Summary
يتم تقديم طريقة للتشريح المجهري لقناة بيض الفأر تسمح بجمع الأجزاء الفردية مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف إجراء تفكك الخلايا البيضوية غير الأنزيمية. الطرق مناسبة لتحليل الجينات والبروتين اللاحق للقطاعات البيضية المختلفة وظيفيا والخلايا البيضوية المنفصلة.
Abstract
أنظمة نماذج الفئران لا مثيل لها لتحليل عمليات المرض بسبب قابليتها للتلاعب الجيني وانخفاض تكلفة العلاجات التجريبية. ومع ذلك ، بسبب صغر حجم الجسم ، أثبتت بعض الهياكل ، مثل قناة البيض التي يبلغ قطرها 200-400 ميكرومتر ، أنه من الصعب نسبيا دراستها إلا عن طريق الكيمياء النسيجية المناعية. في الآونة الأخيرة ، كشفت الدراسات الكيميائية النسيجية المناعية عن اختلافات أكثر تعقيدا في قطاعات قناة البيض مما كان معترفا به سابقا. وبالتالي ، تنقسم قناة البيض إلى أربعة أجزاء وظيفية بنسب مختلفة من سبعة أنواع متميزة من الخلايا الظهارية. من المحتمل أن تجعل الأصول والنسب الجنينية المختلفة لأنواع الخلايا الظهارية المناطق الوظيفية الأربع عرضة للأمراض بشكل مختلف. فعلى سبيل المثال، تنشأ آفات السلائف للسرطان المصلي داخل الظهارة من الإنفونديبولوم في نماذج الفئران ومن المنطقة الفيمبرية المقابلة في قناة فالوب البشرية. يفصل البروتوكول الموصوف هنا طريقة للتشريح المجهري لتقسيم قناة البيض بطريقة تنتج كمية كافية ونقاء من الحمض النووي الريبي الضروري للتحليل النهائي مثل النسخ العكسي الكمي PCR (RT-qPCR) وتسلسل الحمض النووي الريبي (RNAseq). كما وصفت طريقة تفكك الأنسجة غير الأنزيمية في الغالب المناسبة لقياس التدفق الخلوي أو تحليل RNAseq أحادي الخلية للخلايا البيضية المتمايزة تماما. ستسهل الطرق الموصوفة إجراء مزيد من الأبحاث باستخدام قناة البيض الفئرانية في مجال التكاثر والخصوبة والسرطان والمناعة.
Introduction
تتشابه قناة البيض الفئرانية في وظيفتها ومورفولوجيتها مع قناة فالوب البشرية1. يتكون كلاهما من ظهارة هدبية زائفة ، تتكون من خليتين مقيمتين ظهاريتين موصوفتين تاريخيا: الخلايا الهدبية والخلايا الإفرازية1,2. تحتوي قناة البيض على ثلاثة أجزاء معترف بها كلاسيكيا: infundibulum و ampulla و isthmus. في دراسة حديثة ، Harwalkar et al. 3 بحث في مورفولوجيا قناة البيض والتعبير الجيني مما أدى إلى توسيع تصنيف الخلايا الظهارية المقيمة إلى سبع مجموعات سكانية متميزة. بالإضافة إلى ذلك ، أنشأوا تقاطع البرزخ الأمبولاري كجزء متميز من قناة البيض3. يمكن بسهولة توسيع الطريقة الموصوفة هنا ، والتي تركز على infundibulum و ampulla و برزخ ، لتشمل التقاطع الأمبولاري البرزخي أيضا2,3. تحتوي المنطقة القاعية على ostium ، أو فتحة قناة البيض ، وتشمل المنطقة fimbrial وكذلك الساق القريبة. بالانتقال نحو الرحم ، التالي هو الأمبولا ، ثم البرزخ. الخلايا الهدهدية هي الأكثر بروزا في الطرف البعيد من المنطقة ، بالقرب من المبيض ، أو infundibulum ، في حين أن الخلايا الإفرازية هي الأكثر بروزا في الطرف القريب أو جزء البرزخ 1. على عكس قناة فالوب البشرية ، فإن قناة البيض الفئران هي بنية ملفوفة مدعومة من الميزوسالبينكس ، وهو امتداد للرباط العريض الصفاق 1,4. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تغليف قناة بيض الفأر في كيس جرابي يزيد من احتمال نقل البويضات إلى قناة البيض4. يتم تحديد الأمبولا على أنها موقع الإخصاب ، الذي تمر منه الأجنة النامية إلى البرزخ قبل دخول الرحم5. يبلغ قطر الأجزاء البوقية 200-400 ميكرومتر ويبلغ طول المناطق الأطول من الأمبولاري والبرزخ حوالي 0.5-1.0 سم4. تتوزع قناة البيض خلال دورة الاستروس والأمبولا و infundibulum أكثر قابلية للتمدد من البرزخ1.
إن الإفراط في انتشار الخلايا، وخاصة الخلايا الإفرازية، يميز آفات السلائف إلى الأورام المصلية الموجودة في تجويف الحوض6. تنشأ هذه الآفات المصلية داخل الظهارة السلائف في ظهارة قناة البيض فقط في المنطقة الفيمبرية. من غير المعروف لماذا يقتصر تكوين الآفة على هذه المنطقة حيث عادة ما يكون نوع الخلايا السائد مهدبا ، وليس إفرازيا2،7،8. تؤكد الإقليمية من حيث الوظيفة الفسيولوجية الطبيعية ، وكذلك الاهتمام المتزايد بالأصل القضوي لسرطان المبيض 9،10،11،12،13 ، على أهمية التقييم المنفصل لقطاعات قناة البيض.
تفصل الطريقة الموصوفة هنا جمع شرائح قنوات البيض المنفصلة للتحليلات اللاحقة في المصب للتعبير الجيني الخاص بالشرائح ووظيفة الخلايا المنفصلة. تقليديا ، تتم معالجة العديد من الأنسجة لاستخراج الحمض النووي الريبي بالكامل باتباع إما الفينول: طريقة الكلوروفورم أو طريقة الاستخراج الكامل على العمود. ومع ذلك ، وجدنا أنه تم الحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي مع إنتاج عائد كاف باستخدام طريقة الجمع الموصوفة. باستخدام هذه الطريقة، يمكن معالجة أجزاء وظيفية صغيرة جدا من قناة البيض للتحليلات النهائية بدلا من التحقيق في قناة البيض ككل، والتي يمكن أن تخفي النتائج التي تمثل القطاعات المختلفة14.
نادرا ما تم التحقيق في الخلايا المبيضية الفئرانية المنفصلة عن طريق قياس التدفق الخلوي ، على الأرجح بسبب الحد من إنتاجية الخلايا من هذا الأنسجة. كان أحد الأساليب للتغلب على هذه المشكلة هو فصل الخلايا ، وتنميتها في الثقافة ، ثم تحفيز إعادة التمايز في المختبر للحصول على أرقام الخلايا المناسبة لتحليل الخلايا في المراحل النهائية15،16،17،18. أحد القيود المفروضة على هذا النهج هو الوقت خارج الجسم الحي والبيئة الدقيقة المتغيرة في الثقافة ، وكلاهما من المحتمل أن يغير التعبير الجيني. هناك أيضا افتراض بأن إعادة التمايز المورفولوجي لها نفس التوقيع النسخي والبروتيني كما كان موجودا في الحيوان السليم. تم تصميم طريقة التفكك الحالية لتحقيق أكبر عدد من الخلايا الظهارية في مجموعة خلايا القنوات البيضاوية غير المتجانسة مع الحفاظ على تمايز الخلية الواحدة. علاوة على ذلك ، من المحتمل أن يحد النهج غير الأنزيمي في الغالب من فقدان بروتينات سطح الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع إجراءات ومناولة الحيوانات من قبل جامعة كاليفورنيا ، لجنة ريفرسايد المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها ، وكانت وفقا للمبادئ التوجيهية الصادرة عن الجمعية الأمريكية لرعاية المختبر ، ووزارة الزراعة الأمريكية ، والمعاهد الوطنية للصحة. استخدمت الطريقة الموصوفة C57BL/6 من الفئران البالغة والإناث. تم قتل جميع الحيوانات عن طريق قطع الرأس قبل حصاد الأنسجة.
ملاحظة: يرد في الشكل الأول (الشكل 1) نظرة عامة على البروتوكول، الذي يستخدم صبغة زرقاء للمساعدة في تشريح قناة البيض وتفكيكها بكفاءة.
الشكل 1: نظرة عامة على طريقة التشريح المجهري. (أ) تظهر اللوحة اليسرى البنية السليمة التي تمت إزالة معظم وسادة الدهون المبيضية منها وبقايا النسيج الضام المحيط بقناة البيض. بعد ذلك ، تساعد إضافة toluidine blue على تمييز ملفات قناة البيض (اللوحة الوسطى). تظهر اللوحة اليمنى الهياكل بعد إزالة المبيض. (ب) قناة بيض غير ملفوفة مع منعطفات داخلية لتحديد أين يبدأ كل جزء وينتهي. (ج) رسم كاريكاتوري للتجزئة المستخدمة (غير مرسوم على نطاق واسع). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
1. إعداد سطح التشريح
- ضع قطعة من شمع الأسنان على طبق بتري مع مادة لاصقة واتركها تجف (الشكل 2A). قم بتعقيم الطبق بنسبة 70٪ من الإيثانول. السطح جاهز للتشريح.
2. التشريح الكلي للمبيض وقناة البيض والرحم
- شل حركة طبق بتري الذي يحتوي على شمع الأسنان على منصة باردة من اختيارك (على سبيل المثال، كيس ثلج محفوظ عند -20 درجة مئوية قبل الاستخدام) تحت مجهر تشريح عندما يكون جاهزا للتشريح (الشكل 2A).
- تطهير السطح البطني للحيوان مع 70 ٪ من الإيثانول. افتح تجويف البطن والحوض بمقص تشريح معقم وحرك الجهاز الهضمي إلى جانب واحد لتحديد موقع الرحم الظهري ثنائي القرنين. اتبع كل قرن رحمي على السطح لتحديد موقع كل قناة بيض ومبيض مغلف في وسادة الدهون في الرحم ، الموجودة أسفل الكلى مباشرة (الشكل 2B ، C).
- استئصال كل من قنوات البيض الجانبية مع المبيضين وجزء من قرن الرحم البعيد لا يزال متصلا باستخدام مقص التشريح. قطع كل قرن رحمي جانبي مع ما يقرب من 1-2 سم من القرن لا يزال متصلا بقناة البيض الملفوفة والمبيض (الشكل 2D). غمر الأنسجة على الفور في 2 مل من وسط التشريح البارد (انظر جدول المواد).
الشكل 2: التشريح الكلي للمبيض وإعداد التشريح. تقع قناة البيض ظهريا في تجويف الحوض عند قاعدة الكلى داخل وسادة الدهون المبيضية (B). حدد موقع تشعب الرحم في تجويف الحوض (C) واتبع قرن الرحم الجانبي لتحديد موقع سلسلة الرحم وقناة البيض والمبيض (B). إزالة هذه الهياكل عن طريق قطع من خلال قرن رحم واحد والتشريح الخشن. ضعيه على منصة التشريح (A) ووضعي جزء الرحم على شمع الأسنان بإبرة (A و D). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ملاحظة: اتركي ما يكفي من قرن الرحم سليما ومتصلا بقناة البيض للسماح بالالتصاق بمنصة التشريح (الشكل 2D).
- قم بتثبيت أنسجة الرحم على شمع الأسنان بإبرة معقمة 25 جم لتأمين الأنسجة للتشريح (الشكل 2A و D والشكل 3A). العمل تحت مجهر التشريح ، وتنظيف وتشريح وسادة الدهون المبيض والنسيج الضام للسماح بتصور واضح لقناة البيض (الشكل 3B).
الشكل 3: التشريح المجهري لقناة البيض خطوة بخطوة. بعد إزالة الدهون المتبقية والنسيج الضام (A ، B) ، أضف التولويدين الأزرق إلى الأنسجة (C) ، ثم اغسلها لتسهيل التصور والإزالة اللاحقة للمبيض وفك لفائف الأنبوب (D-H). يمكن العثور على infundibulum بجانب البرزخ القريب والتقاطع الرحمي البوقي (UTJ). اسحب الطرف البعيد برفق أثناء القطع عند الميزوسالبينكس لفك لفائفه والكشف عن المنعطفات الداخلية لقناة البيض (H) للتوجيه من أجل التقسيم المناسب. شريط مقياس A-C = 500 ميكرومتر ، شريط مقياس D-H = 400 ميكرومتر (I) رسم كاريكاتوري للأجزاء المختلفة (غير مرسوم على المقياس). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- باستخدام حقنة 1 مل ، قم بتوزيع واحتضان قناة البيض الملصقة على الرحم في 1-2 قطرات من محلول صبغة تولويدين الأزرق المعقم بنسبة 1٪ لمدة 30 ثانية s-1 دقيقة. اشطفيه بمحلول دولبيكو الملحي المخزن بالفوسفات البارد (DPBS) وأزيلي كل السائل (الشكل 3C).
- اسحب المبيض برفق من قناة البيض الملفوفة واقطعه بعيدا عن الغشاء الجراب والرباط العريض لإزالة المبيض من قناة البيض دون المساس بأنسجة البوق (الشكل 3D ، E).
ملاحظة: المبيض غير متصل بقناة البيض ولكنه مغلف في الغشاء الجراب مع قناة البيض (الشكل 2D) ومتصل بالجانب الجانبي من الرحم عبر الرباط العريض.
3. التشريح المجهري وتجزئة قناة البيض
- حدد موقع الطرف البعيد من قناة البيض الموجودة جانبيا للتقاطع الرحمي البوقي (UTJ). لفائف قناة البيض مرة أخرى على نفسها. وبالتالي يمكن وضع نهاية fimbrial جانبية إلى النهاية القريبة وهي نقطة انطلاق مناسبة للتوجيه لفك قناة البيض (الشكل 3F ، I).
- أثناء سحب الأنبوب بلطف ، قم بقطع الميزوسالبينكس (الشكل 3I) باستخدام مقص دقيق على شكل زنبرك لفك قناة البيض (الشكل 3G).
- بمجرد فك الأنبوب ، اقطع الأنبوب لإنتاج المناطق القاعدية والأمبولية والبرزخية (الشكل 3H).
- بعد استئصال infundibulum (نهاية fimbrial وساق قريب) ، قم باستئصال المنطقة الأمبولية عن طريق القطع بعد المنعطف البارز الثاني للأنبوب (قطع بين الدورتين الثانية والثالثة ، بطول 1 سم تقريبا). أخيرا ، اقطع الجزء المتبقي إلى UTJ ، وهي المنطقة البرزخية (الشكل 3H).
ملاحظة: لن يتم فك قناة البيض بالكامل في بنية مستقيمة. سيحافظ الأنبوب على دوراته (الشكل 3H)3. واستنادا إلى المنعطفات اللاحقة التي تلي المنطقة الأمبولية، يمكن للمرء أن يقسم الأنبوب المتبقي إلى التقاطع الأمبولاري البرزخي والبرزخ3. بعد استئصال الأمبولة ، قطع بين الدورتين الخامسة والسادسة للحصول على تقاطع الأمبولاري البرزخي ؛ الأنبوب المتبقي (بدوره السادس إلى بداية UTJ) هو البرزخ3.
- بعد استئصال infundibulum (نهاية fimbrial وساق قريب) ، قم باستئصال المنطقة الأمبولية عن طريق القطع بعد المنعطف البارز الثاني للأنبوب (قطع بين الدورتين الثانية والثالثة ، بطول 1 سم تقريبا). أخيرا ، اقطع الجزء المتبقي إلى UTJ ، وهي المنطقة البرزخية (الشكل 3H).
- قم على الفور بتجميد أجزاء الأنسجة المشوهة في النيتروجين السائل لعزل الحمض النووي الريبي أو إصلاح ومعالجة كل جزء للتضمين الموجه والتحليل النسيجي المناعي.
- أضف 200 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي البارد ومزيج خرزة التجانس 1: 1 (انظر جدول المواد) إلى الأنسجة إذا كنت تتابع استخراج الحمض النووي الريبي (انظر الخطوة 5.1).
4. انفصال قناة البيض
- تابع من الخطوة 3.1.1 أعلاه) من أجل الانفصال الأمثل للظهارة ، افتح شق قناة البيض في المناطق حيثما أمكن (أي infundibulum و ampulla) لفضح الظهارة المضيئة (الشكل 4A).
الشكل 4: تفكك خلايا قناة البيض ، الجزء 1. رسم كاريكاتوري يوضح كيفية كشف الظهارة البعيدة لتفكك الخلايا الأمثل (A) وصورة توضح أسهل طريقة لاستخدام شبكة 1 مم 2 (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- بدءا من منطقة فيمبرال ، باستخدام ملقط كرافعة مالية ، شق الأنبوب طوليا باستخدام مقص على شكل نابض.
- قم بطل الأجزاء المفتوحة الشقية وقناة البيض المتبقية إلى شرائح (~ 1-2 مم في الحجم) وأضف 5 مل من العازل الدافئ غير الأنزيمي (انظر جدول المواد) واحتضنها عند 37 درجة مئوية.
- أعد تعليق قطع الأنسجة والخلايا المنفصلة باستخدام ماصة لمبة كل 3 دقائق لمدة 9-10 دقائق. قم بتخفيف المخزن المؤقت للتفكك بنسبة 1: 1 باستخدام وسط تشريح بارد.
- جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي (350 × غرام ، 3 دقائق ، 4 درجات مئوية). أعد تعليق الخلايا في 2 مل من المخزن المؤقت لتحلل RBC لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة، ثم قم بتخفيف 1:1 باستخدام وسط تشريح بارد.
- جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي (350 × غرام ، 3 دقائق ، 4 درجة مئوية) وإعادة تعليق في 5 مل من محلول pronase الباردة.
- احتضان في وسط الهضم pronase وإعادة تعليق كتل الخلايا مع ماصة لمبة كل 3-5 دقائق حتى يتم تحقيق تعليق خلية واحدة (~ 25-30 دقيقة).
ملاحظة: من الأفضل تنفيذ هذه الخطوة في صفيحة أو قارورة زراعة الأنسجة للسماح بالمراقبة المستمرة لمنع التعرض المفرط غير الضروري للبروناس.
- احتضان في وسط الهضم pronase وإعادة تعليق كتل الخلايا مع ماصة لمبة كل 3-5 دقائق حتى يتم تحقيق تعليق خلية واحدة (~ 25-30 دقيقة).
- مرر الخلايا عبر شبكة ماكرو معقمة (شبكة 1 مم × 1 مم مثبتة على أنبوب مخروطي مع شريط مطاطي (الشكل 4B)) لإزالة أي قطع أنسجة غير منفصلة متبقية. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي (350 × جم ، 3 دقائق ، 4 درجات مئوية) وإعادة تعليقها في وسط بارد مناسب للتحليل في اتجاه المصب (على سبيل المثال ، المخزن المؤقت FACS إذا استمر في تلطيخ التدفق الخلوي).
5. استخراج الحمض النووي الريبي من شرائح القنوات البيضاوية
- قم بتجانس العينات المجمدة في 200 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي في مجانس أنسجة خلاط رصاصة الخرز على المستوى 12 لفترتين (3 دقائق لكل منهما) عند 4 درجات مئوية باستخدام مزيج خرز الفولاذ المقاوم للصدأ.
ملاحظة: للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي، يجب نقل العينات على الفور من حالة التجميد المفاجئة إلى كاشف استخراج الحمض النووي الريبي وعدم وزنها. - تجانس جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة عند 100-200 × g في جهاز طرد مركزي على الطاولة لمدة 5 ثوان تقريبا في درجة حرارة الغرفة لفصل السائل عن الخرز. انقل السوبرناتانت إلى أنبوب جديد.
- أضف 200 ميكرولتر أخرى من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي إلى الخرز لاستعادة المزيد من العينات ، تليها الطرد المركزي (100-200 × جم ، 5 ثوان ، درجة حرارة الغرفة). الجمع بين supernatants.
ملاحظة: استخدم طرف ماصة صغير (معظم أطراف p200 مناسبة) لمنع ترحيل الخرز عند إزالة السوبرناتانت. - اتبع إرشادات الشركة المصنعة لفصل الحمض النووي الريبي وترسيبه تدريجيا. تم ترسيب العينات التمثيلية بين عشية وضحاها عند -20 درجة مئوية مع 100٪ isopropanol (حوالي 2: 1 حجم ، isopropanol: المرحلة المائية المستردة).
- انقل راسب الحمض النووي الريبي الكامل مع المحلول إلى عمود دوران ملزم بالحمض النووي الريبي وأجهزة طرد مركزي لمدة 30 ثانية عند 9500 × جم. قم بتنقية الحمض النووي الريبي على العمود وفقا لإرشادات الشركة المصنعة ، ثم قم بتمييع الحمض النووي الريبي في 20 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. تقييم الجودة / الكمية على مقياس الطيف الضوئي صغير الحجم و / أو المحلل الحيوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ينتج بروتوكول التفكك الموصوف 100،000-120،000 خلية لكل فأر مع تجميع كل من قنوات البيض. هذه الطريقة لطيفة بما يكفي لترك حدود الخلايا متعددة الأهداب سليمة ، مما يسمح بالتمييز بين الخلايا متعددة الأهداب والخلايا الإفرازية ، والتحقق من أن طريقة الهضم لطيفة بما يكفي لمنع إزالة التمايز. تظهر صور التألق المناعي التمثيلي في الشكل 5 كتلا صغيرة من الخلايا بعد الخطوة 4.2.1 ، ثابتة لمدة 3 دقائق في 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) / DPBS ، مغسولة بألبومين مصل البقر بنسبة 1٪ (BSA) / توين محلول ملحي مخزن مؤقتا (BTBST) وملطخ بالتعليق. باختصار ، تم اختراق الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بنسبة 0.5٪ TritonX-100 / BTBST ، وغسلها في BTBST ، وإخمادها للتألق في الخلفية لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في 20 mM glycine / DPBS ، وغسلها في BTBST ، ثم حظرها لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في 5٪ BSA / 0.1٪ TritonX-100 / TBST. ثم تم احتضان الخلايا في الجسم المضاد الأساسي عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها في BTBST (أوكلودين الفأر المضاد للفأر (1: 2000) ؛ الأرنب المضاد للفئران أسيتيلات توبولين (1: 1000)) تليها عدة غسلات في BTBST. تمت إضافة جسم مضاد ثانوي لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في BTBST (الماعز المضاد للفأر IgG Alexa Fluor 555 (1:1000) ؛ الماعز المضاد للأرانب IgG Alexa Fluor 488 (1:1000)) ، وغسله عدة مرات في BTBST ، مرة واحدة في DPBS ، ثم تم تحضينه في وصمة عار نووية لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (1:2000 ، Hoescht 33342) متبوعا بغسل في DPBS. أعيد تعليق الخلايا في 80 ميكرولتر من وسط التركيب المضاد للتلاشي وتركت بين عشية وضحاها في الظلام قبل التصوير (الشكل 5A). يوضح الشكل 5B الخلايا الموجودة في نهاية بروتوكول التفكك. وأجريت تقييمات للجدوى في جميع مراحل البروتوكول، وترد صور تمثيلية في الشكل 5 باء - دال. تمت إضافة يوديد البروبيديوم في 1:100 تخفيف ، ولوحظت الخلايا على الفور على مجهر فلوري مركب مقلوب (الشكل 5C ، بقعة حمراء). وظلت الأهداب سليمة في مجموعات الخلايا الصغيرة (الشكل 5 ألف) ومعلقات الخلية الواحدة (الشكل 5 هاء) مع ملاحظة أن العديد من الخلايا لا تزال تضرب الأهداب (الفيديو الملحق 1).
الشكل 5: تفكك خلايا قناة البيض، الجزء 2. صور الفلورسنت وتباين الطور لمجموعة خلايا إيجابية للأوكلودين (الأحمر) والنوى (الأزرق) والتوبولين الأسيتيل (الأخضر). تظل الحدود القمية الهدبية (الخضراء في الذكاء الاصطناعي و AV) سليمة طوال البروتوكول وتقاوم المزيد من الهضم للخلايا المفردة (E). الذكاء الاصطناعي: دمج, AII: قناة حمراء, AIII: قناة زرقاء, AIV: تباين المرحلة, AV: قناة خضراء. بعد حضانة pronase قصيرة ، تكون غالبية الخلايا مفردة. يظهر تلطيخ يوديد البروبيديوم (PI) قابلية للاستمرار بنسبة 93٪ تقريبا. (ب ) حقل ساطع ، (ج) قناة حمراء PI إيجابية ، (D) دمج. (ه) يظهر الجزء الداخلي من الدمج حدا هدبيا سليما على خلية واحدة مفككة. كانت هذه الخلايا تضرب الأهداب بنشاط (انظر الملحق فيديو 1). تم التقاط الصور على مجهر فلوري مركب مقلوب. الشكل الذكاء الاصطناعي-V شريط المقياس = 20 ميكرومتر، شريط مقياس B-D = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يوفر بروتوكول عزل الحمض النووي الريبي الموصوف إنتاجية ونقاء كافيين ضروريين ل RT-qPCR و RNAseq القطاعيين. تظهر النتائج أن هذه الطريقة تنتج 800-1200 نانوغرام من الحمض النووي الريبي لكل جزء (الشكل 6A) باستثناء العينات غير القاعية حيث قد يكون التجميع من حيوانين ضروريا للحصول على عائد مناسب للمقايسات النهائية. يتم تجميع النتائج المعروضة ل infundibulum من حيوانين ، يبلغ مجموعهما أربع مناطق غير قابلة للتمويل (الشكل 6). هذا البروتوكول ناجح في تحقيق الحمض النووي الريبي النقي ، الذي تم تحليله في البداية بواسطة مقياس الطيف الضوئي للحجم الصغير وأيضا بواسطة المحلل الحيوي (الشكل 6B ، C). وللعينات نسبة امتصاص تبلغ 260/280 نانومتر تتراوح بين 1.8 و2.0 (الشكل 6 ب) نموذجية لأنواع نيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي النقي19. وأخذت نسب الامتصاص (260/230 نانومتر) لكل عينة بمعيار إدراج يتراوح بين 1 و2.2، وهو ما يمثل التلوث المحدود من كواشف العزل (البيانات غير معروضة)19. أظهر التحليل الحيوي للعينات سلامة عالية للحمض النووي الريبي، مع تقييم رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) فوق سبعة (الشكل 6C)، وهو مناسب للتعبير النهائي وتحليل التسلسل20.
الشكل 6: تقييم جودة الحمض النووي الريبي القطاعي. تم تقييم الحمض النووي الريبي الكامل من حيث الإنتاجية (A) والجودة (B ، C) بواسطة مقياس الطيف الضوئي المصغر والمحلل الحيوي. RIN: رقم سلامة الحمض النووي الريبي ، كما تم تقييمه من قبل المحلل الحيوي. القضبان هي متوسط الانحراف المعياري (SD) ±، N = 12 عينة لكل جزء من اثنين من عمليات استخراج الحمض النووي الريبي المنفصلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو تكميلي 1: تصوير الخلايا الحية لأهداب الضرب على الخلايا المنفصلة. ضرب الأهداب بعد الهضم pronase. تم التقاط مقاطع فيديو على مجهر مركب مقلوب. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأجزاء الثلاثة من قناة البيض متميزة نسيجيا ومورفولوجيا ووظيفيا1،2،3. تختلف الظهارة اختلافا كبيرا من أحد طرفي قناة البيض إلى الطرف الآخر. تهيمن الخلايا الهدبية في الطرف الوهمي/القاعي، بينما تهيمن الخلايا الإفرازية في المنطقة البرزخية1. في حين تم الاعتراف بهذا التدرج العام لبعض الوقت ، فقد كشفت الأعمال الأخيرة عن المزيد من الفروق بين قطاعات القنوات البيضاء. وهكذا، في حين أن الخلايا الهدبية تصبح أقل تواترا نحو الطرف القريب من الأنبوب، هناك انخفاض حاد في عددها (من حوالي 60٪ إلى 10٪ هدبية) تنتقل من الأمبولا إلى التقاطع الأمبولاري البرزخي3. علاوة على ذلك ، فإن مجموعات الخلايا الظهارية في الأجزاء القريبة والبعيدة مشتقة من سلالات متميزة من الناحية التنموية1،2،3. لا تساهم الخلايا الظهارية البعيدة في infundibulum و ampulla في مجموعات الخلايا الظهارية القريبة في البرزخ ، كما هو موضح في تتبع نسب العلامات الظهارية. في اليوم الجنيني 12.5 (E12.5) ، يكون للخلايا الظهارية البيضاوية سلالة متميزة مستقلة عن علامة الخلية الظهارية القريبة ، PAX22. هذه الاكتشافات ، بالإضافة إلى تنوع عدد الخلايا بين مختلف الشرائح ، تؤكد بشكل أكبر على ضرورة التحقيق في القطاعات بشكل مستقل. تفصل الطريقة الموصوفة بروتوكول التفكيك وتحديد الشرائح خطوة بخطوة وفقا للأجزاء الثلاثة الموصوفة تاريخيا (infundibulum و ampulla و isthmus). ونظرا لإنشاء التقاطع الأمبولاري - البرزخي مؤخرا كجزء نهائي من قناة البيض، أعطيت الأولوية لتحديد وجمع المناطق الثلاث الموصوفة كلاسيكيا. ومع ذلك ، يمكن توسيع الطريقة لتشمل مجموعة منفصلة من التقاطع الأمبولاري البرزخي ، كما هو موضح أعلاه3.
يعد استخدام الصبغة الزرقاء وموقع infundibulum خطوة حاسمة لاسترخاء قناة البيض بطريقة سريعة وفعالة. تسلط الصبغة الزرقاء الضوء على أوستيوم ولفائف الأنبوب ، مما يسمح بإزالة اللفائف وجمعها بشكل أسرع وأكثر كفاءة. الموقع الأولي للأوستيوم يوجه المرء إلى المناطق البعيدة (غير القاعية) والقريبة (البارزة) من قناة البيض طوال فترة فك اللف. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الحفاظ على جزء قرن الرحم القريب المثبت على منصة التشريح أثناء فك اللفائف يسمح للجراح باستخدام كلتا يديه لخطوات التشريح الحساسة. يمكن أن تؤدي الإزالة الأولية لقناة البيض الملفوفة ومحاولات فك هذا الهيكل دون جعل الأنبوب غير متحرك أو دون استخدام الصبغة بسهولة إلى الارتباك فيما يتعلق بالنهايات البعيدة والقريبة أو التسبب في كسر الأنبوب. كسر الأنبوب سهل ، لذلك يجب توخي الحذر عند فك اللفائف لأن الكسر سيجعل التجزئة القابلة للتكرار غير قابلة للتحقيق. يوصى بشدة باستخدام مقص صغير عالي الجودة على شكل نابض لتحقيق أفضل النتائج.
من المرجح أن يؤدي تقييم توقيع التعبير الجيني في الأجزاء المتنوعة من قناة البيض ، على سبيل المثال ، خلال دورة estrous واستجابة للهرمونات والسيتوكينات التي يتم إعطاؤها ، إلى فهم أفضل بكثير لكيفية تغير قناة البيض استجابة لهذه المحفزات. قد تلقي هذه البيانات الضوء أيضا على العوامل التي تسهم في التحول الظهاري. تم تطوير بروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي هنا للحصول على أعلى كمية ونوعية ممكنة لهذا النسيج ذي الحجم المحدود والبنية البوبية المرنة. تم العثور على التجانس الموصوف ، وهطول الأمطار الحمض النووي الريبي ، والاستخدام المقترن للفينول: الكلوروفورم وطرق التنقية على العمود لتكون الأكثر كفاءة في تحقيق الجودة والكمية المناسبة من الحمض النووي الريبي للتحليل النهائي. لم يتم وزن الأجزاء البيضوية وتم معالجة أجزاء كاملة على الفور من أجل تجانس الأنسجة من أجل منع أي احترار في الأنسجة يؤدي إلى تدهور الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن الأجزاء البوقية الصغيرة تتطلب خطوات تجانس متعددة ، فمن الأهمية بمكان التأكد من إجراء التجانس عند 4 درجات مئوية للحفاظ على سلامة العينة. نظرا لأن هذه الطريقة كافية لإنتاج عائد مناسب للتحليل النهائي ، فإن التطبيق المستقبلي لهذه التقنية سيكون إجراء RNAseq قطاعي ، لم يتم الإبلاغ عنه سابقا ، مما سيساهم بشكل كبير في فهمنا لفسيولوجيا قناة البيض.
أثناء تطوير بروتوكول تفكك الخلايا ، وجدنا أن الهضم الإنزيمي القوي و / أو الطويل تسبب في فقدان واضح للأهداب . لذلك ، ركزنا على تطوير ، وحققنا ، طريقة حافظت على مورفولوجيا الخلية. وستسمح التحسينات في إنتاجية الخلية الواحدة، كما هو موضح هنا، بإجراء تحليلات متعددة الإرسال أكثر قوة وفورية لمختلف أنواع الخلايا الظهارية واللحمية عن طريق قياس التدفق الخلوي. من المرجح أيضا أن يؤدي استخدام بروتوكول تفكك غير إنزيمي يتبعه حضانة قصيرة في البروناس إلى تحسين الحفاظ على مستضدات سطح الخلية على طرق التفكك باستخدام طرق هضم طويلة أو قوية2,18. يتطلب تحليل تسلسل الخلية الواحدة عددا أقل بكثير من الخلايا مقارنة بألواح قياس التدفق الخلوي متعددة الإرسال2,21. لذلك قد يكون تسلسل الخلية الواحدة للأجزاء الثلاثة الموصوفة من قناة البيض ممكنا باستخدام البروتوكول الموصوف.
نظرا لأنه لا يمكن تقديم قناة البيض على طولها بالكامل ، فقد يكون أحد القيود المحتملة للطريقة الحالية هو أن الخلايا التي تشكل ظهارة البرزخ الأضيق كانت ستقلل من التعرض لكواشف التفكك ، وبالتالي قد لا تكون موجودة في التعليق النهائي بنفس النسبة كما هو الحال في الجسم الحي.
نظرا لالتواء قناة البيض، يمكن أن يكون التوجه نحو التحليلات الكيميائية النسيجية المناعية لجميع الأجزاء البيضية أمرا صعبا3. ومع ذلك ، فإن تشريح المقطع الموصوف متبوعا بتضمين موجه للأجزاء البيضية يسمح بتحليل الصور الطولية والمستعرضة بشكل أكثر شمولا دون الحاجة إلى التقسيم المتسلسل عبر الأنبوب الملفوف السليم بأكمله. علاوة على ذلك ، فإن الصبغة الزرقاء المستخدمة في فك اللفائف ، تساعد في الاتجاه الصحيح أثناء تضمين الأجزاء البوقية الصغيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال جائزة وزارة الدفاع للاختراق إلى AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). تم دعم KCR جزئيا من خلال زمالات داخلية: زمالة Pease Cancer Pre-PhD وزمالة Mary Galvin Burden Pre-PhD في العلوم الطبية الحيوية وجامعة كاليفورنيا ، ريفرسايد ، الجوائز الداخلية: منحة أبحاث أطروحة لجنة زمالة مجلس الدراسات العليا وجائزة برنامج سنة أطروحة قسم الدراسات العليا. يشكر المؤلفون جيليان م. رايت وأليسا م. كوماري على المساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها في وقت مبكر لهذه الطريقة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB05 | Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized |
| 1.4 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB14B | Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized |
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS) | Gibco | 21600-010 | Cold, sterile |
| 25G needle | BD | 305122 | |
| 60 mm sterile petri dishes | Corning | 430166 | |
| 70 μm cell meshes | Fisherbrand | 22-636-548 | |
| Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit | Agilent 2100 Bioanalyzer | 5067-1513 | |
| Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
| Bioanlyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer | ||
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Cold plate/pack/surface of choice | N/A | N/A | Kept at -20 °C for dissection |
| Dental wax | Polysciences Inc. | 403 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12 | Corning | 10-090-CV | Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015CV | |
| Fine point forceps of choice | N/A | N/A | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G712b | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21422 | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Immunocytochemical validation images |
| Hepes | Sigma Aldrich | H-3784 | |
| Hoescht 33342 | Cell Signaling Technologies | 4082S | Immunocytochemical validation images |
| Inverted compound microscope | Keyence BZ-X700 | ||
| Mouse anti-mouse Occludin | Invitrogen | 33-1500 | Immunocytochemical validation images |
| Non-enzymatic dissociation buffer | N/A | 5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS | |
| Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm | Thomas Scientific | 1210U04 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P-6148 | Immunocytochemical validation images |
| Pen-Strep | MP Biomedicals | 10220-718 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technologies | 9071S | Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | Prepare pronase digestion medium: 0.15% pronase in DMEM/Ham's F12, sterile |
| Propidium Iodide | Roche | 11 348 639 001 | Viability validation images |
| Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin | Abcam | ab179484 | Immunocytochemical validation images |
| RBC lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | Utilized for on-column purification in text |
| Spring form microdissection scissors | Roboz Surgical | RS-5610 | |
| Sterile 3 mL bulb pipettors | Globe Scientific | 137135 | |
| Toluidine blue | Alfa Aesar | J66015 | Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile |
| Tris-Buffered Saline-Tween (TBST) | N/A | N/A | Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20 |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Inc. | 3555 | Immunocytochemical validation images |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Invitrogen | 15596026 | Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines |
References
- Stewart, C. A., et al. Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. Kubiak, J. Z., et al. , Springer. Berlin Heidelberg. 247-262 (2012).
- Ford, M. J., et al. Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis. Cell Reports. 36 (10), 109677 (2021).
- Harwalkar, K., et al. Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development. Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).
- Agduhr, E. Studies on the structure and development of the bursa ovarica and the tuba uterina in the mouse. Acta Zoologica. 8 (1), 1 (1927).
- Pulkkinen, M. O. Oviductal function is critical for very early human life. Annals of Medicine. 27 (3), 307-310 (1995).
- Kindelberger, D. W., et al. Intraepithelial carcinoma of the fimbria and pelvic serous carcinoma: Evidence for a causal relationship. American Journal of Surgical Pathology. 31 (2), 161-169 (2007).
- Ghosh, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. In vivo genetic cell lineage tracing reveals that oviductal secretory cells self-renew and give rise to ciliated cells. Development. 144 (17), 3031-3041 (2017).
- Lee, Y., et al. A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube. Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).
- Kim, J., et al. High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3921-3926 (2012).
- Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).
- Sherman-Baust, C. A., et al. A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development. Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).
- Zhai, Y. L., et al. High-grade serous carcinomas arise in the mouse oviduct via defects linked to the human disease. Journal of Pathology. 243 (1), 16-25 (2017).
- Karthikeyan, S., et al. Prolactin signaling drives tumorigenesis in human high grade serous ovarian cancer cells and in a spontaneous fallopian tube derived model. Cancer Letters. 433, 221-231 (2018).
- Shao, R., et al. Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: Evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice. Biology of Reproduction. 79 (4), 748-757 (2008).
- Alwosaibai, K., et al. PAX2 maintains the differentiation of mouse oviductal epithelium and inhibits the transition to a stem cell-like state. Oncotarget. 8 (44), 76881-76897 (2017).
- Peri, L. E., et al. A novel class of interstitial cells in the mouse and monkey female reproductive tracts. Biology of Reproduction. 92 (4), 102 (2015).
- Lõhmussaar, K., et al. Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids. Nature Communications. 11 (1), 2660 (2020).
- Chen, S., et al. An air-liquid interphase approach for modeling the early embryo-maternal contact zone. Scientific Reports. 7, 42298 (2017).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2565 (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- McGlade, E. A., et al. Cell-type specific analysis of physiological action of estrogen in mouse oviducts. The FASEB Journal. 35 (5), 21563 (2021).
