Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fyrdubbel schackbräde: En ändring av den tredimensionella schackbrädet för studier av läkemedelskombinationer

Published: July 24, 2021 doi: 10.3791/62311
Automatic Translation
1, 2, 2,3
1Faculty of Medicine and Medical Sciences, University of Balamand, 2Department of Clinical Microbiology, Michigan Health Clinics, 3College of Medicine, Central Michigan University

Summary

Detta protokoll beskriver hur man studerar alla möjliga kombinationer som kan erhållas mellan fyra läkemedel i ett enda experiment. Denna metod är baserad på standardanalysen för mikrospädning av 96-brunnar och beräkningen av fraktionerade hämmande koncentrationer (FIC) för att utvärdera resultaten.

Abstract

Begreppet läkemedelskombinationsterapi blir mycket viktigt främst med den drastiska ökningen av resistens mot droger. Quadruple schackbräde, även kallad Q-checkerboard, syftar till att maximera antalet möjliga kombinationer som kan erhållas mellan fyra läkemedel i ett experiment för att minimera den tid och det arbete som behövs för att uppnå samma resultat med andra protokoll. Detta protokoll är baserat på den enkla mikroutspädningstekniken där läkemedlen späds ut och kombineras i flera 96-brunnsplattor.

I den första uppsättningen 96-brunnsplattor tillsätts Muller-Hinton buljong följt av det första nödvändiga läkemedlet (t.ex. Cefotaxime här) för att seriellt späda ut det. När det första steget är klart används en annan uppsättning 96-brunnsplattor för att späda ut det andra läkemedlet (t.ex. Amikaci), som kommer att överföras genom att ta bort en specifik volym läkemedel 2 och sätta i motsvarande brunnar i den första uppsättningen 96-brunnsplattor som innehåller läkemedel. Det tredje steget görs genom att lägga till de nödvändiga koncentrationerna av det tredje läkemedlet (t.ex. Levofloxacin), till lämpliga plattor i den ursprungliga uppsättningen som innehåller en kombination av läkemedel 1 och 2. Det fjärde steget görs genom att lägga till de nödvändiga koncentrationerna av det fjärde läkemedlet (t.ex. Trimethoprim-sulfamethoxazol) i lämpliga plattor i den första uppsättningen. Sedan kommer E. coli ESBL bakteriell inokulat att beredas och tillsättas.

Denna metod är viktig för att utvärdera alla möjliga kombinationer och har ett bredare utbud av möjligheter att testas ytterligare för in vivo-testning. Trots att det är en tröttsam teknik som kräver mycket fokus är resultaten anmärkningsvärda och tidsbesparande där många kombinationer kan testas i ett enda experiment.

Introduction

Med ökningen av resistens på grund av överanvändning och missbruk av antibiotika1,2, har behovet av att utveckla nya läkemedel och medel för att behandla bakteriella infektioner blivit avgörande. Nya metoder som att utveckla nya läkemedel är mycket viktiga för att övervinna motståndskrisen. Läkemedelsindustrin är dock inte intresserad av att utveckla nya antimikrobiella medel. Dessutom, om nya läkemedel utvecklas, kommer bakterier att fortsätta att utveckla och utveckla resistens mot dessa nya läkemedel3,4. Således kommer problemet med resistens inte att lösas, vilket gör behovet av ett annat tillvägagångssätt ett måste som bör övervägas och studeras för att övervinna bakteriell resistens.

Läkemedelskombination är ett mycket viktigt koncept för behandling av bakteriella infektioner främst de som orsakas av multiresistenta patogener5,6. Det minskar behandlingsloppet, minskar den angivna dosen; således minskar toxiciteten hos det givna läkemedlet, hjälper till att minska resistensutvecklingen och på ett sätt sensibiliserar bakterierna till de givna läkemedlen enligt beskrivningen i begreppet säkerhetskänslighet5,7,8,9.

Resistensutveckling mot ett läkemedel kräver en enda mutation; Resistensutveckling till en kombination av läkemedel som riktar sig mot flera vägar kräver dock flera oberoende mutationer som bromsas av denna kombination. Ett exempel på minskad resistens vid användning av kombinationsbehandling är den minskade resistensfrekvensen mot Rifampin vid Mycobacterium Tuberculosis10. Ett annat exempel är en studie gjord av Gribble et al. som visade att uppkomsten av resistenta stammar hos patienter som tar Piperacillin ensam är högre än hos dem som tar en kombination av karboxypenicillin och aminoglykosid10. Studier har visat att resistensutveckling mot aminoglykosider hos framväxande bakterier gjorde dessa stammar känsliga för olika andra läkemedel5. Kombinationen mellan beta-laktamklass läkemedlet amoxicillin och laktamashämmaren clavulanic syra visade framgång vid behandling av resistenta bakteriestammar8.

Att minska behandlingstiden är en bra fördel till följd av läkemedelskombinationer. Till exempel kommer en behandling av kombinerat penicillin eller ceftriaxon med gentamicin i 2 veckor att ge samma effekt som ges enbart av penicillin eller ceftriaxon när det ges i 4 veckor11. Att kombinera droger möjliggör användning av lägre doser av läkemedel som inte är effektiva när de ges ensamt såsom sub-MICs. Exemplet med sulfonamider kan ges där användningen av trippelsulfonamider vid lägre doser minimerar den toxicitet som produceras som kristallbildning eller kristallluri vid användning av olösliga sulfonamider vid fulla doser12.

Således, minska den angivna dosen och tidpunkten för behandlingen kommer så småningom att minska toxiciteten hos läkemedlen på kroppen. Idén att utveckla metoder för att bedöma samspelet mellan kombinerade läkemedel är mycket viktig. I en studie visade resultaten att kombinationsbehandling är effektivare för behandling av resistenta arter av Acinetobacter och P. aeruginosa8.

Ge droger i kombination
Det finns olika metoder genom vilka vi kan studera läkemedelskombinationer, såsom schackbrädemetoden, metoden för tidsdödskurva och E-testmetoden13. Schackbrädemetoden kan studera alla möjliga kombinationer mellan de två drogerna i fråga i ett experiment självt. Dessutom utvecklades det för att studera en kombination av tre läkemedel14. Nu utvidgar vi detta för att studera en kombination av fyra läkemedel främst för behandling av multiresistenta patogener.

Tidsdödskurvans analys utförs vanligtvis för att testa för bakteriedödande effekten av ett visst läkemedel. Det användes också för att testa för effekten av läkemedelskombinationer där flera läkemedel kombineras vid specifika koncentrationer. Detta protokoll kräver beredning av flera sterila rör eller koppar där vi i varje kopp lägger till buljongen, kombinationen av droger och den nödvändiga bakteriestammen. Efter inkubation och registrering av den optiska densiteten vid flera tidpunkter jämförs resultaten med den normala tillväxttakten för den använda stammen för att se om tillväxttakten ökade, minskade eller inteändrades 13.

E-testmetod görs vanligtvis för att testa för den minimala hämmande koncentrationen (MIC) där en remsa som innehåller en gradientkoncentration av läkemedlet i fråga sätts på en inokulerad platta. Det användes också för att testa kombinationen mellan två droger där två remsor läggs till plattan på ett vinkelrätt sätt som skär vid deras MIC13.

Enligt litteraturen finns det ingen guldstandard att definiera och studera synergi; Således är det svårt att bedöma vilken av metoderna som används för att studera kombinationen är bättre och vilken som ger bättre och mer tillförlitliga resultat främst13. Tidsdödsanalys är dock arbetsintensiv, tidskrävande och dyr15,16, medan E-testmetoden utvecklas för att studera en kombination mellan endast två läkemedel. Checkerboard kan studera alla möjliga kombinationer mellan de två testade drogerna och det är därför denna teknik har valts för att utvecklas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förberedelsesteg

  1. Förbered Muller-Hinton buljong (MHB) genom att lägga till 25 g MH-buljong till 1 L destillerat vatten och blanda. Autoklav vid 121 °C i 2,5 timmar. Förvara sedan de autoklaverade medierna i rumstemperatur eller i kylskåpet.
  2. Subkultur bakterierna i fråga(E. coli ESBL) på agarmedierna med hjälp av fyrkvadrantstrimmningsmetoden och inkubera över natten vid 37 °C.
    1. Använd en steril slinga, ta en koloni och sprid den i den första halvan av MacConkey agar-plattan genom att göra nära parallella streck.
    2. Använd slingan, sprid bakterierna i den andra kvadranten genom att strimma den från den första kvadranten.
    3. Från den andra kvadranten, förläng strecken i den tredje kvadranten med nära parallella streck.
    4. Sprid bakterierna i mitten av den fjärde kvadranten genom att strecka den från den tredje kvadranten.

2. Panelförberedelser

  1. Placera fyra 96-brunnsplattor bredvid varandra för att bilda en kvadrat. Tejpa ihop botten med ett band.
  2. Upprepa det här steget för att få fyra paneler som var och en innehåller 4 plattor och namnge dem A1, A2, A3 och A4.
  3. Tillsätt 50 μL MH-buljong till brunnarna mellan kolumn 2 och kolumn 11 i de fyra panelernas 16 96-brunnsplattor.
  4. Tillsätt 200 μL MH-buljong till brunnen H12 som fungerar som den negativa kontrollbrunnen i 16 96-brunnsplattorna på de fyra panelerna.
  5. Tillsätt 150 μL MH-buljong till brunnarna A1 och H1 som fungerar som positiva kontrollbrunnar i de 16 96-brunnsplattorna på de fyra panelerna.

3. Läkemedel 1, Cefotaxime, seriell utspädning

  1. Tillsätt 15 ml sterilt dH 2 O till ettkonisktrör.
    1. Beräkna volymen som ska avlägsnas från läkemedlets stamlösning enligt formeln C1V1 = C2V2. Således V1 = (C2 x 15 ml) / C1.
      OBS: I vårt fall är Cefotaxime-stamlösningen 105 μg/ml och C2 är 256 μg/ml; således V1 = 38,4 μL.
  2. Ta bort den beräknade volymen från 15 ml sterilt dH2O och tillsätt sedan läkemedlet.
  3. Pipett 50 μL av den beredda läkemedelslösningen i varje brunn i kolumn 11 och kolumn 12 utom H12.
  4. Starta serieutspädningen genom att ta bort 50 μL från kolumn 11 och placera den i motsvarande brunnar i kolumn 10 och sedan från 10 tills den når kolumn 2 där de 50 μL som tas från kolumn 2 kommer att kasseras.
  5. Upprepa steg 3.4 och 3.5 för alla 16 96-brunnsplattor på de fyra panelerna.

4. Läkemedel 2, Amkacin, seriell utspädning

  1. Tillsätt 10 ml sterilt dH 2 O till ettkonisktrör.
  2. Beräkna volymen som ska avlägsnas från läkemedlets stamlösning enligt formeln C1V1 = C2V2. Således V1 = (C2 x 10 ml) / C1.
    OBS: I vårt fall är Amikacin-stamlösningen 103 μg/ml och C2 är 64 μg/ml; således V1 = 64 μL.
  3. Ta bort den beräknade volymen från 10 ml steril dH2O och tillsätt sedan läkemedlet.
  4. Ta åtta separata 96-brunnsplattor.
  5. Tillsätt 100 μL MHB till brunnarna mellan raderna G och B på varje platta.
  6. Tillsätt 100 μL av den tidigare beredda läkemedelslösningen 2 till brunnarna i rad G.
  7. Späd seriellt från rad G till rad B genom att ta 100 μL från varje brunn och slutligen kassera 100 μL från brunnarna på rad B.
  8. Upprepa steg 4.5, 4.6 och 4.7 för att förbereda åtta plattor.

5. Överföring av läkemedel 2 till de fyra panelerna

  1. Pipett 50 μL läkemedel 2 från brunnarna mellan raderna G och B till motsvarande brunnar i varje tallrik i de fyra panelerna. En beredd 96-brunnsplatta innehåller 100 μL läkemedel 2 som räcker för två tallrikar i en panel.

6. Läkemedel 3, Levofloxacin, tillsats

  1. Tillsätt 14 ml sterilt dH 2 O till fyra olikakoniskarör.
  2. Beräkna volymen som ska avlägsnas från läkemedlets stamlösning enligt formeln C1V1 = C2V2. Således V1 = (C2 x 14 ml) / C1.
    OBS: I vårt fall framställs Levofloxacin i fyra olika koncentrationer från en stamlösning på 5 x 103 μg/ml.
    C1 = 2 μg/ml, V1 = 5,6 μL
    C2 = 4 μg/ml, V1 = 11,2 μL
    C3 = 8 μg/ml, V1 = 22,4 μL
    C4 = 16 μg/ml, V1 = 44,8 μL
  3. Ta bort den beräknade volymen från 14 ml sterilt dH2O från varje rör och tillsätt sedan läkemedlet.
  4. Efter att ha förberett de nödvändiga koncentrationerna av det tredje läkemedlet, ta 50 μL och lägg det till motsvarande brunnar mellan raderna B och G och kolumnerna 2 och 12 i motsvarande platta i varje panel där C1 motsvarar de fyra P1-plattorna i de fyra panelerna, C2 motsvarar de fyra P2-plattorna i de fyra panelerna motsvarar C3 de fyra P3-plattorna i de fyra panelerna, och C4 motsvarar de fyra P4-plattorna i de fyra panelerna.

7. Läkemedel 4, Trimethoprim-sulfamethoxazole, tillsats

  1. Tillsätt 14 ml sterilt dH 2 O till ettkonisktrör.
  2. Beräkna volymen som ska avlägsnas från läkemedlets stamlösning enligt formeln C1V1 = C2V2. Således V1 = (C2 x 14 ml) / C1.
    OBS: I vårt fall bereds trimethoprim-sulfamethoxazole i fyra olika koncentrationer från en stamlösning på 48 x 103 μg/ml.
    C1 = 512 μg/ml, V1 = 149,33 μL
    C2 = 1024 μg/ml, V1 = 298,66 μL
    C3 = 2048 μg/ml, V1 = 597,33 μL
    C4 = 4096 μg/ml, V1 = 1 194,66 μL
  3. Ta bort den beräknade volymen från 14 ml steril dH2O i varje rör och tillsätt sedan läkemedlet.
  4. Efter att ha förberett de erforderliga koncentrationerna av det fjärde läkemedlet, ta 50 μL och lägg till det till motsvarande brunnar mellan raderna B och G och kolumnerna 2 och 12 i de fyra plattorna i motsvarande panel där C1 motsvarar panel 1, C2 motsvarar panel 2, C3 motsvarar panel 3 och C4 motsvarar panel 4.

8. Beredning och tillsats av bakteriell inokulat E. coli ESBL

  1. Använd en steril slinga, överför en koloni av bakterieisolatet E. coli ESBL som tidigare odlats på en tallrik till 2 ml steril MHB och virvel.
  2. Kontrollera om det är turbiditet där det ska vara 0,5 McFarland med hjälp av en densitometer.
  3. Tillsätt 80 ml steril MH-buljong till en steril urinkopp.
  4. Tillsätt bakteriell inokulat från 0,5 McFarland inokulat i urinkoppen efter C1V1 = C2V2, där V1 = (106 x 80 ml) / 108 = 800 μL.
  5. Pipett 50 μL av inokulatlösningen 106 CFU/ml i varje brunn utom H12, som är sterilitetskontrollbrunnen.
  6. Inkubera panelerna vid 37 °C över natten.
  7. Efter inkubation, tillsätt 50 μL Iodotetrazolium för att registrera tillväxten i brunnarna.

9. Protokoll för FIC-mallen (kompletterande fil)

  1. Skriv den högsta koncentrationen av läkemedel 1 (Cefotaxime) i den gula cellen i panel A.
  2. Skriv den högsta koncentrationen av läkemedel 2 (Amikacin) i den gula cellen i panel B.
  3. Skriv den högsta koncentrationen av läkemedel 3 (Levofloxacin) i den gula cellen i panel C.
  4. Skriv den högsta koncentrationen av läkemedel 4 (Trimethoprim-sulfamethoxazole) i panel D.
  5. Spåra Redline (Tillväxt/inget tillväxtgränssnitt) genom att markera de brunnar som har tillväxt i rött.
  6. Skriv MIC av läkemedel 1 i tabellen över läkemedel 1 (ATB1).
  7. Skriv MIC av läkemedel 2 i tabellen över läkemedel 2 (ATB2).
  8. Skriv MIC av läkemedel 3 i tabellen över läkemedel 3 (ATB3).
  9. Skriv MIC av läkemedel 4 i tabellen över läkemedel 4 (ATB4).
  10. Så här beräknar du FIC för ATB1
    1. Bestäm brunnarna på gränssnittet Tillväxt/ingen tillväxt.
    2. Dubbelklicka på cellen bredvid FIC1 i tabell ATB1 och dra den gula cellen till vänster om panel A till den första markerade brunnen.
    3. Upprepa steg 9.10.2 för varje vald brunn där brunn 1 motsvarar FIC1, väl 2 motsvarar FIC2 och så vidare.
  11. Så här beräknar du FIC för ATB2
    1. Dubbelklicka på cellen bredvid FIC1 i tabell ATB2 och dra den gula cellen till vänster om panel B till den första förvalda brunnen.
    2. Upprepa steg 9.11.1 för varje förvald brunn.
  12. Så här beräknar du FIC för ATB3
    1. Dubbelklicka på cellen bredvid FIC1 i tabell ATB3 och dra den gula cellen till vänster om panel C till den första förvalda brunnen.
    2. Upprepa steg 9.12.1 för varje förvald brunn.
  13. Så här beräknar du FIC för ATB4
    1. Dubbelklicka på cellen bredvid FIC1 i tabell ATB4 och dra den gula cellen till vänster om panel D till den första förvalda brunnen.
    2. Upprepa steg 9.13.1 för varje förvald brunn.
  14. I tabellen som är märkt ATB1+2+3+4 summerar du FIC1 för varje ATB automatiskt. Samma sak kommer att hända för de andra FIC (FIC2, FIC3 och så vidare).
    1. I cellen som innehåller FIC och markerad i gult dubbelklickar du på den och markerar de summerade ΣFICs från tabell ATB1+2+3+4.
  15. Upprepa dessa steg för vart och ett av de nio ark som representerar de nio plattorna.
    OBS: I ark FIC kommer tabellen att visa den slutliga summerade FIC med tolkningen av det erhållna värdet.

10. MIC-bestämning med hjälp av mikrodilutionsanalysen för de fyra läkemedlen

  1. Märk fyra olika rader med förkortningen av varje testat läkemedel. Till exempel CTX för Cefotaxime, AMK för Amikacin, LEVO för Levofloxacin och SXT för Trimethoprim-sulfamethoxazole.
  2. Pipett 200 μL steril Muller Hinton buljong till brunn nummer 1 och brunn nummer 12 i varje använd rad. Tja nummer 12 kommer att fungera som den negativa kontrollbrunnen.
  3. Pipett 100 μL steril Muller Hinton buljong till brunnarna 2 till 11 i varje använd rad.
  4. Beräkna volymen för varje läkemedel som ska tillsättas med formeln C1V1 = C2V2. Således V1 = (C2 x 4 x V2) / C1. V2 är den slutliga volymen i brunnarna som är 200 μL, C1 är koncentrationen av stamlösningen, och C2 är den ursprungliga koncentrationen som vi behöver ha i den första brunnen.
    OBS: Här använder vi följande:
    Cefotaxime: C1 = 105 μg/ml, där vi späder ut den till 104 μg/ml, C2 = 256 μg/ml; således V1 = 20,48 μL
    Amikacin: C1 = 103 μg/ml, C2 = 64 μg/ml. V1 = 51,2 μL
    Levofloxacin: C1 = 5 x 103 μg/ml, där vi späder ut det till 5 x 102 μg/ml, C2 = 16 μg/ml; V1 = 25,6 μL
    Trimethoprim-Sulfamethoxazole: C1 = 48 x 103 μg/mL, C2 = 4096 μg/mL; V1 = 68,26 μL
  5. Pipett den erforderliga volymen för varje läkemedel i den första brunnen på motsvarande rad efter att ha tagit bort samma volym från 200 μL-buljongen för att erhålla en total volym på 200 μL efter tillsats av läkemedlet.
  6. Späd seriellt genom att ta bort 100 μL från brunn 1 till brunn 2 och så vidare tills den når väl 10 där de 100 μL som avlägsnats från brunn 10 kasseras. Observera att brunn 11 fungerar som den positiva kontrollbrunnen.
  7. Pipett 100 μL av 106 beredd bakteriell inokulat i varje brunn i varje använd rad, med undantag för brunn nummer 12 som fungerar som negativ kontroll.
  8. Inkubera vid 37 °C över natten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2A representerar de resultat som erhålls genom att kombinera Cefotaxime och Amikacin med specifika koncentrationer av Levofloxacin och Trimethoprim-sulfamethoxazole. Vi kan se i den vänstra delen av figuren de fyra plattorna som schematiskt presenteras med koncentrationerna av drogerna i den högra delen av figuren. Pilarna representerar brunnarna på gränssnittet Tillväxt/ingen tillväxt. De färgade brunnarna är brunnarna som innehåller tillväxt. Vi märker att den fjärde plattan inte innehåller tillväxt i kvadranten som innehåller kombinationen. Detta beror på att vi i denna platta har MIC av Levofloxacin som kommer att hämma tillväxten. I denna siffra kan vi se att MIC för Cefotaxime erhålls i brunnen A8, vilket motsvarar 32 μg / mL. Amikacins MIC erhålls i brunnen E1, vilket motsvarar 16 μg/ml. En hämningseffekt ses i raden som innehåller 1/2 MIC av Amikacin (rad D) utöver flera subMICs av Cefotaxime och Levofloxacin utöver 1/8 MIC av Trimethoprim-sulfamethoxazole. Denna hämning av bakterietillväxt i brunnar som innehåller subMIC-koncentrationer kan vara en form av synergism mellan dessa koncentrationer av de fyra läkemedlen.

Figur 2B representerar de resultat som erhålls genom att kombinera Cefotaxime och Amikacin med specifika koncentrationer av Levofloxacin och Trimethoprim-sulfamethoxazole. Vi kan se i den vänstra delen av figuren de fyra plattorna som schematiskt presenteras med koncentrationerna av drogerna i den högra delen av figuren. Pilarna representerar brunnarna på gränssnittet Tillväxt/ingen tillväxt. De färgade brunnarna är brunnarna som innehåller tillväxt. Följ samma tolkning för den fjärde plattan. I panelen som representeras av denna siffra kan vi se att hämningsmönstret för bakterietillväxt inträffade i rad D också, där brunnarna innehåller subMICs av Cefotaxime och levofloxacin, 1/2 MIC av Amikacin och 1/4 MIC av Trimethoprim-sulfamethoxazole.

Figur 2C representerar de resultat som erhålls genom att kombinera Cefotaxime och Amikacin med specifika koncentrationer av Levofloxacin och Trimethoprim-sulfamethoxazole. Vi kan se i den vänstra delen av figuren de fyra plattorna som schematiskt presenteras med koncentrationerna av drogerna i den högra delen av figuren. Pilarna representerar brunnarna på gränssnittet Tillväxt/ingen tillväxt. De färgade brunnarna är brunnarna som innehåller tillväxt. Följ samma tolkning för den fjärde plattan. När det gäller hämningsmönstret i denna panel kan vi se att I raderna C och D ses inte tillväxt. Detta innebär att i brunnarna innehåller flera subMICs av Cefotaxime och Levofloxacine utöver 1/2 MIC av Trimethoprim-sulfamethoxazole och 1/4 MIC och 1/2 MIC av Amikacin.

Figur 2D representerar de resultat som erhålls genom att kombinera Cefotaxime och Amikacin med specifika koncentrationer av Levofloxacin och Trimethoprim-sulfamethoxazole. Vi kan se i den vänstra delen av figuren de fyra plattorna som schematiskt presenteras med koncentrationerna av drogerna i den högra delen av figuren. Pilarna representerar brunnarna på gränssnittet Tillväxt/ingen tillväxt. Följ samma tolkning för den fjärde plattan. Vi kan se att endast i rad A och kolumn 1 har vi färgade brunnar som betyder tillväxt. Detta beror på att vi i denna panel har MIC av trimethoprim-sulfamethoxazole som helt kommer att hämma tillväxten.

Figure 1
Bild 1: Schematisk för Q-schackbrädet och paneler och en karta över hur drogerna läggs till. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: De experimentella resultaten som erhållits i studie 1 för vissa testade kombinationer.

Kompletterande fil. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Quadruple Checkerboard-metoden liknar schackbrädet och den tredimensionella schackbrädet i protokollet. Vissa avgörande åtgärder bör dock beaktas för att undvika fel under försöket.

Se till att testa för MIC för varje läkemedel mot det testade isolatet innan du börjar protokollet för att veta vilka koncentrationer som behövs för att starta utspädningarna med för läkemedel 1 och läkemedel 2 som måste seriellt spädas i plattorna. När det gäller läkemedel 3 och läkemedel 4 bör MIC också vara känt för att beräkna de koncentrationer som behövs för att testas (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC och MIC). Det finns många metoder för att bestämma MIC, men det bästa är att bestämma det med mikrodilutionstekniken eftersom Q-checkerboard-protokollet också använder mikrodilutionsanalysen för seriell utspädning.

I det första steget, medan du tejpar plattorna, se till att bänken är ren och täck plattorna med sterila lock för att undvika förorening. Det är viktigt att notera att detta protokoll kan göras med fyra 96-brunnsplattor som representerar de fyra panelerna, där varje platta är uppdelad i fyra mindre kvadranter. Antalet utspädningar kommer dock att minimeras för det första och andra läkemedlet. Dessutom kan man också använda djupa 384-brunnsplattor istället för att tejpa ihop fyra plattor. Det var dock inte tillgängligt när vi gjorde experimenten. Observera att när du väljer den platta som ska användas, se till att kontrollera kapaciteten för varje brunn eftersom den slutliga volymen i brunnen kommer att vara 250 μL.

Dessutom beror antalet plattor i varje panel och antalet paneler på antalet utspädningar som krävs för det tredje och fjärde läkemedlet. I detta experiment krävdes till exempel fyra utspädningar av det tredje läkemedlet och fyra utspädningar av det fjärde läkemedlet (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC och MIC); Således hade vi fyra plattor i varje panel och fyra paneler.

Utspädningen av det första läkemedlet sker i panelplattorna enligt kolumnerna. Utspädningen av det andra läkemedlet sker dock i separata plattor enligt raderna. Den tredje och fjärde drogen är inte seriellt utspädda. Varje koncentration som används bereds dock i ett separat rör och tillsätts varje brunn i en viss volym. Det är viktigt att notera att brunnarna som innehåller de fyra drogerna finns i kvadranten mellan raderna G och B och kolumnerna 2 och 12 endast. Schackbrädet och de tredimensionella schackbrädeprotokollen filmades eller skrevs inte i detta manuskript eftersom de är kända protokoll och syftet med detta manuskript är att prata om Q-checkerboard-protokollet. I schackbrädetekniken innehåller rad A endast läkemedel 1; således, visar MIC av drog 1. Kolumn 1 innehåller endast läkemedel 2; således, visar MIC av drog 2.

Detta koncept hålls i Q-Checkerboard protokollet där MIC av läkemedel 1 fortfarande visas i rad A och MIC av läkemedel 2 visas fortfarande i kolumn 1. Utöver detta presenterar de två tillsatta drogerna sin MIC i experimentet. Drug 3 har P4-plattan i varje panel där MIC för läkemedel 3 läggs till alla brunnar så vi bör inte observera tillväxten i denna tallrik. På samma sätt har läkemedel 4 A4-panel där MIC för läkemedel 4 läggs till alla brunnar i alla plattor i panel 4 så ingen tillväxt bör observeras i denna panel.

Tillväxten i plattorna registreras baserat på grumligheten i brunnarna, där de grumliga brunnarna anses ha tillväxt. Förutom grumligheten tillsätts 50 μL Iodotetrazolium och lämnas i några minuter. En färgförändring till rosa innebär att det finns tillväxt.

Den här metoden har vissa begränsningar. Det kräver hårt arbete och fokus. Pipetting fel kan uppstå eftersom denna teknik huvudsakligen baseras på pipetting. FIC-beräkningarna anses vara en begränsning i detta fall eftersom vi har att göra med fyra värden inte två eller tre. Om du lägger till ett värde ökar värdet på FIC i brunnen. Således måste de värden för FIC som bestämmer synergism, likgiltighet och antagonism omprövas.

FIC-värden kan ändras mellan flera hänvisningar om de standarder genom vilka synergism, antagonism och likgiltighet definieras. Vissa referenser säger att en FIC på 0,5 och mindre anses vara synergism13, medan andra säger att en FIC mindre än 0,8 anses vara synergism16. En annan referens anger att en FIC mindre än 1 anses vara synergism17. På grund av instabiliteten och konflikten när det gäller att definiera ett enhetligt standard-FIC för synergism ansåg vi att 1 var vår referens.

Den slutliga FIC beräknas genom att lägga till FIC-värdena för varje platta (9 FIC) och dividera den med antalet plattor som är 9. Det är viktigt att notera att panel 4 inte beaktas i resultaten eftersom den innehåller MIC för det fjärde läkemedlet så hämningen kommer att vara arbetet med ett enda läkemedel. Dessutom beaktas inte platta 4 i varje panel eftersom den innehåller MIC för läkemedel 3 där hämningen i denna platta kommer att vara enbart drogen 3. Således slutar vi med 9 plattor (16 - (4 + 3)).

För varje platta beräknas FIC: erna för brunnarna på growth/no Growth interface enligt följande formel: (MIC för läkemedel 1 i kombination / MIC av läkemedel 1 ensam) + (MIC av läkemedel 2 i kombination / MIC av läkemedel 2 ensam) + (MIC av läkemedel 3 i kombination / MIC av läkemedel 3 ensam) + (MIC av läkemedel 4 i kombination / MIC av läkemedel 4 ensam). Därefter divideras antalet erhållna med 4. Denna formel görs för varje brunn på growth/no Growth-gränssnittet i samma platta. Sedan summeras alla FIC:er på samma platta för att erhålla FIC på denna platta. Slutligen, som nämnts tidigare, tillsätts de nio slutliga finansunderrättarna på varje platta och divideras med 9 för att erhålla det slutliga FIC som kommer att tolkas.

En FIC mindre än 1 anses synergistisk där den har en viss grad av synergism: den är antingen något synergistisk (nära en) eller mer synergistisk (när den rör sig mot 0,5 och mindre). Denna beräkning och tolkning görs helt enkelt med hjälp av en FIC-mall som vi utvecklade. Vi går bara in i koncentrationerna, väljer brunnarna på growth/no Growth-gränssnittet för att beräkna FIC: erna, och vi kommer att få det slutliga FIC som tolkas enligt de nämnda kriterierna.

Denna metod gör det möjligt att testa alla möjliga kombinationer som kan göras med fyra droger i ett experiment som kan göras på en dag. Resultaten erhålls nästa dag. Medan, vid tidpunkten döda kurvanalys, mer tid, arbetsmaterial och labbarbetare behövs för att testa samma antal kombinationer, eftersom varje uppsättning kombinationer testas ensam i ett enda rör eller kopp vilket gör det tidskrävande. Denna metod kan användas inte bara för att testa antibakteriella läkemedelskombinationer, men för att testa alla typer av läkemedel som används för att behandla sjukdomar och behöver testas i kombination. Det kan också användas för att testa en kombination av droger och växtextrakt eller till och med en kombination av endast växtextrakt. Poängen är att denna metod kan användas för att testa inte bara specifika droger, men allt som kan kombineras.

Flera begränsningar åtföljer denna metod. Pipetting färdigheter är mycket viktiga när du utför denna analys och eventuella fel som kan uppstå medan pipetting och seriell utspädning kan negativt påverka resultaten och kan leda till falska negativa eller falska positiva resultat. Således kommer alla tekniska framsteg när det gäller rörmaskiner och robotar att vara till stor hjälp för att utföra denna analys. Den här metoden kräver många beräkningar och utspädningar så att ett enda fel kan ändra resultatet av resultaten. Denna teknik ger insikter om hämningseffekten endast och inte dödande effekten. Denna teknik studerar hämningen vid en enda tidpunkt och inte över tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ingen.

Acknowledgments

ingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1000 µL tips Citotest 4330000402
200 µL tips Citotest 4330-0013-17
50 mL centrifuge tube corning 430828 For drug 3 and 4 preparation
5 mL polysterene round-bottom Tube Falcon 352058 For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation
90mm petri dishes JRZ Plastilab As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette
96-well plates corning 3596 For serial diltuion and combining drugs
Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France 10177403 Drug 4
Ceforane, 1 g (Cefotaxime) PHARCO Pharmaceuticals 24750/2006 Drug 1
Densitometer
E. Coli ESBL strain Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon Bacterial strain
Mac Conkey + crystal violet agar BIO-RAD 64169508 For making agar plates used for subculturing
Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin) HIKMA Pharmaceuticals 2BXMIA56N-AEF Drug 2
Muller-Hinton Broth BIO-RAD 69444 For making bacterial media
Multichannel Pipette Thermo Scientific GJ54761 For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs
Paper Tape
Single Channel pipettes Thermo Scientific OH19855 HH40868 For the addition of media, bacteria and drugs
Tavanic, 500 mg (Levofloxacin) sanofi aventis 221937/2009 Drug 3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ibezim, E. Microbial resistance to antibiotics. African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).
  2. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
  3. Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era. Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).
  4. Nathan, C. Antibiotics at the crossroads. Nature. 431 (7011), 899-902 (2004).
  5. Bollenbach, T. Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution. Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).
  6. Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. C. Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases: role of antibiotic combination therapy. Journal of Clinical and Diagnostic Research: JCDR. 8 (6), (2014).
  7. Chanda, S., Rakholiya, K. Combination therapy: Synergism between natural plant extracts and antibiotics against infectious diseases. Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. , (2011).
  8. Cottarel, G., Wierzbowski, J. Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy. Trends in Biotechnology. 25 (12), 547-555 (2007).
  9. Kristiansen, J., Amaral, L. The potential management of resistant infection with non-antibiotics. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 40, 319-327 (1997).
  10. Tamma, P. D., Cosgrove, S. E., Maragakis, L. L. Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 25 (3), 450-470 (2012).
  11. Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. General principles of antimicrobial therapy. Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).
  12. Eliopoulos, G. M., Eliopoulos, C. T. Antibiotic combinations: Should they be tested. Clinical Microbiology Reviews. 1 (2), 139-156 (1988).
  13. Doern, C. D. When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).
  14. Stein, C., et al. Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates. PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).
  15. Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. Synergy between essential oil components and antibiotics: a review. Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).
  16. Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).
  17. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).

Tags

Biologi Nummer 173 antibiotikakombination schackbräde fyra läkemedelsinteraktion
Fyrdubbel schackbräde: En ändring av den tredimensionella schackbrädet för studier av läkemedelskombinationer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Isber, C., Stockman, D. L., Daoud,… More

Isber, C., Stockman, D. L., Daoud, Z. Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations. J. Vis. Exp. (173), e62311, doi:10.3791/62311 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter