Summary
Descrevemos uma abordagem de molécula única para medições de afinidade antígeno-anticorpos usando fotometria em massa (MP). O protocolo baseado em MP é rápido, preciso, usa uma quantidade muito pequena de material, e não requer modificação de proteína.
Abstract
As medidas da especificidade e afinidade das interações antígeno-anticorpos são criticamente importantes para aplicações médicas e de pesquisa. Neste protocolo, descrevemos a implementação de uma nova técnica de molécula única, fotometria em massa (MP), para este fim. MP é uma técnica livre de rótulos e imobilização que detecta e quantifica massas moleculares e populações de anticorpos e complexos de anticorpos de antígeno em um nível de molécula única. Mp analisa a amostra de anticorpos de antígeno em poucos minutos, permitindo a determinação precisa da afinidade vinculante e simultaneamente fornecendo informações sobre a estequiometria e o estado oligomérico das proteínas. Trata-se de uma técnica simples e simples que requer apenas quantidades de picomole de proteína e sem consumíveis caros. O mesmo procedimento pode ser usado para estudar a ligação proteína-proteína para proteínas com uma massa molecular maior que 50 kDa. Para interações proteicas multivalentes, as afinidades de múltiplos locais de ligação podem ser obtidas em uma única medição. No entanto, o modo de medição de molécula única e a falta de rotulagem impõem algumas limitações experimentais. Este método dá os melhores resultados quando aplicado às medições de afinidades de interação submicílar, antígenos com uma massa molecular de 20 kDa ou maiores, e amostras relativamente puras de proteína. Descrevemos também o procedimento para a realização das etapas necessárias de montagem e cálculo usando o software básico de análise de dados.
Introduction
Os anticorpos tornaram-se ferramentas onipresentes da biologia molecular e são usados extensivamente em aplicações médicas e de pesquisa. Na medicina, eles são criticamente importantes em diagnósticos, mas suas aplicações terapêuticas também estão se expandindo e novas terapias baseadas em anticorpos estão sendo constantemente desenvolvidas1,2,3,4. As aplicações científicas dos anticorpos incluem muitas técnicas laboratoriais indispensáveis, como a imunofluorescência5,a imunoprecipitação6,a citometria de fluxo7,a ELISA e a mancha ocidental. Para cada uma dessas aplicações, obter medidas precisas das propriedades vinculantes do anticorpo, incluindo afinidade e especificidade vinculantes, é de importância crucial.
Desde que o primeiro instrumento de ressonância de plasmon de superfície comercial (SPR) foi introduzido em 1990, os biosensores ópticos tornaram-se o "padrão ouro" da caracterização de anticorpos, mas outras técnicas, incluindo a ELISA, também são rotineiramente utilizadas para medir afinidades de anticorpos8,9. Esses métodos geralmente requerem imobilização ou rotulagem das moléculas analisadas, o que pode afetar potencialmente a interação de interesse. Eles também são relativamente lentos, envolvendo múltiplas etapas de ensaio antes que os resultados possam ser coletados para análise de dados. Um método de molécula única recentemente desenvolvido, a fotometria em massa (MP), detecta moléculas diretamente na solução quando pousam na superfície do microscópio, o deslizamento10,11. A detecção óptica baseada em dispersão de luz que a MP emprega não requer rotulagem ou modificação de proteínas. Moléculas proteicas individuais são registradas pelo microscópio de dispersão interferométrica à medida que manchas escuras aparecem na imagem (Figura 1D), e várias milhares de moléculas podem ser detectadas durante a aquisição de dados de um minuto12. O sinal gerado por cada partícula individual é quantificado, e seu valor de contraste (escuridão relativa) é calculado. Os valores de contraste interferométrico são proporcionais às massas moleculares das proteínas, o que permite a identificação de espécies ligadas e livres na mistura antígeno-anticorpo. Ao mesmo tempo, contando eventos de pouso molecular, a MP mede diretamente as populações de espécies. Isso dá aos métodos baseados em MP uma capacidade única de quantificar independentemente as afinidades de vários sites de vinculação.
A ligação das moléculas de antígeno(Ag)aos dois locais de ligação do anticorpo intacto(Ab)pode ser descrita como:
com as constantes de associação de equilíbrio Ka1 e Ka2 definidas como:
onde ci e f i representam concentração e fração do componente i,respectivamente. A concentração total de antígeno(cAg)pode ser expressa como:
Uma vez que são conhecidas as concentrações totais do anticorpo (cAb)tot e antígeno(cAg),esta equação pode ser usada para se encaixar diretamente nas frações de componentes experimentais obtidas das medições de MP e calcular as constantes de associação de equilíbrio Ka1 e Ka2 (ver Informações Complementares).
Os dados da MP também podem ser usados para estimar a cooperatividade entre os dois locais de ligação de anticorpos11. Para dois paratopos de anticorpos com constantes microscópicas idênticas, os fatores estatísticos que descrevem o processo populacional do Ab· Ag e Ab· Oscomplexos Ag2 ditam que as aparentes constantes de equilíbrio macroscópico Ka1 e Ka2 não serão numericamente iguais, e Ka1 = 4Ka2. Portanto, os valores experimentais de Ka1 < 4Ka2 indicam cooperatividade positiva entre os dois locais de ligação de anticorpos. Da mesma forma, Ka1 > 4Ka2 indica cooperatividade negativa.
As medidas mp da afinidade de ligação antígeno-anticorpo são rápidas e requerem uma pequena quantidade de material. As distribuições de massa mp utilizadas para cálculos constantes de equilíbrio fornecem informações adicionais sobre as propriedades da amostra e permitem a avaliação da pureza da amostra, oligomerização e agregação em um único experimento. O mesmo método pode ser usado para medir a ligação proteína-proteína de alta afinidade, e a MP é particularmente útil para estudos de interações proteicas multi-valentes. Complexos multi-proteínas geralmente têm grandes massas moleculares, ótimas para detecção de MP, e dados de molécula única podem ser usados para medir a estequiometria e calcular afinidades de múltiplos locais de ligação simultaneamente. Essas informações geralmente são difíceis de obter usando métodos baseados em massa.
Sem modificações, o protocolo atual é adequado para medições de interações submicrlares relativamente altas e submicrílares com antígenos de uma massa molecular de 20 kDa ou maior. Para obter resultados ótimos, os estoques de proteínas devem ser de alta pureza, mas não há requisitos específicos de buffer. Usando MP, a ligação antígeno-anticorpo pode ser avaliada em menos de cinco minutos. A coleta e análise de dados necessárias para cálculos Kd precisos podem ser realizadas dentro de 30 minutos.
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Protocol
1. Prepare as câmaras de fluxo
- Limpe as tampas de vidro
- Utilizando garrafas de lavagem com água destilada, etanol e isopropanol, enxágue as tampas de 24 mm x 50 mm na seguinte ordem: água, etanol, água, isopropanol, água. Seque as tampas com um fluxo de nitrogênio limpo. É importante enxaguar as tampas de cima para baixo, segurando o canto inferior com fórceps de ponta macia. Seque a tampa na mesma direção para evitar a transferência de contaminação das fórceps(Figura 2A).
- Da mesma forma, enxágue as tampas de 24 mm x 24 mm com água destilada, etanol e água destilada. Seque as tampas com um fluxo de nitrogênio limpo.
- Identifique o lado de trabalho da tampa, coloque uma gota de água destilada na superfície do deslizamento de cobertura limpo e siga os passos 3.1-3.2 do protocolo. Normalmente, apenas um lado da tampa de 24 mm x 50 mm tem a qualidade óptica adequada para medições de MP.
NOTA: Após o foco, não devem ser detectadas imperfeições significativas da superfície, e o valor do "sinal" mostrado no software de coleta de dados deve ser inferior a 0,05%(Figura 1A-C). Os lados de trabalho de todas as tampas na caixa são orientados na mesma direção. O mesmo procedimento deve ser usado para testar a eficiência da limpeza do deslizamento de tampas.
- Monte a câmara de fluxo
- Posicione a tampa de 24 mm x 24 mm sobre um pedaço de papel alumínio. Coloque tiras de fita dupla face em cima da tampa de 24 mm x 24 mm, como mostrado na Figura 2B e corte a fita ao longo da borda do vidro. Separe a folha de cobertura da folha de alumínio e fixe-a ao lado de trabalho da tampa de 24 mm x 50 mm(Figura 2C).
NOTA: O tamanho do canal pode variar, mas recomenda-se uma largura de 3 mm a 5 mm. Canais mais amplos requerem volumes de amostra maiores e canais muito estreitos podem ser difíceis de carregar. Normalmente, dois canais paralelos podem ser facilmente criados na tampa de 24 mm x 24 mm. O protocolo pode ser pausado aqui.
- Posicione a tampa de 24 mm x 24 mm sobre um pedaço de papel alumínio. Coloque tiras de fita dupla face em cima da tampa de 24 mm x 24 mm, como mostrado na Figura 2B e corte a fita ao longo da borda do vidro. Separe a folha de cobertura da folha de alumínio e fixe-a ao lado de trabalho da tampa de 24 mm x 50 mm(Figura 2C).
2. Prepare as amostras de anticorpos-antígenos para as medidas de afinidade
- Filtre pelo menos 2 mL do buffer PBS usando filtros de seringa de 0,22 μm para remover partículas de poeira ou agregados. Centrifugar o estoque de proteínas por 10 minutos na velocidade máxima da centrífuga de mesa (aproximadamente 16.000 x g).
NOTA: O PBS é o buffer recomendado para este protocolo, mas a MP não tem requisitos específicos de buffer, e outros buffers biológicos também são aceitáveis. No entanto, altas concentrações de glicerol (>10%) e forças iônicas muito baixas (concentração de sal <10 mM) podem afetar a qualidade da imagem e dos dados e não são recomendadas. - Determine as concentrações reais dos estoques de anticorpos e antígenos medindo sua absorvância UV de 280 nm.
- Calcule as concentrações de medição da mistura de anticorpos de antígeno. Se o valor estimado da afinidade de ligação de anticorpos não for conhecido, planeje preparar uma amostra com antígeno de 30 nM e concentração de anticorpos de 20 nM. Quando a afinidade aproximada é conhecida, a relação anticorpo-antígeno e suas concentrações devem ser otimizadas de acordo com os valores Kd esperados. Use a concentração total de antígeno na mistura igual à soma do Kd esperado e a concentração total de anticorpos na equação abaixo. Assumindo Kd1 = Kd2 para os dois paratopos do anticorpo, isso resultará em concentrações comparáveis do anticorpo livre e dos complexos anticorpos-antígenos na amostra.
Ajuste a concentração de anticorpos para manter a concentração total de proteínas na amostra dentro da faixa de 10 nM e 50 nM. Os melhores resultados são obtidos utilizando misturas com concentrações de anticorpos entre 5 nM e 25 nM.
NOTA: MP detecta proteínas com massa molecular maior que 40 kDa. Consequentemente, concentrações amostrais de antígenos com massa molecular menor que 40 kDa podem exceder o limite típico de 50 nM. No entanto, em concentrações superiores a aproximadamente 100 nM, mesmo antígenos de massa molecular baixa podem afetar a qualidade da imagem e a precisão da determinação Kd. - Prepare 50 μL da mistura anticorpo-antígeno em sua concentração final de medição calculada na etapa 2.3.
NOTA: Apenas uma amostra da mistura de antígeno-anticorpo é necessária para a determinação Kd. No entanto, preparar várias amostras com diferentes proporções de antígeno para anticorpos pode ajudar a otimizar a concentração amostral. Se os dados de várias amostras forem coletados, eles podem ser analisados através de um ajuste global. - Incubar a mistura de anticorpos de antígeno por aproximadamente 10 minutos à temperatura ambiente para permitir que a reação de ligação atinja o equilíbrio químico. Evite tempos de incubação desnecessariamente longos.
NOTA: O tempo de incubação pode variar dependendo da cinética de ligação. Para confirmar que o equilíbrio químico foi atingido, as medições da amostra podem ser repetidas em diferentes momentos de incubação. Os valores Kd invariantes indicam incubação suficientemente longa. A incubação prolongada pode levar a uma adsorção significativa de proteínas à superfície do labware plástico e, consequentemente, a erros significativos na determinação da concentração de proteínas. Por essa razão, o labware de baixa adesão é fortemente recomendado para a preparação da amostra mp13.
3. Coletar os dados de Fotometria em Massa
- Aplique uma gota de óleo de imersão de microscópio no objetivo do instrumento MP e coloque a câmara de fluxo montada no estágio do microscópio. Certifique-se de que o óleo abrange a distância entre o deslizamento de tampa e o objetivo.
- Carregue a câmara de fluxo e concentre o fotômetro de massa.
- Deposite 10 μL de uma solução tampão limpa e filtrada em uma extremidade do canal da câmara de fluxo preparado na etapa 1. O líquido entrará no canal por ação capilar.
- Ajuste a posição Z do estágio para focar o microscópio na superfície de trabalho da tampa de 24 x 50 mm.
- Na guia Controle de Foco do software de coleta de dados, use os botões de movimento de estágio grosseiro para cima e para baixo para fazer os ajustes iniciais.
- Clique no botão Nitidez para mostrar a leitura do sinal de nitidez e use os botões de ajuste finos para cima e para baixo para maximizar o valor de nitidez.
- Clique nos botões "Definir foco e foco de bloqueio" para ativar a função de rastreamento de foco. Uma imagem devidamente focada(Figura 1A,C) deve ter o valor de "sinal" abaixo de 0,05%.
NOTA: Se o valor do "sinal" na posição máxima de nitidez estiver acima de 0,05%, isso pode indicar impurezas na superfície do vidro ou no buffer.
- Usando o mesmo canal, carregue 20 μL da amostra de anticorpos-antígeno depositando-o em um lado do canal e manchando o líquido da outra extremidade com um pequeno pedaço de papel de mancha(Figura 2D).
NOTA: O volume de um canal de 3 a 5 mm de largura é de aproximadamente 10 μL. Recomenda-se que o volume adicional da amostra substitua completamente o tampão presente no canal e evite a diluição da amostra. - Após o carregamento da amostra, clique imediatamente no botão Gravar para iniciar a coleta de dados, adquirindo um vídeo de 100 s(Figura 1D).
- No final da coleta de dados, digite o nome do arquivo e clique em OK para salvar o arquivo de dados.
- Descarte as tampas e limpe o óleo da lente objetiva com cotonetes ópticos de algodão molhados com isopropanol.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
4. Analisar os dados da MP
- Processe o arquivo de vídeo coletado usando o software de processamento de dados MP para identificar os eventos de aterrissagem.
- Use a opção Arquivo/Abrir menu para carregar o arquivo para a análise e clique em Analisar.
- Clique no botão Carregar para carregar a função de calibração e salvar os dados analisados usando a opção Arquivo/Salvar resultados como menu.
- Ajuste a distribuição de massa molecular com funções gaussianas para obter concentrações relativas de cada espécie na amostra. Esta análise pode ser realizada utilizando um software de grafagem científica comum (ver Tabela de Materiais).
- Importe o arquivo "eventsFitted.csv" no software e plote a distribuição de massa molecular (coluna M no arquivo .csv) usando a função Plot/Statistics/Histogram.
- Clique duas vezes no histograma para abrir a janela Propriedades do Enredo. Desabilitar o binning automático e selecionar um tamanho de caixa de 2,5 kDa. Clique nos botões Aplicar e ir para criar os dados bin centers e contagens.
- Selecione as colunas Bin Centers and Counts e use a função de menu Análise/Picos e Linha de Base/Ajuste de Pico Múltiplo para encaixar o histograma com funções gaussianas. Clique duas vezes para indicar as posições de pico aproximadas no gráfico de distribuição e, em seguida, clique no botão Open NLFit.
- Verifique as caixas de seleção fixas para os centros de pico "xc" e defina seus valores para as massas moleculares esperadas do anticorpo livre e dos complexos de anticorpos de antígeno único e duplo. Verifique a opção Compartilhar para os parâmetros de largura. Clique no botão Encaixar. Os valores de altura máxima dos componentes gaussianos representam a concentração relativa de cada espécie na amostra11.
NOTA: O tamanho da caixa pode ser ajustado para otimizar a resolução do lote de distribuição em massa. O limite de precisão mp é de aproximadamente 1 kDa, e tamanhos menores de caixa podem amplificar o ruído da distribuição, sem revelar nenhuma informação adicional. Tamanhos de lixeiras muito grandes obscurecerão os detalhes finos das distribuições em massa.
- Calcule a fração de concentração de cada espécie usando a seguinte equação:
onde os valores hi e fi representam alturas máximas e frações de concentração do anticorpo livre e do anticorpo de entrada única e dupla na amostra, respectivamente.
5. Calcular valores constantes de equilíbrio
- Encaixe as frações de concentração das espécies de interação calculadas na etapa 4.3 com Eq. 1 e 2 utilizando um software analítico adequado. Aqui demonstramos um método para calcular as constantes de equilíbrio utilizando um programa de planilha14 (ver Informações Complementares).
- Abra a planilha "cálculo Kd.xlsx". Nesta planilha, os valores celulares nas linhas 1 a 10 destacadas em amarelo podem ser modificados para realizar os cálculos das constantes de equilíbrio.
- Digite os valores Kd estimados em unidades nanomolares nas células B1 e B2 na tabela. Esses valores iniciais serão otimizados no procedimento de montagem. Se os valores Kd estimados não forem conhecidos, deixe os valores padrão nas células B1 e B2 inalterados.
- Digite os valores de (cAb)tot e(cAg)tot em unidades nanomolar em células D2 e E2. Digite os valores de fração calculados na etapa 4.3 nas células F2, G2 e H2. Se várias amostras em diferentes proporções de concentração forem medidas, valores adicionais de concentração obtidos para essas amostras podem ser inseridos nas linhas 2 a 10.
- Selecione a função Data/Solver. Digite "$B$15" na caixa "Definir Objetivo" e "$B$1:$B$2" na caixa "Mudando células variáveis:". Selecione o botão de rádio Min para a opção To: Verifique a caixa de seleção Fazer variáveis não-negativas e selecione GRG Nonlinear como o método de resolução. Clique no botão Resolver. Os valores Kd1 e Kd2 mais adequados serão mostrados nas células B1 e B2 e na soma final de erros quadrados na célula B15.
NOTA: Se a função Solver não estiver ativa, selecione Opções no menu Arquivo no programa de planilha. Na categoria Add-ins, selecione o Complemento solver sob os complementos de aplicação inativa e clique no botão Ir. Verifique a caixa de seleção add-in do Solver e clique em OK.
Figura 1: Imagens de fotometria em massa. (A) Imagem de visão nativa representativa do tampão de imagem coletado em uma mancha de cobertura limpa e (B) em um deslizamento de tampa com imperfeições de superfície. (C) Imagem diferenciada da razão de imagem do tampão de imagem e (D) do AHT· Solução HT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparação e carregamento da câmara de fluxo mp. (A) Posição de retenção de deslizamento para o procedimento de limpeza. (B) Alinhamento do deslizamento de tampa de 24 x 24 mm (camada média) e da fita de dupla face (camada superior) na superfície da folha de alumínio (camada inferior, não mostrada). Linhas de traço azul mostram a localização das linhas de corte. (C) Visão superior e lateral da câmara de fluxo montada com dois canais de amostra, e uma imagem da câmara de fluxo montada. (D) Procedimento para carregamento de amostras em um canal de fluxo previamente preenchido com buffer. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
Examinamos anteriormente a interação do humano α-trombina (HT) e do anticorpo anti-trombina monoclonal (AHT) usando o ensaio baseado em MP11. Uma vez que a massa molecular do HT (37 kDa) está abaixo do limite de detecção de 40 kDa, a concentração máxima da amostra pode exceder a limitação de concentração de 50 nM MP sem afetar negativamente a resolução das distribuições de massa. O experimento foi planejado como uma série de titulação com o anticorpo AHT em uma concentração fixa de 25 nM, e o HT em concentrações de 7,5 nM, 15 nM, 30 nM, 60 nM e 120 nM. A Figura 3 mostra as distribuições de massa molecular das misturas de anticorpos de antígeno e da amostra somente de anticorpos. Aqui analisamos os dados utilizando o método descrito no protocolo. Um software de grafia científica foi usado para encaixar as distribuições de massa com três componentes gaussianos representando o AHT gratuito, AHT· HT e AHT· HT2. Os valores de massa molecular conhecidos dos três componentes foram fixados, e um único parâmetro de largura de pico foi montado para as três espécies. Os parâmetros de altura máxima mais adequados dos componentes gaussianos foram normalizados utilizando-se de Eq. 3 para obter frações de concentração de espécies(Tabela 1). Esses valores, juntamente com a concentração total de anticorpos e antígenos para cada amostra, foram inseridos no "cálculo Kd.xlsx". O ajuste global na planilha rende Kd1 = 40 nM (intervalo de confiança de 68,3%: 28 nM, 68 nM) e Kd2 = 28 nM (intervalo de confiança de 68,3%: 17 nM, 45 nM). As frações de concentração experimental e os resultados de ajuste são traçados na Figura 4. Os valores constantes de dissociação obtidos aqui pela adequação das frações de concentração integrada estão de acordo com os obtidos anteriormente por distribuições de MP diretamente e com valores constantes de dissociação obtidos pela Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC)11.
Figura 3: Distribuições de massa molecular mp dos 25 nM AHT misturados com HT em 0, 7,5, 15, 30, 60 e 120 nM (A-F, respectivamente). Pontos pretos mostram os dados experimentais de MP plotados com tamanho de caixa de 2,5 kDa. Linhas ciano, verde e azul representam as distribuições gaussianas mais adequadas do anticorpo livre, anticorpos unides e espécies de anticorpos de dois limites, respectivamente. Linhas vermelhas mostram a soma dos três componentes gaussianos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Frações do AHT gratuito (azul), AHT· HT (vermelho) e AHT· HT2(preto) em função da concentração de HT. Os pontos representam valores experimentais obtidos a partir da montagem gaussiana das distribuições de MP. As linhas sólidas representam o melhor ajuste usando Eq. 1 e Eq. 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Réplicas técnicas das medições de distribuição de massa molecular AHT. As parcelas mostram a reprodutibilidade das medidas de MP e a pureza da preparação do anticorpo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Ab conc (M) | Ag conc (M) | f_Ab | f_AbAg | f_AbAg2 |
| 2.50E-08 | 7.50E-09 | 0.88 | 0.10 | 0.02 |
| 2.50E-08 | 1.50E-08 | 0.81 | 0.15 | 0.04 |
| 2.50E-08 | 3.00E-08 | 0.72 | 0.21 | 0.07 |
| 2.50E-08 | 6.00E-08 | 0.27 | 0.37 | 0.35 |
| 2.50E-08 | 1.20E-07 | 0.05 | 0.23 | 0.72 |
Tabela 1: Alturas máximas normalizadas dos componentes gaussianos obtidas pela montagem das distribuições de MP (Figura 3).
Informações complementares: Implementação do procedimento de ajuste de constantes de equilíbrio na planilha de cálculo excel e afinidade. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O protocolo baseado em Fotometria em Massa descrito aqui fornece um método rápido e preciso de medir afinidades de ligação de anticorpos de antígeno. A análise de MP usa uma quantidade muito pequena de material e informações adicionais — incluindo estequiometria, oligomerização e pureza — podem ser avaliadas a partir dos mesmos dados(Figura 5). Sem modificações, este método é aplicável às medições de constantes de dissociação na faixa de aproximadamente 5 nM a 500 nM, e para moléculas de ligantes com massa molecular de aproximadamente 20 kDa ou maior. O mesmo protocolo pode ser usado não apenas para analisar a ligação antígeno-anticorpo, mas também para medir afinidades de interação proteína-proteína quando a massa molecular de pelo menos um dos parceiros de ligação é maior que 50 kDa. Uma vez que a detecção de MP não é específica, as medidas de MP não podem ser realizadas em amostras contendo uma alta concentração de proteínas portadoras ou grandes impurezas de massa molecular.
O SPR é comumente usado para a caracterização da ligação antígeno-anticorpo, e a comparação direta de ambos os métodos pode ajudar na seleção do ensaio. Em comparação com o SPR, o ensaio de vinculação mp é mais rápido e não requer imobilização de proteínas. Para um experimento de vinculação típico, o MP requer menos material do que os dados de SPR. MP revelam a estequiometria dos complexos que não está prontamente disponível a partir da SPR10,11. Os parâmetros cinéticos de vinculação podem ser obtidos a partir dos dados da MP13,mas a SPR mede diretamente a cinética vinculante, e é capaz de medir uma gama mais ampla de taxas de associação e dissociação. As constantes de associação de dois locais de vinculação separados só podem ser obtidas a partir dos dados da SPR quando as taxas de associação e dissociação de ambos os locais forem suficientemente diferentes. Por outro lado, o MP pode caracterizar precisamente complexos moleculares com múltiplos locais de ligação10,11. SpR é capaz de medir a afinidade vinculante para pequenos ligantes de massa molecular, e mp funciona melhor para ligantes com massa molecular de aproximadamente 20 kDa ou maior.
Coletar dados mp de boa qualidade é um passo fundamental para obter resultados precisos a partir deste protocolo. Impurezas no buffer ou na superfície das tampas interferirão na coleta de dados mp. O foco inadequado distorce o sinal mp levando a erros nas estimativas de massa molecular e nos cálculos de constantes de equilíbrio. Ambos os fatores devem ser examinados ao solucionar o protocolo. Uma consideração importante ao trabalhar com soluções proteicas de baixa concentração é que a adsorção superficial pode levar à perda de material e mudanças na concentração amostral. Os erros resultantes podem ser minimizados usando labware de baixa adsorção e aplicando passivation de superfície. Para obter resultados precisos, é importante permitir que todas as diluições e misturas proteicas atinjam o equilíbrio químico, mas tempos de incubação desnecessariamente longos devem ser evitados. Para cada sistema proteico, recomenda-se que as taxas da proteína não específica vinculante ao vidro de deslizamento de cobertura sejam avaliadas a partir dos dados mp. Se forem observadas taxas significativamente diferentes para diferentes espécies, os dados de MP podem ser facilmente corrigidos para evitar possíveis erros nos cálculos Kd 10,11.
Vários fatores devem ser considerados no planejamento da preparação da amostra. Resultados precisos podem ser obtidos medindo uma única amostra, mas as concentrações de antígeno e anticorpos devem ser ajustadas para obter uma concentração comparável das espécies livres e ligadas. A análise de uma única distribuição de massa dominada por uma das espécies de reação pode fornecer estimativas aceitáveis de valores Kd, mas geralmente produz erros de encaixe relativamente grandes11. Uma estratégia alternativa envolve uma análise global dos dados de titulação. A ferramenta de montagem baseada em software de planilha fornecida com este protocolo pode ser usada para a montagem de dados individuais e para análise global. Se um único experimento ou conjunto de dados for analisado, os intervalos de confiança dos parâmetros de melhor ajuste podem ser estimados usando o método de projeção de erro. Uma descrição detalhada do procedimento de cálculo de intervalos de confiança no software de planilha é fornecida em outros lugares14. Ao projetar o ensaio, recomenda-se planejar para replicar experimentos. Quando os dados dos experimentos de replicação são analisados, o desvio padrão pode ser usado para relatar erros dos valores Kd.
O protocolo descrito aqui pode ser modificado para estender sua aplicabilidade além das limitações típicas de massa molecular e alcance de afinidade. A gama de afinidades mensuráveis é limitada pela faixa de concentração de proteínas acessível por MP, tipicamente de 10 nM a 50 nM. Essa faixa pode ser estendida e amostras de proteínas em concentrações abaixo de 10 nM podem ser medidas usando células de fluxo perfusadas e tempos de aquisição de dados mais longos. Amostras de proteínas em concentrações mais elevadas podem potencialmente ser medidas usando tampas passivadas para as medidas de MP. Para antígenos com uma pequena massa molecular, o anticorpo livre e os picos complexos de anticorpos de antígeno nas distribuições de massa mp não serão resolvidos. Isso impedirá o uso da análise de ajuste de pico gaussiana descrita no protocolo. Nesse caso, a afinidade vinculante ainda pode ser medida titulando o anticorpo com o antígeno e a média das distribuições de MP para obter a massa molecular média de todas as espécies para cada amostra. A equação de vinculação pode então ser adequada a esses dados para obter a afinidade vinculante antígeno-anticorpo11.
Quando informações precisas de afinidade não são necessárias, o protocolo pode ser simplificado e usado para uma triagem rápida de interação com anticorpos. Nesse caso, os poços de junta disponíveis comercialmente podem ser usados em vez de canais de amostra para simplificar ainda mais o procedimento experimental.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Keir Neuman por sua leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo programa intramuros da NHLBI, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AcquireMP | Refeyn | MP data collection software | |
| Anti-human thrombin | Haematologic Technologies | AHT-5020 | RRID: AB_2864302 |
| Cotton-tipped applicators | Thorlabs | CTA10 | cotton optical swabs for lens cleaning |
| Coverslips 24x24 mm | Globe Scientific | 1405-10 | |
| Coverslips 24x50 mm | Fisher Scientific | 12-544-EP | |
| DiscoverMP | Refeyn | MP data processing software | |
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 78080-CF | soft-tipped forceps for coverslips handling |
| Human α-thrombin | Haematologic Technologies | HCT-0020 | |
| Immersion oil | Thorlabs | MOIL-30 | |
| Isopropanol | Alfa Aesar | 36644 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | spreadsheet | |
| OneMP | Refeyn | Mass Photometry instrument | |
| Origin | OriginLab | scientific graphing software | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | 10x stock |
| Syringe filter | Millipore | SLGSR33SS | buffer and sample filtering |
References
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