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Biochemistry

Análisis unicelular de alelos transcripcionalmente activos por FISH de molécula única

Published: September 20, 2020 doi: 10.3791/61680
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Cancer Research, Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University, 4Department of Pharmacology and Chemical Biology, Baylor College of Medicine

Summary

La hibridación in situ de fluorescencia de ARN de molécula única (smFISH) es un método para cuantificar con precisión los niveles y la localización de ARN específicos a nivel de una sola célula. Aquí, informamos nuestros protocolos de laboratorio validados para el procesamiento de bancos húmedos, imágenes y análisis de imágenes para la cuantificación de células individuales de ARN específicos.

Abstract

La transcripción de genes es un proceso esencial en biología celular, y permite a las células interpretar y responder a señales internas y externas. Los métodos tradicionales de población a granel (Northern blot, PCR y RNAseq) que miden los niveles de ARNm carecen de la capacidad de proporcionar información sobre la variación de célula a célula en las respuestas. La visualización y cuantificación precisa de una sola célula y alélica es posible a través de la hibridación in situ de fluorescencia de ARN de molécula única (smFISH). El ARN-FISH se realiza mediante la hibridación de ARN diana con sondas de oligonucleótidos etiquetadas. Estos se pueden obtener imágenes en modalidades de rendimiento medio / alto y, a través de canalizaciones de análisis de imágenes, proporcionan datos cuantitativos sobre ARN maduros y nacientes, todo a nivel de una sola celda. Los pasos de fijación, permeabilización, hibridación e imagen se han optimizado en el laboratorio durante muchos años utilizando el sistema modelo descrito en este documento, lo que resulta en un análisis exitoso y robusto de una sola célula del etiquetado smFISH. El objetivo principal con la preparación y el procesamiento de muestras es producir imágenes de alta calidad caracterizadas por una alta relación señal-ruido para reducir los falsos positivos y proporcionar datos que sean más precisos. Aquí, presentamos un protocolo que describe la canalización desde la preparación de muestras hasta el análisis de datos junto con sugerencias y pasos de optimización para adaptarse a muestras específicas.

Introduction

La transcripción y traducción de genes son los dos principales procesos implicados en el dogma central de la biología, pasando de la secuencia de ADN al ARN y a la proteína1. En este estudio, nos centramos en la producción de ARN mensajero (ARNm) durante la transcripción. La molécula de ARN naciente incluye tanto intrones no codificantes como exones codificantes. Los intrones se empalman co-transcripcionalmente antes de que el ARNm se mueva hacia el citoplasma para su traducción en los ribosomas2,3.

Tradicionalmente, la medición de ARNm se realiza en poblaciones masivas de células (cientos a millones) con ensayos clásicos como RT-qPCR o Northern blotting. Si bien son muy poderosos, estos métodos son limitados, ya que no proporcionan información sobre la variación de célula a célula (heterogeneidad fenotípica), la identificación del número de alelos transcripcionalmente activos y, quizás lo más importante, carecen de información espacial. Más recientemente, las tecnologías de todo el genoma que permiten la secuenciación de ARN de una sola célula (RNAseq) comenzaron a cerrar la brecha entre los métodos de imagen y la secuenciación4. Sin embargo, RNAseq sufre de eficiencias de detección relativamente bajas y los pasos de procesamiento resultan en una pérdida completa de información espacial5. Aunque RNAseq de una sola célula puede proporcionar información sobre la heterogeneidad fenotípica entre una población de células isogénicas, la hibridación in situ de fluorescencia de ARN (RNA-FISH) puede facilitar una exploración más completa de la expresión génica objetivo a nivel espacial, y sobre una base de alelo por alelo6,7.

RNA FISH es una técnica que permite la detección y localización de moléculas de ARN diana en células fijas. A diferencia de los métodos anteriores y laboriosos, el RNA-FISH actual de última generación utiliza sondas de ácido nucleico disponibles comercialmente que son complementarias a las secuencias de ARN objetivo, y estas sondas se hibridan a sus objetivos mediante el emparejamiento de bases Watson-Crick8. Las primeras técnicas de hibridación in situ implicaron un protocolo similar establecido por Gall y Pardue en 1969, ya que una muestra se procesó con sondas de ácido nucleico que se hibridaron específicamente a un ARN objetivo9. Originalmente el ensayo se realizaba mediante detección radiactiva o colorimétrica; sin embargo, en la década de 1980, el desarrollo de protocolos de hibridación fluorescente in situ (FISH) para ADN FISH y más tarde ARN FISH abrió la ruta hacia una detección más sensible, y el potencial de multiplexación10,11.

Otros desarrollos en RNA FISH han llevado a la capacidad de detectar y cuantificar moléculas individuales de ARN (smFISH)12,13. La detección directa es un método en el que las sondas mismas se etiquetan con fluoróforos. Un desafío con smFISH es que existe la necesidad de suficientes sondas de hibridación / objetivo para facilitar la detección de señales fluorescentes como puntos distintos y limitados por difracción. Para abordar este problema, se puede utilizar un conjunto de sondas de oligonucleótidos cortos de ADN monocatenario complementarios a varias regiones del ARN objetivo8,12,14. La unión de múltiples sondas aumenta la densidad del fluoróforo local, haciendo que el ARN sea visible como un punto distinto de alta intensidad mediante microscopía de fluorescencia. Este método es ventajoso porque la unión fuera del objetivo de los oligonucleótidos en el conjunto de sondas puede distinguirse de la verdadera señal puntual de ARN mediante el análisis cuantitativo del tamaño y la intensidad del punto para diferenciar entre la señal verdadera y la unión espuria a oligonucleótidos, facilitando así un análisis más preciso al reducir los falsos positivos12.

Los métodos alternativos para detectar arNm son el método clásico de traducción de nick basado en clones de BAC y el sistema de ADN ramificado desarrollado más recientemente. En el método de traducción de nick clonado por BAC, el ADN a etiquetar se corta enzimáticamente y se agrega un nuevo nucleótido al extremo 3' expuesto. La actividad de la ADN polimerasa I añade un nucleótido etiquetado dando como resultado la sonda deseada15,16. La técnica de ADN ramificado involucra sondas de oligonucleótidos que se hibridan en pares con objetivos de ARN y estas sondas se amplifican utilizando múltiples moléculas de amplificación de señal. Este método puede mejorar significativamente la relación señal-ruido, pero la amplificación puede sesgar la cuantificación precisa ya que los puntos fluorescentes pueden ser muy diferentes en tamaño e intensidad17.

Como sistema modelo para este protocolo, que se emplea completamente como parte de la participación del Programa de Investigación Superfund de NIEHS para cuantificar los efectos de los productos químicos disruptores endocrinos en Galveston Bay / Houston Ship Channel, utilizamos la línea celular de cáncer de mama MCF-7 con receptor de estrógeno (ER) positivo tratada durante la noche con un agonista de ER, 17β-estradiol (E2)7,18,19. E2 regula muchos genes diana ER, incluyendo el gen prototípico ER-diana, GREB17,20,21,22. El protocolo smFISH descrito aquí utiliza un conjunto de dos conjuntos de sondas separados espectralmente dirigidos a GREB1; uno que se hibrida a exones y el otro a intrones, permitiendo la medición de ARN7maduro y naciente. Luego utilizamos microscopía de epifluorescencia junto con la deconvolución para obtener imágenes de muestras etiquetadas con smFISH, y luego aplicamos rutinas de análisis de imágenes para cuantificar el número de alelos activos y ARN maduros por célula.

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Protocol

Para garantizar resultados óptimos, la parte de laboratorio húmedo de este protocolo requiere precauciones estándar sin RNasa en todos los pasos. Por ejemplo, se recomienda encarecidamente el uso de puntas de pipeta filtradas, vasos estériles y tampones libres de RNasa. También se sugiere el uso de inhibidores de la RNasa como los complejos de ribonucleósidos de vanacil, especialmente para los ARN diana de baja abundancia.

1. Cultivo celular y configuración experimental

  1. Mantener las células de cáncer de mama MCF-7 adherentes (ATCC #HTB-22) en un matraz de cultivo de tejido T75 con fenol-rojo libre (solo requerido para experimentos de estimulación hormonal) Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, 2 mM de L-glutamina, 1 nM de piruvato de sodio, 50 UI/ml de penicilina y 50 μg/ml de estreptomicina.
  2. Coloque las fundas redondas recubiertas de poli-D-lisina grabadas con ácido (de 0,16 a 0,19 mm de espesor, 12 mm de diámetro) en una placa de cultivo de tejido multipanúculo de 24 pozos.
    NOTA: Utilice 1 M HCl para grabar con ácido los cobiertas y recubrir con una solución de 1 mg/ml de poli-D-lisina reconstituida en PBS estéril (solución salina tamponada con fosfato sin Ca++ y Mg++)de acuerdo con los protocolos estándar.
  3. Retire los medios de crecimiento de las células y lave una vez con 5 ml de PBS estéril (solución salina tamponada con fosfato sin Ca++ y Mg++). Separe las células MCF-7 utilizando 2-3 ml de solución de tripsina-EDTA al 0,25%. Una vez que las células se desprenden, neutralice la solución de tripsina-EDTA al 0,25% con un volumen igual de medios de crecimiento.
  4. Transfiera las células en la suspensión del medio a un tubo cónico de 15 ml, gire hacia abajo a 391 x g durante 1 minuto para eliminar las células. Retire cuidadosamente los medios del tubo cónico sin perturbar el gránulo celular y vuelva a sususpendir las células en una cantidad adecuada de medios de tratamiento.
    NOTA: El medio de tratamiento es DMEM libre de fenol-rojo suplementado con 5% de carbón-dextrano despojado y dializado FBS, 2 mM L-glutamina, 1 nM piruvato de sodio, 50 UI/ml de penicilina y 50 μg/ml de estreptomicina. Este medio es esencial para los experimentos de estimulación de la hormona esteroide, ya que el componente sérico se agota en gran medida de esteroides al eliminar el carbón de los medios y ha reducido los factores de crecimiento a través de la diálisis.
  5. Sepe las células en cubiertas en la placa multipano de 24 a 60,000 a 70,000 células por pozo en 500 μL de medios de tratamiento. Para este experimento, la confluencia celular debe ser de alrededor del 70-80% al inicio del tratamiento. Optimice la densidad de siembra celular según el tipo de célula, la tasa de crecimiento y la duración del experimento para evitar la confluencia, lo que complica el análisis de imágenes.
    NOTA: Para obtener las mejores imágenes y análisis de imágenes, evite la aglomeración celular. Para este propósito, mezcle la alícuota de las células a fondo mediante pipeteo (o brevemente vórtice) de las células varias veces antes de dispensar en los pozos. Antes de colocar las células chapadas de nuevo en la incubadora, dejar que las células se asienten en la campana de cultivo de tejidos durante unos 20 minutos ayuda a reducir la aglomeración celular.
  6. Incubar las células durante al menos dos días antes de los tratamientos para garantizar la sincronización del ciclo celular y la reducción de fondo debido a cualquier molécula de señalización que permanezca en el suero despojado / dializada de los medios de crecimiento.
  7. Después de una incubación de 48 horas en medios de tratamiento, trate las células MCF-7 con 10 nM 17β-estradiol (E2) y control de vehículos (DMSO), diluidas en medios de tratamiento durante 24 horas. Este tratamiento utiliza una dosis saturada de E2 para inducir una respuesta máxima. Realizar experimentos de curso de tiempo y dosis-respuesta para determinar empíricamente las condiciones para diferentes genes objetivo, modelos celulares y tipos de tratamientos. Como ejemplo, véase nuestra reciente publicación7.

2. Preparación de tampones

  1. Para preparar el tampón de fijación, diluya el formaldehído monomérico purificado (vendido por los proveedores de microscopía electrónica como paraformaldehído al 16%) al 4% en PBS estéril Ca++/ Mg++ (solución salina tamponada con fosfato más Ca++ y Mg++). Agregue complejos de ribonucleósidos de vanacil (VRC) al tampón de fijación para una concentración final de 2 mM para retrasar la degradación del ARN.
    1. Calcule la cantidad total de tampón de fijación en función de la necesidad de 300-500 μL de fijador por pozo de una placa multipano de 24. Guarde el formaldehído al 4% en hielo hasta que sea necesario en el paso de fijación.
      NOTA: Haga que el búfer de fijación sea nuevo para cada experimento.
      PRECAUCIÓN: El formaldehído es un teratógeno que se absorbe a través de la piel. Use este producto químico en una campana extractora de humos junto con el EPP apropiado de acuerdo con sus regulaciones institucionales.
  2. Para el paso de permeabilización, prepare etanol al 70% en agua libre de nucleasas. Una opción alternativa es 0.5% Triton-X100 en PBS Estéril Ca++/ Mg++ más 2 mM de VRC. Calcule la cantidad total de tampón de permeabilización necesario utilizando 500 μL de tampón por pozo.
  3. Para preparar 9 ml del tampón de hibridación, agregue 2 ml de caldo de sulfato de dextrano al 50% y 1 ml de tampón 20x SSC (citrato de sodio salino) a 6 ml de agua libre de nucleasa. Vortex para mezclar completamente el búfer de hibridación. Este búfer se puede almacenar a 4 °C durante un hasta una semana.
  4. Hay cinco pasos de lavado separados que requieren 2 tampones de citrato de sodio salino (SSC). Calcule el volumen final de 2x búfer SSC necesario anticipando 500 μL de tampón por cubierta por paso de lavado. Diluya la cantidad requerida de tampón SSC 20x stock en agua libre de nucleasas. Se pueden agregar 2 mM VRC a los pasos de lavado como precaución adicional. Este tampón se puede almacenar a temperatura ambiente durante la duración de los pasos de procesamiento.

3. Fijación para ARN FISH

  1. Después del tratamiento, retire el medio de los pozos y lave una vez con PBS Ca++/ Mg++estéril y frío. Si se utiliza un modelo de célula de baja adherencia, no utilice un vacío para aspirar líquido; use pipeteo manual para quitar cuidadosamente el medio del costado del pozo y omita el paso de lavado inicial. Añadir un tampón de fijación de 500 μL durante 30 minutos sobre hielo.
    NOTA: Si la muestra es propensa a la degradación del ARN, use PBS estéril con 2 mM VRC para el paso de lavado en este punto.
  2. Retire el fijador y deséchelo en residuos químicos de acuerdo con las regulaciones institucionales. Lave las células dos veces con PBS estéril frío Ca++/ Mg++ durante 3 minutos.
  3. Retire el PBS y agregue 500 μL de etanol al 70% a cada pozo. Selle la placa de 24 pozos con una película de plástico de parafina. Colocar en un rotador a 4 °C durante un mínimo de cuatro horas. Lo mejor es dejar las muestras en etanol al 70% durante la noche. El protocolo se puede pausar en este punto y las muestras se pueden almacenar hasta por una semana en etanol al 70%.
    NOTA: Se puede utilizar como alternativa un Triton-X100 al 0,5% en PBS con solución VRC de 2 mM. Incubar las muestras en 500 μL de este tampón de permeabilización durante 20 minutos a temperatura ambiente en un rotador. Si se utiliza este búfer de permeabilización, el protocolo no se puede pausar en este punto y debe continuar a través del paso de hibridación.

4. Hibridación para ARN FISH

  1. Retire el tampón de permeabilización y lave una vez en 500 μL de tampón 2x SSC más formamida al 10% durante 5 minutos a temperatura ambiente en un rotador.
  2. Prepare el búfer de hibridación completo. Calcule aproximadamente 30 μL de tampón de hibridación completo por cubierta. Agregue formamida al búfer de hibridación para alcanzar el porcentaje necesario. Por ejemplo, si se necesitan 500 μL de tampón de hibridación completo, entonces consistiría en 450 μL del tampón de hibridación previamente hecho más 50 μL de formamida de grado molecular para alcanzar el 10% vol / vol. Vórtice brevemente para mezclar.
    PRECAUCIÓN: La formamida es un teratógeno que se absorbe a través de la piel. Use este producto químico en una campana de humos junto con el EPP apropiado de acuerdo con las regulaciones institucionales.
  3. Diluya las sondas de intrón GREB1 (etiquetado con Atto 647N) y exón GREB1 (etiquetado con Quasar 570) 1:300 en tampón de hibridación. Mezclar mediante pipeteo. Proteja este búfer de la luz y úselo inmediatamente.
    NOTA: Las sondas fueron diseñadas y fabricadas como se detalla en Stossi et al7. Las sondas generalmente se proporcionan como un grupo de sondas de oligonucleótidos secos que deben reconstituirse en un tampón TE libre de RNAse de acuerdo con el protocolo del fabricante14. La solución de stock para estas sondas fue de 12,5 μM, por lo tanto; la concentración de trabajo de las sondas es de 42 nM.
  4. Prepare una cámara humidificadora para el paso de hibridación durante la noche. Coloca un trozo de película plástica de parafina, sin exponer de lado hacia arriba, en una placa de Petri de vidrio limpiada con un descontaminante superficial para eliminar las RNasas. Satura dos toallas de papel con agua estéril y colóquelas a lo largo de los bordes de la placa de Petri para proporcionar humedad, ya que el secado puede destruir el etiquetado específico.
  5. Alícuota las sondas salpicando 30 μL de sondas en tampón de hibridación en el lado limpio de la película de plástico de parafina. Distribuya las alícuotas de las sondas para que las cubiertas no entren en contacto entre sí.
  6. Usando forzapas esterilizadas, voltee suavemente la celda de la cubierta hacia abajo sobre las sondas en la placa de Petri de vidrio. Evite las burbujas de aire y no aplique presión a las cubiertas.
    NOTA: No deseche la placa de cultivo de tejidos con el tampón 2x SSC, ya que será necesario para los pasos posteriores.
  7. Selle la placa de Petri de vidrio con una película de plástico de parafina y cubra la placa con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz a los fluoróforos. Incubar durante la noche, hasta 16 horas, a 37 °C en una superficie plana no giratoria. El tiempo de incubación se puede variar empíricamente, sin embargo, se recomienda un mínimo de 4 horas.
    NOTA: Los coverslips son susceptibles de deslizarse cuando se incuban en el tampón de hibridación, lo que puede provocar manchas secas en el coverslip y dañar la muestra.

5. Preparación de muestras para la obtención de imágenes

  1. Al día siguiente, retire las fundas de la cámara humidificadora con fuerceps y devuélvalas a la placa de 24 pomos con el lado de la celda hacia arriba. Agregue 500 μL de tampón SSC fresco 2x más formamida al 10% para eliminar el exceso de sonda y la hibridación no específica.
    NOTA: Proteja las muestras de la luz a partir de este momento.
  2. Lave las células dos veces con 500 μL de tampón 2x SSC más formamida al 10% durante 15 minutos cada una a 37 ° C en un rotador calentado.
  3. Contratinúe ADN con DAPI a 1 μg/mL en 2 tampones SSC durante 10 minutos a temperatura ambiente en un rotador.
  4. Lave una vez con 2 tampones SSC durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  5. Monte las cubiertas en portaobjetos de vidrio utilizando medios de montaje no endurecedores después de eliminar cualquier exceso de 2 tampones SSC con una toalla de papel y un lavado rápido en agua sin nucleasas para eliminar el exceso de sales. Finalmente, selle las fundas con esmalte de uñas transparente.

6. Microscopía de alta resolución y procesamiento de imágenes

  1. Imagine las muestras en un microscopio de epifluorescencia de campo amplio utilizando un objetivo de aceite de 60x o 100x y una cámara sCMOS. Vea la tabla de materiales para el microscopio específico y el objetivo utilizado para este experimento.
    1. Imágenes completas tan pronto como las muestras se procesen por completo para evitar la degradación de la señal dependiente del tiempo.
      NOTA: En este experimento se utiliza aceite de inmersión con un índice de refracción (RI) de 1.516. Se deben realizar pruebas empíricas para hacer coincidir el RI de aceite con muestras específicas, ya que los desajustes de RI darán como resultado aberraciones de la función de propagación de puntos que afectarán la deconvolución de la imagen.
  2. Las imágenes se capturan con un tamaño de píxel lateral de 0,10827 μm.
  3. Optimice la cantidad de iluminación de la fuente de luz (es decir, el porcentaje de transmitancia) y los tiempos de exposición para cada canal (filtros DAPI, TRITC, CY5 en este ejemplo en particular) utilizando la muestra que se espera que tenga la intensidad más alta (es decir, controles positivos). En este experimento, se espera que la muestra tratada con E2 tenga una mayor intensidad para ambos conjuntos de sondas GREB1. En general, el porcentaje de transmitancia para las sondas de intrón y exón GREB1 es del 50 al 100%, y los tiempos de exposición oscilan entre 0,25 y 0,60 segundos.
  4. Además, adquiera imágenes en condiciones que eviten el fotoblanqueo y /o cualquier saturación de píxeles de la cámara. En nuestra experiencia, debería haber una diferencia mínima de ~ diez veces entre el fondo y la intensidad de la señal. La saturación de pocos píxeles / campo puede ocurrir debido a señales no específicas en la muestra (es decir, suciedad en el eslipto, agregados de sonda fuera de la celda), lo que puede ser aceptable, pero solo si las regiones saturadas no se incluyen en la cuantificación.
  5. Para establecer la adquisición de una pila z, concéntrese en la muestra en el canal DAPI. Seleccione la parte superior e inferior de la pila z a las distancias donde los núcleos teñidos de DAPI se deses foco. El tamaño de paso de la pila z que utilizamos es de 0,25 μm por rebanada y la pila z total debe abarcar toda la celda (aproximadamente 10 μm en celdas MCF-7). Sin embargo, el tamaño del paso z-stack cambiará de acuerdo con el objetivo utilizado y debe seguir el criterio de muestreo de Nyquist.
    NOTA: Los intrones generalmente están presentes solo en el núcleo; sin embargo, los exones están tanto en el núcleo como en el citoplasma. Por lo tanto, establecer la pila z como se describió anteriormente capturará la mayor parte del etiquetado de intrones y exones, ya que la pila z abarca toda la celda.
  6. Por lo general, imagine un mínimo de 200 células para el análisis cuantitativo en experimentos preliminares para capturar una instantánea de la magnitud de la respuesta y la variación entre las células.
  7. Algunas células fotografiadas se excluyen del análisis final (es decir, la tasa de abandono) porque serán filtradas por la tubería de análisis (es decir, células que tocan el borde de la imagen, células apoptóticas / mitóticas).
    NOTA: Al seleccionar áreas de imagen, hay algunos factores a tener en cuenta. Elija áreas con células distribuidas uniformemente y no superpuestas según lo definido por la fluorescencia nuclear etiquetada con DAPI. Además, intente seleccionar áreas que tengan el menor número de núcleos a lo largo de los bordes del área de la imagen para evitar contar las celdas parciales. Las imágenes automatizadas e imparciales siempre se prefieren para los experimentos que requieren análisis estadístico.
  8. Después de la adquisición, desconvolucione las imágenes utilizando un algoritmo restaurador agresivo utilizando 10 ciclos (es decir, el número de iteraciones). Genere proyecciones de intensidad máxima para el análisis de imágenes (omita este paso si se requiere un análisis 3D específico). Guarde todas las imágenes de proyección de acuerdo con la profundidad de bits de la cámara utilizada; en nuestro caso se guardaron imágenes TIFF en escala de grises de 16 bits. Las imágenes RGB tienen una profundidad de bits reducida, lo que resulta en una pérdida de información; por lo tanto, las imágenes RGB no son adecuadas para el análisis de imágenes.

7. Análisis de imágenes

  1. Lea las instrucciones y descargue el cuaderno jupyter de github (https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis).
  2. Instale python anaconda distribution (https://www.anaconda.com/distribution/) versión 3.6 o superior.
  3. Abra el símbolo del sistema anaconda y escriba en el comando de instalación Instalar SIMPLE ITK para anaconda (https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk).
  4. Abra anaconda navigator e inicie jupyter notebook. Abrirá un navegador web que muestra directorios y archivos. Navegue a través de las estructuras de directorios para llegar al directorio que contiene el cuaderno jupyter descargado de github.
  5. Abra el bloc de notas y ejecute cada celda presionando Mayús e Intro simultáneamente.
  6. Siga los detalles de cada función y paso proporcionados en el bloc de notas. Para un conjunto diferente de imágenes, es posible que haya que cambiar algunos valores de parámetros.
    NOTA: En resumen, los núcleos se segmentan desde el canal DAPI utilizando umbrales locales con un tamaño de bloque de 251 píxeles, se rellenaron agujeros y se eliminaron objetos menores de 100 píxeles. Los núcleos que tocaban se dividieron utilizando un algoritmo de cuenca. La máscara nuclear se dilató en 100 píxeles y la cuenca se utilizó para separar los objetos que tocan el uso de núcleos como cuencas. Para identificar el ARN en estado estacionario (exones), se utilizó el umbral de Otsu; para los alelos activos transcripcionales (intrón), primero se aplicó un desenfoque gaussiano (sigma=1) y luego se utilizó el umbral de entropía máxima.

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Representative Results

Para analizar las respuestas hormonales a través de smFISH, como ejemplo, elegimos el modelo de receptor de estrógeno (ER) utilizado en ensayos de alto rendimiento para determinar la presencia de sustancias químicas disruptoras endocrinas en desastres ambientales en el contexto de la participación en el Programa de Investigación superfondo del NIEHS7. En este experimento, las células adherentes de cáncer de mama MCF-7 fueron tratadas con el agonista ER 17β-estradiol (E2, 10 nM) o vehículo (DMSO) durante 24 horas. Los conjuntos de sondas separados espectralmente contra secuencias grebónicas intrónicas (Atto 647N, rojo en la Figura 1)y exónicas (Quasar 570, verde en la Figura 1)permiten la visualización y cuantificación simultáneas del ARNm naciente y maduro; es importante destacar que se marca el número de alelos transcripcionalmente activos en cada célula que se ha demostrado que forman parte del curso de tiempo de respuesta al estrógeno7.

El protocolo completado genera proyecciones de intensidad máxima (TIFF) de 16 bits para cada región de interés. La segmentación nuclear se realiza utilizando núcleos teñidos con DAPI, y los límites celulares se estiman expandiendo la máscara nuclear. Las señales de intrón y exón GREB1 se segmentan y se asignan a cada célula individual. La Figura 1 muestra imágenes descontornadas proyectadas y su segmentación para una muestra tratada con DMSO y E2.

Figure 1
Figura 1: imágenes de muestra smFISH y salida de segmentación de imágenes. (A) Las células MCF-7, tratadas con DMSO (panel izquierdo) y 17β-estradiol (E2, panel derecho) durante 24 horas, se hibridaron para dirigirse a los intrones GREB1 (Atto 647N, ARNm naciente, rojo) y a los exones GREB1 (Quasar 570, ARNm maduro, verde). Las imágenes se adquieren a 60x/1.42NA, se descontornan y se proyectan a máxima intensidad. (B) Las imágenes de (A) se procesan a través de la tubería de análisis de imágenes descrita que define la máscara nuclear, estima la máscara celular, identifica el ARNm maduro individual y los alelos transcripcionalmente activos. Las manchas de intrón y exón GREB1 se asignan a células individuales. Barra de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Siguiendo la canalización del análisis de imágenes, obtuvimos el número de células que no tocaban los límites de la imagen en función de la imagen de diez campos aleatorios por tratamiento, y se determinó que había 150 células tratadas con DMSO y 149 células tratadas con E2. Dado que las células aneuploides MCF-7 tienen cuatro copias del gen GREB1, y con sondas de intrón y exón, las señales superpuestas determinarán el número de alelos y células que participan en la transcripción activa24. Determinamos la fracción de la población celular para cada tratamiento que tenía de cero a cuatro alelos GREB1 activos contando las manchas superpuestas de intrones y exones. Al igual que en nuestro estudio anterior, definimos las células transcripcionalmente activas como aquellas que mostraban dos o más alelos GREB1 activos7. Como se ve en la Figura 2A-2B,las células tratadas con E2 tienen una fracción 4 veces mayor de células que muestran dos o más alelos GREB1 activos en comparación con las células tratadas con vehículos7.

Figure 2
Figura 2: Cuantificación de GREB1 inducido por E2 a nivel de célula por célula y alelo por alelo. (A) La distribución del número de alelos GREB1 activos por célula comparando las células tratadas con vehículo (barras azules) y E2 (barras rojas). (B) Fracción de células que se consideran transcripcionalmente activas, definidas aquí como células con dos o más alelos GREB1 activos7. (C) Distribución del número de ARNm maduros GREB1 por célula para cada tratamiento. (D) Número medio de ARN/célula madura GREB1 representado como valor medio para la población. Las barras de error indican una desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los intrones se empalzan a partir del ARNm naciente para producir ARNm maduro que consiste solo en secuencias de exones. Por lo tanto, también es posible contar el número de ARNm maduros por célula cuantificando el número de manchas verdes. La Figura 2C-2D muestra el cambio en la distribución del ARNm/célula GREB1 maduro y el cambio de pliegue agregado (20x) en la población celular después del tratamiento con E2.

De acuerdo con las observaciones originales durante 24 horas de tratamiento con E2, no todas las células responden de la misma manera (es decir, las respuestas son heterogéneas en la población de MCF-7)7. Por ejemplo, el número de ARNm GREB1 maduros por célula muestra un amplio rango de expresión (~15 veces) incluso en las células tratadas con E2 de 24 horas; Los métodos de cuantificación de ARN a granel no logran discernir los amplios niveles de transcripción en las células mediante el promedio estadístico. Esto enfatiza el poder de smFISH para explorar respuestas heterogéneas de célula a célula y alelo por alelo en una población de células isogénicas.

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Discussion

La metodología smFISH descrita se basa en protocolos previamente publicados7,12,14. En este protocolo, explicamos los pasos críticos que se optimizaron desde el laboratorio húmedo (incluida la densidad de siembra, el tiempo de fijación, la permeabilización y la concentración de la sonda), hasta las imágenes y el análisis de imágenes, proporcionando una tubería experimental completa para los laboratorios interesados en realizar análisis unicelulares de transcripción de genes.

Para facilitar el análisis de una sola célula, es importante que las células sean subconfluentes y no se superpongan para que los bordes celulares se estimen sin la necesidad de un límite celular. Sugerimos completar un ensayo de proliferación celular que abarque una amplia gama de densidades de siembra durante la duración del experimento para optimizar la densidad celular.

Determinar el tiempo de fijación óptimo es fundamental para un experimento smFISH exitoso. Hemos encontrado que la fijación de las muestras con formaldehído purificado al 4%, diluido en PBS estéril que contiene VRC durante 30 minutos en hielo, mejora significativamente la consistencia de las imágenes smFISH de alta calidad, especialmente si se requiere un análisis estructural mediante la combinación de anticuerpos contra factores de interés. El formaldehído fija muestras mediante macromoléculas de reticulación y puede mantener mejor las estructuras celulares que otros métodos de fijación como los que emplean disolventes orgánicos25. Sin embargo, es necesario ajustar el tiempo de fijación y la temperatura para que la muestra específica evite la fijación excesiva o inferior de la muestra26. VRC es útil porque reduce la degradación del ARN y es útil especialmente para el ARN27poco abundante. Hay dos opciones con las que hemos tenido éxito para el paso de permeabilización. La primera es una incubación de etanol al 70% a 4 °C y la segunda es una incubación triton-X100 al 0,5% a temperatura ambiente7,14. Es posible realizar el mismo protocolo en alto rendimiento utilizando placas multipantazo de fondo de vidrio compatibles con imágenes (96 y 384 pozos). El éxito constante en la realización de smFISH ha dependido del uso de placas multipano de vidrio utilizando fijador que contiene VRC, y 0.5% Triton-X 100 con VRC para el paso de permeabilización. Aunque las placas inferiores de plástico óptico son una opción, la calidad de imagen y el éxito han sido marcadamente menores.

Se requiere una alta relación señal-ruido para el análisis de una sola célula para filtrar la señal de fondo y los falsos positivos e identificar correctamente los puntos limitados por difracción. La señal de fondo se suma a los valores de intensidad de la señal de interés. El alto fondo a menudo surge de un diseño experimental subóptimo, y aunque se resta de las mediciones de intensidad fluorescente, es mejor obtener inicialmente una imagen de las regiones de interés con la menor señal de fondo posible28. Se requiere un alto rango dinámico, con una diferencia mínima de ~ 10 veces, para determinar con éxito si la señal se considera fondo o señal de interés29. Los puntos falsos positivos se refieren a la señal que reside fuera de los límites celulares, a menudo debido a cubiertas mal limpias, lavado insuficiente después de la hibridación o agregación de sondas que ocurre cuando las sondas se autoasocian30. Si se producen señales no específicas debidas a la unión espuria del oligo conjunto a ARN que son diferentes del objetivo (es decir, debido a pseudogenes o similitudes de secuencia), estas pueden evaluarse probando los conjuntos de sondas en un modelo que no expresa el gen de interés (es decir, MEFs knock-out, KNOCKR/Cas9 knock-out)31. Además, como con cualquier experimento de microscopía de fluorescencia, las sondas de intrón y exón deben estar separadas espectralmente. En nuestro experimento de ejemplo, elegimos los tintes Atto 647N y Quasar 570 para el conjunto de sondas GREB1 porque son compatibles con las especificaciones de los conjuntos de filtros en el microscopio utilizado, resistentes al fotobleaching y tienen un rendimiento cuántico relativamente alto8,14,32. Dependiendo de la muestra, recomendamos hacer una serie de dilución de la sonda de stock (generalmente una dilución de 1:200 a 1:1000, o 12.5 nM a 62.5 nM) para identificar la mejor relación señal-ruido para cada conjunto de sondas específico. Algunos proveedores suministran sondas etiquetadas a medida con fluoróforos seleccionados por el usuario para aumentar el brillo, reducir el fotobleaching y, si es necesario, agregar 1-2 canales adicionales generalmente disponibles en la mayoría de los microscopios fluorescentes modernos7,8,14. Aunque smFISH tiene la capacidad de medir ARN de baja abundancia, un problema clave es aumentar su sensibilidad y capacidad para detectar ARN parcialmente degradado, especialmente para muestras de tejido. Lograr una mayor relación señal-ruido es posible mediante el uso de sondas de ADN ramificadas diseñadas para amplificar la señal, aunque no hemos encontrado que este enfoque sea útil en nuestros estudios33. Los microscopios confocales utilizan una fuente de luz enfocada para iluminar la muestra mientras bloquean la luz desenfocada para que no llegue a los detectores con uno o más agujeros de alfiler. La microscopía confocal de escaneo puntual generalmente se desaconseja para las imágenes RNA-FISH porque las sondas se fotobleach más rápido a partir de la iluminación láser. Sin embargo, dependiendo de la muestra y la intensidad de la señal, los microscopios confocales pueden generar imágenes con poca o ninguna pérdida de señal8. Aquí, utilizamos un microscopio de epifluorescencia de campo amplio con un objetivo de alto aumento y alta apertura numérica para recolectar el número máximo de fotones emitidos por las sondas FISH34. Aunque las imágenes pueden ser borrosas por la luz desenfocada de los planos adyacentes de la pila z, se aplican algoritmos de deconvolución restaurativa para "reasignar" computacionalmente la luz difractada entre las pilas z adquiridas a su punto de origen34. Esto produce imágenes finales de alta resolución para el análisis de imágenes. Si es posible, sería mejor comparar empíricamente diferentes modalidades de imagen para determinar el sistema que es mejor para su experimento28.

Hay muchas extensiones y aplicaciones posibles de smFISH. En nuestro experimento modelo, completamos una ronda de hibridación con un conjunto de sondas para el gen GREB1. Sin embargo, es posible completar varias rondas de smFISH de manera secuencial (seqFISH)13,35. En este método, los ARNsmos en la célula se marcan mediante rondas secuenciales de hibridación, imágenes, extracción de sonda y rehipridación. Con el fin de aumentar masivamente la multiplexación hasta el nivel de transcriptoma completo, se han desarrollado técnicas de código de barras (por ejemplo, MER-FISH)36,37,38. Esto utiliza una estrategia de código de barras de fluorescencia para identificar de forma única cadaARNm 37,39. Estas técnicas se han adaptado a los tejidos, y cuando se combinan con la microscopía de expansión, un método que expande físicamente una muestra con una red de polímeros, puede proporcionar un mayor acceso de sondas a los ARN endógenos36,40,41. MER-FISH también permite aumentar el brillo de la señal de moléculas individuales mediante técnicas de amplificación deseñales 38. El protocolo que describimos es un proceso de dos días, sin embargo, es posible acortar el protocolo smFISH para que la hibridación de las sondas al ARN objetivo pueda ocurrir en tan solo ~ 5 minutos (Turbo-FISH)26. La inmunofluorescencia se puede combinar con smFISH (IF-FISH) para detectar simultáneamente proteínas y ARNm en una sola muestra42. El protocolo debe optimizarse para las sondas FISH y los anticuerpos utilizados para cada experimento para reducir la degradación de la degradación de proteínas y / o ARN en la muestra, ya que algunos materiales (es decir, tampones y fijadores) no son compatibles para procesar tanto proteínas como ARNm43. Consulte varias publicaciones de nuestro laboratorio como ejemplos de experimentos IF-FISH exitosos, además de los protocolos IF-FISH optimizados7,18.

En conclusión, presentamos un método de hibridación in situ de fluorescencia de molécula única (smFISH) que proporciona información sobre la heterogeneidad de una sola célula y la variación alelo por alelo en respuesta al estímulo. Si bien este protocolo está optimizado para el sistema modelo descrito anteriormente, proporcionamos una serie de posibles ajustes que pueden mejorar otros modelos de genes diana7.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

MAM, FS y MGM están financiados por NIEHS (Proyecto 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM y PKS cuentan con el apoyo del Centro GCC de Microscopía Avanzada e Informática de Imágenes (RP170719), financiado por el CPRIT. Las imágenes también cuentan con el apoyo del Núcleo de Microscopía Integrada en Baylor College of Medicine con fondos de NIH (DK56338 y CA125123), CPRIT (RP150578), el Centro Oncológico Integral Dan L. Duncan y el Consorcio John S. Dunn de la Costa del Golfo para Genómica Química.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17β Estradiol Sigma-Aldrich E2257 CAS Number 50-28-2
Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free ThermoFisher Scientific AM9770
Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose Fisher Scientific MT10017CV Manufactured by Invitrogen
DAPI Sigma-Aldrich D8417 Without sodium pyruvate
Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile Sigma-Aldrich 3730-100ML
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++ Corning 21030CV Manufactured by Calbiochem
Ethanol, 200 Proof (100%) Fisher Scientific 07-678-005
Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate Corning 353047 Manufactured by Decon Laboratories
Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL Fisher Scientific 50-753-2978 Manufactured by Gemini Bio Products
GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope GE Healthcare
Hyclone Water, Molecular Biology Grade Fisher Scientific SH3053802
Immersion Oil 1.516 GE Healthcare Life Sciences 29162940 Manufactured by GE Healthcare Bio-Science
L-glutamine Solution Fisher Scientific MT25005Cl Manufactured by Corning
MCF-7 cells ATCC HTB-22
Molecular Grade Formamide Promega PAH5051
Olympus 60x/1.42 NA Objective Olympus
Parafilm Bemis Company, Inc. 52858-076 Distributed by VWR
Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710
Penicilin-Streptomycin Solution Fisher Scientific MT3001Cl Manufactured by Corning
Ribonucleoside Vanadyl Complex VWR 101229-716 Manufactured by New England Biosciences
RNase Away Ambion 9780
Sodium pyruvate, 100 mM Fisher Scientific 11-360-070 Manufactured by Gibco
Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5 Fisher Scientific 12-545-81P
Triton X-100, 100 mL Fisher Scientific BP151-100 Manufactured by Fisher BioReagents
Trypsin-EDTA Solution 0.25% Sigma-Aldrich T4049-500ML
Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL Fisher Scientific NC9265087 Manufactured by Vector Laboratories

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Análisis unicelular de alelos transcripcionalmente activos por FISH de molécula única
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Mistry, R. M., Singh, P. K., Mancini, M. G., Stossi, F., Mancini, M. A. Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH. J. Vis. Exp. (163), e61680, doi:10.3791/61680 (2020).

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