Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de isolatie en versterking van aerobe en facultatieve anaerobe muisconjunctivale commensale bacteriën met behulp van een uniek oogswab en op cultuur gebaseerde verrijkingsstap met daaropvolgende identificatie door microbiologische methoden en MALDI-TOF massaspectrometrie.
Abstract
Het oculaire oppervlak werd ooit beschouwd als immuun bevoorrecht en abiotisch, maar onlangs lijkt het erop dat er een kleine, maar aanhoudende commensale aanwezigheid is. De identificatie en monitoring van bacteriële soorten in het oogslijmvlies waren een uitdaging vanwege hun geringe overvloed en beperkte beschikbaarheid van geschikte methodologie voor commensale groei en identificatie. Er zijn twee standaardbenaderingen: op cultuur gebaseerde of DNA-sequencingmethoden. De eerste methode is problematisch vanwege de beperkte herwinbare bacteriën en de tweede benadering identificeert zowel levende als dode bacteriën die leiden tot een afwijkende weergave van de oculaire ruimte. We ontwikkelden een robuuste en gevoelige methode voor bacteriële isolatie door voort te bouwen op standaard microbiologische kweektechnieken. Dit is een op uitstrijkjes gebaseerde techniek, met behulp van een "in-lab" gemaakt dun wattenstaafje dat zich richt op het onderste bindvlies, gevolgd door een versterkingsstap voor aerobe en facultatieve anaerobe geslachten. Dit protocol heeft ons in staat gesteld om conjunctivale soorten zoals Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp., enz. te isoleren en te identificeren. De aanpak is geschikt om commensale diversiteit bij muizen onder verschillende ziekteomstandigheden te definiëren.
Introduction
Het doel van dit protocol is om de specifieke isolatie van levensvatbare en zeldzame aerobe en facultatieve anaerobe microben uit het oculaire bindvlies te verbeteren om het oculaire microbioom te karakteriseren. Uitgebreide studies hebben commensale mucosale gemeenschappen geprofileerd op de huid, darmen, luchtwegen en geslachtsorganen en tonen aan dat deze gemeenschappen de ontwikkeling van het immuunsysteem en de respons1,2,3beïnvloeden . Van oculaire commensale gemeenschappen is aangetoond dat ze veranderen tijdens bepaalde ziektepathologieën, zoals droge ogenziekte4,syndroom van Sjogren5 en diabetes6. Toch wordt het vermogen om een typische oculaire oppervlaktecommensale gemeenschap te definiëren belemmerd door hun relatief lage overvloed in vergelijking met de andere mucosale sites6,7,8. Dit leidt tot een controverse over de vraag of er een ingezeten oculaire microbioom is en of het bestaat, of het verschilt van het huidmicrobioom en bijgevolg het lokale effect ervan op de ontwikkeling en reactie van het aangeboren immuunsysteem. Dit protocol kan helpen deze vraag op te lossen.
Over het algemeen zijn benaderingen om de oculaire commensale niche te definiëren gebaseerd op sequencing en op cultuur gebaseerde technieken4,7,9. S rDNA-sequencing en BRISK-analyse7 vertonen een bredere diversiteit dan op cultuur gebaseerde technieken, maar kunnen geen onderscheid maken tussen levende en dode microben. Omdat het oculaire oppervlak vijandig is voor veel microben als gevolg van de antimicrobiële eigenschappen van traanfilm4 die een grote reeks DNA-fragmenten genereren, zullen DNA-gebaseerde benaderingen deze artefacten detecteren die de gegevens kunnen scheeftrekken in de richting van identificatie van dode bacteriën als ingezeten commensalen in plaats van verontreinigingen. Dit resulteert in afwijkende commensale identificatie en karakterisering van de oculaire ruimte als hoger in microbenrijkdom en diversiteit10. Dit maakt het moeilijk om het ingezeten oculaire microbioom te definiëren via DNA-gebaseerde methoden. Overwegende dat standaard kweekgebaseerde technieken geen commensalen kunnen detecteren omdat de belasting te laag is11. Onze methode verbetert de standaardpraktijken door een dun wattenstaafje te gebruiken dat zich op het bindvlies kan richten, waardoor besmetting van de naburige huid wordt vermeden, evenals het concept dat levensvatbare organismen kunnen worden verrijkt door een korte cultuur in voedingsrijke media met als doel levensvatbare maar niet-cultureerbare, evenals verrijking voor zeldzame levensvatbare microben te reanimeren.
De resultaten, relatieve overvloed aan oculaire commensalen per oogdoekje, karakteriseren het conjunctiva resident microbioom en zijn belangrijk voor vergelijkende doeleinden. Onze gegevens tonen aan dat er een verschil is tussen huid en conjunctivale microbiota, evenals een grotere diversiteit met verhoogde leeftijd en een geslachtsspecifiek verschil in overvloed. Bovendien heeft deze aanpak reproduceerbaar commensale verschillen gevonden in knock-out muizen12. Dit protocol kan worden toegepast om het oculaire microbioom te beschrijven dat kan variëren als gevolg van kooipraktijken, geografie of ziektetoestand, evenals de lokale effecten van commensale metabolieten en producten op de ontwikkeling en respons van het immuunsysteem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met muizen volgen de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee. Volg de laboratoriumveiligheidsrichtlijnen (zoals voorgeschreven door uw afdeling Institutionele Milieuhygiëne) bij het werken met micro-organismen en mogelijk verontreinigde materialen. Gebruik geschikte afvalrecipiënten en ontsmettingsprocedures voordat mogelijk biologisch verontreinigde materialen worden verwijderd.
1. Voorbereiding van oogdoekjes, opstelling van het werkveld, uitstrijkjes van muizenogen en verrijking van monsters
- Bereid steriele oogdoekjes voor
OPMERKING: Steriele oogdoekjes zijn dun gecoate houten tandenstokers met een vezeldunne laag katoenen batting en in huis gemaakt.- Autoclaaf de juiste hoeveelheid wattenslag en tandenstokers voor het aantal muizen dat moet worden uitgewreven.
- Knijp een half centimeter lang stuk katoenen slag met duim en wijsvinger af. Plaag het slaan door met duimen en wijsvingers aan de randen te trekken om een vlakke enkele poreuze laag te vormen, stoppend net voordat het slaan uit elkaar valt (kleine stukjes katoen verspreid over het uitgerekt slaan zijn acceptabel).
- Draai het slaan rond een van de scherpe uiteinden van de tandenstoker door het uitgerekt stuk lichtjes op de tandenstokerpunt te houden terwijl het gedraaid is, zie figuur 1. Het "voltooide" oogdoekje heeft een zeer dunne laag katoen over de punt, die zich ongeveer een halve tot een centimeter van de punt uitstrekt.
- Plaats "voltooide" wattenstaafjes in een klein bekerglas, veeg het wattenstaafje naar beneden en dek af. autoclaaf.
- De werkruimte instellen
- Bereid anesthesie voor met 2 ml ketamine (100 mg/ml), 400 μL xylazine (100 mg/ml) en 27,6 ml steriele zoutoplossing (0,9% NaCl in dH2O) in een steriele steriele centrifugebuis van 50 ml. Filtersterilisatie en aliquot anesthesie voor onmiddellijk gebruik (kan gedurende 1 maand bij 4 °C worden bewaard; laat altijd vóór gebruik op kamertemperatuur komen).
- Maak het werkgebied vrij en reinig het met ontsmettingsmiddel om verontreiniging tot een minimum te beperken.
- Aliquot 0,5 ml steriele Brain Heart Infusion media (BHI) in gelabelde steriele microcentrifugebuizen van 1,5 ml (1 buis per muis en controle); schik in microcentrifugerek. Zet het rek op ijs.
- Stel de werkstroom als volgt in (van links naar rechts): anesthesiestation voor muizen (kooi met experimentele muizen, lege steriele kooi, anesthesie op kamertemperatuur, 25 G naald en 1 ml spuit), oogswabstation (gesteriliseerd BHI op ijs, gesteriliseerde oogdoekjes, schone papieren handdoeken, 70% isopropanolspray) en beplatingsstation (bloedagarplaten op kamertemperatuur, 10 μL pipet , 10 μL steriele wegwerptips, biogevaarlijke afvalcontainer).
- Oog swabbing
- Dien 10 μL anesthesie toe per 1 g muisgewichtsdosering van respectievelijk ketamine en xylazine intraperitoneaal aan elke volwassen muis en plaats in een autoclaafkooi. Test anesthesie door achtervoetkussen te knijpen; geen beweging duidt op een passende anesthesie.
- Wijs één hand toe om alleen verdoofde muizen te behandelen en de andere hand om alleen het oogdoekje en de cultuur te hanteren. Verwijder voor swabbing de volledig verdoofde muis uit de kooi; plaats bovenop het schone werkoppervlak dat aan de zijkant is geplaatst met het linkeroog bloot. Spuit gehandschoende handen met isopropanol, droog met schone papieren handdoek.
- Uncap specifiek gelabeld BHI micro-centrifuge buis met speciale media handling hand. Plaats de buis terug in het microcentrifugerek op ijs. Dompel de met katoen beklede punt van het oogdoekje in BHI, trek het oogdoekje uit de buis en wervel de punt 2 keer tegen de binnenband om overtollige vloeistof te verwijderen.
- Houd de muis met de hand voorzichtig bij het nekvel. Plaats met de andere hand de punt van het oogdoekje tegen het mediale conjunctivale gebied van het linkeroog, zie figuur 2A. Druk de oogbol licht in en beweeg het wattenstaafje in een raamwasbeweging(figuur 2B)heen en weer, tussen het onderste ooglid en het oog, 10 keer. Houd constante druk aan.
- Zonder de vacht aan te raken, verwijdert u voorzichtig de punt van het wattenstaafje, loodrecht op de plaats waar het is ingebracht, en plaatst u het wattenstaafje met de katoenen kant direct naar beneden in een gelabelde microcentrifugebuis met BHI-media. Breng een smerende oogdruppel aan op het gesmeerd oog.
- Breng de muis terug naar de kooi.
- Laat het wattenstaafje 10 tot 15 minuten op ijs staan en verwijder het oogdoekje met de gesteriliseerde gehandschoende hand door de punt gedurende 10 omwentelingen in het medium te mengen. Trek het wattenstaafje gedurende 5 omwentelingen terug door de punt tegen de binnenwand van de microcentrifugebuis te draaien. Gooi het wattenstaafje weg in een biogevaarlijke container.
- Herhaal de stappen 1.3.2 tot en met 1.3.7 voor elke muis en voor controlemonsters (huid- of bontdoekje). Steriliseer handschoenen op de juiste manier tussen elk wattenstaafje.
- Verrijking
- Verrijk het monster door de buis statisch gedurende 1 uur bij 37 °C te incuberen
- Label tijdens de incubatie één trypticase soja op kamertemperatuur met 5% schapenbloedagarplaat (TSA-plaat) per muis en verdeel in tweeën.
- Verwijder na de incubatie van de oogswabcultuur verrijkte monsters uit de incubator en plaats deze op ijs.
- Kort vortexmonsters om te mengen en te borderen volgens het schema in figuur 3A. Aliquot 10 μL van het monster op de TSA-plaat en kantel de plaat om een strip te vormen, herhaal dit 2 keer.
- Aan de andere kant van de scheidingslijn van de plaat, punt 10 μL monster op agar, herhaal 9 keer.
- Incubeer platen bij 37 °C gedurende 18 uur, 2 dagen en 4 dagen (in een schone kamer die voorkomt dat agarplaten drogen). Tel kolonies in stroken, noteer morfologie en bereken kolonievormende eenheden (CFUs) per swab voor morfologisch vergelijkbare isolaten. Kijk naar stippen voor unieke organismen die niet in stroken zijn gevangen.
2. Masterplaat, karakterisering en identificatie van oculaire microben
-
Hoofdplaat
- Teken roosters op de achterkant van een TSA-plaat (figuur 3B). Kies een kolonie met een steriele tandenstoker van elke muis oog swab plaat en streep de master plate vierkant (rasters), label raster met kolonienummer en muis informatie. Kies en bord drie verschillende kolonies voor elke morfologisch verschillende kolonie.
- Incubeer de plaat 's nachts bij 37 °C. Ga 96 uur door met incubatie en controleer dagelijks op het verschijnen van nieuwe isolaten.
OPMERKING: De Commensal-populatie zal variëren op basis van de leeftijd van de muis, voeding, ziektetoestand en kooipraktijken. Isolaatkarakterisering is gebaseerd op de overheersende aerobe en facultatieve anaerobe bacteriën die in ons laboratorium worden aangetroffen.
-
kenschets
- Dupliceer13 plaatmicroben op Mannitol Salt Agar (MSA) en MacConkey (MAC) platen, incubeer 's nachts bij 37 °C. Noteer groei voor elk isolaat en aanwezigheid van wasachtige kolonies of gele kolonies met halo op MSA.
- Voor Gram positieve cocci, test met de catalasetest13,14. Plaats een druppel van 3% waterstofperoxide op een schone glazen glijbaan. Kies met een steriele tandenstoker de bijbehorende microbe uit de oogswabplaat. Geen bellenvorming duidt op Streptococcus spp., lichte bubbelvorming duidt op Corynebacterium spp. en misschien Aerococcus spp. en snelle bubbelvorming duidt op Staphylococcus spp.
-
Identificatie: MALDI-TOF MS-analyse
OPMERKING: Bacteriële identificaties worden uitgevoerd met behulp van de MALDI-TOF en de Software Database. Dit systeem maakt gebruik van matrix-ondersteunde laser desorptie ionisatie-tijd van vlucht massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) voor het ontwikkelen van spectra profielen die worden vergeleken met bekende bacteriële spectra voor identificatie. E.coli, ATCC 8739, wordt gebruikt voor systeemkalibratie.- Plaatbacterieel isolaat op TSA-platen die 5% schapenbloed bevatten en 's nachts incuberen met 5% kooldioxide bij 37 °C.
- Breng met behulp van een lus van 1 μL een dunne laag van de zuivere bacteriën aan op de MALDI-TOF-doelschuif; 1 μL MALDI-TOF MS CHCA matrixoplossing (alfa-cyano-4-hydroxycinnoïnezuur) wordt bedekt en volledig aan de lucht gedroogd voordat de dia in het MALDI-TOF-instrument wordt geladen.
- Elk isolaat wordt in tweevoud gespot.
- Rapporten met waarschijnlijkheidsscores van meer dan 80%, die wijzen op een hoge discriminatiewaarde, worden geaccepteerd als betrouwbare resultaten en de bacteriële identificatie wordt geaccepteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve resultaten voor een oogswabplaat die verschillende methoden voor plateren aantoont, zijn afgebeeld in figuur 3A met morfologisch diverse isolaten van C57BL/6-muis. Voor elk afzonderlijk isolaat werden de kolonies geteld in de strip en de relatieve overvloed, unieke Kolonievormende Eenheden (CFUs) per oogswab, berekend en uitgezet voor vergelijkingsdoeleinden. Voor microbiologische karakterisering werden bacteriën uit individuele muisoogswabplaten geplukt om een master TSA-plaat te produceren (gemaakt door morfologisch verschillende isolaten in drievoud van elke muisoogswabplaat te plukken). Vanaf de master plate, op de daaropvolgende dag of wanneer de groei verschijnt, werden aanvullende tests uitgevoerd om de microben te karakteriseren of te identificeren. De hoofdplaat werd gebruikt om voldoende entmateriaal te leveren om de respectieve isolaten uit te breiden.
De soort werd gekenmerkt met behulp van microbiologische technieken en vervolgens geïdentificeerd door MALDI-TOF MS-analyse. Elk isolaat van de hoofdplaat, werd getest door catalasetest13,14 en gekweekt op selectieve media. Aangezien de overheersende microben in onze studies Streptococcus spp., Staphylococcus spp. en Corneybacterium spp. zijn, werden Mannitol Salt Agar (MSA) en Mac Conkey Agar (MAC) gebruikt als de selectieve agar13. Groei op Mannitol Salt Agar duidt op Staphylococcus spp13,16. Aangezien MSA fenolrood bevat, duidt een gele halo rond de kolonie op mannitolfermentatie en classificatie als Staphylococcus aureus (bevestig met alternatieve tests zoals Coagulase-test)13. De groei op MacConkey agar wijst op Gram negatieve bacteriën, aangezien galzouten en kristalviolet het bacteriële membraan kunnen overtreden en gram positieve bacteriële groei remmen13. Wasachtige groei op MSA duidt op de productie van mycolisch zuur en kan te wijten zijn aan organismen zoals Corneybacterium spp13. Ten slotte onderscheidt de catalasetest Streptococcus spp. van Staphylococcus spp13,16, en in sommige gevallen kan een zwakke positieve test wijzen op Aerococcus spp15.
Om isolaten te identificeren, werd een TSA-plaat 's nachts gestreeld en geïncubeerd in een omgeving van 5% kooldioxide en 37 °C en MALDI-TOF MS uitgevoerd. Figuur 4 toont de resultaten S. acidominimus (een lid van viridans Streptococcus spp. 17) en A. viridans. Vaak Aerococcus spp. zijn verkeerd geïdentificeerd als de viridansgroep van streptokokken18,19, gebaseerd op biochemische en fenotypische tests. MALDI-TOF MS kon de isolaten identificeren met een betrouwbaarheidsniveau van 99,9 zonder niet-identificeerbare soorten.
Geslachtsbias verschillen kunnen worden waargenomen in figuur 5, waar significant verschillende niveaus van commensale organismen werden teruggevonden van mannelijke en vrouwelijke C57BL/6 muizen. De relatieve overvloed voor elk isolaat werd bepaald. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans en coagulase negatieve stafylokokken (CZS) isoleren #1 en E. coli spp. werden gevonden bij alle muizen, waarbij de mannetjes een hogere relatieve overvloed en grotere diversiteit vertoonden.
Figuur 1: In-house oogswab.
(A) Een dun, ongeveer 1 cm, stuk getrokken katoenen slag werd gehouden tussen de steriele tandenstokerpunt en wijsvinger en de tandenstoker werd gerold met behoud van lichte druk tegen de wijsvinger totdat het katoen volledig op de tandenstokerpunt was gerold. (B) Voorbeeld van een oogswab. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Plaatsing van muisconjunctivale oogswabs.
(A) De BHI natte ooguitstrijkje tip werd ingebracht, onder een hoek van 90°, in de mediale hoek van het linkeroog van een verdoofde muis, waardoor de oogbol werd ingedrukt. (B) Het wattenstaafje werd langs het bindvlies bewogen terwijl het licht onder druk op het oog bleef in een heen en weer beweging, 10 keer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Representatieve resultaten voor het oogswab en de master plates.
(A) 10 μL van het inengeënte oogswab verrijkte media werd aan de rechterkant van de bloedagarplaat geciteerd en 30 tot 60 graden gekanteld om de media in staat te stellen stroken te vormen en aan de linkerkant van de plaat werden tien 10 μL punten van het monster afgegeven. De foto van de geïncubeerde plaat toont individuele kolonies en morfologische diversiteit. (B) Een hoofdplaat van isolaten werd gecreëerd door een kolonie uit de oogswabplaat te plukken en binnen een van de vierkanten (roosters) strepen te maken. Drie morfologisch vergelijkbare kolonies zijn in afzonderlijke rasters gestreept. Elk raster heeft drie strepen van dezelfde kolonie die werd geplukt uit de muisoog swab plaat. Nadat de groei op de platen verscheen, werd het isolaat gekenmerkt door selectieve beplating en catalasetests. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Voorbeeld van MALDI-TOF MS resultaten.
Elk isolaat werd 's nachts op TSA gekweekt, aangebracht op MALDI-TOF MS-dia en bedekt met MALDI-TOF MS-oplossing, aan de lucht gedroogd en in tweevoud gespot. De resultaten voor Streptococcus acidominimus (A) en Aerococcus viridans (B) werden positief geïdentificeerd met een betrouwbaarheidswaarde van 99,9. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Sex-biased commensal conjunctival growth.
Leeftijdsgematchte C57BL6/N muizen werden vergeleken voor relatieve commensale diversiteit. De ogen werden uitgewenst en commensale organismen geïdentificeerd. De meest overheersende soort was Streptococcus acidominimus, die significant overvloediger was bij mannelijke dan vrouwelijke muizen (2-weg ANOVA, p<0,0001). Er werden 5 verschillende CZS-isolaten geïdentificeerd, Aerococcus viridans en E.coli. Hoewel sommige van de CZS-isolaten niet bij alle muizen aanwezig waren, werden de Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans, CNS-isolaat 1 en E. coli gevonden bij alle muizen met verschillende overvloeden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vanwege de paucibacteriële toestand van het oculaire oppervlak hebben veel laboratoria moeite gehad met het isoleren van oculaire commensalen7,20, wat resulteerde in een laag aantal monsters met groei, lage overvloed en lage diversiteit8. Deze methode verbetert de standaard kweekpraktijken4,21 aanzienlijk door de toevoeging van een verrijkingsstap, evenals een opnieuw ontworpen oogdoekje en identificatie door MALDI-TOF MS. De verrijkingsstap pakt een lage herstelbaarheid aan door de bacteriële belasting te versterken. De significante toename van herwinbare bacteriën van minder dan 100 CFUs tot de relatieve overvloed van 2.500 CFUs per oogdoekje voor wilde mannelijke muizen suggereert dat incubatie in voedingsrijke media levensvatbare maar niet-cultiveerbare bacteriën22,23nieuw leven inblaast, waardoor het herstel van slapende microben mogelijk is. Recente op cultuur gebaseerde verrijkingsstappen zijn opgenomen in microbiota moleculaire sequencingstudies om discriminatie tussen gastheer- en microbiële expressiehandtekeningen24,25,26mogelijk te maken en zeldzame geslachten te versterken. Onze protocolverrijkingsstap is de eerste die wordt toegepast op oculaire microbioomstudies en maakt gebruik van verrijking om levende microben te selecteren, het aantal herstelbare schaarse isolaten uit te breiden en misschien levensvatbare maar niet-cultiveerbare commensals te reanimeren. Bovendien maakt ons in eigen huis gemaakte oogswab gericht uitstrijkje van het bindvlies mogelijk, waardoor verontreiniging van de omringende huid / vacht wordt verminderd vanwege zijn kleine formaat en dunne puntige taps toelopende vorm. De keuze van swab coating dikte en materiaal is belangrijk21. Dit door het laboratorium gemaakte oogswab is bedekt met een dunne laag niet-toxische wattenslag, die voorkomt dat swabbed commensal beknelling in het swabmateriaal, evenals, de voorkeur heeft boven calciumalginaat oogswabs die cytoxisch kunnen zijn27. Longitudinale tests tonen aan dat onze methode reproduceerbaar is; met de dominante bacteriën die zijn teruggevonden uit oogswabs, waaronder Streptococcus spp., Coagulase Negative Staphylococcus (CNS) en Corynebacterium spp. Deze resultaten komen overeen met gepubliceerde bevindingen voor de dominante facultatieve anaerobe oculaire geslachten7,9,20 gedetecteerd via op cultuur gebaseerde of op beeldvorming gebaseerde methoden. Deze methode heeft een breder spectrum van isolaten gevonden in het bindvlies, waaronder Escherichia coli en Pseudomonas spp. Bovendien maakt de identificatie door MALDI-TOF MS een betere discriminatie tussen geslachten en soorten mogelijk, zoals de viridansgroep van streptokokken en Aerococci spp. 19,28.
Drie stappen zijn van cruciaal belang bij het maximaliseren van het resultaat: vervaardiging van oogswabs, oogswabtechniek en unieke isolaatselectie uit de oogswabplaat. Zoals hierboven besproken, is een zeer dunne platte laag katoen belangrijk voor de eerste vangst van commensalen van het oculaire oppervlak en voor hun daaropvolgende afgifte in de verrijkingsmedia. Dikke of klonterige swabs kunnen leiden tot de selectie van verontreinigingen, evenals het vasthouden van isolaten in de swabtip. Ten tweede is continue depressie van de oogbol tijdens swabbing noodzakelijk om verontreiniging van omliggende oppervlakken te minimaliseren. De ideale swabbing-techniek omvat een normale (90 graden) invoeging van het swab in de mediale inferieure conjunctivale fornix en een constante swabbingdruk in combinatie met langzame continue beweging. Ten slotte moet de oogswabplaat dagelijks worden gecontroleerd om te selecteren op nieuw verschijnende isolaten of die met een andere snelheid groeien om het representatieve microbioom volledig vast te leggen.
Er zijn een paar protocolbeperkingen die kunnen worden aangepakt met een duidelijk begrip van de resultaten of wijziging van het protocol. De resultaten zijn een maat voor relatief levensvatbare commensale overvloed, en niet voor daadwerkelijke conjunctivale bacteriële belasting, met als doel de oculaire commensale gemeenschap te definiëren. De relatieve overvloed en diversiteit zijn gebruikt in onze studies voor vergelijkende doeleinden bij bacteriële keratitis, evenals, om de aangeboren immuunrespons bij knock-out en wilde type muizen te onderzoeken12. Bovendien hangt de identificatie door MALDI-TOF MS af van een substantiële database28, die een resultaat oplevert van "no ID" voor onbekende isolaatspectraprofielen, wat het belang van het gebruik van een huidige database benadrukt. Ten slotte detecteert dit protocol alleen aerobe en facultatieve anaerobe bacteriën, maar het raamwerk is aanpasbaar en kan worden gebouwd om de oculaire microbiële ruimte te helpen definiëren door wijziging van verrijkingsmedia, plaatgroeiomstandigheden en selectiemedium. Door de stamplaat en verrijkingsgroeiomstandigheden te veranderen in anaeroob,kan een andere vaak geïsoleerde oculaire commensal, Propionibacterium spp. of andere anaeroben worden gedetecteerd; hoewel we in onze handen bijna geen anaerobe groei zagen.
Misschien kan dit raamwerk worden gebruikt in combinatie met diepe DNA-sequencingtechnieken. Een belangrijke hindernis bij microbenidentificatie via DNA-sequencing is het onvermogen om de levensvatbaarheid te beoordelen10. Dit protocol kan een orthogonale methode bieden door verrijkingsmedia en platingvoorwaarden aan te passen aan de voorkeursgroeicriteria van een kandidaat-isolaat (geïdentificeerd door DNA-sequencing). Dit kan resulteren in een waardevolle op cultuur gebaseerde aanpak om commensalen te vangen van levensvatbare maar onveranderlijke bacteriën of aanwezige maar weinig overvloed soorten.
Definitie van de levensvatbare oculaire commensale gemeenschap is essentieel voor het onderzoeken van het oculaire commensale expressieprofiel. Breed onderzoek suggereert dat korte keten vetzuren en microbiële producten de oculaire immuunrespons moduleren3,29,30,31,32,33, en dat hun werking lokaal plaatsvindt. Dit suggereert dat niet alleen distale productie, maar lokale productie van deze factoren belangrijk is. Ook veranderen ziektetoestanden zoals droge ogen en diabetes het oculaire oppervlakmicrobioom4,6,33,34. Dit benadrukt de noodzaak van een methode die dna-gebaseerde sequencing en op cultuur gebaseerde benaderingen overbrugt, zodat het levensvatbare oculaire microbioom in gezondheid en ziekte beter kan worden gedefinieerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenverstrengeling om bekend te maken.
Acknowledgments
Financiering van P30 DK034854 ondersteunde VY, LB en studies in het Massachusetts Host-Microbiome Center en financiering van NIH / NEI R01 EY022054 ondersteunde MG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
References
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
- Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
- Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
- Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
- Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
- Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
- Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
- Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
- Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547 (2020).
- Johnson, T. R., Case, C. L. Laboratory Experiments in Microbiology. , Pearson Benjamin Cummings Pubs. San Francisco, CA. (2010).
- Reiner, K.
- UK SMI. Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , Gov.UK. (2014).
- Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
- Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus--a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
- Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
- Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
- Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117 (2018).
- Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880 (2017).
- Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
- Epstein, S. S.
- Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
- Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56 (2019).
- Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831 (2019).
- Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
- Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
- Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855 (2016).
- Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
- Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
- Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
- Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11 (2020).
- Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
