再現するマウスモデルの需要は明確であり、翻訳研究のための標的薬の前臨床評価のための効率的なプラットフォームを提供する。
最新の状態では、TIE2機能獲得変異に関連するVMのトランスジェニックマウスモデルは報告されていない。現在のトランスジェニックVMマウスモデルは、活性化変異PIK3CA p.H1047R p.H1047R33,55のユビキタスまたは組織制限発現に依存する。これらのトランスジェニック動物は、このホットスポットPIK3CA突然変異の全身または組織特異的な効果に関する重要な洞察を提供する。これらのモデルの限界は、初期致死をもたらす病理学的血管ネットワークの形成である。したがって、これらのマウスモデルは、突然変異事象の散発的な発生およびVM病理の局在的性質を完全に反映していない。
反対に、患者由来の異種移植片モデルは、患者由来の病理組織または細胞を免疫不全マウス7に移植または注入することに基づいている。異種移植片モデルは、疾患の発症と新しい治療薬8の発見に関する知識を広げるための強力なツールです。さらに、患者由来の細胞を使用すると、科学者は突然変異異質性を再現して患者の異型のスペクトルを研究することができます。
ここでは、アチミックヌードマウスの後ろに、TIE2および/またはPIK3CAの変異体を構成的に活性な形態を発現する患者由来VM ECを皮下に注入するプロトコルについて説明する。注入された血管細胞は、以前の血管異種移植片モデル9、10、1110に記載されているように血管新生9を促進するためにECMフレームワークに懸濁される。,11これらのVM ECは、重要な形態形成を受け、支持細胞の不在時に肥大した、浸透した病理学的血管を生成する。VMの記載された異種移植片モデルは、制御不能な内腔の膨張を阻害する能力に対する標的薬物の前臨床評価のための効率的なプラットフォームを提供する。
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Protocol
患者組織サンプルは、シンシナティ小児病院医療センター(CCHMC)、がんおよび血液疾患研究所の機関政策に基づく承認された機関審査委員会(IRB)の下で、腫瘍および血管異常を有する患者からの組織サンプルおよびデータの収集およびリポジトリからのインフォームド・コンセントに基づいて参加者から得られ、臨床調査委員会の承認を得た。以下に記載されているすべての動物の手順は、CCHMC制度動物のケアと使用委員会によって見直され、承認されています。
1. 材料・ストックソリューションの準備
- 完全な内皮細胞増殖培地(EGM)の調製
- キットに存在する以下の成長因子を含む内皮基底培地(EBM)を補う(材料表参照):ヒト線維芽細胞成長因子-β(hFGF-β)、血管内皮成長因子(VEGF)、長Arg3インスリン様成長因子-I(R3-IGF-I)、アスコルビン酸、表皮成長因子(EGF)、ギタマイシンスルフェーゼおよびアゲンタマイシンスルフェス、およびサンギン-スルフェスと31%ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン(PSG)溶液と20%ウシ胎児血清(FBS)を加えます。
注: ヒドロコルチゾンを追加することはお勧めしません。 - 滅菌は、0.2 μmボトルトップフィルターを通して、50 mL円錐形のチューブに0.2 μmボトルとアリコメディアを通して溶液をフィルターし、4°Cで1週間または-20°Cで最大1年間貯蔵します。
- キットに存在する以下の成長因子を含む内皮基底培地(EBM)を補う(材料表参照):ヒト線維芽細胞成長因子-β(hFGF-β)、血管内皮成長因子(VEGF)、長Arg3インスリン様成長因子-I(R3-IGF-I)、アスコルビン酸、表皮成長因子(EGF)、ギタマイシンスルフェーゼおよびアゲンタマイシンスルフェス、およびサンギン-スルフェスと31%ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン(PSG)溶液と20%ウシ胎児血清(FBS)を加えます。
- コラゲナーゼAストック溶液を準備する
- 50 mg/mL コラゲナーゼ A ストック溶液をリン酸緩衝塩水 (PBS) で調製します。
- 滅菌は、0.2 μmフィルターとシリンジを備えた層流フードの下で溶液をフィルターし、100 μLのアリコートを-20 °Cで保管します。
- 組織採取培地(緩衝剤A)
- 0.927 gの塩化カルシウム二水和物(CaCl2.2H2O)と1gの硫酸ヘプタヒドリル(MgSO4.7H2 O)を500mLの蒸留水に加えて、Ca2+/Mg2+ストック液を調製します。2+2+滅菌は、0.2 μmボトルトップフィルターを通してオートクレーブガラスボトルに溶液をフィルターし、室温(RT)で保管します。
- 10% Ca2+/Mg2+ 溶液と2%FBSとダルベッコの修正イーグルミディアム(DMEM)を補います。
- 滅菌は、0.2 μmフィルターとシリンジを用いた層流フードの下で溶液をろ過し、-20°Cで5 mLのアリコートを貯蔵する。
- 組織培養プレートのフィブロネクチンコーティング
- 5.3gの炭酸ナトリウム(Na2CO3;0.1M)を脱イオン3水500mLに溶解して、コーティングバッファー(バッファB)を調製します。バッファーの pH を 1 M 塩酸 (HCl) を使用して 9.4 に調整します。0.2 μmボトルトップフィルターを通してオートクレーブガラスボトルにラミナーフローフードの下でフィルターを入れ、RTで保管します。
- コーティングの場合、ピペット2 mL/5 mL/10 mLのバッファBの60mm/100 mm/145mmの組織培養プレート毎にそれぞれ。1 μg/cm2 のヒト血漿フィブロネクチン精製タンパク質溶液を加え、液をプレートにそっと分配します。
- 37°Cでインキュベートプレート、20分間5%CO2。
- 吸引緩衝Bを、細胞を培養する前にPBSでプレートを洗浄する。
2. VM患者組織からの内皮細胞の分離
- 固体VM組織からのECの分離
注: VM 組織は、IRB 承認プロトコルの下で手術12,,13を脱バルクすることによって切除されます。- 洗浄VM組織(組織サンプル重量は、通常、0.5 gと1.5 gの間の範囲)PBSで5%のPSGで。
- ティッシュを100mm細胞培養皿に移し、滅菌外科的解剖ツールを用いてティッシュサンプルを小片に分け、50 mL円錐形の管に移す。
- 1mg/mLの最終濃度のためにバッファAの5mLに100μLのコラゲターゼAストック溶液を加え、これを組織に加え、37°Cで30分間、5分ごとに内容物を振りながら細かく消化します。
- 50 mL円錐管内の6mmの滑らかな表面の害虫粉砕機を使用して、RTで消化した組織を慎重に粉砕します。
- 0.5%のウシ血清アルブミン(BSA)と2%のPSGを補った冷たいPBSの5 mLを加えながら、害虫を使用して消化した組織を慎重に粉砕し続けます。この手順を 4 回繰り返します。
- 100 μmの細胞ストレーナーを通して50 mLの円錐チューブに溶液をフィルターし、組織断片を除去します。
- 遠心分離機細胞懸濁液はRTで400 x g で5分間、ステップ2.3に進みます。
- 患者硬化療法から得られた病変血からのVM ECの分離
- IRB承認プロトコルの下で硬化療法からヒトVM病変血液を得る。
- PBSで希薄な病変血液(サンプル量は通常0.5mL~5mL)、最終容積は40mLに及ぶ。
- 遠心分離機細胞懸濁液をRTで200xgで5分間懸濁した。 g
- 初期細胞めっき
- 上清を捨て、EGMの1mLで単細胞ペレットを再懸濁する。
- フィブロネクチンコーティング(1 μg/cm²)100 mmプレートと種子1 mLの細胞懸濁液に、9 mLの完全なEGMを加えます。
- 加湿した5%CO2雰囲気中で37°Cの細胞を2インキュベートする。
- 1日おきに2mLのメディアを取り除き、2 mLの無菌濾過FBSを加えます。
- 細胞培養が40\u201250%の合流度に達すると、培地をEGMを完了するように変更します。通常、細胞がこの合流に達するまでに 2\u20123 週間かかります。
- ECコロニーの出現を毎日観察してください。それらは典型的な「石畳のような」形態によって認識することができる(図1A)。3\u20125 の間の EC コロニーは各サンプルに現れます。
- 個々の EC コロニーが互いに触れ始めるまで、別の 5\u20127 日に対して、1 日おきにメディアを変更します。
- 個々の EC コロニーの手動分離
- ECコロニーを収穫するには、PBSの5 mLでプレートを洗浄し、手動で血清ピペットで吸引します。
- プレートを顕微鏡に持って行き、蓋と底部の両方にマーキングペンを使用して複数のECコロニーの位置を丸で囲み、層流フードに戻します。
- 印が付いた領域に0.05%トリプシン-EDTA溶液の50 μLをピペット化することによってECコロニーを取り外します。
- 小さなセルスクレーパーまたはピペットチップを使用して、プレートから細胞を静かに削ります。
- プレートを最も近いエッジに傾け、マークされた領域ごとに1 mLのEGMですすいでセルを収集します。
- ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用してセルの数を数えます。
- 収集したECコロニーを1 x 104 細胞/cm2 の密度で、新鮮なEGMを含むフィブロネクチンコーティング(1 μg/cm²)細胞培養皿にプレートします。翌日、EGM を完了するようにメディアを変更します。
- 細胞が80%の合流度に達するまで、2\u20123週の間、1日おきにEGMを完了するように培地を変更します。
- 2 mLのエプシンを37°Cで100mm皿あたり100mm皿あたり2 mLで2 mL2mL2分間、EGM 4 mLを加えてトリプシンを中和します。
- 細胞懸濁液を1つの15 mL円錐形チューブに集め、遠心分離機をRTで400 x g で5分間回収します。上清を吸引し、EGMの2mLで細胞を再懸濁する。
- ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用してセルの数を数えます。得られる典型的な細胞数は、100mm細胞培養プレートあたり1 x106 細胞または100mm組織培養板当たり2 x106 細胞である。
- 細胞を5分間RTで400xgで遠心分離gして細胞を吸引した。ステップ 3.2.1 に進みます。
3. 内皮細胞の選択と拡張
- 抗CD31結合磁気ビーズの調製
- 反CD31結合磁気ビーズを含むバイアルを30sの渦。必要なビーズの数は8 x 106 ビーズ/2 x 106 セルです。
- PBSに0.1%BSAを含む1mLの洗浄液で所望の量の抗CD31結合磁気ビーズを1.5 mLマイクロ遠心チューブで洗浄します。
- マイクロ遠心分離チューブを細胞分離マグネットに1分間置きます。
- 上清を吸引し、洗浄工程を繰り返す。
- 内皮細胞の精製とめっき
- 2.4.12で得られた細胞ペレットを500 μLの洗浄液で再懸濁し、PBSで0.1%BSAを含有する。
- 磁気ビーズを含むマイクロ遠心分離管に細胞溶液を加え、十分に再懸濁します。
- 4°Cで20分間、緩やかな傾きでインキュベートします。
- PBSに0.1%BSAの500 μLを加え、よく混ぜます。
- チューブを細胞分離マグネットの上に1分間置きます。
- ビーズに触れることなく、細胞のCD31陰性分率を含む液体のすべてを穏やかに吸引する。
- PBSで1mLの0.1%BSAでCD31陽性細胞分画を含むビーズペレットを洗浄し、磁気分離を繰り返します。
- 洗浄と磁気分離工程を最低3回繰り返し、CD31陽性細胞分画を精製する。
- 精製した内皮細胞を15 mL円錐形チューブに再懸濁し、RTで400 x g で5分間スピンダウンします。
- EGMの1 mLで上清を除去し、細胞ペレットを再懸濁します。
- フィブロネクチンコーティング(1 μg/cm²)100 mmプレートと種子1 mLの細胞懸濁液に、9 mLの完全なEGMを加えます。この初期シード処理では、まだ一部の磁性ビーズがセルに取り付けられていることに注意してください。ほとんどのビーズは細胞の膨張中に洗い流されますが、少数のビーズが初期の通路に持続する可能性があります。
- 加湿した5%CO2雰囲気中で37°Cの細胞を2インキュベートする。
- 細胞が80%の合流度に達するまで、一日おきに培地を交換する(図1B)。
- 内皮細胞拡張
- 細胞が80%の合流度に達したら、2 mL 0.05%トリプシン-EDTAを37°Cで100mm皿あたり2 mLで2分間取り外します。
- EGMの4 mLを加えることによってトリプシンを中和し、15 mLの円錐形の管に細胞を集める。
- 5分間RTで400 x g で遠心分離機。
- 上清を吸引し、EGMの2mLで細胞を再懸濁し、ヘミック計または自動細胞計数で細胞数をカウントする。
- 1 x 104 細胞/cm²の密度で145 mmフィブロネクチンコーティング(1 μg/cm²)の組織培養プレートにシード細胞。
- 目的のセル数が満たされるまでセルの通過を続けます。コンフルエント145mm組織培養プレートには約8\u20129 x 106 細胞が含まれ、必要な細胞数は1回の注射あたり2.5 x 106 細胞であると考えてください。異種移植のためには、継ぎ道3と8の間の細胞のみを考慮すべきである。
4. VM患者由来異種移植プロトコル
注:このプロトコルでは、5\u20126週齢、男性免疫不全、無地ヌードFoxn1nuマウスを 使用しています。
すべての動物の手順は、機関動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されなければなりません。
- 注射前日の材料の調製
- プレチルシリンジ、針、およびピペットの先端 -20 °Cの冷凍庫で一晩。
- ゲルの粘度の増加を避けるために、4°Cに置かれた氷のバケツの上に一晩基質膜細胞外マトリックス(BMEM)をゆっくりと解凍します。
- 注射のための細胞懸濁液の調製
- 5 mLのプレウォームド 0.05% トリプシン EDTA を 37 °C で 37 °C で 2 分間トリプシンします。
- 5 mLのEGMを加えてトリプシンを中和し、細胞を15 mL円錐形チューブに集めます。
- 5分間RTで400 x g で遠心分離機。
- 上清を吸引し、EGMの3mLで細胞を再懸濁し、ヘミック計または自動細胞カウンターを用いて細胞数をカウントする。
- 計画されたすべての注入に必要なセルの総数を決定します。
注: 推奨されるセル数は、1 回のインジェクションあたり 2.5 x 106 セル です。通常、技術的な重複のために、各マウスで合計 2 回の注射が実行されます。シリンジへの移動中の損失を考慮して、細胞数の10%超過を計算する必要があります。 - 計算されたセル数を含む体積を新しい50 mL円錐形チューブおよびペレット細胞に、RTで400 x g で5分間遠心して移動します。
- 上清を吸引し、少量(約50\u201270 μL)を残してペレットを緩めます。
- シリンジ調製
- 20 μL/注入の余分なボリュームを計算して、シリンジへの転送中の損失を考慮します。細胞ペレットを氷上での注入につき220μLのBMEMで再懸濁する。細胞懸濁液の注入された容積は、病変当たり200μLである。
- 均質な細胞懸濁液を得るために氷の上に十分に細胞懸濁液を混ぜ、泡を作成することを避ける。
- 1 mLピペットと1 mLシリンジを使用して、同時にシリンジのプランジャーを引っ張りながら吸引力によってシリンジ開口部にBMEM細胞混合物をピペット。
- ルアーは26G x 5/8インチの無菌針を注射器にロックし、注射前に準備した注射器を氷の上に平らに保ちます。
- マウスへの皮下注射
- イオブルラン気化器を使用して、1 L/minの流量で5%イオブルラン/酸素混合物でマウスを麻酔します。動物の適切なセドレーション(例えば、つま先のピンチに反応しない)を確保する。鼻コーンを介して送達される1.5%のイオブルラン/酸素の連続投与によって麻酔を維持する。
- マウスを胃の上に置き、移植が起こる背中の領域を露出させ、70%エタノールで注射領域を消毒する。
- 準備したシリンジをそっとロールし、落ち着いた細胞を再中断します。注射器の針の端に泡をフリックし、すべての気泡の除去を確実にするために細胞懸濁液の少量を排出します。
注:マウスの左側と右側のマウスごとに2回の注射を行うことができます。 - つまんで、親指と人差し指を使用して「テントのような」構造を作成し、皮膚のすぐ下に皮下に針を挿入します。針が筋肉組織への注入を防ぐためにつままれた皮膚を解放することによって、皮膚の深さだけであることを確認してください。
- 45°の角度で針を保持する慎重に細胞懸濁液の200 μLを注入して、小さな球状の質量を作り出します(図1C)。
- スケールでマウスの体重を記録し、マウスに耳をタグ付けし、ケージに戻ります。
- 沈めに続くマウスを監視して、正常な活性に戻ることを確認します。
- 病変成長モニタリング
- キャリパーを使用して、各プラグの長さと幅を測定します(図1D)。
- 病変の収集まで1日おきに測定を文書化する。
5. 組織の収集と処理
- CO2チャンバーに9日後にマウスを安楽死2させ、死を確認するためにバイタルサインを確認する。マウスを安楽死させる二次的な方法としてマウスに子宮頸部脱臼を行う。
- 外科的鉗子とはさみを使用して解剖することによって、マウスの側面から異種移植病変/プラグを収穫する。
注:プラグ内の血液で満たされた血管の破裂を防ぐためには、解剖ツールで病変プラグに触れないようにし、皮膚などの過度の周囲の組織をプラグに取り付けたままにすることが重要です。 - 切除された病変をPBSに浸して洗浄する。
- カメラでカメラステージを設定します。プラグをルーラーとまな板に合わせます。全てのプラグの画像を撮って、病変の総血管を記録する(図1E)。
- RTで一晩10%ホルマリンに沈めることによってプラグを固定します。
- 翌日PBSでプラグを洗い、70%エタノールに移します。
- パラフィン埋め込み用の病変プラグ(病理コア)を処理する。
6. 病変切除
- ミクロトームを使用して、収集したマウス病変から5μmのセクションを正に帯電したスライドに切り取ります。
注:その後の分析では、プラグの中央のセクション(組織に約50\u201270 μm)が重要です。 - パラフィンを60°Cで1時間溶融してから染色します。
- 化学ヒュームフローフードの下で、組織を逆パラフィン化し、再水和します。そのため、10分間のキシレン、100%エタノール(EtOH)5分間、3分間90%EtOH、および3分間80%EtOHでインキュベートスライド。
- 脱イオン水で5分間滑り落ちる。
7. ヘマトキシリンとエオシン(H&E)
- 2分間のヘマトキシリンのインキュベートセクション。
- 汚れた瓶にスライドを入れ、水が透明になるまで水道水の安定した流れによってシンクで洗い流します。
- 脱水和物は、1分間70%EtOH、1分間80%のEtOH、1分間90%EtOH、1分間100%EtOH、1分間100%EtOHで組織を順次インキュベートしてスライドします。
- 30 sのためのエオシンYの染色セクション。
- 溶液が明確になるまで、新鮮な100%EtOHでリンス。
- 2分間、キシレンでインキュベートスライド。スライドを煙のフードの下で5\u201210分間乾燥させます。
- 異種移植片のセクションの上に永久的な、非水性の取付け媒体の滴を分配し、上にカバースリップを置く。
- イメージングの前にスライドを一晩乾燥させます。
8. 免疫検査
- トリスベースの0.6 gと0.5 M EDTAから500 mLの脱イオン水の1 mLを秤量することにより、抗原回収バッファー(Tris-EDTA)を調製します。1 M HCl を使用して pH を 9.0 に調整し、250 μL の Tween-20 を追加します。
- 抗原検索バッファーを備えたビーカー内の非パラフィン化組織スライド(ステップ6.2\u20126.3)をインキュベートし、加熱ブロックで攪拌し、95°Cで20分間攪拌する。
- ビーカーを加熱ブロックから取り出し、溶液を35°Cに冷却し、PBSで3分間洗浄します。
- 5%正常な馬の血清中のブロック組織切片は、RTで30分間PBSで行う。
- 20 μg/mLのビオチン化UEA-IをPBSの5%の正常な馬の血清に希釈して、ビオチン化されたウレックスエウロパエウス・アググルチニン-I(UEA-I)の働く溶液を準備します。
- セクションごとのUEA-Iの働く解決のPipet 50\u2012100 μLおよび加湿室のRTで1時間のインキュベート。
- PBSで2回3分間スライドを洗浄します。
- RTで5分間の過酸化水素3%のクエンチスライドセクション。
- PBSで2回3分間スライドを洗浄します。
- PBSで5%の正常な馬の血清でストレプトアビジンわさびペルオキシダーゼ共役の5μg/mLを準備します。
- 各ティッシュの滑り口のPipet 50\u2012100 μLおよび加湿の部屋のRTで1時間のインキュベート。
- PBSで2回3分間スライドを洗浄します。
- メーカーの指示に従って3,3'Diaminobenzidine(DAB)溶液を準備し、セクションごとに50\u2012100 μLを追加します。
- 10\u201215分のインキュベートセクションは、2\u20125分ごとに汚れの開発をチェックし、監視します。
- PBSで3回3分間スライドを洗います。
- ヘマトキシリンを1滴加え、3分間インキュベートします。
- 汚れた瓶にスライドを入れ、水が透明になるまで水道水の安定した流れによってシンクで洗い流します。
- 80%のEtOHで1分間、90%のEtOHで1分間、1分間100%EtOH、キシレンで2分間連続してインキュベートスライド。
- スライドを煙のフードの下で5\u201210分間乾燥させます。
- 異種移植片のセクションの上に永久的な、非水性の取付け媒体の滴を分配し、上にカバースリップを置く。
- イメージングの前にスライドを一晩乾燥させます。
9. ヒト由来血管チャネルの解析
注:VM病変の血管は、血管領域および血管密度を測定することによって定量される。定量化のために考慮されるのは、UEA-I陽性のヒト由来の血管チャネルのみです。
- 20倍の倍率(高出力フィールド[HPF])で明視野顕微鏡で病変部ごとに4〜5枚の画像を撮ります。オーバーラップを避けるために、病変部内のX平面パターンでHPF画像を撮影します(図1F-H)。撮影した画像にスケールバーを含めます。
- HPF イメージをイメージ J ([ファイル] > [開く] ) で開きます。スケールバーのピクセルを次のように調整します。直線ツールを使用して、スケール バーを表示します。測定したピクセルを mm に変換するには、[ 分析 ] > [ スケールの設定] をクリックします。
- [ 解析 ] > [ 計測値の設定] をクリックし、[ エリア ] と [オーバーレイに追加] を選択します。
- 分析/測定 を使用して、HPF の合計フィールド 領域を測定します。ステップ9.8で定量化するためにこの測定を保存します。
- フリーハンド選択ツールを使用して、UEA-I+ 血管チャネルを手動で概説します。
注:血管チャネルは、UEA-I+ - ECが血液細胞を含む可能性のある領域として定義されます。 - [分析] > [メジャー]をクリックして、概説されている UEA-I+血管領域 (mm2/HPF) を定量化します。
- 1つのプラグ内で取られた5つのHPFすべてに対してこの測定を繰り返します。
- 全5つのHPFの全血管面積を平均する。得られたHPF当たりの血管面積は、その後HPFフィールド面積(mm2、ステップ9.5)で分割され、パーセント(%)として表される。
- 血管密度の定量については、取られた各HPFのUEA-I++血管チャネル数を数える。血管密度は、HPF領域当たりにカウントされるUEA-I+血管チャネルの平均数(血管/mm2)である。+ 2
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Representative Results
本プロトコルは、免疫不全ヌードマウスの後部への患者由来ECの皮下注射に基づいてVMのマウス異種移植片モデルを生成するプロセスを説明する。内皮細胞コロニーは、VM組織または病変血液から最初の細胞分離後4週間以内に収穫することができる(図1A、B)。注射の翌日、異種移植病変プラグは約80\u2012100 mm2の表面積をカバーする。私たちの手の中では、TIE2/PIK3CA変異ECを有する病変プラグは、注射14、15から7\u20129日以内に目に見えて血管化され、15浸透している(図1C-E)。しかしながら、病変の成長の程度は可変であり、患者およびサンプルの不均一性を反映する。
病変プラグは、ヒトVM組織の組織病理学的特徴を密接に再現する:内皮細胞の薄い層によって並ぶ拡大された血管チャネル(図1F\u2012H)。これらの血管構造は、典型的には赤血球を含み、宿主マウス血管系を用いて機能的なアナストモーゼを確認する(図1F\u2012H)。ヒト特異的レクチンUEA-Iを用いた免疫ヒストリカル染色は、血管病変を裏打ちする細胞がマウス血管系ではなくヒト移植細胞に由来することを確認できる(図1H)。VM-EC 分離から病変プラグの解剖までの手順を要約したスキームを図 2に示します。
図1:代表的な結果。
(A)EC選択前にVM組織から分離した3週間後の一次混合細胞培養の代表的な画像。典型的な内皮細胞コロニー(EC)および汚染線維芽細胞(FB)。(B)VM患者由来組織由来の精製(CD31ビーズ選択)内皮細胞培養物の画像。スケールバー= 200 μm(C) 病変は球形構造を形成する。血管化は、ヌードマウスの皮膚を通して青みがかった色のために見える。(D)破線は、キャリパーを使用して長さ(L)と幅(W)を測定することによって、病変サイズがどのように再コード化されているかを示す。(E)9日目に目に見えて血管化された異種移植病変外植の写真。スケールバー= 1cm(F)病変プラグセクションの代表的な画像。定量化のために5つの高出力フィールド画像が撮影されたX平面パターンは、白い破線のボックスで示されます。スケールバー = 1000 μm(G\u2012H) VM病変プラグセクションの代表的なイメージ。(G) ヘマトキシリンおよびエオシン染色および(H)ヒト特異的レクチンUEA-Iの免疫体系化学スケールバー= 100 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:VMの患者由来異種移植片を生成するワークフローの概略図。
(A)患者VM病変固体組織または病変血液から単離された内皮細胞は、メッキされ、80%の合流に達すると、抗CD31結合免疫磁気ビーズによって選択され、拡大する。(B)ECの皮下注射の場合、0日目に、マウスの裏側の皮膚を人差し指と親指でつまんでテント状の構造を作る。病変は、実験日9を通してキャリパーを使用して1日目と1日おきに測定されます。病変は組織学的分析のために解剖され、処理される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、VMの患者由来異種移植片モデルを生成する方法について説明する。このマウスモデルは、研究者が病理学的ルーメンの拡大をより深く理解することを可能にする優れたシステムを提示し、VMの治療のためのより効果的で標的療法の開発に役立ちます。これは、毛細血管リンパ性静脈奇形16のような他のタイプの血管異常を調査するために容易に適応することができる。再現性のある血管病変の生成を成功させるために重要ないくつかのステップがあります。まず、患者由来の内皮細胞は純粋で(他の細胞タイプの存在を除く)、かつ注射時に指数関数的に増殖する必要がある。汚染線維芽細胞または他の間葉非ECは、細長い形態によって容易に認識することができる。まれに、抗CD31抗体を結合した磁気ビーズを用いて精製した後でも、培養中に非ECの数が少ない場合があります。これらの培養は、内皮特異的細胞表面マーカーを用いてさらに精製を必要とする。別のアプローチとして、内皮細胞の単一細胞クローン拡張が可能である。これは、1つの培養物内のすべての細胞が1つの単一の細胞から派生するので、変異ECの均質性を再確認するであろう。しかし、細胞は増殖能力を上回り、9\u201210の継ぎ手の後に老化表現型に変換する傾向があるため、VM由来のECにはこのアプローチは推奨されません。異種移植実験のために3\u20128の通路間の細胞を使用し、注射の前日に細胞を通過しないことが重要です。
異種移植片モデルは、異なる活性化突然変異を運ぶ他の血管異常を調査するために変更することができる。また、患者組織試料が一部の研究室ではアクセス困難であるため、異種移植片モデルは、ヒト臍帯血内皮細胞(HUVEC)などのECを用いて、機能不全血管成長を,引き起こすことが知られている変異/sを発現するように遺伝子操作することにより適応させることができる。
異種移植片の注入に推奨される細胞の数は、BMEMの2.5 x 106細胞/200μLである。しかし、細胞数が不足している場合は、動物1人当たりの注射数を1回に減らすか、注射量を最低100μLに減らすることができる。後者の場合、細胞密度比(例えば、1.25 x 106細胞/100 μL BMEM)を維持することが重要です。BMEMを使用する場合、射出前の細胞懸濁液の固化を避けるために、すべてのステップを氷上で行う必要があります。注射中に重要であり、針は皮膚の下に直接45°の角度で挿入され、筋肉組織から離れて筋肉組織から離れて筋肉に注入すると、病変再現性を妨げ、病変解を困難にする。マウスごとに、右に 1 つ、各動物の左側に 1 つずつ、合計 2 回の注射を実行できます。同じマウスの 2 回目の注入は、技術的な複製として機能します。病変が時間の経過とともに成長し、お互いに干渉する可能性があるため、背中に多くの注射はお勧めできません。治療済みマウスと未治療(車両のみ)マウスの異種移植プラグを比較した前臨床試験における統計分析については、研究グループごとに最低5匹(10匹の異種移植プラグ)を使用することをお勧めします。利用可能であれば、第2の注入は、非突然変異ECを使用して「内部制御」として使用することができる。我々は、HUVECのような一次非変異ECをコントロールとして用い、これらの細胞が小さなチャネル14、15,15のごくわずかな数を形成したことを示している。さらに、これらのHUVEC制御病変プラグでは、9日目以降にマウス由来の血管チャネルがプラグに浸透していることに気付いた。実験計画により長いインキュベーション時間が必要な場合、これらの浸潤チャネルは、マウスと交差反応しないヒト特異的CD31抗体やウレックスエウロパエウス・アググルチニンI(UEA-I)などのヒト特異的マーカーの染色により、容易に分析から除外することができる。
病変が動物の健康と幸福の負担にならないようにするには、病変の大きさを観察し、毎日マウスの体重を記録し、出血や打撲傷などの任意の側の合併症に注意を払うことが重要です。病変量が500mm3を超える3場合は、実験を終了する必要があります。
血管病変が拡大し、浸透する場合、病変の破裂を避けるために解剖中に極度の注意を払わなければならない。解剖ツールで病変プラグに触れないようにし、過度の周囲の組織(皮膚など)をプラグに取り付けたままにすることが重要です。これは、正確な分析を妨げる異種移植片のプラグ内の血管構造の崩壊を防ぐ。
最後に、一貫性を保つためには、マウスの血管構造を吻合する境界領域ではなく、最初の組織学的分析がプラグの中央(組織に約50\u201270 μm)で始まることが重要です。マウスECに侵入するのではなく、ヒト由来ECによって血管構造が形成されることを確認するために、UEA-Iやマウスと交差反応しない代替ヒト特異的抗体などのヒト特異的ECマーカーで組織切片を染色することを強くお勧めします。
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Disclosures
著者らは開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、ノラ湖の校正に感謝したいと考えています。この原稿で報告された研究は、国立衛生研究所の一部である賞番号R01 HL117952(E.B.)の下で、国立心臓、肺、血液研究所によって支援されました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | Subcutaneous injection |
| Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) | Vector Laboratories | B-1065 | Histological anlaysis |
| Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) | Thermo Fisher | 974106 | Cell culture |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BSA | A7906-50MG | Cell culture; Histological analysis |
| Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma | C7902-500G | Cell culture |
| Caliper | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | Lesion plug measurment |
| CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) | Life Technologies | 11155D | EC separation |
| Cell strainer (100 μM) | Greiner | 542000 | Cell culture |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (15 mL) | Greiner | 07 000 241 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (50 mL) | Greiner | 07 000 239 | Cell culture |
| Coplin staining jar | Ted Pella | 21029 | Histological anlaysis |
| Coverglass (50 X 22 mm) | Fisher Scientific | 12545E | Histological anlaysis |
| DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) | Vector Laboratories | SK-4105 | Histological anlaysis |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-027-CV | Cell culture |
| DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | EC separation |
| Ear punch | VWR | 10806-286 | Subcutaneous injection |
| EDTA (0.5M, pH 8.0) | Life Technologies | 15575-020 | Histological anlaysis |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) | Lonza | CC-3162 | Cell culture |
| Eosin Y (alcohol-based) | Thermo Scientific | 71211 | Histological anlaysis |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Histological anlaysis |
| Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | Cell culture |
| Filter tip 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | Multiple steps |
| Filter tip 20 μL | VWR | 10017-064 | Multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 10017-068 | Multiple steps |
| Formalin buffered solution (10%) | Sigma | F04586 | Lesion plug dissection |
| Hemacytometer (INCYTO; Disposable) | SKC FILMS | DHCN015 | Cell culture |
| Hematoxylin | Vector Hematoxylin | H-3401 | Histological anlaysis |
| Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) | Sigma | FC010-10MG | Cell culture |
| Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) | Sigma | H1009 | Histological anlaysis |
| ImageJ Software | Analysis | ||
| Isoflurane, USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | Subcutaneous injection |
| magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma | M1880-500G | Cell culture |
| Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) | Corning | 356237 | Subcutaneous injection |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | VWR | 87003-294 | EC separation |
| Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) | Fisher Scientific | 1255015-CS | Histological anlaysis |
| Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | Subcutaneous injection |
| Normal horse serum | Vector Laboratories | S-2000 | Histological anlaysis |
| Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) | Corning | 30-009-CI | Cell culture |
| Permanent mounting medium (VectaMount) | Vector Laboratories | H-5000 | Histological anlaysis |
| Pestle Size C, Plain | Thomas Scientific | 3431F55 | EC isolation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | Cell culture |
| Scale | VWR | 65500-202 | Subcutaneous injection |
| Serological pipettes (10 ml) | VWR | 89130-898 | Cell culture |
| Serological pipettes (5ml) | VWR | 89130-896 | Cell culture |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma | 223530 | Cell culture |
| Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC | Vector Laboratories | SA-5004 | Cell culture |
| Syringe (60ml) | BD Biosciences | 309653 | Cel culture |
| SYRINGE FILTER (0.2 µM) | Corning | 431219 | Cell culture |
| Syringes (1 mL with Luer Lock) | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | Subcutaneous injection |
| Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) | Greiner | 664160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plate (145X20 mm) | Greiner | 639160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Tris-base (Trizma base) | Sigma | T6066 | Histological anlaysis |
| Trypan Blue Solution (0.4 %) | Life Technologies | 15250061 | Cell culture |
| Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) | Corning | 25-052-Cl | Cell culture |
| Tween-20 | Biorad | 170-6531 | Histological anlaysis |
| Wheaton bottle | VWR | 16159-798 | Cell culture |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3P-1GAL | Histological anlaysis |
References
- Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management. Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).
- Limaye, N., et al. Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations. Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).
- Castel, P., et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).
- Limaye, N., et al. Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation. The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).
- Castillo, S. D., et al. Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans. Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).
- Stratman, A. N., et al. Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices. Blood. 114 (2), 237-247 (2009).
- Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models. Cells. 8 (8), 889 (2019).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).
- Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Roh, Y. N., et al. The results of surgical treatment for patients with venous malformations. Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).
- Marler, J. J., Mulliken, J. B. Current management of hemangiomas and vascular malformations. Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).
- Goines, J., et al. A xenograft model for venous malformation. Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).
- Li, X., et al. Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).
- Le Cras, T. D., et al. Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation. Angiogenesis. , 1-18 (2020).
- Boscolo, E., et al. Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).
