Summary
Burada sunulan, mikrobiyolojik tabanlı yöntemler ve MALDI-TOF kütle spektrometresi ile daha sonra tanımlanması ile benzersiz bir göz çubuğu ve kültür tabanlı zenginleştirme adımı kullanılarak aerobik ve öğretim üyesi anaerobik fare konjonktival commensal bakterilerin izolasyonu ve amplifikasyonu için bir protokoldür.
Abstract
Oküler yüzey bir zamanlar immün ayrıcalıklı ve abiyotik olarak kabul edildi, ancak son zamanlarda küçük, ancak kalıcı bir kommensal varlık olduğu görülüyor. Oküler mukozadaki bakteri türlerinin tanımlanması ve izlenmesi, düşük bollukları ve kommensal büyüme ve tanımlama için uygun metodolojinin sınırlı metodolojisi nedeniyle zor olmuştur. İki standart yaklaşım vardır: kültür tabanlı veya DNA dizileme yöntemleri. İlk yöntem, sınırlı geri kazanılabilir bakteriler nedeniyle sorunludur ve ikinci yaklaşım, oküler alanın anormal bir temsiline yol açan hem canlı hem de ölü bakterileri tanımlar. Standart mikrobiyolojik kültleme tekniklerini geliştirerek bakteri izolasyonu için sağlam ve hassas bir yöntem geliştirdik. Bu, alt konjonktivayı hedefleyen "laboratuvar içi" yapılmış ince bir çubuk kullanan, ardından aerobik ve öğretim üyesi anaerobik cins için bir amplifikasyon adımı kullanan çubuk tabanlı bir tekniktir. Bu protokol, Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp., vb. Yaklaşım, farklı hastalık koşullarında farelerde kommensal çeşitliliği tanımlamak için uygundur.
Introduction
Bu protokolün amacı, oküler mikrobiyomu karakterize etmek için oküler konjonktivadan canlı ve nadir aerobik ve öğretim üyesi anaerobik mikropların spesifik izolasyonunu arttırmaktır. Kapsamlı çalışmalar cilt, bağırsak, solunum ve genital sistemlerdeki kommensal mukozal toplulukların profilini çıkarmıştır ve bu toplulukların bağışıklık sisteminin gelişimini ve yanıt1, 2,3'üetkilediğini göstermektedir. Göz eti kommenal topluluklarının Kuru göz hastalığı4, Sjogren sendromu5 ve diyabet6gibi bazı hastalık patolojileri sırasında değiştiği gösterilmiştir. Yine de, tipik bir oküler yüzey kommenal topluluğunu tanımlama yeteneği, diğer mukozal sitelere kıyasla nispeten düşük bollukları ile engellenir6,7,8. Bu, yerleşik bir oküler mikrobiyom olup olmadığı ve varsa, cilt mikrobiyomundan farklı olup olmadığı ve sonuç olarak doğuştan gelen bağışıklık sistemi gelişimi ve yanıtı üzerindeki yerel etkisi hakkında bir tartışmaya neden olur. Bu protokol bu sorunun çözülmesine yardımcı olabilir.
Genel olarak, oküler kommensal niş tanımlamak için yaklaşımlar sıralama ve kültür tabanlı tekniklere dayanır4,7,9. 16 S rDNA dizilimi ve BRISK analizi7, kültür tabanlı tekniklerden daha geniş bir çeşitlilik gösterir, ancak canlı ve ölü mikroplar arasında ayrım yapamaz. Göz yaşartıcı filmin anti-mikrobiyal özellikleri4 nedeniyle göz yüzeyi birçok mikroplara düşman olduğundan, DNA tabanlı yaklaşımlar, ölü bakterilerin kirleticiler yerine yerleşik kommensallar olarak tanımlanmasına yönelik verileri çarpıtabilecek bu eserleri tespit edecektir. Bu, oküler alanın mikrop bolluğu ve çeşitliliğinde daha yüksek olarak anormal kommensal tanımlama ve niteleme ile sonuçlanır10. Bu, yerleşik oküler mikrobiyomun DNA tabanlı yöntemlerle tanımlanmasını zorlaştırır. Standart kültür tabanlı teknikler, yük çok düşük olduğundan virgülleri algılayamaz11. Yöntemimiz, konjonktivayı hedefleyebilen ince bir çubuk kullanarak standart uygulamaları geliştirir, böylece komşu ciltlerden kontaminasyonu önler, ayrıca canlı organizmaların canlı ama kült olmayan mikropları canlandırmak ve nadir uygulanabilir mikroplar için zenginleştirmek amacıyla besin yoğun ortamlarında kısa kültürle zenginleştirilebileceği kavramını da önler.
Sonuçlar, göz çubuğu başına göreceli oküler kommensal bolluğu, konjonktiva yerleşik mikrobiyomu karakterize eder ve karşılaştırmalı amaçlar için önemlidir. Verilerimiz, cilt ve konjonktival mikrobiyota arasında bir fark olduğunu, ayrıca artan yaş ve bol miktarda cinsiyete özgü bir fark ile daha fazla çeşitlilik olduğunu göstermektedir. Ayrıca, bu yaklaşım tekrar tekrar nakavt farelerde övgüye yersiz farklılıklar buldu12. Bu protokol, kafes uygulamaları, coğrafya veya hastalık durumuna bağlı olarak değişebilen oküler mikrobiyomun yanı sıra kommensal metabolitlerin ve ürünlerin bağışıklık sistemi gelişimi ve yanıtı üzerindeki yerel etkilerini tanımlamak için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Farelerle ilgili tüm prosedürler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi yönergelerine uyar. Mikroorganizmalar ve potansiyel olarak kontamine olmuş malzemelerle çalışırken laboratuvar güvenliği yönergelerini (Kurumsal Çevre Sağlığı ve Güvenliği departmanınız tarafından yönlendirildiği şekilde) izleyin. Biyolojik tehlikeyle kirlenmiş olabilecek malzemelerin bertaraf edilmeden önce uygun atık kaplarını ve dekontaminasyon prosedürlerini kullanın.
1. Göz çubuğu hazırlama, çalışma alanı kurulumu, fare gözü svabbing ve örnek zenginleştirme
- Steril göz sürüntüleri hazırlayın
NOT: Steril göz çubukları, lif ince pamuklu bir çubuk tabakası ile ince kaplanmış ahşap kürdanlardır ve evde yapılır.- Sürünecek fare sayısı için uygun miktarda pamuklu vuruş ve kürdan alın.
- Başparmak ve işaret parmağıyla yarım santimetre uzunluğunda pamuklu bir parçayı kıstırın. Düz bir tek gözenekli tabaka oluşturmak için başparmak ve işaret parmağı ile kenarları çekerek vuruşu alaya almak, vuruş parçalanmadan hemen önce durmak (gerilmiş vuruş boyunca dağılmış küçük pamuk parçaları kabul edilebilir).
- Kıvrılırken kürdan ucundaki gerilmiş parçayı hafifçe tutarak vuruşu kürdanın keskin uçlarından birinin etrafında döndürün, bkz. "Tamamlanmış" göz çubuğu, ucun üzerine gerilmiş, ucundan yaklaşık yarım ila bir santimetre uzağa uzanan çok ince bir pamuk tabakasına sahip olacaktır.
- Küçük beher içine "tamamlanmış" sürüntüler yerleştirin, tarafı aşağı doğru sürün ve örtün. otoklav.
- Çalışma alanını ayarlama
- Steril 50 mL steril santrifüj tüpünde 2 mL ketamin (100 mg/mL), 400 μL ksilazin (100 mg/ml) ve 27,6 mL steril salin (dH2O'da %0,9 NaCl) içeren anestezi hazırlayın. Hemen kullanım için sterilize ve aliquot anestezisini filtreleyin (1 ay boyunca 4 °C'de saklanabilir; kullanmadan önce her zaman oda sıcaklığına eşit olmasına izin verin).
- Kirlenmeyi en aza indirmek için çalışma alanını dezenfektan ile temizleyin ve temizleyin.
- Aliquot 0.5 mL steril Beyin Kalbi İnfüzyon ortamı (BHI) etiketli 1.5 mL steril mikrosantrifüj tüpler (fare ve kontrol başına 1 tüp); mikrosantrifüj rafında düzenleyin. Rafı buza koy.
- İş akışını aşağıdaki gibi ayarlayın (soldan sağa): fare uyuşturma istasyonu (deneysel fareler içeren kafes, boş steril kafes, oda sıcaklığı anestezisi, 25 G iğne ve 1 mL şırınga), göz temizleme istasyonu (buz üzerinde aliquoted BHI, sterilize göz çubukları, temiz kağıt havlular, % 70 izopropanol spreyi) ve kaplama istasyonu (oda sıcaklığı kan agar plakaları, 10 μL boru , 10 μL steril tek kullanımlık uçlar, biyolojik tehlike atık konteyneri).
- Göz küreme
- Her yetişkin fareye sırasıyla 1 g fare ağırlığı ketamin ve ksilazin dozajı başına 10 μL anestezi uygulayın ve otoklavlı bir kafese yerleştirin. Arka ayak pedlerini sıkarak anesteziyi test edin; hiçbir hareket uygun anesteziyi gösterir.
- Bir elinizin sadece uyuşturulmış fareleri idare etmesi için, diğer elinin ise sadece göz bezini ve kültürü idare etmesi için atayın. Sürünme için, tamamen uyuşturuldulanmış fareyi kafesten çıkarın; sol gözü açıktayken kendi tarafına yerleştirilmiş temiz çalışma yüzeyinin üzerine yerleştirin. Eldivenli ellere izopropanol püskürtün, temiz kağıt havlu ile kurulayın.
- Uncap, özel medya işleme ipi ile BHI mikro santrifüj tüpünü özellikle etiketledi. Tüpü buz üzerindeki mikro santrifüj rafına geri yerleştirin. Göz küreğinin pamuk kaplı ucunu BHI'ye batırın, fazla sıvıyı çıkarmak için ucu iç tüpe 2 kez döndürerek göz bezini tüpten çekin.
- Fare taşıma eliyle, fareyi boynun scruff'ından hafifçe tutun. Diğer taraftan, göz çubuğu ucunu sol gözün medial konjonktival bölgesine yerleştirin, bkz. Göz küresini hafifçe bastırın ve bezi bir pencere yıkama hareketiyle (Şekil 2B) ileri geri, alt göz kapağı ve göz arasında 10 kez hareket ettirin. Sürekli basıncı koruyun.
- Kürke dokunmadan, çubuk ucunu, yerleştirildiği yere dik olarak hafifçe çıkarın ve çubuk pamuk tarafını doğrudan BHI ortamı içeren etiketli bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Sürünmüş göze yağlayıcı bir göz damlası uygulayın.
- Fareyi kafese geri götür.
- Bez buz üzerinde 10 ila 15 dakika bekletin ve ucu 10 dönüş için medyada karıştırarak sterilize eldivenli elle göz bezini çıkarın. 5 dönüş için mikro santrifüj tüpünün iç duvarına uç döndürerek çubuğu çekin. Bezi biyolojik tehlike kabına atın.
- Her fare ve kontrol örnekleri (cilt veya kürk çubuğu) için 1.3.2 ile 1.3.7 adımlarını yineleyin. Eldivenleri her çubuk arasında uygun şekilde sterilize edin.
- zenginleşme
- Tüpü statik olarak 37 °C'de 1 saat inkübe ederek numuneyi zenginleştirir
- Kuluçka sırasında, bir oda sıcaklığındaki Trypticase Soya'yı fare başına% 5 koyun kanı agar plakası (TSA plakası) ile etiketlayın ve ikiye bölün.
- Göz bezi kültürü inkübasyonundan sonra, zenginleştirilmiş örnekleri inkübatörden çıkarın ve buza yerleştirin.
- Şekil 3A'dakişemaya göre karıştırmak ve plakalamak için kısaca girdap örnekleri. Numunenin Aliquot 10 μL'si TSA plakasına ve bir şerit oluşturmak için plakayı eğin, 2 kez tekrarlayın.
- Plakanın bölme çizgisinin diğer tarafında, agar üzerinde nokta 10 μL örnek, 9 kez tekrarlayın.
- 37 °C'deki plakaları 18 saat, 2 gün ve 4 gün boyunca kuluçkaya bırakın (agar plakalarının kurumasını önleyen temiz bir odada). Şeritlerdeki kolonileri sayın, morfolojiye dikkat edin ve morfolojik olarak benzer izolatlar için sürüntü başına koloni oluşturan birimleri (CFO'lar) hesaplayın. Şeritler halinde yakalanmayan benzersiz organizmalar için noktalara bakın.
2. Ana plaka, karakterizasyon ve oküler mikropların tanımlanması
-
Ana plaka
- Bir TSA plakasının arkasına ızgaralar çizin (Şekil 3B). Her fare gözü çubuk plakasından steril kürdanlı bir koloni seçin ve ana plaka karesini (ızgaralar), etiket ızgarasını koloni numarası ve fare bilgileriyle çizin. Morfolojik olarak farklı her koloni için üç farklı koloniyi seçin ve plakala.
- Plakayı 37 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın. Kuluçkaya 96 saat devam edin, yeni izolelerin görünümünü günlük olarak kontrol edin.
NOT: Commensal popülasyon fare yaşı, beslenme, hastalık durumu ve kafes uygulamalarına göre değişecektir. İzole karakterizasyonu laboratuvarımızda bulunan baskın aerobik ve öğretim üyesi anaerobik bakterilere dayanmaktadır.
-
Karakterizasyonu
- Mannitol Salt Agar (MSA) ve MacConkey (MAC) plakalarında13 tabak mikrop kopyalayın, 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın. Msa'da haleli mumsu kolonilerin veya sarı kolonilerin her bir izolesi ve varlığı için büyümeye dikkat edin.
- Gram pozitif koksuzlar için katalaz testi ile test13,14. Temiz bir cam kaydırağın üzerine% 3 hidrojen peroksit damlası yerleştirin. Steril bir kürdan kullanarak, ilgili mikrobu göz bezi plakasından seçin. Hiçbir kabarcık oluşumu Streptococcus spp.gösterir, hafif kabarcık oluşumu Corynebacterium spp. ve belki de Aerococcus spp. ve hızlı kabarcık oluşumu Staphylococcus spp gösterir gösterir.
-
Tanımlama: MALDI-TOF MS analizi
NOT: Bakteri kimlikleri MALDI-TOF ve Yazılım Veritabanı kullanılarak gerçekleştirilir. Bu sistem, tanımlama için bilinen bakteri spektrası ile karşılaştırılan spektra profilleri geliştirmek için uçuş kütle spektrometresinin (MALDI-TOF MS) matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon süresini kullanmaktadır. E.coli, ATCC 8739, sistem kalibrasyonu için kullanılır.- Plaka bakteriyel, %5 koyun kanı içeren TSA plakalarına izole eder ve 37 °C'de % 5 karbondioksit ile bir gecede kuluçkaya yatırılır.
- 1 μL döngü kullanarak, MALDI-TOF hedef slaydına ince bir saf bakteri tabakası uygulayın; 1 μL MALDI-TOF MS CHCA matris çözeltisi (alfa-cyano-4-hidroksinnamik asit) kaplanır ve kaydırağı MALDI-TOF cihazına yüklemeden önce tamamen kurumasına izin verilir.
- Her yalıtma yinelenen olarak görülür.
- Yüksek bir ayrımcılık değerine işaret eden %80'den büyük olasılık puanları içeren raporlar güvenilir sonuçlar olarak kabul edilir ve bakteriyel tanımlama kabul edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kaplama için farklı yöntemleri gösteren bir göz çubuğu plakası için temsili sonuçlar, C57BL / 6 fareden morfolojik olarak farklı izolatları gösteren Şekil 3A'da resmedilmiştir. Her ayrı izole için, koloniler şeritte sayıldı ve göreceli bolluk, göz çubuğu başına benzersiz Koloni Şekillendirme Birimleri (CFO'lar), karşılaştırma amacıyla hesaplandı ve çizildi. Mikrobiyolojik karakterizasyon için, bakteriler ana bir TSA plakası üretmek için tek tek fare gözü çubuk plakalarından seçildi (her fare gözü çubuk plakasından üç taraflı morfolojik olarak farklı izolatlar seçilerek oluşturuldu). Ana plakadan, sonraki günde veya büyüme göründüğünde, mikropları karakterize etmek veya tanımlamak için ek testler yapıldı. Ana plaka, ilgili izolatları genişletmek için yeterli inokülyum sağlamak için kullanılmıştır.
Türler mikrobiyolojik teknikler kullanılarak karakterize edildi ve daha sonra MALDI-TOF MS analizi ile tanımlandı. Ana plakadan her izole, katalaz testi13,14 ile test edildi ve seçici medyada yetiştirildi. Çalışmalarımızdaki baskın mikroplar Streptococcus spp., Staphylococcus spp. ve Corneybacterium spp., Mannitol Salt Agar (MSA) ve Mac Conkey Agar (MAC) seçici agar13olarak kullanıldığından. Mannitol Tuz Agar büyüme Staphylococcus spp13,16gösterir . MSA fenol kırmızısı içerdiğinden, koloninin etrafındaki sarı bir hale, mannitol fermantasyonunu ve staphylococcus aureus olarak sınıflandırılmasını gösterir (Koagülaz testi gibi alternatif testlerle onaylayın)13. MacConkey agar üzerinde büyüme Gram negatif bakterileri gösterir, çünkü safra tuzları ve kristal menekşe bakteri zarını aşabilir ve Gram pozitif bakteri üremesini engelleyebilir13. MSA'daki mumsu büyüme mikolik asit üretimini gösterir ve Corneybacterium spp13gibi organizmalardan kaynaklanabilir. Son olarak, katalaz testi Streptococcus spp.'yi Staphylococcus spp13,16'dan ayırır ve bazı durumlarda zayıf pozitif test Aerococcus spp15'i gösterebilir.
İzoleleri tanımlamak için, %5 karbondioksit ve 37 °C ortamda bir gecede bir TSA plakası çizildi ve inkübe edildi ve MALDI-TOF MS yapıldı. Şekil 4 sonuçları gösterir S. acidominimus (viridans Streptococcus spp üyesi. 17) ve A. viridans. Genellikle Aerococcus spp. biyokimyasal ve fenotipik testlere dayanarak streptokok18,19viridans grubu olarak yanlış tanımlanmıştır. MALDI-TOF MS, tanımlanamayan bir tür olmadan 99.9 güven seviyesine sahip izolatları tanımlayabildi.
Cinsiyet taraflı farklılıklar gözlenebilir Şekil 5, erkek ve dişi C57BL / 6 farelerden önemli ölçüde farklı ömensal organizma seviyeleri kurtarıldı. Her bir izolat için göreli bolluk belirlendi. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans ve koagüle negatif stafilokok(CNS)#1 ve E. coli spp izole. tüm farelerde bulundu, erkekler daha yüksek göreceli bolluk ve daha fazla çeşitlilik gösterdi.
Şekil 1: Kurum içi göz bezi.
(A) Steril kürdan noktası ile işaret parmağı arasında ince, yaklaşık 1 cm çekilmiş pamuk vuruşu yapılmış ve pamuk kürdan ucuna tamamen yuvarlanana kadar işaret parmağına karşı hafif basınç korunarak kürdan yuvarlanmıştır. (B) Göz bezi örneği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Fare konjonktival göz çubuğu yerleşimi.
(A) BHI ıslak göz çubuğu ucu, 90 ° açıyla, uyuşturulmuş bir farenin sol gözünün medial köşesine sokuldu ve gözün morali bozuldu. (B) Çubuk, 10 kez ileri geri hareket halinde göze hafifçe baskı yaparken konjonktiva boyunca hareket ettirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Göz çubuğu ve ana plakalar için temsili sonuçlar.
(A) 10 μL göz çubuğu aşılanmış zenginleştirilmiş ortam, kan agar plakasının sağ tarafında aliquoted ve ortamın şeritler oluşturmasına izin vermek için 30 ila 60 derece eğildi ve plakanın sol tarafında, numunenin on 10 μL noktası dağıtıldı. Kuluçka plakasının fotoğrafı bireysel kolonileri ve morfolojik çeşitliliği göstermektedir. (B) Göz çubuğu plakasından bir koloni seçerek ve karelerden (ızgaralardan) biri içinde çizgilenerek bir ana izolat plakası oluşturulmuştur. Morfolojik olarak benzer üç koloni ayrı ızgaralarda çizgilenmiştir. Her ızgarada fare gözü çubuğu plakasından seçilen aynı koloninin üç çizgisi vardır. Plakalarda büyüme ortaya çıktıktan sonra, izole seçici kaplama ve katalaz testi ile karakterize edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: MALDI-TOF MS sonuçları örneği.
Her izole bir gecede TSA'da kültürlendi, MALDI-TOF MS slaydına uygulandı ve MALDI-TOF MS çözeltisi ile kaplandı, hava kurudu ve yinelenen olarak tespit edildi. Streptococcus acidominimus (A) ve Aerococcus viridans (B) sonuçları 99.9 güven değeri ile pozitif olarak tanımlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Cinsiyet taraflı kommenal konjonktival büyüme.
Yaş uyumlu C57BL6/N fareler göreceli kommensal çeşitlilik için karşılaştırıldı. Gözler tarandı ve kommensal organizmalar tanımlandı. En baskın tür Streptococcus acidominimusErkekte dişi farelerden önemli ölçüde daha fazlaydı (2 yönlü ANOVA, s<0.0001). Aerococcus viridans ve E.coliolmak üzere 5 farklı CNS izolatları tespit edildi. CNS izolatlarının bazıları tüm farelerde bulunmazken, Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans, CNS isolate 1 ve E. coli farklı bolluklara sahip tüm farelerde bulundu. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oküler yüzeyin paucibacterial durumu nedeniyle, birçok laboratuvar oküler commensals7,20izole etmektezorlandı,bu da büyüme, düşük bolluk ve düşük çeşitlilik ile düşük numune sayısına neden oldu8. Bu yöntem, bir zenginleştirme adımının yanı sıra MALDI-TOF MS tarafından yeniden tasarlanmış bir göz çubuğu ve tanımlaması eklenerek standart kültür uygulamaları4,21'i önemli ölçüde geliştirir. Zenginleştirme adımı, bakteri yükünü yükselterek düşük geri kazanabilme olanağini ele alıyor. Geri kazanılabilir bakterilerde 100 CFO'dan vahşi tip erkek fareler için göz bezi başına 2.500 CFO'nun göreceli bolluğuna kadar önemli artış, besin bakımından zengin medyadaki inkübasyonun canlı ancak ekilebilir olmayan bakterileri yeniden canladığını göstermektedir22,23, böylece uykuda olan mikropların iyileşmesine izin verir. Son kültür tabanlı zenginleştirme adımları, konak ve mikrobiyal ekspresyon imzaları24 , 25,26arasında ayrımcılığa olanak sağlamak ve nadir cinsleri güçlendirmek için mikrobiyota moleküler dizileme çalışmalarına dahil edilmiştir. Protokol zenginleştirme adımımız, oküler mikrobiyom çalışmalarına uygulanan ilk adımdır ve canlı mikropları seçmek, kurtarılabilir kıt İzole sayısını genişletmek ve belki de uygulanabilir ancak kült olmayan kommensalları canlandırmak için zenginleştirmeden yararlanır. Ayrıca, bizim ev yapımı göz bez, konjonktivanın hedefli sürünmesine izin verir, küçük boyutu ve ince sivri konik şekli nedeniyle çevredeki cilt / kürk kontaminasyonunu azaltır. Swab kaplama kalınlığı ve malzeme seçimi önemlidir21. Göz küreği yapılan bu laboratuvar, svap malzemesi içinde sürünmüş kommensal tuzakları önleyen ve sitotoksik olabilen kalsiyum aljinat göz sürüntülerine tercih edilen ince bir toksik olmayan pamuk vuruşu tabakası ile kaplanmıştır27. Boyuna testler yöntemimizin tekrarlanabilir olduğunu göstermektedir; Streptococcus spp., Coagulase Negative Staphylococcus (CNS) ve Corynebacterium sppdahil olmak üzere göz sürüntülerinden kurtarılan baskın bakterilerle. Bu sonuçlar, kültür tabanlı veya görüntüleme tabanlı yöntemlerle tespit edilen baskın fakülte anaerobik oküler cins7,9,20 için yayınlanan bulgularla aynı fikirdedir. Bu yöntem, konjonktivada Escherichia coli ve Pseudomonas sppdahil olmak üzere daha geniş bir izolat spektrumu buldu. Ayrıca, MALDI-TOF MS tarafından tanımlanması, viridans streptokok grubu ve Aerococci spp gibi cins ve türler arasında daha iyi ayrımcılık sağlar. 19,28.
Sonucu en üst düzeye çıkarmada üç adım kritik öneme sahiptir: göz bezi üretimi, göz bezi tekniği ve göz çubuğu plakasından benzersiz izole seçimi. Yukarıda tartışıldığı gibi, çok ince bir düz pamuk tabakası, öküler yüzeyden virgüllerin ilk yakalanması ve daha sonra zenginleştirme ortamına salınmış olmaları için önemlidir. Kalın veya topaklanmış sürüntüler, kirleticilerin seçimine ve çubuk ucu içindeki izolatların korunmasına yol açabilir. İkincisi, çevredeki yüzeylerden kontaminasyonu en aza indirmek için göz küresinin sürünürken sürekli depresyonu gereklidir. İdeal sürünme tekniği, çubuğun medial alt konjonktival fornix'e normal (90 derece) yerleştirilmesini ve yavaş sürekli hareketle birlikte sabit sürünme basıncını içerir. Son olarak, göz bezi plakası, yeni görünen izolatlar veya temsili mikrobiyomu tam olarak yakalamak için farklı bir hızda büyüyenler için seçmek için günlük olarak izlenmelidir.
Sonuçların net bir şekilde anlaşılması veya protokolün değiştirilmesi ile ele alınabilecek birkaç protokol sınırlaması vardır. Sonuçlar, oküler kommenal topluluğu tanımlamak amacıyla gerçek konjonktival bakteri yükünün değil, göreceli uygulanabilir kommensal bolluğun bir ölçüsüdür. Göreceli bolluk ve çeşitlilik, bakteriyel keratitte karşılaştırmalı amaçlar için çalışmalarımızda ve ayrıca nakavt ve yabani tip farelerde doğuştan gelen bağışıklık tepkisini araştırmak için kullanılmıştır12. Buna ek olarak, MALDI-TOF MS tarafından tanımlama önemli bir veritabanına bağlıdır28Bilinmeyen yalıtıcı spektrum profilleri için "kimlik yok" sonucunu sunar ve geçerli bir veritabanı kullanmanın önemini vurgular. Son olarak, bu protokol sadece aerobik ve öğretim üyesi anaerobik bakterileri tespit eder, ancak çerçevesi uyarlanabilir ve zenginleştirme ortamının, plaka büyüme koşullarının ve seçim ortamının değiştirilmesiyle oküler mikrobiyal alanın tanımlanmasına yardımcı olmak için inşa edilebilir. Ana plaka ve zenginleştirme büyüme koşullarını anaerobik olarak değiştirerek, daha sonra yaygın olarak izole edilmiş başka bir oküler kommensal, Propionibacterium spp. veya diğer anaerobes, tespit edilebilir; Ancak, elimizde neredeyse hiç anaerobik büyüme görmedik.
Belki de bu çerçeve derin DNA dizileme teknikleri ile birlikte kullanılabilir. DNA dizilimi yoluyla mikrop tanımlamada önemli bir engel canlılığın değerlendirilememesidir10. Bu protokol, zenginleştirme ortamlarını ve kaplama koşullarını bir adayın izole ettiği (DNA dizilimi ile tanımlanan) tercih edilen büyüme kriterleriyle eşleşecek şekilde değiştirerek ortogonal bir yöntem sağlayabilir. Bu, uygulanabilir ancak sürdürülemez bakterilerden veya mevcut ancak düşük bolluk türlerinden övgüleri yakalamak için değerli bir kültür tabanlı yaklaşımla sonuçlanabilir.
Uygulanabilir oküler kommenal topluluğun tanımı, oküler kommensal ifade profilini incelemek için gereklidir. Geniş araştırmalar, kısa zincirli yağ asitlerinin ve mikrobiyal ürünlerin oküler immün yanıt 3,29,30,31,32,33'ü modüle ettiğini ve eylemlerinin lokal olarak gerçekleştiğini göstermektedir. Bu sadece distal üretim değil, aynı zamanda bu faktörlerin yerel üretiminin de önemli olduğunu göstermektedir. Ayrıca, kuru göz hastalığı ve diyabet gibi hastalık durumları oküler yüzey mikrobiyom 4,6,33,34'ü değiştirir. Bu, sağlık ve hastalıkta uygulanabilir oküler mikrobiyomun daha iyi tanımlanabilmesi için DNA tabanlı dizilemenin yanı sıra kültür tabanlı yaklaşımlar arasında köprü kuran bir yönteme duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Açıklayamak için çıkar çatışması yok.
Acknowledgments
P30 DK034854'ten sağlanan finansman, Massachusetts Host-Microbiome Center'daki VY, LB ve çalışmaları ve NIH/NEI R01 EY022054'ten gelen fon MG'yi destekledi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
References
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
- Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
- Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
- Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
- Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
- Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
- Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
- Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
- Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547 (2020).
- Johnson, T. R., Case, C. L. Laboratory Experiments in Microbiology. , Pearson Benjamin Cummings Pubs. San Francisco, CA. (2010).
- Reiner, K.
- UK SMI. Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , Gov.UK. (2014).
- Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
- Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus--a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
- Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
- Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
- Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117 (2018).
- Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880 (2017).
- Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
- Epstein, S. S.
- Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
- Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56 (2019).
- Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831 (2019).
- Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
- Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
- Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855 (2016).
- Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
- Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
- Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
- Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11 (2020).
- Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
