Summary
Denne protokollen er utformet for å gi instruksjonsinformasjon for klonisk forplantning av Cannabis sativa L. ved å implementere aeroponiske systemer. Metoden som er beskrevet her inkluderer alle nødvendige forsyninger og protokoller for å kunne reprodusere ønskelige morfologiske og kjemiske egenskaper i slekten Cannabis.
Abstract
Denne protokollen beskriver standardiseringen av en effektiv klonisk forplantningsteknikk av hamp ved å bruke aeroponiske systemer. Primære skytekaklinger ble utskilt fra to hampvarianter, kalt "Cherry Wine" og "Red Robin" (17-20% m / w CBD), som fungerte som "moderplante". En auxin forløper (indole-3-smørsyre) ble påført for å stimulere rotutvikling i basaldelen av de utskilte stikkene før plassering i systemet. Stiklinger ble lett tilpasset næringståkeløsningen hver tredje dag for å gi ernæringsmessig støtte, da løsningen inneholder de essensielle makronæringsstoffene, inkludert nitrogen, fosfor og kalium. Vannbeholderen i det aeroponiske systemet opprettholdt et pH-område mellom 5,0-6,0 og en vanntemperatur mellom 20-22 °C. En nedsenkbar vannpumpe ble brukt til å levere vann til stikkene. Skytespisskuttene ble forsynt med 24 timers lys per dag i 10 dager til rotutviklingen skjedde, hvorpå de rotfestede stikkene ble transplantert til forskningsformål. Disse aeroponiske systemene har vist seg å generere ønskelige resultater for cannabisforplantning. Metoden beskrevet her lindrer potensielle tidsbegrensninger som oppstår fra tradisjonelle metoder for å muliggjøre et mer effektivt middel for den aseksuelle forplantningen av cannabis.
Introduction
Cannabis sativa L. er en årlig, dioecious, blomstrende plante klassifisert i familien Cannabaceae. Cannabinoider, produsert hovedsakelig innenfor kjerteltrichomer som ligger på det ytre epidermale laget av bract vev på kvinnelige blomsterstand1, blir et stadig mer populært forskningstema, hovedsakelig på grunn av deres gradvis anerkjente medisinske egenskaper. Cannabidiol (CBD) er den nest mest fremtredende cannabinoiden som finnes i Cannabis etter Δ9-tetrahydrocannabinol (THC) og tilskrives en rekke medisinske fordeler, inkludert smertestillende egenskaper2, anti-anfallsegenskaper3, antidepressive egenskaper4, redusere risikoen for diabetes5 og behandle ulike søvnforstyrrelser6. På grunn av mangfoldet av helsemessige fordeler forbundet med metabolittene til Cannabis-anlegget, er det en økende etterspørsel etter sin kommersielle produksjon7. For å møte denne etterspørselen blir dyrkingsmetoder stadig forbedret og gjenoppfunnet for kontinuerlig å levere konsistent plantemateriale av høy kvalitet til den fremvoksende Cannabis-industrien.
Utbredelsen av cannabis kan forenkles på to måter: seksuell eller aseksuell reproduksjon. Et eksempel på seksuell reproduksjon er pollinerende en kvinnelig ovule med pollen fra en manns stamen, noe som resulterer i et frø som kan spires. Frøspredning er en pålitelig dyrkingsmetode som har blitt brukt til avl og dyrkingsformål der ønskelige fenotypiske egenskaper velges i foreldrelinjer for å forbedre kvaliteten på avkom cannabisplanter, inkludert egenskaper som tørketoleranse, insektmotstand, økt utbytte og økt styrke8 . Imidlertid er utilsiktet kryssbestøvning en iboende risiko når du utfører seksuell reproduksjon, forårsaker uønskede avkom, noe som fører til potensielt tap av ønskelige egenskaper eller en innføring av uønskede egenskaper. Et eksempel på denne utilsiktede pollineringen fremheves av hampavlere som mottar hampfrø pollinert med THC-produserende pollen, noe som resulterer i betydelig økonomisk tap på grunn av de ikke-kompatible plantene (>0,3% totalt THC m / w) 9. I tillegg, for å generere en avling som bare består av kvinner, må et feminisert frø bli sådd i stedet for et ikke-feminisert frø, noe som kan føre til hermafroditisme og andre uønskede egenskaper som fører til økonomisk tap. For å overvinne begrensningen av seksuell reproduksjon av Cannabis, har aseksuell reproduksjon blitt praktisert mye i kommersielle produksjonsmodeller av Cannabis-industrien10.
Aseksuell reproduksjon av Cannabis krever bare en enkelt plante, noe som gjør det mulig å multiplikasjon av en enkelt genotype som muliggjør kommersiell produksjon av planter som bærer ønskelige agronomiske og farmasøytiske egenskaper. En vanlig form for aseksuell cannabisreproduksjon er å kutte og sette inn små deler av en kvinnelig plante i et jordløst substrat11 som er dekket av en fuktighetskuppel for å indusere rotdannelse. Selv om denne metoden har vist seg vellykket, er en vanlig ulempe akkumuleringen av et høyt fuktighetsnivå (vanligvis 80% eller høyere) inne i kuppelen, noe som gir et ideelt vekstmiljø for sopppatogener, noe som kan være skadelig for nye, følsomme stiklinger. En annen form for aseksuell forplantning er mikropropagasjon ved hjelp av vevskultur, der sterile teknikker tillater forplantning av insekt, mikrobe og virusfritt Cannabis plantemateriale i begrenset plass12. Denne prosessen er imidlertid dyr, tidkrevende og krever opplærte laboratorieteknikere som generelt er utilgjengelige for store Cannabis-anlegg .
Svært få publiserte forskningsrapporter finnes om den klonale utbredelsen av cannabis. For å gi grunnlag for forståelsen av aseksuell reproduksjon av cannabis til forskningsformål og industriell produksjon, hadde denne studien som mål å demonstrere hvor enkelt og tilgjengelig det er å bruke aeroponiske systemer for klonisk forplantning av cannabis. Aeroponiske systemer er ideelle for aseksuell forplantning av cannabis, som konsekvent leverer næringsrikt vann til stikkene, induserer tidlig rotdannelse i tide, og gjør det mulig å opprettholde en plante på ubestemt tid om nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generasjon av en moderplante for klonforplantning
- Velg en sunn, kvinnelig moderplante som utviser ønskelige morfologiske og kjemiske egenskaper som er spesifikke for den tiltenkte bruken.
- La moderplanten nå riktig størrelse (omtrent 25 modne skudd) for klonisk forplantning (dvs. stiklinger).
- La moderplantene forbli i vegetativ vekststadium (lys: mørk = 18 t: 6 h) for å fremme skuddvekst for fremtidig forplantning.
2. Bygging og tilberedning av aeroponisk system
- Begynn med å plassere lokket på toppen av beholderen (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). Bor ønsket antall hull inn i lokket samtidig som det gir tilstrekkelig plass (helst 3 cm) mellom hver.
- Plasser vannpumpen (Materialbord) i midten av beholderen.
- Hell 7-8 L destillert vann i beholderen slik at pumpemunnstykket forblir omtrent 2,5 cm over vannlinjen.
MERK: Dette sikrer at den nedsenkbare vannpumpen (Materialbord) kan skyve vann med nok kraft til å spre seg over lokket på beholderen. Destillert vann anbefales; Vanlig vann fra springen kan imidlertid også brukes. - Plasser riktig mengde Rockwool-kuber (3,81 cm) (Materialbord) eller mediekuber du velger i hvert spor. Slå på pumpen og la den gå i 24 timer.
MERK: Rockwool-kuber foretrekkes på grunn av deres "forankringsevne" på de nylig forankrede stikkene som bidrar til å holde planter oppreist etter transplantasjon.
3. Velge og utskille passende skudd
- Samle skudd i nærheten av det apikale meristem ved hjelp av en sterilisert skalpell eller saks. Stiklinger er ~ 10 cm lange, ideelt med flere noder.
MERK: Klipp stammen i en 45° vinkel. Kutting i en 45° vinkel øker overflatearealet til den basale delen av kuttet, noe som gir mer plass til rotutvikling. Det er valgfritt å lage en liten spalte (1-2 cm) midt på 45° kuttet for å øke overflatearealet ytterligere. - Fjern alt løvverk unntatt løvverk som finnes på de tre øverste nodene.
- Dypp den nylig utskilte skjæringen i rotløsningen som inneholder indole-3-smørsyre (IBA) (Materialbord) ~ 2-5 cm opp fra bunnen av stammen i ~ 5 s.
- Sett skjæret inn i midten av en Rockwool-kube plassert i det aeroponiske systemet.
MERK: Skjæredybden skal forbli ~1-2 cm fra bunnen av Rockwool-kuben. - Spray de uberørte stikkene med næringståkeoppløsningen (Materialbord) hver tredje dag.
- Voks stikkene med 18-24 timers lys per dag med en fotosyntetisk fotonflukstetthet (PPFD) på 100 μmol / m2 / s ved 24-29 ° C og 40-60% relativ fuktighet.
4. Vedlikehold av aeroponisk system og propagule helse
- Fyll opp systemet med vann ved en pH mellom 5,0- 6,0 hver 2-5 dager.
- Tåke lett på stikkene (en tåke per skjæring) med næringståkeoppløsningen (Materialbord) hver tredje dag.
- Tilsett 5 ml av hver næringsløsning (Materialbord) i reservoaret hver 3-5 dager.
MERK: Næringstilsetningen fører til at vannet blir brunt og grumsete. - Tilsett 15 ml alger og bakterier rengjøringsløsning som inneholder hypoklorsyre (0,028%) per 10 liter vann hver 5.
5. Transplantasjon av propaguler
- Velg stiklinger med lange, hvite, fibrøse røtter.
MERK: Unngå stiklinger med brune, slimete og korte rotsystemer, da dette er en indikator for tilstedeværelsen av rotrot og vil vanligvis ta lengre tid å akklimatisere seg til det nye voksende mediet og kan gi uønskede sykdommer. - Løsne Forsiktig Rockwool-kuben fra systemet og løsne røttene.
- Transplanter Cannabis propagules til 4 L barnehagepotte fylt med en næringsrik jordblanding (Materialbord).
MERK: Vanning anbefales umiddelbart for å forhindre at røttene tørker ut.
6. Rengjøring og lagring av aeroponisk system
- Når systemet ikke lenger er i bruk, vask med vann og rengjør med 70% etanol eller et annet desinfeksjonsmiddel.
- Fjern filteret fra vannpumpen og skyll med vann for å fjerne rusk.
- Tørk systemet ved å tørke det av med papirhåndklær eller en vaskeklut.
- Plasser pumpen inne i karet med lokket på og oppbevar den til det er nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å validere effektiviteten til det beskrevne aeroponiske systemet ble totalt 10 og 12 sunne 14 cm lange skudd utskilt fra henholdsvis moderplantene , 'Cherry Wine' og 'Red Robin', henholdsvis (figur 1A,B). Etter å ha dyppet i rotinduksjonsmedier, ble klonene plassert i systemet (figur 2A). Konstruksjonen og driften av et aeroponisk system vises som et skjematisk diagram i figur 2A.
Etter 2 dager med akklimatisering begynte alle kloner å utvikle røtter på 3-7 dager og fullt utviklede røtter 37 cm i lengde etter 10-14 dager på systemet, som var tilstrekkelig til å bli plantet til en jordfylt gryte (figur 2B, D). Figur 3 viser gjennomsnittlig lengde på skudd og røtter av hver variasjon. Skuddlengden og rotlengden ble målt før overføring til jorda. Gjennomsnittlig lengde på skudd og røtter var 24,8 cm ± 2,4 cm og 37,8 cm ± 2,5 cm for henholdsvis 'Cherry Wine' og 21,4 cm ± 2,1 cm og 39,7 cm ± 5,9 cm for 'Red Robin', henholdsvis (Figur 3A,B). Forskjellene mellom de to varianter ble analysert av toveis ANOVA, etterfulgt av Tukeys multippel medfølelsestest, og viste ingen signifikante forskjeller i skudd og rotlengder mellom de to varianter (n = 10-12, p < 0,05).
Figur 1: En sunn moderplante som genererer flere skudd for klonforplantning. (A) Eldre moderplanter, "Cherry Wine" (foran) og "Red Robin" (bak) på ~ 4 måneder med vegetativ vekst, og viser mange skudd som er ideelle for forplantning. (B) Omtrentlig lengde (14 cm) for riktig skyteeksisjon for kloning av cannabis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Etablering av det aeroponiske systemet for cannabisklonal forplantning. (A) Skjematisk diagram som illustrerer komponentene i det aeroponiske systemet (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). (B) Aeroponisk system fullt okkupert av "Cherry Wine" kloner. (C) Inne i det aeroponiske systemet med kloner som viser rotvekst. (D) Sunn rotvekst i Rockwool-kuben etter 10 dager i det aeroponiske systemet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skudd- og rotlengdemålinger for "Cherry Wine" og "Red Robin" etter 10 dager i det aeroponiske kloningssystemet. (A) En bar-graf og (B) tabell som representerer lengden på skyting og rot i de to hamp varianter. Forskjellene i skudd- / rotlengder mellom to varianter ble analysert av toveis ANOVA, etterfulgt av Tukeys multisammenligningstest. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med den økende etterspørselen etter cannabisplanter med konsistent cannabinoidinnhold, har ulike kloniske forplantningsmetoder blitt utnyttet i cannabisindustrien . Den aseksuelle forplantningen viser flere fordeler i forhold til seksuelle metoder for storskala, konsistent produksjon. Et aeroponisk forplantningssystem er en modifisert versjon av et hydroponisk system som bruker en aerert næringsrik vanntåke for å gi rask rotutvikling. Det beskrevne aeroponiske systemet består av tre kritiske trinn, 1) som genererer en sunn kvinnelig Cannabis 'mor' -plante som en genetisk kilde for et ønsket fysisk / kjemisk trekk, 2) kutteskudd (apikale meristems) og behandle med rotinduksjonsmedier som inneholder auxinforløperen, IBA og 3) akklimatisering av propagulen i ønsket barnehagepott.
Det aeroponiske forplantningssystemet tillater effektiv produksjon av hamp kloner med klare fordeler i forhold til ulike forplantningsmetoder. Det inkluderer 1) tid og kostnadsbesparende gjennom mindre arbeidsfremkallende sunn, moden rotdannelse så snart som 5 dager; 2) genetisk homogenitet - slik at man kan produsere genetisk identiske kloner, unntatt genetiske variasjoner, for å imøtekomme reproduserbar cannabisforskning og industriapplikasjoner; 3) ensartethet i store operasjoner; og 4) mindre sårbarhet for mikrobielle patogener - opprettholde et relativt lavt fuktighetsnivå i øvre baldakin av planter enn fuktighetsnivået bygget inne i beholderen der rotutvikling oppstår.
Selv om det aeroponiske systemet gir en rekke fordeler, er det noen begrensninger som presenteres som bør håndteres nøye under praksis. For det første, da alle næringsstoffene leveres hydroponisk, kan det lett forurenses med alge-, sopp- og virale (f.eks. hop latent viroid) patogener som fører til misdannelse av rotsystemet som reduseres gjennom regelmessig behandling av antimikrobielle / sopp / virale midler. For det andre kan den utbredte bruken av et enkelt moderanlegg være problematisk for produksjonsanlegg. Å ha en enkelt genotype klonelinje som den eneste planten i en produksjonsmodell fører til risiko for hele avlingstap hvis den genotypen er utsatt for et gitt eller patogen som er tilstede i det dyrkingsanlegget; Dermed anbefales det å opprettholde flere moderplanter fra forskjellige avledninger som brukes til å forplante produksjonskloner med dette aeroponiske kloningssystemet for å begrense økonomisk tap fra et gitt eller patogen13. Det anbefales å bare vegetativt vokse en moderplante i ikke mer enn 6 måneder før kloning av et nytt moderanlegg til bruk som fremtidig kilde til produksjonskloner. Dette forhindrer overgrodde røtter som kan føre til usunne moderplanter og lavere kloning av suksessrater, samt overgrodde baldakiner som kan huse og patogener, som kan overføres til de forplantede klonene.
Det aeroponiske systemet er industrielt skalerbart på en kostnadseffektiv måte. Figur 1 viser at minst 20 plantematerialer kan plasseres i en enkelt beholder (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). Systemet kan enkelt skaleres opp for å holde mer enn 50 planter per enhet uten å øke kostnadene på vann, næringsstoffer og elektrisitet. Fordelene beskrevet her for den nåværende metoden gir en grunn til å implementere det aeroponiske kloningssystemet i industripraksis og forskningslaboratorier for den tidseffektive og ensartede forplantningen av Cannabis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av Institute of Cannabis Research ved Colorado State University-Pueblo og Ministry of Science and ICT (2021-DD-UP-0379), og Chuncheon city (Hemp R&D og industrialisering, 2020-2021), Forfatterne ønsker også å takke Justin Henderson på Summit CBD for den sjenerøse donasjonen for "Cherry Wine" frø.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-part Fox Farm | Fox Farm | Soil Mix | |
| 1-part Promix | Promix | Soil Mix | |
| 1-part Roots Organic Original | Auora Innovations | Soil Mix | |
| 1-part Wiggle Worm Earth Worm Castings | UNCO Industries | Soil Mix | |
| Algae and Bacterial Cleaning Solution (Clear Rez) | EZ Clone | SKU#: 225 | 8 fl. Oz. |
| Artificial Lighting | AgroBrite | SKU#: 1399 | T5 324W 4' 6-Tube Fixture with Lamps |
| Cannabis Mother plant 1 (Cherry Wine) | Summit CBD | N/A | Donated material |
| Cannabis Mother Plant 2 (Red Wine) | Trilogene | SKU: 0101RR | |
| Corresponding Plastic Lid | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm |
| Drill Bit 1 | Dewalt | DW1586 | 38.1 mm spade drill bit |
| Drill Bit 2 | Dewalt | DW1308 | 3.175 mm drill bit |
| Flora/Bloom (Nutrient Solution)-5 mL | General Hydroponics | SKU#: 726 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) (Available Phosphate 5.0%, Soluble Potash 4.0%, Magnesium 1.5%, Sulfur 1.0%) |
| FloraGrow (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 724 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 2.0% (0.25% Ammoniacal Nitrogen, 1.75% Nitrate Nitrogen), Available Phosphate 1.0%, Soluble Potash 6.0%, Magnesium 0.5%)) |
| FloraMicro (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 759 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 5.0% (0.3% Ammoniacal Nitrogen, 4.7% Nitrate Nitrogen), Soluble Potash 1.0%, Calcium 5.0%, Boron 0.01%, Cobalt 0.0005%, Copper 0.01%, Iron 0.1%, Manganese 0.05%, Molybdenum 0.0008%, Zinc 0.015%)) |
| Horticultural Scissors | Shear Perfection | SKU#: 12620 | Platinum Stainless Steel Bonsai Scissors (2.4") |
| Isopropyl Alcohol | Equate | Walmart # 574133562 | 70% concentration |
| Nutrient Mist Solution (Clonex Mist) | Growth Technology | SKU#: 4889 | 10.14 fl. Oz (300 ml) (Total Nitrogen: 5.9 × 10-4 %, Available Phosphate: 4.0 × 10-4 %, Soluble Potash: 5.0 × 10-4 %) |
| pH Down | General Hydroponics | SKU#: 733 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| pH Up | General Hydroponics | SKU#: 730 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| Plastic Container | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm x 30.48 cm |
| Power Drill | Dewalt | DCD709B | 20-Volt Max ½” Drill |
| Rockwool Cubes | Grodan | SKU#: 830 | 38.1 mm |
| Rooting Solution (Clonex Rooting Gel) | Growth Technology | SKU#: 939 | 3.4 fl. Oz. (100 ml) (Indolebutyric Acid - 0.31%) |
| Statistic Software (Prism) | GraphPad Inc. | ||
| Submersible Water Pump | ActiveAQUA | SKU: AAPW250 | Model: AAPW250, Voltage 120V, Power 16W |
References
- ElSohly, M. A., Radwan, M. M., Gul, W., Chandra, S., Galal, A.
- Cunetti, L., et al. Chronic pain treatment with cannabidiol in kidney transplant patients in Uruguay. Transplantation Proceedings. 50 (2), 461-464 (2018).
- Hausman-Kedem, M., Menascu, S., Kramer, U. Efficacy of CBD-enriched medical cannabis for treatment of refractory epilepsy in children and adolescents - An observational, longitudinal study. Brain & Development. 40 (7), 544-551 (2018).
- Linge, R., et al. Cannabidiol induces rapid-acting antidepressant-like effects and enhances cortical 5-HT/glutamate neurotransmission: role of 5-HT1A receptors. Neuropharmacology. 103, 16-26 (2016).
- Lehmann, C., et al. Experimental cannabidiol treatment reduces early pancreatic inflammation in type 1 diabetes. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (4), 655-662 (2016).
- Shannon, S., Lewis, N., Lee, H., Hughes, S. Cannabidiol in anxiety and sleep: A large case series. The Permanente Journal. 23, 18-41 (2019).
- Russo, E. B. History of cannabis and its preparations in saga, science, and sobriquet. Chemistry & Biodiversity. 4 (8), 1614-1648 (2007).
- Vera, C. L., Hanks, A.
- Deventer, M. V. Hot hemp: How high THC levels can ruin a legal hemp harvest. , Available from: https://www.westword.com/marijuana/hot-hemp-how-high-thc-levels-can-ruin-a-legal-hemp-harvest-9963683 (2018).
- Lata, H., Chandra, S., Techen, N., Khan, I. A., ElSohly, M. A. Assessment of the genetic stability of micropropagated plants of Cannabis sativa by ISSR markers. Planta Medica. 76 (1), 97-100 (2010).
- Caplan, D., Dixon, M., Zheng, Y. Optimal rate of organic fertilizer during the flowering stage for Cannabis grown in two coir-based substrates. HortScience. 52 (12), 1796 (2017).
- Monthony, A. S., Page, S. R., Hesami, M., Jones, A. M. P. The past, present and future of Cannabis sativa tissue culture. Plants (Basel). 10 (1), 185 (2021).
- Clarke, R. C., Merlin, M. D. Cannabis domestication, breeding history, present-day genetic diversity, and future prospects. Critical Reviews in Plant Sciences. 35 (5-6), 293-327 (2016).
