Quadruple-Checkerboard: een wijziging van het driedimensionale dambord voor het bestuderen van medicijncombinaties

Summary

Dit protocol beschrijft hoe alle mogelijke combinaties kunnen worden bestudeerd die kunnen worden verkregen tussen vier geneesmiddelen in één experiment. Deze methode is gebaseerd op de standaard 96-well plate micro verdunningstest en de berekening van fractionele remmende concentraties (FIC's) om de resultaten te evalueren.

Abstract

Het concept van medicamenteuze combinatietherapie wordt vooral erg belangrijk met de drastische toename van de resistentie tegen geneesmiddelen. Het viervoudige dambord, ook wel het Q-dambord genoemd, is gericht op het maximaliseren van het aantal mogelijke combinaties dat kan worden verkregen tussen vier geneesmiddelen in één experiment om de tijd en het werk te minimaliseren dat nodig is om dezelfde resultaten met andere protocollen te bereiken. Dit protocol is gebaseerd op de eenvoudige microverdunningstechniek waarbij de geneesmiddelen worden verdund en gecombineerd in verschillende 96-putplaten.

In de eerste set van 96-put platen wordt Muller-Hinton bouillon toegevoegd, gevolgd door het eerste vereiste medicijn (bijv. Cefotaxime hier) om het serieel te verdunnen. Nadat de eerste stap is voltooid, wordt een andere set 96-putplaten gebruikt om het tweede medicijn te verdunnen (bijv. Amikaci), dat zal worden overgedragen door een specifiek volume van medicijn 2 te verwijderen en in de overeenkomstige putten te plaatsen in de eerste set van 96-putplaten die medicijn één bevatten. De derde stap wordt gedaan door de vereiste concentraties van het derde geneesmiddel (bijv. Levofloxacine) toe te voegen aan de juiste platen in de eerste set met combinatie van geneesmiddel 1 en 2. De vierde stap wordt gedaan door de vereiste concentraties van het vierde geneesmiddel (bijv. Trimethoprim-sulfamethoxazol) toe te voegen aan de juiste platen in de eerste set. Vervolgens wordt E. coli ESBL bacterieel entmateriaal bereid en toegevoegd.

Deze methode is belangrijk om alle mogelijke combinaties te evalueren en heeft een breder scala aan mogelijkheden om verder te testen voor in vivo testen. Ondanks dat het een vermoeiende techniek is die veel focus vereist, zijn de resultaten opmerkelijk en tijdbesparend waar veel combinaties in één experiment kunnen worden getest.

Introduction

Met de toename van resistentie als gevolg van overmatig gebruik en misbruik van antibiotica^1,2, is de noodzaak om nieuwe medicijnen en middelen te ontwikkelen om bacteriële infecties te behandelen cruciaal geworden. Nieuwe benaderingen zoals de ontwikkeling van nieuwe medicijnen zijn erg belangrijk om de weerstandscrisis te overwinnen. De farmaceutische industrie is echter niet geïnteresseerd in de ontwikkeling van nieuwe antimicrobiële middelen. Bovendien, als nieuwe geneesmiddelen worden ontwikkeld, zullen bacteriën blijven evolueren en resistentie ontwikkelen tegen deze nieuwe geneesmiddelen^3,4. Het probleem van resistentie zal dus niet worden opgelost, waardoor de noodzaak van een andere aanpak een must is die moet worden overwogen en bestudeerd om bacteriële resistentie te overwinnen.

Medicijncombinatie is een zeer belangrijk concept voor de behandeling van bacteriële infecties, voornamelijk die welke worden veroorzaakt door multidrug resistente pathogenen^5,6. Het vermindert het verloop van de behandeling, verlaagt de gegeven dosis; dus, het verminderen van de toxiciteit van het gegeven geneesmiddel, helpt bij het verminderen van de snelheid van resistentieontwikkeling en sensibiliseert in zekere zin de bacteriën voor de gegeven geneesmiddelen zoals beschreven in het concept van collaterale gevoeligheid^5,7,8,9.

Resistentieontwikkeling tegen één medicijn vereist één mutatie; resistentieontwikkeling tegen een combinatie van geneesmiddelen gericht op meerdere trajecten vereist echter verschillende onafhankelijke mutaties die door deze combinatie worden vertraagd. Een voorbeeld van verminderde resistentie tijdens het gebruik van combinatietherapie is de verminderde weerstand tegen Rifampine bij Mycobacterium Tuberculosis¹⁰. Een ander voorbeeld is een studie uitgevoerd door Gribble et al. die aantoonde dat de snelheid van opkomst van resistente stammen bij patiënten die Piperacilline alleen nemen hoger is dan bij patiënten die een combinatie van carboxypenicilline en aminoglycoside¹⁰nemen . Studies hebben aangetoond dat resistentieontwikkeling tegen aminoglycosides in evoluerende bacteriën deze stammen gevoelig maakte voor verschillende andere geneesmiddelen⁵. De combinatie tussen het bèta-lactamklasse geneesmiddel amoxicilline en de lactamaseremmer clavulaanzuur toonde succes bij de behandeling van resistente bacteriestammen⁸.

Het verminderen van de behandelingstijd is een goed voordeel als gevolg van medicijncombinaties. Bijvoorbeeld, een therapie van gecombineerde penicilline of ceftriaxon met gentamicine gedurende 2 weken zal dezelfde werkzaamheid geven die alleen door penicilline of ceftriaxon wordt gegeven wanneer het gedurende 4 weken wordt gegeven¹¹. Het combineren van geneesmiddelen maakt het gebruik van lagere doseringen van geneesmiddelen mogelijk die niet effectief zijn wanneer ze alleen worden gegeven, zoals de Sub-MICs. Het voorbeeld van sulfonamiden kan worden gegeven wanneer het gebruik van triple-sulfonamiden bij lagere doses de geproduceerde toxiciteit minimaliseert, namelijk kristalvorming of kristalurie bij gebruik van onoplosbare sulfonamiden in volledige doses¹².

Dus, het verlagen van de gegeven dosering en het tijdstip van de behandeling zal uiteindelijk de toxiciteit van de geneesmiddelen op het lichaam verminderen. Het idee om methoden te ontwikkelen om de interactie tussen gecombineerde geneesmiddelen te beoordelen is erg belangrijk. In één studie toonden de resultaten aan dat combinatietherapie effectiever is voor de behandeling van resistente soorten Acinetobacter en P. aeruginosa⁸.

Het geven van drugs in combinatie
Er zijn verschillende methoden waarmee we medicijncombinaties kunnen bestuderen, zoals de dambordmethode, de tijddodingscurvemethode en de E-testmethode¹³. De dambordmethode kan alle mogelijke combinaties tussen de twee geneesmiddelen in kwestie in één experiment zelf bestuderen. Bovendien werd het ontwikkeld om een combinatie van drie geneesmiddelen te bestuderen¹⁴. Nu breiden we dit uit om een combinatie van vier geneesmiddelen te bestuderen, voornamelijk voor de behandeling van multidrug-resistente pathogenen.

De time-kill curve assay wordt meestal uitgevoerd om te testen op het bacteriedodende effect van een bepaald medicijn. Het werd ook gebruikt om te testen op het effect van drugscombinaties waarbij verschillende geneesmiddelen in specifieke concentraties worden gecombineerd. Dit protocol vereist de bereiding van verschillende steriele buizen of kopjes waar we in elke beker de bouillon, combinatie van medicijnen en de vereiste bacteriële stam toevoegen. Na incubatie en registratie van de optische dichtheid op verschillende tijdstippen, worden de resultaten vergeleken met de normale groeisnelheid van de gebruikte stam om te zien of de groeisnelheid is toegenomen, afgenomen of niet is veranderd¹³.

E-testmethode wordt gewoonlijk uitgevoerd om te testen op de minimale remmende concentratie (MIC) waarbij een strip met een gradiëntconcentratie van het geneesmiddel in kwestie op een ingeënte plaat wordt geplaatst. Het werd ook gebruikt om de combinatie tussen twee geneesmiddelen te testen waarbij twee stroken loodrecht aan de plaat worden toegevoegd die elkaar kruisen op hun MMC's¹³.

Volgens de literatuur is er geen gouden standaard om synergie te definiëren en te bestuderen; het is dus moeilijk te beoordelen welke van de methoden die worden gebruikt om de combinatie te bestuderen beter is en welke betere en betrouwbaardere resultaten oplevert, voornamelijk¹³. Time-kill assay is echter arbeidsintensief, tijdrovend en duur^15,16, terwijl de E-testmethode is ontwikkeld om een combinatie tussen slechts twee geneesmiddelen te bestuderen. Checkerboard kan alle mogelijke combinaties tussen de twee geteste geneesmiddelen bestuderen en daarom is ervoor gekozen om deze techniek te ontwikkelen.

Protocol

1. Voorbereidingsstappen

1. Bereid Muller-Hinton bouillon (MHB) door 25 g MH bouillon toe te voegen aan 1 L gedestilleerd water en meng. Autoclaaf bij 121 °C gedurende 2,5 uur. Bewaar de autoclaafmedia vervolgens op kamertemperatuur of in de koelkast.
2. Subcultuur de bacteriën in kwestie (E. coli ESBL) op de agar media met behulp van de vier-kwadrant streaking methode en incuberen 's nachts bij 37 °C.
   1. Neem met behulp van een steriele lus één kolonie en verspreid deze in de eerste helft van de MacConkey-agarplaat door nauwe parallelle strepen te maken.
   2. Met behulp van de lus, verspreid de bacteriën in het tweede kwadrant door het uit het eerste kwadrant te strepen.
   3. Breid vanaf het tweede kwadrant de strepen in het derde kwadrant uit met behulp van nauwe parallelle strepen.
   4. Verspreid de bacteriën in het midden van het vierde kwadrant door het uit het derde kwadrant te strepen.

2. Voorbereiding van het paneel

1. Plaats vier 96-put platen naast elkaar om een vierkant te vormen. Plak met behulp van een tape hun billen aan elkaar.
2. Herhaal deze stap om vier panelen te verkrijgen die elk 4 platen bevatten en noem ze A1, A2, A3 en A4.
3. Voeg 50 μL MH-bouillon toe aan de putten tussen kolom 2 en kolom 11 in de 16 96-putplaten van de vier panelen.
4. Voeg 200 μL MH-bouillon toe aan de put H12 die dient als de negatieve controleput in de 16 96-putplaten van de vier panelen.
5. Voeg 150 μL MH-bouillon toe aan de putten A1 en H1 die dienen als positieve controleputten in de 16 96-putplaten van de vier panelen.

3. Geneesmiddel 1, Cefotaxime, seriële verdunning

1. Voeg aan een conische buis 15 ml steriele dH₂O toe.
   1. Bereken het volume dat uit de voorraadoplossing van het geneesmiddel moet worden verwijderd volgens de formule C₁V₁ = C₂V₂. Dus V₁ = (C₂ x 15 ml) / C₁.
      OPMERKING: In ons geval is de Cefotaxime-voorraadoplossing 10⁵ μg/ml en C₂ 256 μg/ml; dus V₁ = 38,4 μL.
2. Verwijder het berekende volume van de 15 ml steriele dH₂O en voeg vervolgens het medicijn toe.
3. Pipet 50 μL van de bereide geneesmiddeloplossing in elke put in kolom 11 en kolom 12, behalve H12.
4. Start de seriële verdunning door 50 μL uit kolom 11 te verwijderen en in de overeenkomstige putten in kolom 10 te plaatsen, en vervolgens van 10 tot het bereiken van kolom 2, waar de 50 μL uit kolom 2 zal worden weggegooid.
5. Herhaal stap 3.4 en 3.5 voor alle 16 96-putplaten van de vier panelen.

4. Geneesmiddel 2, Amkacine, seriële verdunning

1. Voeg aan een conische buis 10 ml steriele dH₂O toe.
2. Bereken het volume dat uit de voorraadoplossing van het geneesmiddel moet worden verwijderd volgens de formule C₁V₁ = C₂V₂. V₁ = (C₂ x 10 ml) / C₁.
   OPMERKING: In ons geval is de Amikacine-voorraadoplossing 10³ μg/ml en C₂ 64 μg/ml; dus V₁ = 64 μL.
3. Verwijder het berekende volume van de 10 ml steriele dH₂O en voeg vervolgens het medicijn toe.
4. Neem acht afzonderlijke 96-put platen.
5. Voeg aan elke plaat 100 μL MHB toe aan de putten tussen rijen G en B.
6. Voeg 100 μL van het eerder bereide medicijn 2-oplossing toe aan de putten van rij G.
7. Verdun serieel van rij G naar rij B door 100 μL uit elke put te halen en gooi ten slotte de 100 μL uit de putten van rij B.
8. Herhaal stap 4.5, 4.6 en 4.7 om acht borden voor te bereiden.

5. Overdracht van geneesmiddel 2 naar de vier panelen

1. Pipetteer 50 μL geneesmiddel 2 uit de putten tussen rijen G en B in de overeenkomstige putten in elke plaat in de vier panelen. Eén bereide 96-putplaat bevat 100 μL geneesmiddel 2, wat voldoende is voor twee platen in één paneel.

6. Geneesmiddel 3, Levofloxacine, toevoeging

1. Voeg aan vier verschillende conische buizen 14 ml steriele dH₂O toe.
2. Bereken het volume dat uit de voorraadoplossing van het geneesmiddel moet worden verwijderd volgens de formule C₁V₁ = C₂V₂. V₁ = (C₂ x 14 ml) / C₁.
   OPMERKING: In ons geval wordt Levofloxacine bereid in vier verschillende concentraties uit een stamoplossing van 5 x 10³ μg/ml.
   C₁ = 2 μg/ml, V₁ = 5,6 μL
   C₂ = 4 μg/ml, V₁ = 11,2 μL
   C₃ = 8 μg/ml, V₁ = 22,4 μL
   C₄ = 16 μg/ml, V₁ = 44,8 μL
3. Verwijder het berekende volume van de 14 ml steriele dH₂O uit elke buis en voeg vervolgens het medicijn toe.
4. Neem na het bereiden van de vereiste concentraties van het derde geneesmiddel 50 μL en voeg het toe aan de overeenkomstige putten tussen rijen B en G en kolommen 2 en 12 in de overeenkomstige plaat in elk paneel waar C1 overeenkomt met de vier P1-platen in de vier panelen, C2 komt overeen met de vier P2-platen in de vier panelen , C3 komt overeen met de vier P3-platen in de vier panelen en C4 komt overeen met de vier P4-platen in de vier panelen.

7. Geneesmiddel 4, Trimethoprim-sulfamethoxazol, toevoeging

1. Voeg aan een conische buis 14 ml steriele dH₂O toe.
2. Bereken het volume dat uit de voorraadoplossing van het geneesmiddel moet worden verwijderd volgens de formule C₁V₁ = C₂V₂. V₁ = (C₂ x 14 ml) / C₁.
   OPMERKING: In ons geval wordt trimethoprim-sulfamethoxazol bereid in vier verschillende concentraties uit een stamoplossing van 48 x 10³ μg/ml.
   C₁ = 512 μg/ml, V₁ = 149,33 μL
   C₂ = 1024 μg/ml, V₁ = 298,66 μL
   C₃ = 2048 μg/ml, V₁ = 597,33 μL
   C₄ = 4096 μg/ml, V₁ = 1 194,66 μL
3. Verwijder het berekende volume van de 14 ml steriele dH₂O van elke buis en voeg vervolgens het medicijn toe.
4. Neem na het bereiden van de vereiste concentraties van het vierde geneesmiddel 50 μL en voeg het toe aan de overeenkomstige putten tussen rijen B en G en kolommen 2 en 12 in de vier platen in het overeenkomstige paneel waar C1 overeenkomt met paneel 1, C2 overeenkomt met paneel 2, C3 overeenkomt met paneel 3 en C4 overeenkomt met paneel 4.

8. Bereiding en toevoeging van bacterieel entmateriaal E. coli ESBL

1. Breng met behulp van een steriele lus één kolonie van het bacteriële isolaat E. coli ESBL over die eerder op een plaat was gekweekt in 2 ml steriele MHB en vortex.
2. Controleer op de troebelheid waar het 0,5 McFarland moet zijn met behulp van een densitometer.
3. Voeg 80 ml steriele MH-bouillon toe aan een steriele urinebeker.
4. Voeg bacterieel entmateriaal van het 0,5 McFarland-entmateriaal toe aan de urinekop na C₁V₁ = C₂V₂, waarbij V₁ = (10⁶ x 80 ml) / 10⁸ = 800 μL.
5. Pipet 50 μL van de entoplossing 10⁶ KVE/ml in elke put behalve H12, de steriliteitscontroleput.
6. Incubeer de panelen 's nachts bij 37 °C.
7. Voeg na incubatie 50 μL Iodotetrazolium toe om de groei in de putten te registreren.

9. Protocol voor de FIC-template (Aanvullend Dossier)

1. Schrijf de hoogste concentratie geneesmiddel 1 (Cefotaxime) in de gele cel in paneel A.
2. Schrijf de hoogste concentratie van geneesmiddel 2 (Amikacine) in de gele cel in paneel B.
3. Schrijf de hoogste concentratie van geneesmiddel 3 (Levofloxacine) in de gele cel in paneel C.
4. Schrijf de hoogste concentratie van geneesmiddel 4 (Trimethoprim-sulfamethoxazol) in paneel D.
5. Traceer de Redline (Growth/no Growth interface) door de putten met groei in rood te benadrukken.
6. Schrijf de MIC van medicijn 1 in de tabel van medicijn 1 (ATB1).
7. Schrijf de MIC van geneesmiddel 2 in de tabel van medicijn 2 (ATB2).
8. Schrijf de MIC van geneesmiddel 3 in de tabel van geneesmiddel 3 (ATB3).
9. Schrijf de MIC van geneesmiddel 4 in de tabel van geneesmiddel 4 (ATB4).
10. FIC voor ATB1 berekenen
    1. Bepaal de putten op de interface Groei/geen groei.
    2. Dubbelklik in tabel ATB1 op de cel naast FIC1 en sleep de gele cel links van paneel A naar de eerst geselecteerde put.
    3. Herhaal stap 9.10.2 voor elke geselecteerde put waar goed 1 overeenkomt met FIC1, put 2 overeenkomt met FIC2, enzovoort.
11. Het FIC voor ATB2 berekenen
    1. Dubbelklik in tabel ATB2 op de cel naast FIC1 en sleep de gele cel links van paneel B naar de eerste vooraf geselecteerde put.
    2. Herhaal stap 9.11.1 voor elke vooraf geselecteerde put.
12. Het FIC voor ATB3 berekenen
    1. Dubbelklik in tabel ATB3 op de cel naast FIC1 en sleep de gele cel links van paneel C naar de eerste vooraf geselecteerde put.
    2. Herhaal stap 9.12.1 voor elke vooraf geselecteerde put.
13. Het FIC voor ATB4 berekenen
    1. Dubbelklik in tabel ATB4 op de cel naast FIC1 en sleep de gele cel links van paneel D naar de eerste vooraf geselecteerde put.
    2. Herhaal stap 9.13.1 voor elke vooraf geselecteerde put.
14. Som in de tabel met het label ATB1+2+3+4 automatisch de FIC1 van elke ATB op. Hetzelfde geldt voor de andere FIC's (FIC2, FIC3, enzovoort).
    1. Dubbelklik in de cel met FIC en geel gemarkeerd en selecteer de samengevatte ΣFICs in tabel ATB1+2+3+4.
15. Herhaal deze stappen voor elk van de negen vellen die de negen platen vertegenwoordigen.
    OPMERKING: In het fic-blad wordt in de tabel de definitieve samengevatte FIC met de interpretatie van de verkregen waarde weergegeven.

10. MIC-bepaling met behulp van de microdilutietest voor de vier geneesmiddelen

1. Label vier verschillende rijen met de afkorting van elk getest medicijn. Bijvoorbeeld CTX voor Cefotaxime, AMK voor Amikacine, LEVO voor Levofloxacine en SXT voor Trimethoprim-sulfamethoxazol.
2. Pipet 200 μL steriele Muller Hinton bouillon in put nummer 1 en put nummer 12 in elke gebruikte rij. Nou nummer 12 zal dienen als de negatieve controle goed.
3. Pipet 100 μL steriele Muller Hinton bouillon naar de putten 2 tot 11 in elke gebruikte rij.
4. Bereken het volume van elk toe te voegen geneesmiddel met behulp van de formule C₁V₁ = C₂V₂. Dus V₁ = (C₂ x 4 x V₂) / C₁. V₂ is het uiteindelijke volume in de putten dat 200 μL is, C₁ is de concentratie van de stamoplossing en C₂ is de initiële concentratie die we in de eerste put moeten hebben.
   OPMERKING: Hier gebruiken we het volgende:
   Cefotaxime: C₁ = 10⁵ μg/ml, waarbij we het verdunnen tot 10⁴ μg/ml, C₂ = 256 μg/ml; dus V₁ = 20,48 μL
   Amikacine: C₁ = 10³ μg/ml, C₂ = 64 μg/ml; dus V₁ = 51,2 μL
   Levofloxacine: C₁ = 5 x 10³ μg/ml, waarbij we het verdunnen tot 5 x 10² μg/ml, C₂ = 16 μg/ml; dus V₁ = 25,6 μL
   Trimethoprim-sulfamethoxazol: C₁ = 48 x 10³ μg/ml, C₂ = 4096 μg/ml; dus V₁ = 68,26 μL
5. Pipetteer het vereiste volume voor elk medicijn in de eerste put van de overeenkomstige rij na het verwijderen van hetzelfde volume uit de bouillon van 200 μL om een totaal volume van 200 μL te verkrijgen na toevoeging van het medicijn.
6. Serieel verdunnen door 100 μL te verwijderen van put 1 in put 2 enzovoort tot het bereiken van goed 10 waar de 100 μL die uit put 10 is verwijderd, zal worden weggegooid. Merk op dat put 11 dient als de positieve controle goed.
7. Pipet 100 μL van 10⁶ bereid bacterieel entmateriaal in elke put in elke gebruikte rij, behalve putnummer 12 die als negatieve controle dient.
8. Incubeer 's nachts bij 37 °C.

Representative Results

Figuur 2A geeft de resultaten weer die zijn verkregen door Cefotaxime en Amikacine te combineren met specifieke concentraties Levofloxacine en Trimethoprim-sulfamethoxazol. We kunnen in het linkerdeel van de figuur de vier platen zien die schematisch worden gepresenteerd met de concentraties van de medicijnen in het rechterdeel van de figuur. De pijlen vertegenwoordigen de putten op de interface Groei/geen Groei. De gekleurde putten zijn de putten die groei bevatten. We merken dat de vierde plaat geen groei bevat in het kwadrant dat de combinatie bevat. Dit komt omdat we in deze plaat de MIC van Levofloxacine hebben die de groei zal remmen. In deze figuur kunnen we zien dat de MIC van het Cefotaxime wordt verkregen in de put A8, die gelijk is aan 32 μg/ml. De MIC van Amikacine wordt verkregen in de put E1, die gelijk is aan 16 μg/ml. Een remmingseffect wordt waargenomen in de rij met 1/2 MIC Amikacine (rij D) naast verschillende subMICs van Cefotaxime en Levofloxacine naast 1/8 MIC trimethoprim-sulfamethoxazol. Deze remming van de bacteriegroei in putten die subMIC-concentraties bevatten, kan een vorm van synergisme zijn tussen deze concentraties van de vier geneesmiddelen.

Figuur 2B geeft de resultaten weer die zijn verkregen door Cefotaxime en Amikacine te combineren met specifieke concentraties Levofloxacine en Trimethoprim-sulfamethoxazol. We kunnen in het linkerdeel van de figuur de vier platen zien die schematisch worden gepresenteerd met de concentraties van de medicijnen in het rechterdeel van de figuur. De pijlen vertegenwoordigen de putten op de interface Groei/geen Groei. De gekleurde putten zijn de putten die groei bevatten. Volg dezelfde interpretatie voor de vierde plaat. In het paneel dat door deze figuur wordt vertegenwoordigd, kunnen we zien dat het remmingspatroon van bacteriële groei ook in rij D voorkwam, waar de putten subMICs van Cefotaxime en levofloxacine, 1/2 MIC van Amikacine en 1/4 MIC van Trimethoprim-sulfamethoxazol bevatten.

Figuur 2C geeft de resultaten weer die zijn verkregen door Cefotaxime en Amikacine te combineren met specifieke concentraties Levofloxacine en Trimethoprim-sulfamethoxazol. We kunnen in het linkerdeel van de figuur de vier platen zien die schematisch worden gepresenteerd met de concentraties van de medicijnen in het rechterdeel van de figuur. De pijlen vertegenwoordigen de putten op de interface Groei/geen Groei. De gekleurde putten zijn de putten die groei bevatten. Volg dezelfde interpretatie voor de vierde plaat. Wat betreft het remmingspatroon in dit paneel, we kunnen zien dat in rijen C en D groei niet wordt gezien. Dit betekent dat in de putten verschillende subMICs cefotaxime en levofloxacine bevatten naast 1/2 MIC trimethoprim-sulfamethoxazol en 1/4 MIC en 1/2 MIC amikacine.

Figuur 2D geeft de resultaten weer die zijn verkregen door Cefotaxime en Amikacine te combineren met specifieke concentraties Levofloxacine en Trimethoprim-sulfamethoxazol. We kunnen in het linkerdeel van de figuur de vier platen zien die schematisch worden gepresenteerd met de concentraties van de medicijnen in het rechterdeel van de figuur. De pijlen vertegenwoordigen de putten op de interface Groei/geen Groei. Volg dezelfde interpretatie voor de vierde plaat. We kunnen zien dat we alleen in rij A en kolom 1 gekleurde putten hebben die groei betekenen. Dit komt omdat we in dit paneel de MIC van trimethoprim-sulfamethoxazol hebben die de groei volledig zal remmen.

Figuur 1: Schema van de Q-checkerboard setup en panelen en een kaart van hoe de medicijnen worden toegevoegd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: De experimentele resultaten verkregen in proef 1 voor bepaalde geteste combinaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De methode Quadruple Checkerboard lijkt op het dambord en het driedimensionale dambord in het protocol. Er moet echter rekening worden gehouden met bepaalde cruciale stappen om fouten tijdens het experiment te voorkomen.

Zorg ervoor dat u voor de MIC van elk geneesmiddel test tegen het geteste isolaat voordat u het protocol start om te weten wat de concentraties zijn die nodig zijn om de verdunningen te starten voor geneesmiddel 1 en medicijn 2 die serieel in de platen moeten worden verdund. Wat geneesmiddel 3 en geneesmiddel 4 betreft, moet mic ook bekend zijn om de te testen concentraties te berekenen (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC en MIC). Er zijn veel methoden om de MIC te bepalen, maar het beste is om het te bepalen met de microdilutietechniek, omdat het Q-checkerboard-protocol ook de microdilutietest gebruikt voor seriële verdunning.

In de eerste stap, tijdens het tapen van de platen, zorg ervoor dat de bank schoon is en bedek de platen met steriele hoezen om besmetting te voorkomen. Het is belangrijk op te merken dat dit protocol kan worden gedaan met behulp van vier 96-putplaten die de vier panelen vertegenwoordigen, waarbij elke plaat is verdeeld in vier kleinere kwadranten. Het aantal verdunningen wordt echter geminimaliseerd voor het eerste en tweede medicijn. Daarnaast kan men ook diepe put 384-put platen gebruiken in plaats van vier platen aan elkaar te tappen. Het was echter niet beschikbaar toen we de experimenten deden. Houd er rekening mee dat bij het kiezen van de te gebruiken plaat, zorg ervoor dat u de capaciteit van elke put controleert, omdat het uiteindelijke volume in de put 250 μL zal zijn.

Bovendien hangt het aantal platen in elk paneel en het aantal panelen af van het aantal verdunningen dat nodig is voor het derde en vierde medicijn. In dit experiment waren bijvoorbeeld vier verdunningen van het derde geneesmiddel en vier verdunningen van het vierde geneesmiddel vereist (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC en MIC); dus we hadden vier platen in elk paneel en vier panelen.

De verdunning van het eerste medicijn vindt plaats in de platen van de panelen volgens de kolommen. De verdunning van het tweede medicijn vindt echter plaats in afzonderlijke platen volgens de rijen. De derde en vierde drugs worden niet serieel verdund. Elke gebruikte concentratie wordt echter in een afzonderlijke buis bereid en in een bepaald volume aan elke put toegevoegd. Het is belangrijk op te merken dat de putten met de vier geneesmiddelen alleen aanwezig zijn in het kwadrant tussen rijen G en B en kolommen 2 en 12. Het dambord en de driedimensionale dambordprotocollen zijn niet gefilmd of geschreven in dit manuscript omdat het bekende protocollen zijn en het doel van dit manuscript is om te praten over het Q-checkerboard protocol. In de dambordtechniek bevat rij A alleen medicijn 1; dus, het tonen van de MIC van drug 1. Kolom 1 bevat alleen geneesmiddel 2; dus, het tonen van de MIC van drug 2.

Dit concept wordt bewaard in het Q-Checkerboard protocol waar MIC van drug 1 nog steeds wordt getoond in rij A en MIC van drug 2 nog steeds wordt weergegeven in kolom 1. Daarnaast presenteren de twee toegevoegde medicijnen hun MIC in het experiment. Drug 3 heeft de P4-plaat in elk paneel waar de MIC van medicijn 3 aan alle putten wordt toegevoegd, dus we moeten de groei in deze plaat niet observeren. Evenzo heeft medicijn 4 een A4-paneel waarbij de MIC van medicijn 4 wordt toegevoegd aan alle putten in alle platen in paneel 4, dus er mag geen groei worden waargenomen in dit paneel.

De groei in de platen wordt geregistreerd op basis van de troebelheid in de putten, waar de troebele putten worden beschouwd als groei. Naast de troebelheid wordt 50 μL Iodotetrazolium toegevoegd en enkele minuten bewaard. Een verandering in kleur naar roze betekent dat er groei is.

Deze methode heeft bepaalde beperkingen. Het vereist hard werken en focus. Pipetteerfouten kunnen optreden omdat deze techniek voornamelijk gebaseerd is op pipetten. De FIC-berekeningen worden in dit geval als een beperking beschouwd, omdat we te maken hebben met vier waarden, niet met twee of drie. Het toevoegen van een waarde zal de waarde van de FIC in de put verhogen; daarom moeten de waarden van fic die synergisme, onverschilligheid en antagonisme bepalen, worden heroverwogen.

FIC-waarden kunnen veranderen tussen verschillende verwijzingen naar de normen waarmee synergisme, antagonisme en onverschilligheid worden gedefinieerd. In sommige referenties staat dat een FIC van 0,5 en minder als synergisme¹³wordt beschouwd , terwijl andere stellen dat een FIC van minder dan 0,8 als synergisme wordt beschouwd¹⁶. Een andere verwijzing stelt dat een FIC van minder dan 1 als synergisme wordt beschouwd¹⁷. Vanwege de instabiliteit en het conflict bij het definiëren van een uniforme standaard FIC van synergisme, beschouwden we 1 als onze referentie.

De uiteindelijke FIC wordt berekend door de FIC-waarden van elke plaat (9 FIC's) op te tellen en te delen door het aantal platen dat 9 is. Het is belangrijk op te merken dat panel 4 niet wordt meegenomen in de resultaten, omdat het de MIC van het vierde medicijn bevat, dus de remming zal het werk van een enkel medicijn zijn. Bovendien wordt plaat 4 in elk paneel ook niet overwogen, omdat het de MIC van medicijn 3 bevat, waarbij de remming in deze plaat alleen de handeling van medicijn 3 zal zijn. Zo eindigen we met 9 platen (16 - (4 + 3)).

Voor elke plaat worden de FIC's berekend voor de putten op de Growth/no Growth interface volgens de volgende formule: (MIC van drug 1 in combinatie / MIC van drug 1 alleen) + (MIC van drug 2 in combinatie / MIC van drug 2 alleen) + (MIC van drug 3 in combinatie / MIC van drug 3 alleen) + (MIC van drug 4 in combinatie / MIC van drug 4 alleen). Vervolgens wordt het verkregen aantal gedeeld door 4. Deze formule wordt voor elke put gedaan op de interface Groei/geen groei in dezelfde plaat. Vervolgens worden alle FIC's van dezelfde plaat bij elkaar opgeteld om de FIC van deze plaat te verkrijgen. Ten slotte worden, zoals eerder vermeld, de 9 definitieve FIC's van elke plaat toegevoegd en gedeeld door 9 om de uiteindelijke FIC te verkrijgen die zal worden geïnterpreteerd.

Een FIC kleiner dan 1 wordt beschouwd als synergetisch wanneer het een zekere mate van synergisme heeft: het is ofwel licht synergetisch (dicht bij één) of meer synergetisch (wanneer het naar 0,5 en minder gaat). Deze berekening en interpretatie gebeurt eenvoudig met behulp van een FIC-sjabloon dat we hebben ontwikkeld. We voeren gewoon de concentraties in, kiezen de putten op de interface Groei /geen groei om de FIC's te berekenen, en we krijgen de uiteindelijke FIC die wordt geïnterpreteerd volgens de genoemde criteria.

Deze methode maakt het mogelijk om alle mogelijke combinaties te testen die kunnen worden gedaan met behulp van vier geneesmiddelen in één experiment die op één dag kunnen worden gedaan. De resultaten worden de volgende dag verkregen. Terwijl tegen de tijd doden curve test, meer tijd, werkmaterialen, en laboratoriummedewerkers nodig zijn om hetzelfde aantal combinaties te testen, omdat elke set combinaties alleen wordt getest in een enkele buis of beker waardoor het tijdrovend. Deze methode kan niet alleen worden gebruikt om antibacteriële medicijncombinaties te testen, maar ook om alle soorten geneesmiddelen te testen die worden gebruikt om ziekten te behandelen en moet in combinatie worden getest. Het kan ook worden gebruikt om een combinatie van medicijnen en plantenextracten of zelfs een combinatie van alleen plantenextracten te testen. Het punt is dat deze methode kan worden gebruikt om niet alleen specifieke medicijnen te testen, maar alles wat kan worden gecombineerd.

Verschillende beperkingen gaan gepaard met deze methode. Pipetten vaardigheden zijn erg belangrijk tijdens het uitvoeren van deze test en elke fout die kan optreden tijdens pipetten en seriële verdunning kan de resultaten negatief beïnvloeden en kan leiden tot vals negatieve of vals positieve resultaten. Dus alle technologische vooruitgang met betrekking tot pipetten machines en robots zal een grote hulp zijn bij het uitvoeren van deze test. Deze methode vereist veel berekeningen en verdunningen, zodat elke fout de uitkomst van de resultaten kan veranderen. Deze techniek geeft alleen inzicht in het remmingseffect en niet in het moordeffect. Deze techniek bestudeert de remming op één moment en niet in de loop van de tijd.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 µL tips	Citotest	4330000402
200 µL tips	Citotest	4330-0013-17
50 mL centrifuge tube	corning	430828	For drug 3 and 4 preparation
5 mL polysterene round-bottom Tube	Falcon	352058	For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation
90mm petri dishes	JRZ Plastilab		As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette
96-well plates	corning	3596	For serial diltuion and combining drugs
Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole	By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France	10177403	Drug 4
Ceforane, 1 g (Cefotaxime)	PHARCO Pharmaceuticals	24750/2006	Drug 1
Densitometer
E. Coli ESBL strain	Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon		Bacterial strain
Mac Conkey + crystal violet agar	BIO-RAD	64169508	For making agar plates used for subculturing
Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)	HIKMA Pharmaceuticals	2BXMIA56N-AEF	Drug 2
Muller-Hinton Broth	BIO-RAD	69444	For making bacterial media
Multichannel Pipette	Thermo Scientific	GJ54761	For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs
Paper Tape
Single Channel pipettes	Thermo Scientific	OH19855 HH40868	For the addition of media, bacteria and drugs
Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)	sanofi aventis	221937/2009	Drug 3