Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Rilevamento automatizzato e ad alto rendimento dell'aderenza batterica alle cellule ospiti

Published: September 17, 2021 doi: 10.3791/62764
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2College of Veterinary Medicine, Texas A&M University

ERRATUM NOTICE

Summary

Il rilevamento delle interazioni patogeno ospite-batterico basate sull'aderenza fenotipica utilizzando l'imaging di etichettatura a fluorescenza ad alto rendimento insieme a metodi di analisi statistica automatizzati consente una rapida valutazione delle potenziali interazioni batteriche con le cellule ospiti.

Abstract

L'identificazione di patogeni batterici emergenti è fondamentale per la salute e la sicurezza umana. L'aderenza batterica alle cellule ospiti è un passo essenziale nelle infezioni batteriche e costituisce un segno distintivo di potenziale minaccia. Pertanto, l'esame dell'aderenza dei batteri alle cellule ospiti può essere utilizzato come componente della valutazione della minaccia batterica. Un metodo standard per enumerare l'aderenza batterica alle cellule ospiti è quello di co-incubare i batteri con le cellule ospiti, raccogliere i batteri aderenti, placcare le cellule raccolte su mezzi solidi e quindi contare le unità formanti colonie risultanti (CFU). In alternativa, l'aderenza batterica alle cellule ospiti può essere valutata utilizzando approcci basati sulla microscopia a immunofluorescenza. Tuttavia, le strategie convenzionali per l'attuazione di questi approcci richiedono molto tempo e sono inefficienti. Qui viene descritto un metodo di imaging automatizzato basato sulla microscopia a fluorescenza sviluppato di recente. Se combinato con l'elaborazione delle immagini ad alto rendimento e l'analisi statistica, il metodo consente una rapida quantificazione dei batteri che aderiscono alle cellule ospiti. Due specie batteriche, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa e Gram-positive Listeria monocytogenes e corrispondenti controlli negativi, sono state testate per dimostrare il protocollo. I risultati mostrano che questo approccio enumera rapidamente e accuratamente i batteri aderenti e riduce significativamente i carichi di lavoro e le tempistiche sperimentali.

Introduction

L'adesione batterica è un processo in cui i batteri si attaccano ad altre cellule o superfici. L'instaurazione di successo dell'infezione da parte di agenti patogeni batterici richiede l'adesione alle cellule ospiti, la colonizzazione dei tessuti e, in alcuni casi, l'invasione delle cellule ospiti1,2,3. Le malattie infettive emergenti costituiscono gravi minacce per la salute pubblica, come evidenziato dalla recente pandemia di COVID-194,5,6. È importante sottolineare che i patogeni nuovi o emergenti potrebbero non essere facilmente individuati utilizzando approcci basati sulla genomica, specialmente nei casi in cui l'agente patogeno è stato progettato per eludere il rilevamento o non contiene firme genomiche che lo identificano come patogeno. Pertanto, l'identificazione di potenziali agenti patogeni utilizzando metodi che valutano direttamente i segni distintivi della patogenicità, come l'aderenza batterica alle cellule ospiti, può svolgere un ruolo critico nell'identificazione dei patogeni.

L'aderenza batterica alle cellule ospiti è stata utilizzata per valutare i meccanismi di patogenesi batterica per decenni1,7. L'imaging microscopico8,9 e l'enumerazione dell'unità di formazione di colonie batteriche (CFU)10,11,12,13 mediante placcatura post-infezione sono due metodi di laboratorio ben sviluppati per testare l'aderenza microbica e/o l'infezione delle cellule ospiti14. Considerando la dimensione della scala micrometrica delle cellule batteriche, l'enumerazione delle cellule batteriche aderenti richiede generalmente l'uso di tecniche avanzate di microscopia ad alto ingrandimento, nonché approcci di imaging ad alta risoluzione, tra cui microscopia elettronica, microscopia ad espansione (ExM)15,16e imaging tridimensionale17 . In alternativa, l'enumerazione dei batteri legati o internalizzati all'interno delle cellule ospiti può essere eseguita placcando la serie di diluizione dei batteri raccolti su agar solido e contando le CFU risultanti10,12,13. Questo metodo è laborioso e include molti passaggi manuali, che introduce difficoltà nello stabilire una procedura standardizzata o automatizzata richiesta per le analisi ad alto rendimento18,19. Pertanto, lo sviluppo di nuovi metodi per valutare l'attaccamento delle cellule ospiti affronterebbe le attuali limitazioni nel campo.

Uno di questi metodi è descritto qui che utilizza la microscopia automatizzata ad alto throughput, combinata con l'elaborazione delle immagini ad alto throughput e l'analisi statistica. Per dimostrare l'approccio, sono stati eseguiti esperimenti con diversi patogeni batterici, tra cui Pseudomonas aeruginosa, un patogeno batterico Gram-negativo opportunistico di esseri umani, animali e piante14,20, che si trova spesso a colonizzare il tratto respiratorio di pazienti con funzioni di difesa dell'ospite compromesse. Questo approccio ha ottimizzato il processo di imaging microscopico descritto in precedenti studi14,20. Il rilevamento dell'imaging è stato semplificato da cellule ospiti e batteri marcati con fluorescenza per tracciare rapidamente la vicinanza di essi, il che ha ridotto drasticamente il carico di lavoro della microscopia per ottenere immagini ad alta risoluzione per distinguere i batteri. Inoltre, l'analisi statistica automatizzata delle immagini nel conteggio delle cellule ospiti e dei batteri ha sostituito l'esperimento pratico di placcatura CFU batterica per stimare il rapporto tra conta batterica aderente per cellula ospite. Per confermare la compatibilità di questo metodo, sono stati testati anche più ceppi batterici e tipi di cellule ospiti, come Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus , Bacillus cereus e Klebsiella pneumoniae, così come le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC), e i risultati supportano la diversità e l'efficacia del metodo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Coltura cellulare A549

  1. Mantenere la linea cellulare A549 in mezzo F-12K integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) e incubare a 37 °C, 5% CO2.
  2. Cambiare il mezzo ogni 3-4 giorni e passare all'85% -95% di confluenza.
  3. Brevemente, sciacquare le cellule con 1 x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4, se non diversamente indicato) e trattare con 1 ml di 0,25% di tripsina-0,53 mM soluzione di acido etilendiamminatetraacetico (EDTA) (immergendo lo strato cellulare) per circa 2 minuti a 37 °C.
  4. Aggiungere ulteriori 6 mL di terreno di crescita completo (F-12K medio + 10% FBS) per interrompere l'attività della proteasi. Quindi, placcare le cellule in un pallone sterile di coltura tissutale di polistirene T-75 con un rapporto di sottocoltivazione di 1: 3-1: 8. Il volume finale della cultura è di 12 ml.
  5. Seminare circa 1 x 104 cellule A549 (concentrazione cellulare: ~1 x 105 cellule/ml) su ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti il giorno prima dei test di aderenza.

2. Crescita batterica e colorazione

  1. Eseguire tutti i lavori batterici in un armadio di biosicurezza, laboratorio di livello di biosicurezza 2.
  2. Inoculare tutte le colture batteriche, tra cui P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes e B. subtilis, ecc., dal brodo di glicerolo congelato e coltivarle in brodo di soia tripttico (TSB, 3 ml) in un incubatore vibrante a 37 ° C durante la notte mantenuto a 250 giri / min.
  3. Il giorno successivo, utilizzare una diluizione 1:100 della coltura notturna per inoculare una sottocoltura e coltivarli in TSB (1 mL) per 3 ore alla fase esponenziale, misurare l'OD a 600 nm (OD600) per confermare. Assicurarsi che l'OD600 sia compreso tra 0,4 e 0,6.
  4. Prima di eseguire il test di aderenza batterio-ospite, le diluizioni seriali in piastre di sospensione batterica su piastre di TSB-agar, incubarle durante la notte a 37 ° C e quindi stabilire le CFU batteriche dal numero di colonie. Per P. aeruginosa, un OD600 di 1,0 corrisponde a 2 x 108 cellule batteriche vitali / mL, e per L. monocytogenes, un OD600 di 1,0 corrisponde a 9 x 108 cellule batteriche vitali / mL.
  5. Raccogliere le colture batteriche in fase esponenziale mediante centrifugazione a 13.000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente (RT), quindi lavarle una volta utilizzando 1x PBS (1 mL). Sospendere i pellet batterici in 1 mL di 1x PBS e determinare le concentrazioni misurando OD600 di sospensioni batteriche. Ad esempio, P. aeruginosa con OD600 di 0,5 rappresenta una concentrazione di 1 x 108 cellule batteriche/ml.
  6. Macchiare la sospensione batterica usando un colorante fluorescente verde o rosso a RT per 30 minuti con una rotazione delicata al buio. Per questo, aggiungere 2 μL del colorante colorante colorante concentrato 500 volte in 1 mL di sospensione batterica per diluire il colorante 1 volta. Per lavare via il colorante colorante, centrifugare i batteri colorati a 13.000 x g per 2 minuti e risospesare il pellet in 1 mL di 1x PBS per tre volte.
    NOTA: se nell'esperimento vengono utilizzati batteri con tag di fluorescenza (GFP, RFP, mCherry, ecc.), saltare questa fase di colorazione batterica. In questo protocollo sono stati utilizzati P. aeruginosa con tag GFP e L. monocytogenes colorante fluorescente rosso.
  7. Raccogliere le cellule batteriche colorate o i batteri marcati con GFP mediante centrifugazione a 13.000 x g per 2 minuti. Risospesare in mezzo fresco F-12K (1 mL) e misurare l'OD600 di ogni coltura. Successivamente diluire le colture alle concentrazioni desiderate in base alla molteplicità dell'infezione (MOI) e alla concentrazione della cellula ospite. Il volume finale utilizzato in questo esperimento è di 500 μL.
    NOTA: Ad esempio, se la concentrazione di cellule ospiti contata utilizzando la colorazione Trypan Blue è 1 x10 5 cellule / mL, la concentrazione desiderata di cellule batteriche a un MOI di 100 sarà 1 x 107 cellule / mL. La concentrazione di P. aeruginosa a 0,5 OD600 è 1 x 108/mL. Per ottenere la concentrazione desiderata, diluire la coltura di P. aeruginosa 10 volte, aggiungere 50 μL di coltura risospesa a 450 μL di mezzo fresco F-12K.

3. Aderenza batterica e colorazione delle cellule ospiti

  1. In primo luogo, lavare i monostrati di celle A549 seminati tre volte con PBS caldo 1x. Per ogni lavaggio, aggiungere 100 μL di 1x PBS a ciascun pozzetto, pipettare delicatamente su e giù tre volte, smaltire 1x PBS o attendere 10 s dopo l'aggiunta e quindi aspirare per rimuovere 1x PBS. Per determinare la cinetica dell'associazione batterica, sovrapporre le cellule con 100 μL di concentrazioni desiderate di sospensione batterica con diversi MOS (0, 1, 10 e 100). Abbassare i batteri a 200 x g per 10 minuti e incubare le cellule A549 infette a 37 °C, 5% CO2 per ulteriori 1 ora.
    NOTA: In questo esperimento, ogni condizione aveva un tripliceto tecnico.
  2. Rimuovere i batteri non legati lavando i monostrati cinque volte con PBS caldo 1x come descritto sopra. Aggiungere 100 μL di formaldeide al 4% (in 1x PBS) in ciascun pozzetto delle piastre a 96 pozzetti per fissare le cellule. Lasciare riposare le piastre sul ghiaccio per 15 minuti e quindi lavare via la soluzione di fissaggio usando 1x PBS tre volte.
  3. Per macchiare i nuclei, aggiungere 50 ng/mL di 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e incubarlo per 10 minuti a RT. Dopo l'incubazione, lavare i pozzetti tre volte usando 1x PBS. Coprire le cellule A549 infette con 100 μL di 1x PBS per evitare l'essiccazione. Procedere per la fase successiva o conservare la piastra a 4 °C per un massimo di 2 giorni al buio.

4. Imaging, elaborazione e analisi automatizzati a fluorescenza

  1. Per mantenere l'integrità dei dati, scegli in modo casuale e manuale cinque posizioni di ciascun pozzo per acquisire le immagini con ingrandimento 20x. Cattura le immagini fluorescenti di cellule e batteri A549 rispettivamente sotto i canali DAPI e GFP. Utilizzare il canale PE-Cy5 per i batteri macchiati dal colorante fluorescente rosso.
  2. Per avere una risoluzione migliore, elabora tutte le immagini per l'appiattimento e la deconvoluzione dello sfondo. Impostare i parametri come 68 μm di diametro della sfera di rotolamento per levigare e misurare automaticamente la funzione di diffusione del punto (PSF) della deconvoluzione dell'immagine in base all'obiettivo.
  3. Per contare tutte le cellule e i batteri qualificati, misurare l'intensità di fluorescenza delle cellule ospiti e dei batteri e impostare l'intensità di fluorescenza più debole delle cellule ospiti e dei batteri come soglie per il conteggio cellulare. Contare tutti i batteri vicini a una cellula ospite entro 15 μm di distanza come batteri aderenti come il diametro della cellula A549 è 10,59-14,93 μm21.
    NOTA: un'impostazione predefinita nel sistema di imaging conta selettivamente le cellule ospiti con diametri compresi tra 5-100 μm e batteri di dimensioni comprese tra 0,2 e 5 μm (larghezza e lunghezza).
  4. In base ai risultati dell'elaborazione manuale delle immagini sopra menzionati, applicare i parametri di levigatura dell'immagine, deconvoluzione, dimensioni degli oggetti, distanza e intensità di fluorescenza al resto delle immagini automatizzate. Dopo l'analisi automatizzata, considerare le letture critiche, come la conta totale delle cellule ospiti, le dimensioni e le forme delle cellule, le conteggie batteriche totali e la conta batterica media per cellula ospite, che era l'indicatore più importante, per determinare l'aderenza batterica.
  5. Esportazione dei dati e analisi statistica
    1. Esporta i risultati analizzati da tutte le immagini in un foglio di calcolo (ad esempio, formato "xlsx"). Il sistema automatizzato genera due serie di risultati: 1) la conta batterica media aderente da ciascuna immagine; 2) i dati informativi di ogni singola cellula ospite, come la conta batterica aderente su una singola cellula, la dimensione dell'ospite e l'intensità media di fluorescenza della cellula ospite e dei batteri, dall'immagine corrispondente.
    2. Calcola il numero medio e la deviazione standard delle conteggiche batteriche aderenti da tutte le immagini per rappresentare il livello di aderenza batterica rispetto ai controlli negativi. In questo metodo, E. coli e B. subtilis sono serviti come controlli negativi nel testare l'aderenza batterica Gram-negativa e Gram-positiva, rispettivamente. Eseguire ANOVA bidirezionali per testare variazioni significative tra i punti dati durante il trattamento per tre esperimenti indipendenti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Per sviluppare il test di aderenza batterica basato sull'imaging a fluorescenza, P. aeruginosa ceppo PAO1 e la sua controparte ad aderenza negativa E. coli sono stati utilizzati per testare l'efficacia del protocollo, poiché l'aderenza di questi batteri alle cellule A549 era stata riportata14,20,22. In primo luogo, P. aeruginosa (PAO1) marcata GFP e E. coli marcata GFP sono state co-incubate con una linea cellulare epiteliale immortalata umana A549 in vari MOI, rispettivamente. I risultati hanno mostrato che PAO1 ha aderito alle cellule A549 in modo dose-dipendente (Figura 1A,B); nel frattempo è stata verificata anche un'aderenza quasi nulla di E. coli (Figura 1A,B). C'erano 50 immagini catturate e analizzate ad ogni MOI. Sono stati eseguiti ANOVA bidirezionali per testare le variazioni significative di tre esperimenti indipendenti.

Figure 1
Figura 1: Il batterio Gram-negativo P. aeruginosa ha aderito alle cellule A549 entro 1 ora dalla co-incubazione. (A) Immagini microscopiche per una panoramica dell'aderenza batterica in cui le immagini sono state scattate utilizzando l'ingrandimento 20x. PAO1 e il controllo di aderenza negativa E. coli hanno aderito alle cellule A549 alla molteplicità indicata di infezioni (MOI). I batteri erano etichettati con GFP-fluorescenza. I nuclei cellulari A549 sono stati colorati da DAPI. La barra della scala è di 50 μm. (B) Quantificazione della conta batterica aderente per cellula A549. Per ogni ceppo batterico testato (PAO1 ed E. coli)in ogni MOI, un totale di 50 immagini sono state applicate all'analisi in ogni condizione. I dati sono ± deviazione standard (SD) da un rappresentante di tre esperimenti indipendenti. È stata eseguita l'analisi statistica bidirezionale ANOVA. * p < 0,05, *** p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati simili sono stati osservati anche quando sono stati utilizzati batteri Gram-positivi, L. monocytogens23,24 e il suo controllo negativo B. subtilis ( Figura 2A,B). L'aderenza alle cellule A549 era significativa in L. monocytogenes rispetto a B. subtilis (Figura 2A,B).

Figure 2
Figura 2: L. monocytogenes batterico Gram-positivo ha aderito alle cellule A549 entro 1 ora dalla co-incubazione. (A) Immagini microscopiche per una panoramica di L. monocytogenes, così come il controllo negativo B. subtilis aderenza alle cellule A549 a diversi MOI. I batteri sono stati colorati usando un colorante rosso-fluorescente. I nuclei cellulari A549 sono stati colorati con DAPI. La barra della scala è di 50 μm. (B) Quantificazione della conta batterica aderente per cellula A549. Per ogni ceppo batterico testato (L. monocytogenes e B. subtilis) in ogni MOI, un totale di 50 immagini sono state applicate all'analisi in ogni condizione. I dati sono ± SD da un rappresentante di tre esperimenti indipendenti. È stata eseguita l'analisi statistica bidirezionale ANOVA. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Un'immagine rappresentativa della segmentazione e dei conteggi di P. aeruginosa aderente all'ospite è mostrata nella Figura 3 (Maschere gialle: batteri selezionati, contorno rosso: singola conta batterica). Le impostazioni per i bersagli sia dell'ospite che dei batteri sono descritte nella sezione Protocollo.

Figure 3
Figura 3: Immagini di esempio di segmentazione e conteggio batterico nel processo di analisi automatizzato. (A) Immagini microscopiche di P. aeruginosa hanno aderito ad A549 ad un MOI di 100 senza segmentazione batterica e conteggio. (B) La stessa immagine dopo l'analisi statistica della segmentazione e del conteggio batterico. Maschere gialle: batteri selezionati, contorno rosso: singola conta batterica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I risultati delle analisi automatizzate, comprese le dimensioni e le aree delle cellule ospiti, la conta batterica e delle cellule ospiti, nonché la conta batterica media per cellula ospite, che rappresenta lo stato di salute delle cellule ospiti, il livello di aderenza batterica e la citotossicità batterica, sono elencati nella Tabella 1 e nella Tabella 2. La Tabella 1 rappresenta le conteggie batteriche aderenti a livello cellulare medio da diverse immagini, mentre la Tabella 2 rappresenta le conteggiche batteriche aderenti analizzate su un'immagine a un singolo livello cellulare A549. Queste immagini rappresentative sono state catturate da cellule A549 infettate da PAO1 ad un MOI di 100. I risultati analizzati dell'immagine iniziale nella Figura 3 sono stati elencati come Immagine 1 nella Tabella 1 e nella Tabella 2.

Tabella 1: Risultati dell'analisi statistica di 9 immagini rappresentative a livello cellulare. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

In ogni immagine, il conteggio della somma dell'ospite e le macchie della somma batterica rappresentano rispettivamente i conteggi totali dei nuclei dell'ospite e i conteggi batterici totali riconosciuti dal sistema in base ai parametri sopra descritti. Inoltre, il calcolo automatizzato del rapporto delle macchie batteriche rappresenta la conta batterica media per cellula ospite, derivata dal conteggio delle macchie di somma batterica / somma dell'ospite. Inoltre, possono essere incluse anche letture aggiuntive; ad esempio, i conteggi degli ospiti aderenti ai batteri illustrano il fenomeno universale o specifico dell'aderenza ospite-batterio. Quando i conteggi degli ospiti aderenti ai batteri sono molto inferiori ai conteggi della somma degli ospiti, al contrario, la conta batterica media per ospite è relativamente alta, il che rappresenta che tale fenotipo di aderenza ha un'eterogeneità significativa.

Tabella 2: Analisi statistica a singolo cellulare di un'immagine rappresentativa. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

L'analisi delle cellule singolari fornisce maggiori dettagli sulle cellule ospiti e sui bersagli batterici in ogni immagine, il che è più utile quando si raccolgono altre caratteristiche batteriche e le si applica all'analisi computazionale automatizzata per sviluppare uno strumento più potente nella valutazione della potenziale patogenicità batterica, come un modello di apprendimento automatico che è in fase di studio. In questo protocollo, la dimensione e l'area dell'ospite rappresentano i diametri e le aree di ciascun nucleo ospite macchiato e l'intensità di fluorescenza dell'ospite rappresenta l'intensità media dei nuclei colorati. Il conteggio e l'area delle macchie batteriche rappresentano i bersagli batterici aderenti a ciascuna cellula ospite e alle loro aree totali. L'intensità di fluorescenza batterica rappresenta l'intensità media di tutti i batteri aderenti.

Non sorprende che alcuni batteri virulenti non abbiano aderito all'A549 mentre alcuni batteri con alti livelli di aderenza batterica non sono necessariamente correlati alla patogenicità. È stato anche testato un diverso tipo di cellula ospite, HUVEC, per massimizzare l'applicazione di questo metodo. I risultati hanno mostrato l'efficace rilevazione e i diversi fenotipi di aderenza dei batteri (Figura 4). Diverse cellule ospiti potrebbero aumentare la stima di potenziali patogeni batterici; ad esempio, i patogeni Serratia rubidaea e Streptococcus agalactiae erano aderenti a HUVEC ma non alle cellule A549 (Figura 4). Inoltre, l'E. coli enteroemorragico citotossico (EHEC) non era aderente né ad A549 né a HUVEC (Figura 4). Pertanto, è fondamentale garantire che il metodo sia adatto a più tipi di cellule ospiti per rispondere alla specificità delle interazioni ospite-batteri. Entrambe le cellule A549 e HUVEC sono state co-incubate con batteri a un MOI di 100 a 37 °C per 1 ora.

Figure 4
Figura 4: Specificità dell'aderenza batterica alle cellule ospiti A549 e HUVEC. I ceppi batterici, tra cui S. rubidaea, S. agalactiae, E. coli enteroemorragico citotossico (EHEC), PAO1,P. aeruginosa ΔpilA (PAO-NP),E. coli, S. aureus e S. aureus ΔsaeR,sono stati testati su cellule A549 e HUVEC con un MOI di 100 per 1 ora di co-incubazione a 37 °C, 5% CO2. I batteri sono stati macchiati con un colorante rosso-fluorescente. Le conteggiche batteriche aderenti sono state quantificate da 45 immagini/ceppo batterico in tre esperimenti indipendenti. I dati sono medi ± SD da un rappresentante di tre esperimenti indipendenti. * p < 0,05, *** p < 0,001, **** p<0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Il protocollo descrive un approccio automatizzato per enumerare l'attaccamento batterico alle cellule ospiti. L'approccio descritto presenta diversi vantaggi interessanti rispetto ai metodi convenzionali. In primo luogo, questo approccio consente la quantificazione precisa del numero di cellule patogene microbiche che sono attaccate alle singole cellule ospiti. È importante sottolineare che questa quantificazione può essere eseguita senza la necessità di laboriose raccolte batteriche, diluizioni seriali, placcatura su mezzi solidi e determinazione delle CFU10,11,12. Pertanto, la tecnica descritta riduce il carico di lavoro complessivo necessario per quantificare l'aderenza batterica. Va apprezzato che i vantaggi dell'approccio proposto sono amplificati quando si cerca di rilevare fenotipi di aderenza in esperimenti di screening su larga scala, compresa l'identificazione di geni batterici o ospiti in librerie mutanti o CRISPR, rispettivamente, che regolano questo processo. In secondo luogo, la valutazione diretta delle interazioni tra l'ospite e le cellule batteriche utilizzando la microscopia a fluorescenza fornisce informazioni per chiarire i meccanismi di patogenicità batterica, comprese le alterazioni nella sopravvivenza, nella morfologia o nella dinamica di un ospite o delle cellule batteriche. Infine, l'analisi statistica automatizzata eseguita sulle immagini raccolte nell'analisi non solo fornisce una quantificazione complessiva dell'associazione batterica media con le cellule ospiti, ma consente anche la valutazione delle interazioni dinamiche, monocellulari, ospite-patogeno.

Nonostante questi vantaggi, i metodi descritti presentano alcune importanti limitazioni. In primo luogo, la colorazione fluorescente dei batteri è necessaria per enumerare la loro aderenza alle cellule ospiti. Pertanto, il colorante colorante fluorescente deve macchiare selettivamente i batteri rispetto alle loro controparti delle cellule ospiti. Inoltre, il colorante colorante non deve alterare il fenotipo di attaccamento dei batteri che lo trasportano. Pertanto, l'ottimizzazione della colorazione a fluorescenza batterica (ad esempio, concentrazione, durata della colorazione) deve essere determinata prima di eseguire gli studi di aderenza descritti. In questo protocollo, la colorazione fluorescente di ceppi batterici tra cui P. aeruginosa, L. monocytogenes, E. coli e B. subtilis per 30 minuti non influisce sulla loro aderenza alle cellule ospiti. In secondo luogo, a causa della specificità delle diverse interazioni ospite-batterio, un singolo tipo di cellula ospite potrebbe non essere sufficiente per valutare l'attaccamento batterico alle cellule ospiti. Pertanto, potrebbero essere necessari più tipi di cellule ospiti per ottenere una comprensione completa del grado in cui un dato microbo può aderire alle superfici delle cellule ospiti. In terzo luogo, la segmentazione batterica non era completamente efficiente quando i batteri spingevano l'aggregazione durante la co-incubazione, ad esempio S. aureus, o quando i batteri formavano grumi a un MOI più alto (>100), ad esempio P. aeruginosa. In questo caso, è necessario applicare un ingrandimento maggiore per catturare le immagini, oppure più immagini dovrebbero essere utilizzate nell'analisi per ridurre l'effetto dell'aggregazione batterica.

Le cellule epiteliali polmonari umane (A549) e gli HUVEC sono stati impiegati negli studi per dimostrare la plasticità dell'approccio rispetto al tipo di cellula ospite ed entrambe hanno mostrato alti livelli di suscettibilità all'aderenza batterica. L'uso di due tipi di cellule ospiti ha anche dimostrato che il metodo descritto potrebbe essere ampiamente applicato per caratterizzare rapidamente le interazioni ospite-batterio aderenti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Tutti gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgments

Siamo grati al Dr. Kaite Zlotkowski di Biotek Inc. per il loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dal Dipartimento della Difesa con il numero di contratto W911NF1920013 a PdF, dalla Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) e dal Dipartimento degli Interni con contratto n. 140D6319C0029 a PdF. Il contenuto delle informazioni non riflette necessariamente la posizione o la politica del governo e non dovrebbe essere dedotto alcun avallo ufficiale.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS VWR 45001-130
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher 62248 Host cell staining dye
96 well plate Corning 3882 Half area well, flat clear bottom
A549 cells ATCC  CCL 185 Mammalian cell line
BactoView Live Red Biotium 40101 Bacteria staning dye
Centrifuge Eppendorf 5810R
CFSE cell division tracker BioLegend 423801
Cytation 5  BioTek Cytation 5  Cell imaging multi-mode reader
E. coli Laboratory stock 
EGM bulletKit Lonza CC-3124 HUVEC cell culture medium
EHEC NIST collections
F-12k medium ATCC  302004 A549 cell culture medium
Fetal bovine serum Corning 35-016-CV
HUVEC Laboratory stock 
L. monocytogenes NIST collections
OD600 DiluPhotometer IMPLEN
P. aeruginosa Dr. Lori Burrows laboratory stock
P. aeruginosa ΔpilA Dr. Lori Burrows laboratory stock
S. agalactiae NIST collections
S. aureus BEI NR-46543
S. aureus ΔsaeR BEI NR-48164
S. rubidaea NIST collections
Typical soy broth Growcells MBPE-4040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
  2. Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
  3. Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
  4. Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver. Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).
  5. Ortiz-Prado, E., et al. Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).
  6. Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19. Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).
  7. Woo, V., et al. Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression. Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).
  8. Pandey, A., et al. Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection. Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).
  9. Ding, S., et al. Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes. iScience. 24 (3), 102192 (2021).
  10. Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).
  11. Qin, Q. M., et al. Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).
  12. Qin, Q. M., et al. A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).
  13. Pandey, A., et al. Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).
  14. Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells. Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).
  15. Götz, R., et al. Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy. Nature Communications. 11, 6173 (2020).
  16. Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).
  17. Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).
  18. Hoffmann, S., et al. High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).
  19. Hazan, R., Que, Y. -A., Maura, D., Rahme, L. G. A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates. BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).
  20. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).
  21. Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).
  22. Farinha, M. A., et al. Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice. Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).
  23. Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes. Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).
  24. Ortega, F. E., et al. Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).

Tags

Immunologia e infezione Numero 175

Erratum

Formal Correction: Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells
Posted by JoVE Editors on 02/08/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

to:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

Rilevamento automatizzato e ad alto rendimento dell'aderenza batterica alle cellule ospiti
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik,… More

Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik, E., Samuel, J. E., de Figueiredo, P. Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. J. Vis. Exp. (175), e62764, doi:10.3791/62764 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter