Summary
这里介绍的是一个协议，用于分离和放大有氧和体性厌氧小鼠结膜共体细菌使用独特的眼拭子和基于培养的丰富步骤，随后通过微生物为基础的方法和MALDI-TOF质谱识别。
Abstract
眼表面曾经被认为是免疫特权和非生物，但最近看来，有一个小的，但持久的共生存在。眼粘膜细菌物种的鉴定和监测一直具有挑战性，因为其丰度低，而且缺乏适当的共生和识别方法。有两种标准方法：基于文化或DNA测序方法。第一种方法是有问题的，由于有限的可回收细菌和第二种方法识别活细菌和死细菌导致异常的眼部空间表示。我们利用标准的微生物培养技术，开发出一种坚固灵敏的细菌分离方法。这是一种基于拭子的技术，使用"实验室内"制成的薄拭子，瞄准下结膜，然后是有氧和足部厌氧基因的放大步骤。该协议使我们能够分离和识别结膜物种，如 科琳细菌、凝固负葡萄球菌、链球菌等。该方法适用于定义不同疾病条件下小鼠的同体多样性。
Introduction
本议定书的目的是加强从眼结膜中分离出可行和罕见的有氧和足性厌氧微生物的具体隔离，以特性眼微生物群。广泛的研究已经剖析了皮肤、肠道、呼吸道和生殖器上的粘膜群落，并表明这些社区影响免疫系统的发展和反应1，2，3。眼科共生社区已被证明在某些疾病病理学中发生改变，如干眼病4、Sjogren综合征5和糖尿病6。然而，与其他粘膜部位6、7、8相比，其丰度相对较低，妨碍了定义典型眼表面共体群落的能力。这引发了一场关于是否有常驻眼微生物群以及是否存在、它是否与皮肤微生物群不同以及其对与生俱来的免疫系统发育和反应的局部影响的争议。此协议可以帮助解决此问题。
一般来说，定义眼部共融利基的方法是基于测序和基于文化的技术4，7，9。16 S rDNA测序和BRISK分析7显示，与基于文化的技术相比，其多样性更为广泛，但无法区分活微生物和死微生物。由于眼部表面由于撕裂膜的抗微生物特性而对许多微生物怀有敌意，因此基于DNA的方法将检测这些文物，这些文物可能会使数据偏向于将死细菌识别为常驻共产物而不是污染物。这导致异常的共体识别和描述的眼部空间是较高的微生物丰度和多样性10。这使得很难通过基于DNA的方法定义常驻眼微生物群。然而，基于文化的标准技术无法检测共体，因为负载太低11。我们的方法改进了标准做法，使用薄拭子，可以瞄准结膜，从而避免来自邻近皮肤的污染，以及可行的生物体可以通过营养密集介质的短暂培养来丰富的概念，目的是恢复可行但不可耕种的微生物，以及丰富稀有可行的微生物。
结果，每个眼拭子的眼部共生体相对丰度，是结膜常驻微生物群的特征，对比较目的很重要。我们的数据显示，皮肤和结膜微生物之间有差异，随着年龄的增长和性别的丰度差异，多样性也越来越大。此外，这种方法在淘汰小鼠12中重新发现了共性差异。此协议可用于描述可能因细胞实践、地理或疾病状态而变化的眼微生物群，以及共生代谢物和产品对免疫系统发育和反应的局部影响。
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Protocol
所有涉及小鼠的程序均遵循机构动物护理和使用委员会的准则。在与微生物和潜在受污染材料合作时，请遵循实验室安全指南（由您的机构环境健康和安全部门指导）。在处置可能受到生物危害的受污染材料之前，使用适当的废物贮器和净化程序。
1. 眼拭子准备、工作现场设置、鼠标眼拭子和样品浓缩
- 准备无菌眼拭子
注：无菌眼拭子是薄涂层的木制牙签，纤维薄层棉击打和自制。- 自动抽脂适量的棉击和牙签，以清除被擦拭的老鼠数量。
- 用拇指和食指捏掉一块半厘米长的棉击。用拇指和食指拉在边缘，形成一个扁平的单多孔层，在击球分崩离析之前停止（在整个伸展击球中分散的一小块棉花是可以接受的）。
- 将击球绕在牙签的一端，轻轻握住牙签尖端的拉伸件，使其扭曲，见 图1。"完成"眼拭子将有一个非常薄的棉层伸展在尖端，延伸约半到一厘米远的尖端。
- 将"完成"的拭子插入小烧嘴中，向下拭子侧并盖住。高压 釜。
- 设置工作空间
- 准备麻醉，在无菌的50毫升无菌离心管中含有2毫升氯胺酮（100毫克/毫升）、400微升的西拉津（100毫克/毫升）和27.6毫升的无菌盐水（dH2O中的0.9%纳克）。过滤器消毒和麻醉立即使用（可储存在4°C1个月;始终允许在使用前平衡到室温）。
- 用消毒剂清洁工作区域，以尽量减少污染。
- Aliquot 0.5 mL 无菌脑心输液介质 （BHI） 放入标有 1.5 mL 无菌微中微管（每只鼠标 1 管并控制）：安排在微中心架。将机架放在冰上。
- 设置工作流程如下（从左到右）：小鼠麻醉站（笼内装有实验鼠， 空无菌笼、室温麻醉、25 G针头和1mL注射器）、眼拭子站（冰上引用的BHI、消毒眼拭子、干净的纸巾、70%异丙酚喷雾剂）和电镀站（室温血脂板、10 μL移液器）， 10 μL 无菌一次性提示，生物危害废物容器）。
- 眼睛擦拭
- 每1克小鼠体重剂量分别给每只成年小鼠注射10微克麻醉剂，并放入自封笼中。通过挤压后脚垫测试麻醉;没有运动表示适当的麻醉。
- 分配一只手只处理麻醉小鼠，另一只手只处理眼拭子和文化。对于擦拭，从笼子里取出完全麻醉的老鼠：放置在干净的工作表面的顶部，位于其"侧面，左眼暴露。用异丙酚喷洒戴手套的手，用干净的纸巾擦干。
- Uncap 专门标记 BHI 微型离心机管，配有专用介质处理手。将管子放回冰上的微型离心机架。 将棉质涂层的眼拭子尖浸入 BHI 中，从管子中取出眼拭子，将眼拭子旋转 2 次，对着内管，以去除多余的液体。
- 用鼠标处理手，轻轻地按住鼠标的脖子擦伤。另一方面，将眼尖拭子放在左眼的中间结合区域，见 图2A。轻轻压低眼球，在窗户清洗运动中（图2B）来回移动拭子，在下眼睑和眼睛之间移动10次。保持恒定的压力。
- 无需接触毛皮，轻轻取出拭子尖端，垂直于插入位置，并将棉签侧直接放入含有 BHI 介质的标记微离心管中。将润滑眼滴涂抹在擦拭的眼睛上。
- 把老鼠还给笼子。
- 让拭子在冰上站立10至15分钟，用消毒的手套手取出眼拭子，在介质中混合尖端10次旋转。通过将尖端旋转到微型离心管的内壁进行 5 次旋转来提取拭子。将拭子丢弃在生物危害容器中。
- 每个鼠标和控制样本（皮肤或毛皮拭子）重复步骤 1.3.2 到 1.3.7。在每个拭子之间适当消毒手套。
- 富 集
- 通过在 37 °C 下静态地孵育管 1 小时来丰富样品
- 在孵化过程中，用每只老鼠5%的羊血糖板（TSA板）标记一个室温的Trypticase大豆，并分成两半。
- 眼拭子培养孵化后，从孵化器中取出丰富的样品并放在冰上。
- 根据 图3A中的示意图，将漩涡样品与板短暂混合。将样品的 10 μL 引用到 TSA 板上，并将板倾斜以形成条状，重复 2 次。
- 在板的分界线的另一边，在 agar 上点 10 μL 的样品，重复 9 次。
- 在 37 °C 下孵化板，18 小时、2 天和 4 天（在防止 agar 板干燥的干净腔室中）。以条状计数菌落，注意形态，并计算每个拭子的菌落形成单位 （CFUs），以形成形态相似的分离物。查看未在条带中捕获的独特生物点。
2. 眼微生物的主板、特征和识别
-
主板
- 在 TSA 板背面绘制网格（图 3B）。从每个鼠标眼拭子板中挑选一个带无菌牙签的菌落，并划出主板正方形（网格）、带有菌落编号和鼠标信息的标签网格。为每个形态上截然不同的殖民地挑选和盘取三个不同的殖民地。
- 在 37 °C 下连夜孵化盘子。 继续孵化96小时，每天检查新隔离物的外观。
注：根据小鼠年龄、营养、疾病状态和捕食做法，共和人群会有所不同。分离特征基于我们实验室中发现的主要是有氧和足部性厌氧细菌。
-
表征
- 复制曼尼托盐阿加 （MSA） 和麦康基 （MAC） 板上的13 个板微生物，在 37 °C 的夜间孵化。 注意每个隔离区的增长和蜡殖民地或黄色殖民地的存在，在 MSA 上带有光环。
- 对于格拉姆阳性可可西，测试与猫科动物测试13，14。将3%过氧化氢滴在干净的玻璃滑梯上。使用无菌牙签，从眼拭板中挑选相应的微生物。没有气泡形成表示链球菌，轻微的气泡形成表示科里恩细菌，也许气泡的快速形成表示葡萄球菌的含量。
-
识别：马尔迪-托夫MS分析
注：细菌鉴定使用MALDI-TOF和软件数据库进行。该系统采用矩阵辅助激光脱硫电流时间飞行质谱仪（MALDI-TOF MS），用于开发光谱剖面，该光谱剖面与已知细菌光谱进行比较以进行识别。 大肠杆菌，ATCC 8739，用于系统校准。- 板菌分离到TSA板含有5%羊血，并在37°C时以5%的二氧化碳在一夜之间孵化。
- 使用 1 μL 循环，将纯细菌的薄层涂抹在 MALDI-TOF 目标滑梯上;1μL 的 MALDI-TOF MS CHCA 基质溶液（阿尔法-氰诺-4-羟基辛酸）覆盖并允许在将幻灯片加载到 MALDI-TOF 仪器之前完全干燥。
- 每个隔离点都以重复体中发现。
- 包含概率分数大于 80% 的报告，表明具有较高的歧视值，被接受为可靠的结果，并接受细菌识别。
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Representative Results
显示不同电镀方法的眼拭板的代表性结果见 图 3A， 显示与 C57BL/6 鼠标的形态多样性隔离。对于每个不同的隔离，殖民地被计算在条和相对丰度，独特的殖民地形成单位（CFU）每个眼拭子，计算和绘制的比较目的。对于微生物特征，细菌从单个鼠标眼拭子板中采摘，以产生主 TSA 板（通过从每个鼠眼拭子板中采摘三元形的形态分明分离物创建）。从主板块，在第二天或当增长出现时，运行额外的测试，以特征或识别微生物。主板用于提供足够的接种，以扩大各自的隔离。
该物种的特点是使用微生物技术，然后通过MALDI-TOFMS分析确定。每个分离从主板，由猫科动物测试13，14和生长在选择性介质。由于我们研究的主要微生物是链球菌，葡萄球菌和康奈细菌，曼尼托盐阿加（MSA）和麦克康基阿加（MAC）被用作选择性琼脂13。曼尼托盐阿加的生长表明葡萄球菌第13，16页。由于 MSA 含有苯酚红色，因此菌落周围的黄色光环表示曼尼托发酵并分类为金黄色葡萄球菌（通过其他测试（如凝固酶测试）13进行确认。麦康基阿加的生长表明格拉姆呈阴性细菌，因为胆汁盐和水晶紫罗兰能够侵入细菌膜，抑制格拉姆正细菌生长13。MSA的蜡状生长表明菌酸的产生，可能是由于有机体，如康奈细菌第13页。最后，阴极测试区分链球菌从葡萄球菌第13，16页，在某些情况下，弱阳性测试可能表明Aerococcus第15页。
为了识别隔离物，TSA 板在 5% 的二氧化碳和 37 °C 环境中被划破并一夜之间孵育，并进行了 MALDI-TOF MS。图4显示的结果S.酸性肌炎（病毒链球菌spp的成员。17）和A. 维里丹斯。经常是俄罗斯石油公司。根据生化和表型测试，被误认为是链球菌18、19的病毒性群体。MALDI-TOF MS 能够识别出具有 99.9 信心水平的隔离体，没有无法识别的物种。
在 图5中可以看到性别偏差，从雄性C57BL/6小鼠身上发现明显不同水平的共生生物。确定了每个隔离物的相对丰度。 链球菌酸性氨基尼穆斯， 气管病毒 和凝固性负葡萄球菌（CNS）分离#1 和大肠杆菌。发现在所有小鼠，与雄性表现出更高的相对丰度和更大的多样性。
图1：内部眼拭子。
（A） 在无菌牙签点和食指之间握有一块薄约1厘米的拉棉击球，牙签被卷起，同时对食指保持轻微压力，直到棉花完全卷到牙签尖上。（B） 眼拭子示例。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：鼠标结膜眼拭子放置。
（A） BHI 湿眼拭子尖入麻醉小鼠左眼的内角，以90°角，压抑眼球。（B） 拭子沿着结膜移动，同时在来回运动中保持对眼睛的轻微压力，10次。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：眼拭子和主板的代表性结果。
（A） 10 μL 的眼拭子接种丰富的介质被引用在血脂板的右侧，倾斜 30 至 60 度，使介质形成条状，在板的左侧，分配了 10 个 10 μL 点的样品。孵化板的照片显示了各个殖民地和形态多样性。（B） 从眼拭板中挑选一个菌落，并在其中一个正方形（网格）内条纹，从而创建了一个隔离的主板。三个形态相似的殖民地被条纹在单独的网格中。每个网格都有三条从鼠标眼拭子板中挑选的相同殖民地的条纹。在板上出现生长后，分离体的特点是选择性电镀和催化测试。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：马尔迪-托夫MS结果示例。
每个隔离物在 TSA 上通宵培养，应用于 MALDI-TOF MS 幻灯片，并覆盖着 MALDI-TOF MS 解决方案，空气干燥并重复发现。链球菌酸性肌酸性（A）和气管病毒（B）的结果被确认为信心值99.9。请单击此处查看此图的较大版本。
图5：偏性共性结膜生长。
年龄匹配的C57BL6/N小鼠被比较相对共性多样性。眼睛被擦拭，并识别出共生生物。最主要的物种是链球菌酸性肌酸性，雄性比雌性小鼠（双向ANOVA，p.0001<）要丰富得多。确定了5种不同的CNS隔离物，即墨西哥航空公司和大肠杆菌。虽然一些CNS分离物并非存在于所有小鼠中，但在所有丰度不同的小鼠中都发现了链球菌、气管病毒、CNS分离1和大肠杆菌。
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Discussion
由于眼表面的低菌态，许多实验室难以分离眼科共生体7、20，导致生长、丰度低、多样性低的样品数量少。这种方法通过增加充实步骤以及MALDI-TOF MS重新设计的眼拭子和识别，显著改进了标准文化实践4，21。浓缩步骤通过放大细菌负荷来解决低可回收性问题。可回收细菌从不到100个CFU显著增加到野生型雄性小鼠每眼拭子2，500个CFU的相对丰度，这表明营养丰富的媒介的孵化使可行但不可繁殖的细菌重新焕发活力，从而能够恢复休眠微生物。最近基于培养的丰富步骤已纳入微生物分子测序研究，使宿主和微生物表达特征之间的区别24，25，26，并放大罕见的属。我们的协议浓缩步骤是首次应用于眼微生物群研究，并利用浓缩物选择活微生物，扩大可回收的稀缺分离物的数量，并可能复苏可行但不可耕种的共生体。此外，我们在家里制作的眼拭子允许有针对性地擦拭结膜，减少周围皮肤/毛皮的污染，因为它的体积小，尖锥形薄。棉签涂层厚度和材料的选择是重要的21。这个实验室制造的眼拭子涂有一层薄薄的无毒棉击打，防止拭子材料内的拭子缠绕，以及，比钙藻酸眼拭子，可以是细胞毒性27。纵向测试表明，我们的方法是可重复的：从眼拭子中恢复的主要细菌包括链球菌、凝固金黄色葡萄球菌（CNS）和科里内细菌。这些结果与通过基于培养或成像的方法检测的主要亲子性厌氧眼系7、9、20的已发表的发现一致。这种方法在结膜中发现了更广泛的分离物，包括大肠杆菌和伪多莫纳斯spp。此外，MALDI-TOF MS的鉴定使属和物种之间能够更好地区别对待，例如链球菌和气溶胶的病毒性群体。19，28.
三个步骤对于最大化结果至关重要：眼拭子制造、眼拭子技术和独特的眼拭板分离选择。如上所述，非常薄的扁平棉层对于从眼表面初步捕获共体以及随后释放到浓缩介质中非常重要。厚或块状拭子可导致污染物的选择，以及保留在拭子尖端的隔离物。其次，在擦拭时眼球持续抑郁是必要的，以尽量减少来自周围表面的污染。理想的擦拭技术包括将拭子正常（90度）插入中下部辅音，以及稳定的擦拭压力以及缓慢的连续运动。最后，必须每天监测眼拭板，以选择新出现的分离物或以不同速度生长的分离物，以便完全捕获具有代表性的微生物群。
在明确了解协议结果或修改后，可以解决一些协议限制问题。研究结果是衡量相对可行的共生丰度，而不是实际的结膜细菌负担，目的是定义眼共体群落。相对丰度和多样性已用于我们的研究，用于细菌角膜炎的比较目的，以及研究与生俱来的免疫反应在淘汰和野生类型的小鼠12。此外，MALDI-TOF MS 的识别依赖于一个庞大的数据库28，为未知隔离光谱配置文件提供"无 ID"的结果，突出了使用当前数据库的重要性。最后，该协议只检测有氧和足部性厌氧细菌，但其框架是适应性的，可以通过修改浓缩介质、板生长条件和选择介质来帮助定义眼部微生物空间。通过将主板和富集生长条件更改为厌氧，然后可以检测到另一种常见的孤立眼共体、丙氨基细菌或其他厌氧性：虽然，在我们手中，我们几乎没有看到厌氧生长。
也许，这个框架可以与深DNA测序技术一起使用。通过DNA测序识别微生物的一个主要障碍是无法评估可行性10。该协议可以通过修改浓缩介质和电镀条件来匹配候选隔离物（通过DNA测序识别）首选生长标准，提供正交方法。这可能导致一种基于文化的有价值的方法，从可行但不可耕种的细菌或目前但丰度的物种中捕获动物。
对可行的眼部共生社区的定义对于检查眼部共生表达特征至关重要。广泛的研究表明，短链脂肪酸和微生物产品调节眼部免疫反应3，29，30，31，32，33，他们的行动发生在局部。这表明，不仅是解剖生产，而且这些因素的局部生产也很重要。此外，疾病状态，如干眼病和糖尿病改变眼表面微生物群4，6，33，34。这突出表明需要一种将基于DNA的测序以及基于文化的方法联系起来的方法，以便更好地定义健康和疾病中可行的眼微生物群。
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Disclosures
没有利益冲突要披露。
Acknowledgments
来自P30 DK034854的资金支持VY，LB和马萨诸塞州主机微生物中心的研究，以及NIH/NEI R01 EY022054支持MG的资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
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