Summary
このプロトコルは、エアロポニックシステムを実装することにより 、大麻サティバ L.のクローン伝播のための教育情報を提供するように設計されています。ここで説明する方法は 、大麻属の望ましい形態学的および化学的特性を正常に再現するために必要なすべての供給およびプロトコルを含む。
Abstract
このプロトコルは、エアロポニックシステムを利用した麻の効率的なクローン伝播技術の標準化を記述する。一次撮影挿し木は、「チェリーワイン」と「レッドロビン」(17-20%w/w CBD)という名前の2つの麻の品種から切除され、「母植物」として機能しました。システムに配置する前に、切除切りの基礎部分の根の発達を刺激するために、オーキシン前駆体(インドール-3-酪酸)を適用した。3日ごとに栄養ミスト溶液で挿し木を軽くミストし、窒素、リン、カリウムなどの必須栄養素が含まれているため、栄養補助を提供しました。エアロポニックシステムの水貯蔵所は、5.0〜6.0の間のpH範囲と20〜22 °Cの間の水温を維持した。 水中ウォーターポンプを使用して、挿し木に水を送り込んだ。シュートチップの切削は、根の発達が起こるまで1日24時間の光を提供され、根ざした切削は研究目的で移植された。これらのエアロポニックシステムは大麻の伝播のための望ましい結果を生成することが証明 されている 。ここで説明する方法は 、大麻の無性伝播のためのより効率的な手段を可能にするために、伝統的な方法から生じる潜在的な時間の制約を軽減します。
Introduction
大麻L.は、カナバセ科に分類される毎年恒例の、栄養価の高い開花植物です。カンナビノイドは、主に女性の花序の組織の外側表皮層に位置する腺毛状突起内で産生され、主に徐々に認識された薬効のために、ますます人気のある研究トピックになりつつある。カンナビジオール(CBD)は、Δ9-テトラヒドロカンナビノール(THC)の後に大麻に見られる2番目に顕著なカンナビノイドであり、鎮痛特性2、抗けいれん特性3、抗うつ特性4、糖尿病のリスクを低減する、および様々な睡眠障害を治療する多くの薬効に起因する6。大麻植物の代謝産物に関連する健康上の利点の多くのために、その商業規模の生産7の需要が高まっています。この需要を満たすために、栽培方法は絶えず改善され、新興の大麻産業に継続的に一貫した、高品質の植物材料を供給するために再発明されています。
大麻の伝播は、性的または無性生殖の2つの方法で促進することができます。性的生殖の例は、発芽することができる種子をもたらす男性のstamenから花粉で女性の卵子を受粉することです。種子発芽は、干ばつ耐性、昆虫耐性、収量の増加、ポテンシーの増加などの形質を含む子孫大麻植物の品質を向上させるために、望ましい表現型形質が親のラインで選択される繁殖および栽培目的で使用されてきた信頼性の高い栽培方法です8.しかし、意図しないクロス受粉は、性的生殖を行う際に固有のリスクであり、望ましくない子孫を引き起こし、望ましい形質の潜在的な喪失または望ましくない形質の導入につながる。この意図しない受粉の例は、麻の種子を受け取る麻栽培者がTHC-生産花粉で受粉し、非準拠植物(>0.3%合計THC w/w)9による大きな経済的損失をもたらす。さらに、女性のみで構成される作物を生成するには、女性化種子を非女性化種子の代わりに播種する必要があり、これは雌雄同体症やその他の望ましくない形質を経済的損失に導く可能性があります。大麻の性的生殖の制限を克服するために、無性生殖は大麻産業10の商業生産モデルで広く実践されています。
大麻の無性生殖は、望ましい農学および医薬特性を運ぶ植物の商業生産を可能にする単一の遺伝子型の乗算を可能にする単一の植物を、必要とするのみ。無性大麻の繁殖の一般的な形態は、根形成を誘発するために湿度ドームで覆われている土壌のない基質11に雌植物の小さな部分を切断し、挿入することです。この方法は成功しているが、一般的な欠点は、新しい、敏感な挿し木に有害であり得る真菌病原体のための理想的な成長環境を提供し、ドーム内の湿度の高いレベル(通常80%以上)の蓄積です。無性の伝播のもう一つの形態は、無菌技術が限られたspace12で昆虫、微生物、およびウイルスフリー大麻植物物質の伝播を可能にする組織培養を用いた微小伝播である。しかし、このプロセスは高価で時間がかかり、大規模な大麻施設では一般的にアクセスできない訓練を受けた実験技師が必要です。
大麻のクローン伝播に関する公表された研究報告書はほとんどありません。研究目的と工業生産のための大麻の無性生殖の理解のための基礎を提供するために、この研究は、大麻のクローン伝播のためのエアロポニックシステムを採用することの容易さとアクセシビリティを実証することを目的とした。エアロポニックシステムは大麻の無性伝播に最適で、栄養豊富な水を切削に一貫して供給し、早期の根形成をタイムリーに誘導し、必要に応じて植物を無期限に維持することを可能にする。
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Protocol
1. クローン伝播のための母植物の生成
- その意図された使用に固有の望ましい形態学的および化学的特性を示す健康な、女性の母の植物を選択する。
- 母植物がクローン伝播(すなわち挿し木)に適切な大きさ(およそ25個の成熟した芽)に達することを許可する。
- 将来の伝播のために芽の成長を促進するために、母植物が栄養成長段階(明:暗い=18時間=18時間:6時間)にとどまることを可能にする。
2. エアロポニックシステムの構築と準備
- まず、容器の上に蓋を置きます(38.1 cm x 25.4 cm x 30.48 cm)。各穴の間に十分なスペース(好ましくは3cm)を設けながら、所望の穴数を蓋にあける。
- 水ポンプ(材料表)を容器の中央に配置します。
- 7~8 Lの蒸留水を容器に注ぎ、ポンプノズルが水線の上に約2.5cm残るようにします。
注:これは、水中ウォーターポンプ(材料表)が容器の蓋全体に広がるのに十分な力で水を押すことができることを保証します。蒸留水を推奨します。ただし、通常の水道水を使用することもできます。 - 適切な量のロックウールキューブ(3.81 cm)(材料表)またはメディアキューブを各スロットに取り付けます。ポンプの電源を入れ、24時間走るようにします。
注:ロックウールキューブは、移植後に植物を直立させるのに役立つ新しく根付いた挿し木に「アンカー」能力があるため好まれます。
3. 適切な撮影の選択と切除
- 滅菌メスやはさみを使用して、頭上のメリステムの近くで撮影を収集します。挿し木は、理想的には、いくつかのノードで、長さが〜10センチメートルです。
メモ:ステムを45°の角度で切ります。45°の角度で切断すると、切断の基底部の表面積が増加し、根の開発のためのより多くのスペースを可能にします。45°カットの中央に小さなスリット(1-2 cm)を作って表面積をさらに大きくするオプションです。 - 上の 3 つのノードに存在する葉を除くすべての葉を削除します。
- 新しく切り出した切削を、茎の基部から〜5〜5cm上にインドール-3-酪酸(IBA)(材料表)を含む根付き溶液に浸します。
- エアロポニックシステムに配置されたロックウールキューブの中心に切削を挿入します。
注:切断挿入深度は、ロックウールキューブの底部から〜1〜2センチメートルを残す。 - 3日ごとに、根っこく切り抜きに栄養ミスト溶液(材料表)をスプレーします。
- 1日当たり18-24時間の光量で、24-29°Cおよび40-60%の相対湿度で100 μmol/m2/sの光合成光束密度(PPFD)で切削を成長させます。
4. エアロポニックシステムのメンテナンスとプロパグルの健康
- 2~5日ごとに5.0~6.0の間のpHでシステムに水を補給します。
- 3日ごとに、栄養ミスト溶液(材料表)で挿し木(1カットごとに1つのミスト)を軽く霧にします。
- 3~5日ごとに5mLの栄養溶液(材料表)を貯留槽に加えます。
注:栄養素の添加は、水が茶色と濁っている原因となります。 - 次亜塩素酸を含む藻類および細菌洗浄液の15mLを加える(0.028%)水10Lあたり5日毎(材料表)。
5. プロパグレスの移植
- 長い、白い、繊維状の根を持つ切削を選択します。
注:これは根腐れの存在の指標であり、通常、新しい成長培地に順応するために時間がかかり、不要な病気をもたらす可能性がありますので、茶色、ぬるぬる、短い根系で切断を避けてください。 - 慎重にシステムからロックウールキューブを取り除き、根を解きます。
- 栄養価の高い土壌ミックス(材料表)で満たされた4 L保育園のポットに大麻のプロパグルを移植。
注:根が乾燥するのを防ぐために、すぐに水をまくことをお勧めします。
6. エアロポニックシステムの洗浄と保管
- システムが使用されなくなったら、水で洗い、70%エタノールまたは別の消毒剤で洗浄してください。
- 水ポンプからフィルターを取り外し、水ですすいで残骸を取り除きます。
- ペーパータオルまたは洗濯布で拭いてシステムを乾燥させます。
- 蓋をしたふもとにポンプを入れ、必要になるまで保管します。
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Representative Results
記載されたエアロポニック系の効率を検証するために、母植物である「チェリーワイン」と「レッドロビン」から、それぞれ10と12の健康な14cmの長い芽をそれぞれ切除した(図1A、B)。突出誘導媒体に浸漬した後、クローンをシステムに入れた(図2A)。エアロポニックシステムの構築と動作を 図2Aの概略図として示しています。
順応の2日後、すべてのクローンは3〜7日で根を発達させ始め、10-14日後に根を37cm発達させ、土壌で満たされたポットに植えるのに十分であった(図2B、D)。 図3は、各品種の平均シュートと根の長さを示しています。撮影長と根長は、土壌に移る前に測定した。平均シュートと根の長さは24.8cm±2.4cm、37.8cm±2.5cmで「チェリーワイン」、2.1cm ±、39.7cm±5.9cmの21.4cm±「レッドロビン」がそれぞれ(図3A,B)。2つの品種の違いを双方向のANOVAで分析し、続いてTukeyの複数の思いやりテストを行い、2つの品種間の撮影と根の長さに有意な差を示さなかった(n = 10-12、p<0.05)。
図1:クローン伝播のために複数の芽を発生させる健康な母親の植物。 (A)成熟した母植物、栄養成長の約4ヶ月で「チェリーワイン」(手前)と「レッドロビン」(裏)、伝播に理想的な数多くの芽を示す。(B) 大麻をクローニングするための適切な撮影切除のためのおおよその長さ(14 cm)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:大麻クローン伝播のためのエアロポニックシステムの確立。 (A)エアロポニック系の成分を示す模式図(38.1cm x 25.4cm x 30.48cm)。(B) 「チェリーワイン」クローンが完全に占めるエアロポニック系。(C)根成長を示すクローンを有するエアロポニック系内。(D)エアロポニック系で10日後のロックウールキューブの健全な根成長。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:エアロポニッククローニングシステムで10日後に「チェリーワイン」と「レッドロビン」のシュートとルートの長さの測定。 (A)2種の麻の中のシュートと根の長さを表す棒グラフと(B)表。2種類のシュート/ルート長の違いを双方向のANOVAで分析し、続いてTukeyの多重比較検定を行いました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
一貫したカンナビノイド含有量を持つ 大麻 植物の需要が高まっていると、 大麻業界で 様々なクローン伝播方法が利用されています。無性伝播は、大規模で一貫した生産のための性的方法よりもいくつかの利点を示しています。エアロポニック伝播システムは、急速な根の開発を提供するために、気泡栄養豊富な水霧を利用する水耕栽培システムの修正版です。説明されたエアロポニックシステムは、3つの重要なステップで構成され、1)望ましい物理的/化学的形質の遺伝的源として健康な女性 の大麻 「母親」植物を生成し、2)切断芽(有頭メリステム)および補助前駆体、IBA、および3)を含む根誘導培地で治療する。
エアロポニック伝播システムは、異なる伝播方法に対して明確な利点を有する麻クローンの効率的な生産を可能にする。それは、早ければ5日で、より少ない労働誘発健康、成熟した根形成を通じて1)時間とコスト削減を含む。2)遺伝的均質性 - 再現性大麻研究や産業アプリケーションに対応するために、任意の遺伝的変異を除いて、遺伝的に同一 のクローンを 生成することができます。3)大規模な操作での均一性。4)微生物病原体に対する脆弱性が少ない - 根の発生が起こる容器の内部に構築された湿度レベルよりも植物の上部キャノピーの湿度の比較的低いレベルを維持する。
エアロポニックシステムには多くの利点がありますが、実践の間に慎重に対処すべきいくつかの制限があります。まず、すべての栄養素が水耕的に提供されるように、それは容易に藻類、真菌、およびウイルス(例えば、ホップ潜伏ビロイド)の病原体(例えば、抗微生物/真菌/ウイルス剤の定期的な治療によって軽減される根系の奇形につながる)で汚染され得る。第二に、シングルマザー工場の普及は、生産設備にとって問題となる可能性があります。単一の遺伝子型クローンラインを生産モデルの唯一の植物として持つことは、その遺伝子型がその栽培施設に存在する特定の害虫または病原体の影響を受けやすい場合、作物全体の損失のリスクにつながります。したがって、任意の任意の害虫や病原体13からの経済的損失を制限するために、このエアロポニッククローニングシステムを使用して生産クローンを伝播するために使用される多様な系統から複数の母植物を維持することが推奨されます。生産クローンの将来のソースとして使用する新しい母の植物をクローニングする前に、6ヶ月以上の栄養的に母植物を育てるだけをお勧めします。これは、不健康な母親の植物と低いクローニング成功率につながる可能性のある生い茂った根だけでなく、伝播されたクローンに伝染する可能性のある害虫や病原体を収容することができる生い茂った天蓋を防ぎます。
エアロポニックシステムは、費用対効果の高い方法で工業的にスケーラブルです。 図1 は、少なくとも20個の植物材料を単一の容器(38.1 cm x 25.4 cm x 30.48 cm)に収納できることを示しています。水、栄養素、電気のコストを増やすことなく、ユニットあたり50以上の植物を保持するように容易にスケールアップすることができます。現在の方法のためにここで説明した利点は 、大麻の時間効率と均一な伝播のための業界の慣行や研究所にエアロポニッククローニングシステムを実装する理由を提供します。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、コロラド州立大学プエブロ校の大麻研究所と科学・ICT省(2021-DD-UP-0379)、チュンチョン市(ヘンプ研究開発と工業化、2020-2021)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-part Fox Farm | Fox Farm | Soil Mix | |
| 1-part Promix | Promix | Soil Mix | |
| 1-part Roots Organic Original | Auora Innovations | Soil Mix | |
| 1-part Wiggle Worm Earth Worm Castings | UNCO Industries | Soil Mix | |
| Algae and Bacterial Cleaning Solution (Clear Rez) | EZ Clone | SKU#: 225 | 8 fl. Oz. |
| Artificial Lighting | AgroBrite | SKU#: 1399 | T5 324W 4' 6-Tube Fixture with Lamps |
| Cannabis Mother plant 1 (Cherry Wine) | Summit CBD | N/A | Donated material |
| Cannabis Mother Plant 2 (Red Wine) | Trilogene | SKU: 0101RR | |
| Corresponding Plastic Lid | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm |
| Drill Bit 1 | Dewalt | DW1586 | 38.1 mm spade drill bit |
| Drill Bit 2 | Dewalt | DW1308 | 3.175 mm drill bit |
| Flora/Bloom (Nutrient Solution)-5 mL | General Hydroponics | SKU#: 726 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) (Available Phosphate 5.0%, Soluble Potash 4.0%, Magnesium 1.5%, Sulfur 1.0%) |
| FloraGrow (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 724 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 2.0% (0.25% Ammoniacal Nitrogen, 1.75% Nitrate Nitrogen), Available Phosphate 1.0%, Soluble Potash 6.0%, Magnesium 0.5%)) |
| FloraMicro (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 759 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 5.0% (0.3% Ammoniacal Nitrogen, 4.7% Nitrate Nitrogen), Soluble Potash 1.0%, Calcium 5.0%, Boron 0.01%, Cobalt 0.0005%, Copper 0.01%, Iron 0.1%, Manganese 0.05%, Molybdenum 0.0008%, Zinc 0.015%)) |
| Horticultural Scissors | Shear Perfection | SKU#: 12620 | Platinum Stainless Steel Bonsai Scissors (2.4") |
| Isopropyl Alcohol | Equate | Walmart # 574133562 | 70% concentration |
| Nutrient Mist Solution (Clonex Mist) | Growth Technology | SKU#: 4889 | 10.14 fl. Oz (300 ml) (Total Nitrogen: 5.9 × 10-4 %, Available Phosphate: 4.0 × 10-4 %, Soluble Potash: 5.0 × 10-4 %) |
| pH Down | General Hydroponics | SKU#: 733 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| pH Up | General Hydroponics | SKU#: 730 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| Plastic Container | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm x 30.48 cm |
| Power Drill | Dewalt | DCD709B | 20-Volt Max ½” Drill |
| Rockwool Cubes | Grodan | SKU#: 830 | 38.1 mm |
| Rooting Solution (Clonex Rooting Gel) | Growth Technology | SKU#: 939 | 3.4 fl. Oz. (100 ml) (Indolebutyric Acid - 0.31%) |
| Statistic Software (Prism) | GraphPad Inc. | ||
| Submersible Water Pump | ActiveAQUA | SKU: AAPW250 | Model: AAPW250, Voltage 120V, Power 16W |
References
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