Summary
Este protocolo está diseñado para proporcionar información instructiva para la propagación clonal de Cannabis sativa L. mediante la implementación de sistemas aeropónicos. El método descrito aquí incluye todos los suministros y protocolos necesarios para reproducir con éxito las propiedades morfológicas y químicas deseables en el género Cannabis.
Abstract
Este protocolo describe la estandarización de una técnica eficiente de propagación clonal del cáñamo mediante la utilización de sistemas aeropónicos. Los esquejes de brotes primarios se extirparon de dos variedades de cáñamo, llamadas "Cherry Wine" y "Red Robin" (17-20% p / p CBD), que sirvieron como "planta madre". Se aplicó un precursor de auxina (ácido indol-3-butírico) para estimular el desarrollo de la raíz en la porción basal de los esquejes extirpados antes de su colocación en el sistema. Los esquejes se nebulizaron ligeramente con la solución de niebla nutritiva cada tres días para proporcionar apoyo nutricional, ya que la solución contiene los macronutrientes esenciales, incluidos el nitrógeno, el fósforo y el potasio. El depósito de agua del sistema aeropónico mantuvo un rango de pH entre 5.0-6.0 y una temperatura del agua entre 20-22 ° C. Se utilizó una bomba de agua sumergible para suministrar agua a los esquejes. Los esquejes de punta de brote se proporcionaron con 24 horas de luz por día durante 10 días hasta que se produjo el desarrollo de la raíz, sobre el cual los esquejes de raíz se trasplantaron con fines de investigación. Estos sistemas aeropónicos han demostrado generar resultados deseables para la propagación del cannabis . El método descrito aquí alivia las posibles limitaciones de tiempo que surgen de los métodos tradicionales para permitir un medio más eficiente para la propagación asexual del cannabis.
Introduction
Cannabis sativa L. es una planta anual, dioica, con flores clasificada en la familia Cannabaceae. Los cannabinoides, producidos predominantemente dentro de tricomas glandulares ubicados en la capa epidérmica externa de los tejidos de las brácteas en las inflorescencias femeninas1, se están convirtiendo en un tema de investigación cada vez más popular, principalmente debido a sus propiedades medicinales progresivamente reconocidas. El cannabidiol (CBD) es el segundo cannabinoide más prominente que se encuentra en el cannabis después del Δ9-tetrahidrocannabinol (THC) y se atribuye a una serie de beneficios medicinales, incluidas las propiedades analgésicas2, las propiedades anticonvulsivas3, las propiedades antidepresivas4, la reducción del riesgo de diabetes5 y el tratamiento de diversos trastornos del sueño6. Debido a la multitud de beneficios para la salud asociados con los metabolitos de la planta de Cannabis, existe una creciente demanda de su producción a escala comercial7. Para satisfacer esta demanda, los métodos de cultivo se mejoran y reinventan constantemente para suministrar continuamente material vegetal consistente y de alta calidad a la emergente industria del cannabis.
La propagación del Cannabis se puede facilitar de dos maneras: reproducción sexual o asexual. Un ejemplo de reproducción sexual es la polinización de un óvulo femenino con polen del estambre de un macho, lo que resulta en una semilla que puede germinar. La germinación de semillas es un método de cultivo confiable que se ha utilizado con fines de mejoramiento y cultivo donde se seleccionan rasgos fenotípicos deseables en las líneas parentales para mejorar la calidad de las plantas de cannabis de descendencia, incluidos rasgos como la tolerancia a la sequía, la resistencia a los insectos, el aumento del rendimiento y el aumento de la potencia8 . Sin embargo, la polinización cruzada no intencionada es un riesgo inherente al realizar la reproducción sexual, causando descendencia indeseable, lo que conduce a la pérdida potencial de rasgos deseables o a la introducción de rasgos no deseados. Un ejemplo de esta polinización no intencionada se destaca en los cultivadores de cáñamo que reciben semillas de cáñamo polinizadas con polen productor de THC, lo que resulta en una pérdida económica significativa debido a las plantas no conformes (>0,3% de THC total p/p)9. Además, para generar un cultivo que consiste solo en hembras, se debe sembrar una semilla feminizada en lugar de una semilla no feminizada, lo que puede conducir al hermafroditismo y otros rasgos indeseables que conducen a la pérdida económica. Para superar la limitación de la reproducción sexual del Cannabis, la reproducción asexual se ha practicado ampliamente en los modelos de producción comercial de la industria del Cannabis10.
La reproducción asexual del cannabis requiere una sola planta, lo que permite la multiplicación de un solo genotipo que permite la producción comercial de plantas que llevan rasgos agronómicos y farmacéuticos deseables. Una forma común de reproducción asexual del cannabis es cortar e insertar pequeñas porciones de una planta hembra en un sustrato sin suelo11 que está cubierto por una cúpula de humedad para inducir la formación de raíces. Aunque este método ha demostrado ser exitoso, un inconveniente común es la acumulación de un alto nivel de humedad (generalmente 80% o más) dentro de la cúpula, proporcionando un ambiente de crecimiento ideal para los patógenos fúngicos, que pueden ser perjudiciales para los esquejes nuevos y sensibles. Otra forma de propagación asexual es la micropropagación mediante cultivo de tejidos, donde las técnicas estériles permiten la propagación de insectos, microbios y material vegetal de cannabis libre de virus en un espacio limitado12. Este proceso, sin embargo, es costoso, requiere mucho tiempo y requiere técnicos de laboratorio capacitados que generalmente son inaccesibles para las instalaciones de cannabis a gran escala.
Existen muy pocos informes de investigación publicados sobre la propagación clonal del cannabis. Con el fin de proporcionar una base para la comprensión de la reproducción asexual del cannabis con fines de investigación y producción industrial, este estudio tuvo como objetivo demostrar la facilidad y accesibilidad del empleo de sistemas aeropónicos para la propagación clonal del cannabis. Los sistemas aeropónicos son ideales para la propagación asexual del cannabis, suministrando constantemente agua rica en nutrientes a los esquejes, induciendo la formación temprana de raíces de manera oportuna y permitiendo que una planta se mantenga indefinidamente si es necesario.
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Protocol
1. Generación de una planta madre para la propagación clonal
- Seleccione una planta madre hembra sana que exhiba características morfológicas y químicas deseables específicas para su uso previsto.
- Permita que la planta madre alcance el tamaño apropiado (aproximadamente 25 brotes maduros) para la propagación clonal (es decir, esquejes).
- Permita que las plantas madre permanezcan en la etapa de crecimiento vegetativo (luz: oscura = 18 h: 6 h) para promover el crecimiento de los brotes para su propagación futura.
2. Construcción y preparación del sistema aeropónico
- Comience colocando la tapa en la parte superior del recipiente (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). Perfore el número deseado de orificios en la tapa mientras proporciona un espacio adecuado (preferiblemente 3 cm) entre cada uno.
- Coloque la bomba de agua (Tabla de Materiales) en el centro del recipiente.
- Vierta 7-8 L de agua destilada en el recipiente para que la boquilla de la bomba permanezca aproximadamente a 2,5 cm por encima de la línea de flotación.
NOTA: Esto garantiza que la bomba de agua sumergible (Tabla de materiales) pueda empujar el agua con suficiente fuerza para extenderse a través de la tapa del recipiente. Se recomienda agua destilada; sin embargo, también se puede usar agua del grifo regular. - Coloque la cantidad adecuada de cubos de lana de roca (3,81 cm) (Tabla de materiales) o cubos de medios de su elección en cada ranura. Encienda la bomba y deje que funcione durante 24 h.
NOTA: Se prefieren los cubos de lana de roca debido a su capacidad de "anclaje" en los esquejes recién enraizados que ayudan a mantener las plantas erguidas después del trasplante.
3. Selección y eliminación de los disparos apropiados
- Recolecte los brotes cerca del meristemo apical usando un bisturí o tijera esterilizada. Los esquejes miden ~ 10 cm de longitud, idealmente con varios nodos.
NOTA: Corte el tallo en un ángulo de 45°. El corte en un ángulo de 45 ° aumenta el área de superficie de la porción basal del corte, lo que permite más espacio para el desarrollo de la raíz. Es opcional hacer una pequeña hendidura (1-2 cm) en el medio del corte de 45 ° para aumentar aún más el área de superficie. - Elimine todo el follaje excepto el follaje presente en los tres nodos superiores.
- Sumerja el corte recién extirpado en la solución de enraizamiento que contiene ácido indol-3-butírico (IBA) (Tabla de materiales) ~ 2-5 cm desde la base del tallo durante ~ 5 s.
- Inserte el corte en el centro de un cubo de lana de roca colocado en el sistema aeropónico.
NOTA: La profundidad de inserción de corte debe permanecer ~ 1-2 cm desde la parte inferior del cubo de lana de roca. - Rocíe los esquejes sin raíces con la solución de niebla nutritiva (Tabla de Materiales) cada 3 días.
- Cultive los esquejes con 18-24 h de luz por día con una densidad de flujo de fotones fotosintético (PPFD) de 100 μmol/m2/s a 24-29 °C y 40-60% de humedad relativa.
4. Mantenimiento del sistema aeropónico y salud del propágulo
- Reponga el sistema con agua a un pH entre 5.0- 6.0 cada 2-5 días.
- Rocíe ligeramente los esquejes (una niebla por corte) con la solución de niebla nutritiva (Tabla de Materiales) cada 3 días.
- Agregue 5 ml de cada solución nutritiva (Tabla de materiales) al reservorio cada 3-5 días.
NOTA: La adición de nutrientes hace que el agua sea marrón y turbia. - Añadir 15 ml de la solución limpiadora de algas y bacterias que contiene ácido hipocloroso (0,028%) por 10 L de agua cada 5 días (Tabla de materiales).
5. Trasplante de propágulos
- Seleccione los esquejes con raíces largas, blancas y fibrosas.
NOTA: Evite los esquejes con sistemas de raíces marrones, viscosas y cortas, ya que este es un indicador de la presencia de podredumbre de la raíz y generalmente tardará más en aclimatarse al nuevo medio de cultivo y puede traer enfermedades no deseadas. - Desaloje cuidadosamente el cubo de lana de roca del sistema y desenrede las raíces.
- Trasplante los propágulos de Cannabis a una maceta de vivero de 4 L llena de una mezcla de suelo nutritivo (Tabla de Materiales).
NOTA: Se recomienda regar inmediatamente para evitar que las raíces se sequen.
6. Limpieza y almacenamiento del sistema aeropónico
- Cuando el sistema ya no esté en uso, lavar con agua y limpiar con etanol al 70% u otro desinfectante.
- Retire el filtro de la bomba de agua y enjuague con agua para eliminar los desechos.
- Seque el sistema limpiándolo con toallas de papel o una toallita.
- Coloque la bomba dentro de la bañera con la tapa puesta y guárdela hasta que sea necesaria.
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Representative Results
Para validar la eficiencia del sistema aeropónico descrito, se extirparon un total de 10 y 12 brotes sanos de 14 cm de largo de las plantas madre, 'Cherry Wine' y 'Red Robin', respectivamente (Figura 1A, B). Después de sumergirse en los medios de inducción de enraizamiento, los clones se colocaron en el sistema (Figura 2A). La construcción y operación de un sistema aeropónico se muestra como un diagrama esquemático en la Figura 2A.
Después de 2 días de aclimatación, todos los clones comenzaron a desarrollar raíces en 3-7 días y raíces completamente desarrolladas de 37 cm de longitud después de 10-14 días en el sistema, lo que fue suficiente para ser plantado en una maceta llena de suelo (Figura 2B, D). La Figura 3 muestra la longitud promedio de los brotes y raíces de cada variedad. La longitud del brote y la longitud de la raíz se midieron antes de transferirse al suelo. La longitud media de los brotes y las raíces fue de 24,8 cm ± 2,4 cm y 37,8 cm ± 2,5 cm para 'Cherry Wine' y 21,4 cm ± 2,1 cm y 39,7 cm ± 5,9 cm para 'Red Robin', respectivamente (Figura 3A, B). Las diferencias entre las dos variedades fueron analizadas por ANOVA bidireccional, seguido por la prueba de compasión múltiple de Tukey, que no mostró diferencias significativas en las longitudes de brotes y raíces entre las dos variedades (n = 10-12, p < 0.05).
Figura 1: Una planta madre sana que genera múltiples brotes para la propagación clonal. (A) Plantas madre maduras, "Cherry Wine" (delante) y "Red Robin" (detrás) a ~4 meses de crecimiento vegetativo, exhibiendo numerosos brotes ideales para la propagación. (B) Longitud aproximada (14 cm) para la escisión adecuada de brotes para la clonación de cannabis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Establecimiento del sistema aeropónico para la propagación clonal de Cannabis. (A) Diagrama esquemático que ilustra los componentes del sistema aeropónico (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). (B) Sistema aeropónico totalmente ocupado por clones de "Cherry Wine". (C) Dentro del sistema aeropónico con clones que exhiben crecimiento radicular. (D) Crecimiento saludable de la raíz en el cubo de lana de roca después de 10 días en el sistema aeropónico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Mediciones de la longitud del brote y la raíz para "Cherry Wine" y "Red Robin" después de 10 días en el sistema de clonación aeropónica. (A) Un gráfico de barras y una tabla (B) que represente la longitud del brote y la raíz en las dos variedades de cáñamo. Las diferencias en las longitudes de brote / raíz entre dos variedades se analizaron mediante ANOVA bidireccional, seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Con la creciente demanda de plantas de cannabis con un contenido constante de cannabinoides, se han explotado varios métodos de propagación clonal en la industria del cannabis . La propagación asexual muestra varias ventajas sobre los métodos sexuales para una producción consistente a gran escala. Un sistema de propagación aeropónica es una versión modificada de un sistema hidropónico que utiliza una niebla de agua aireada rica en nutrientes para proporcionar un rápido desarrollo de las raíces. El sistema aeropónico descrito se compone de tres pasos críticos, 1) generar una planta "madre" de Cannabis hembra sana como fuente genética para un rasgo físico/ químico deseado, 2) cortar brotes (meristemas apicales) y tratar con medios de inducción radicular que contengan el precursor de auxina, IBA, y 3) aclimatación del propágulo en la maceta de vivero deseada.
El sistema de propagación aeropónica permite la producción eficiente de clones de cáñamo con claras ventajas sobre los diferentes métodos de propagación. Incluye 1) ahorro de tiempo y costos a través de una formación de raíces sanas y maduras que inducen menos mano de obra tan pronto como 5 días; 2) homogeneidad genética: permite producir clones genéticamente idénticos, excluyendo cualquier variación genética, para acomodar la investigación reproducible del cannabis y las aplicaciones de la industria; 3) uniformidad en las operaciones a gran escala; y 4) menor vulnerabilidad a los patógenos microbianos: mantener un nivel relativamente bajo de humedad en el dosel superior de las plantas que el nivel de humedad construido dentro del contenedor donde se produce el desarrollo de la raíz.
Aunque el sistema aeropónico ofrece una serie de ventajas, hay algunas limitaciones presentadas que deben abordarse cuidadosamente durante las prácticas. En primer lugar, como todos los nutrientes se proporcionan hidropónicamente, puede contaminarse fácilmente con patógenos de algas, hongos y virales (por ejemplo, viroides latentes del lúpulo) que conducen a la malformación del sistema radicular que se mitiga a través del tratamiento regular de agentes antimicrobianos / fúngicos / virales. En segundo lugar, el uso generalizado de una sola planta madre puede ser problemático para las instalaciones de producción. Tener una sola línea de clones de genotipo como única planta en un modelo de producción conlleva un riesgo de pérdida de todo el cultivo si ese genotipo es susceptible a una plaga o patógeno determinado que está presente en esa instalación de cultivo; por lo tanto, se recomienda mantener múltiples plantas madre de diversos linajes que se utilizan para propagar clones de producción con este sistema de clonación aeropónica para limitar la pérdida económica de cualquier plaga o patógeno dado13. Se aconseja cultivar vegetativamente una planta madre durante no más de 6 meses antes de clonar una nueva planta madre para usarla como la futura fuente de clones de producción. Esto evita las raíces demasiado crecidas que pueden conducir a plantas madre poco saludables y menores tasas de éxito de clonación, así como las copas demasiado crecidas que pueden albergar plagas y patógenos, que pueden transmitirse a los clones propagados.
El sistema aeropónico es escalable industrialmente de una manera rentable. La Figura 1 muestra que al menos 20 materiales vegetales pueden ser alojados en un solo recipiente (38,1 cm x 25,4 cm x 30,48 cm). El sistema se puede ampliar fácilmente para albergar más de 50 plantas por unidad sin aumentar los costos de agua, nutrientes y electricidad. Las ventajas descritas aquí para el método actual proporcionan una razón para implementar el sistema de clonación aeropónica en las prácticas de la industria y los laboratorios de investigación para la propagación uniforme y eficiente en el tiempo del cannabis.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el Instituto de Investigación de Cannabis de la Universidad Estatal de Colorado-Pueblo y el Ministerio de Ciencia y TIC (2021-DD-UP-0379), y la ciudad de Chuncheon (Hemp R&D and industrialization, 2020-2021), Los autores también desean agradecer a Justin Henderson en Summit CBD por la generosa donación de semillas "Cherry Wine".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-part Fox Farm | Fox Farm | Soil Mix | |
| 1-part Promix | Promix | Soil Mix | |
| 1-part Roots Organic Original | Auora Innovations | Soil Mix | |
| 1-part Wiggle Worm Earth Worm Castings | UNCO Industries | Soil Mix | |
| Algae and Bacterial Cleaning Solution (Clear Rez) | EZ Clone | SKU#: 225 | 8 fl. Oz. |
| Artificial Lighting | AgroBrite | SKU#: 1399 | T5 324W 4' 6-Tube Fixture with Lamps |
| Cannabis Mother plant 1 (Cherry Wine) | Summit CBD | N/A | Donated material |
| Cannabis Mother Plant 2 (Red Wine) | Trilogene | SKU: 0101RR | |
| Corresponding Plastic Lid | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm |
| Drill Bit 1 | Dewalt | DW1586 | 38.1 mm spade drill bit |
| Drill Bit 2 | Dewalt | DW1308 | 3.175 mm drill bit |
| Flora/Bloom (Nutrient Solution)-5 mL | General Hydroponics | SKU#: 726 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) (Available Phosphate 5.0%, Soluble Potash 4.0%, Magnesium 1.5%, Sulfur 1.0%) |
| FloraGrow (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 724 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 2.0% (0.25% Ammoniacal Nitrogen, 1.75% Nitrate Nitrogen), Available Phosphate 1.0%, Soluble Potash 6.0%, Magnesium 0.5%)) |
| FloraMicro (Nutrient Solution)- 5 mL | General Hydroponics | SKU#: 759 | 946 mL (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) ((Total Nitrogen 5.0% (0.3% Ammoniacal Nitrogen, 4.7% Nitrate Nitrogen), Soluble Potash 1.0%, Calcium 5.0%, Boron 0.01%, Cobalt 0.0005%, Copper 0.01%, Iron 0.1%, Manganese 0.05%, Molybdenum 0.0008%, Zinc 0.015%)) |
| Horticultural Scissors | Shear Perfection | SKU#: 12620 | Platinum Stainless Steel Bonsai Scissors (2.4") |
| Isopropyl Alcohol | Equate | Walmart # 574133562 | 70% concentration |
| Nutrient Mist Solution (Clonex Mist) | Growth Technology | SKU#: 4889 | 10.14 fl. Oz (300 ml) (Total Nitrogen: 5.9 × 10-4 %, Available Phosphate: 4.0 × 10-4 %, Soluble Potash: 5.0 × 10-4 %) |
| pH Down | General Hydroponics | SKU#: 733 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| pH Up | General Hydroponics | SKU#: 730 | 946 ml (1 Quart) 2.43 lbs. (1.1 kg) |
| Plastic Container | Office Depot | N/A | 38.1 cm x 25.4 cm x 30.48 cm |
| Power Drill | Dewalt | DCD709B | 20-Volt Max ½” Drill |
| Rockwool Cubes | Grodan | SKU#: 830 | 38.1 mm |
| Rooting Solution (Clonex Rooting Gel) | Growth Technology | SKU#: 939 | 3.4 fl. Oz. (100 ml) (Indolebutyric Acid - 0.31%) |
| Statistic Software (Prism) | GraphPad Inc. | ||
| Submersible Water Pump | ActiveAQUA | SKU: AAPW250 | Model: AAPW250, Voltage 120V, Power 16W |
References
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