Summary
En metode for mikrodisseksjon av musens ovidukt som tillater innsamling av de enkelte segmentene samtidig som RNA-integriteten opprettholdes. I tillegg er ikke-enzymatisk oviductal celle dissosiasjonsprosedyre beskrevet. Metodene er egnet for påfølgende gen- og proteinanalyse av de funksjonelt forskjellige oviduktsegmentene og dissosierte oviduktceller.
Abstract
Musemodellsystemer er uovertruffen for analyse av sykdomsprosesser på grunn av deres genetiske manipulabilitet og lave kostnader for eksperimentelle behandlinger. Men på grunn av deres lille kroppsstørrelse har noen strukturer, som ovidukten med en diameter på 200-400 μm, vist seg å være relativt vanskelig å studere bortsett fra ved immunhiistokjemi. Nylig har immunhiistokjemiske studier avdekket mer komplekse forskjeller i oviduktsegmenter enn tidligere anerkjent; Dermed er ovidukten delt inn i fire funksjonelle segmenter med forskjellige forhold mellom syv forskjellige epitelcelletyper. De forskjellige embryologiske opprinnelsene og forholdene til epitelcelletypene gjør sannsynligvis de fire funksjonelle regionene differensialt utsatt for sykdom. For eksempel oppstår forløperlesjoner til serøse intraepitheliale karsinomer fra infundibulum i musemodeller og fra den tilsvarende fimbrial-regionen i det menneskelige egglederne. Protokollen som er beskrevet her beskriver en metode for mikrodisseksjon for å dele opp ovidukten på en slik måte at den gir tilstrekkelig mengde og renhet av RNA som er nødvendig for nedstrømsanalyser som omvendt transkripsjon-kvantitativ PCR (RT-qPCR) og RNA-sekvensering (RNAseq). Også beskrevet er en for det meste ikke-enzymatisk vev dissosiasjonsmetode egnet for strømning cytometri eller enkeltcellet RNAseq analyse av fullt differensierte oviduktceller. Metodene som beskrives vil lette videre forskning ved hjelp av murin ovidukten innen reproduksjon, fruktbarhet, kreft og immunologi.
Introduction
Murin ovidukten er lik i funksjon og morfologi til det menneskelige fallopianrøret1. Begge består av et pseudostratifisert ciliated epitel, bestående av to historisk beskrevne epitelceller: ciliated celler og sekretoriske celler1,2. Ovidukten har tre klassisk anerkjente segmenter: infundibulum, ampulla og isthmus. I en nylig studie, Harwalkar et al. 3 undersøkte oviduktmorfologi og genuttrykk som førte til utvidelse av kategorisering av bosatte epitelceller til syv forskjellige populasjoner. I tillegg etablerte de ampullary-isthmus-krysset som et tydelig segment av ovidukten3. Metoden som er beskrevet her, som fokuserer på infundibulum, ampulla og isthmus, kan lett utvides til å omfatte det ampullære-iskemiske krysset også2,3. Den infundibulære regionen inneholder ostium, eller åpning av ovidukten, og inkluderer fimbrialområdet så vel som den proksimale stengelen. Beveger seg mot livmoren, neste er ampulla, og deretter isthmus. Ciliated celler er mest fremtredende i den distale enden av regionen, proksimal til eggstokken, eller infundibulum, mens sekretoriske celler er mest fremtredende i den proksimale enden eller isthmus segment1. I motsetning til det menneskelige egglederen er murin ovidukten en spolet struktur støttet av mesosalpinxen, en forlengelse av det brede ligamentperitoneum1,4. I tillegg er mus ovidukten innkapslet i en bursalsekk som øker sannsynligheten for oocyttoverføring til ovidukten4. Ampulla er identifisert som plasseringen av befruktning, hvorfra utviklende embryoer passerer inn i isthmus før de går inn i livmoren5. Tubal segmenter er 200-400 μm i diameter og lengre ampullære og isthmus regioner er ca 0,5-1,0 cm i lengde4. Ovidukten distendene under østrogensyklusen og ampulla og infundibulum er mer distensible enn isthmus1.
Over spredning av celler, spesielt sekretoriske celler, karakteriserer forløperlesjoner til serøse svulster som finnes i bekkenhulen6. Disse forløper serøse intraepitheliale lesjonene oppstår i oviduktepitelet utelukkende i fimbrialområdet; Det er ukjent hvorfor lesjonsdannelse er begrenset til denne regionen der normalt den dominerende celletypen er ciliated, ikke sekretorisk2,7,8. Regionaliteten når det gjelder normal fysiologisk funksjon, samt økt interesse for oviduktal opprinnelse av eggstokkkreft9,10,11,12,13, understreker viktigheten av separat evaluering av oviduktsegmentene.
Metoden som er beskrevet her beskriver innsamlingen av separate oviduktsegmenter for påfølgende nedstrømsanalyser av segmentspesifikke genuttrykk og funksjon av dissosierte celler. Tradisjonelt behandles mange vev for hele RNA-ekstraksjon etter enten fenol: kloroformmetode eller en komplett ekstraksjonsmetode på kolonnen; Vi fant imidlertid at RNA-kvaliteten ble opprettholdt samtidig som den produserte tilstrekkelig avkastning med den beskrevne kombinasjonsmetoden. Ved hjelp av denne metoden kan svært små funksjonelle segmenter av ovidukten behandles for nedstrømsanalyser i stedet for å undersøke ovidukten som helhet, noe som kan maskere resultater som er representative for de forskjellige segmentene14.
Dissosierte murinlegende celler har sjelden blitt undersøkt av strømningscytometri, mest sannsynlig på grunn av det begrensende celleutbyttet fra dette vevet. En tilnærming for å overvinne dette problemet har vært å dissosiere celler, vokse dem i kultur, og deretter stimulere re-differensiering in vitro for å oppnå passende celletall for nedstrøms celleanalyse15,16,17,18. En begrensning i denne tilnærmingen er tiden ex vivo og endret mikromiljø i kulturen, som begge sannsynligvis endrer genuttrykk. Det er også en antagelse at morfologisk re-differensiering har samme transkripsjonelle og proteomiske signatur som var tilstede i det intakte dyret. Den nåværende dissosiasjonsmetoden ble designet for å oppnå det høyeste antallet epitelceller i en heterogen oviduktcellepopulasjon samtidig som man opprettholder encellet differensiering. Videre begrenser den for det meste ikke-enzymatiske tilnærmingen sannsynligvis tapet av celleoverflateproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All dyrehåndtering og prosedyrer ble godkjent av University of California, Riverside institusjonelle dyrepleie- og brukskomité og var i samsvar med retningslinjer fra American Association for Laboratory Animal Care, United States Department of Agriculture og National Institutes of Health. Den beskrevne metoden benyttet C57BL/6 voksne, kvinnelige mus. Alle dyr ble avlivet ved halshugging før vevshøsting.
MERK: En oversikt over protokollen, som bruker et blått fargestoff for å hjelpe til med effektiv disseksjon og uoiling av ovidukten, vises i den første figuren (figur 1).
Figur 1: Oversikt over mikrodeseksjonsmetoden. (A) Venstre panel viser den intakte strukturen som det meste av eggstokkfettputen og rester av bindevev rundt ovidukten er fjernet fra. Etter dette bidrar tilsetningen av toluidinblå til å skille spolene til ovidukten (midtpanelet). Høyre panel viser strukturer etter fjerning av eggstokken. (B) En usammenhengende ovidukt med interne svinger for å bestemme hvor hvert segment begynner og slutter. (C) Tegneserie av segmenteringen som brukes (ikke trukket til skala). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
1. Klargjøring av disseksjonsoverflaten
- Fest et stykke tannvoks til en Petri-tallerken med lim og la den tørke (figur 2A). Desinfiser parabolen med 70% etanol. Overflaten er klar for disseksjon.
2. Makrodisseksjon av eggstokken, ovidukten og livmoren
- Immobiliser Petri-retten som inneholder tannvoksen på en kald plattform (f.eks. en ispakke som oppbevares ved -20 °C før bruk) under et disseksjonsmikroskop når den er klar til disseksjon (figur 2A).
- Desinfiser dyrets ventrale overflate med 70% etanol. Åpne buk- og bekkenhulen med steril disseksjonssaks og flytt mage-tarmkanalen til den ene siden for å finne den dorsale bihornale livmoren. Følg hvert livmorhorn rostrally for å finne hver ovidukt og eggstokk innhyllede i livmorfettputen, som finnes like under nyrene (figur 2B, C).
- Slukk begge laterale ovidukter med eggstokkene og en del av det distale livmorhornet som fortsatt er festet ved hjelp av disseksjonssaks. Klipp hvert laterale livmorhorn med ca. 1-2 cm av hornet som fortsatt er festet til den spolede ovidukten og eggstokken (figur 2D). Senk vevet umiddelbart ned i 2 ml kaldt disseksjonsmedium (se materialtabell).
Figur 2: Makrodisseksjon av eggstokken og disseksjonsoppsettet. Ovidukten ligger dorsalt i bekkenhulen ved foten av nyrene i eggstokkfettputen (B). Finn livmorbifurkasjonen i bekkenhulen (C) og følg det laterale livmorhornet for å finne livmor-ovidukt-eggstokkkontinuumet (B). Fjern disse strukturene ved å skjære gjennom ett livmorhorn og grov disseksjon. Plasser på dissekeringsplattformen (A) og fest livmordelen til tannvoks med en nål (A og D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
MERK: La nok livmorhorn være intakt og festet til ovidukten for å tillate festing på disseksjonsplattformen (figur 2D).
- Fest livmorvevet til tannvoksen med en steril nål på 25 G for å sikre vev for disseksjon (figur 2A, D og figur 3A). Arbeid under disseksjonsmikroskopet, rengjør og disseker bort eggstokkfettputen og bindevevet for å tillate klar visualisering av ovidukten (figur 3B).
Figur 3: Mikrodesinfeksjon trinnvis. Etter fjerning av restfett og bindevev (A, B), legg toluidinblått til vevet (C), og vask deretter bort for å lette visualisering og etterfølgende fjerning av eggstokken og unoiling av røret (D-H). Infundibulumet finnes ved siden av det proksimale isthmus- og livmor-tubalkrysset (UTJ). Trekk lett den distale enden mens du skjærer ved mesosalpinxen for å løsne og avsløre de endogene svingene til ovidukten (H) for å orientere seg for passende segmentering. Figur A-C skala bar = 500 μm, D-H skala bar = 400 μm (I) Tegneserie av de ulike segmentene (ikke trukket til skala). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Bruk en 1 ml sprøyte, dispenser og inkuber ovidukten festet til livmoren i 1-2 dråper steril 1% toluidinblå fargestoffløsning i 30 s-1 min. Skyll med kald Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) og fjern all væsken (figur 3C).
- Trekk eggstokken lett fra den spolede ovidukten og kutt bort ved bursalmembranen og det brede ligamentet for å fjerne eggstokken fra ovidukten uten å gå på kompromiss med tubalvevet (figur 3D,E).
MERK: Eggstokken er ikke festet til ovidukten, men innkapslet i bursalmembranen med ovidukten (figur 2D) og koblet til livmorens sideside via det brede ligamentet.
3. Mikrodisseksjon og segmentering av ovidukten
- Finn den distale, fimbriale enden av ovidukten som finnes lateral til livmor-tubal krysset (UTJ). Ovidukten spoler tilbake på seg selv; Derfor kan den fimbriale enden plasseres lateral til den proksimale enden og er et passende utgangspunkt for å orientere seg for unoiling av ovidukten (figur 3F, I).
- Mens du forsiktig trekker i røret, kutt bort på mesosalpinxen (figur 3I) med vårformet mikrosaks for å løsne ovidukten (figur 3G).
- Når røret er usammenhengende, kutt det for å produsere de infundibulære, ampullære og istemiske områdene (figur 3H).
- Etter eksisjon av infundibulum (fimbrial ende og proksimal stilk), slukk ampullærområdet ved å kutte etter den andre fremtredende svingen av røret (kutt mellom svinger to og tre, ca. 1 cm i lengden). Til slutt kutter du den gjenværende delen til UTJ, som er det istemiske området (figur 3H).
MERK: Ovidukten vil ikke helt løsne i en rett struktur. Røret vil opprettholde sine svinger (figur 3H)3. Basert på de påfølgende svingene etter ampullærområdet, kan man videre segmentere det gjenværende røret inn i det ampullære-istemiske krysset og isthmus3. Etter ampulla eksisjon, kutt mellom sving fem og seks for å oppnå ampullær-istemisk kryss; det gjenværende røret (drei seks til starten av UTJ) er isthmus3.
- Etter eksisjon av infundibulum (fimbrial ende og proksimal stilk), slukk ampullærområdet ved å kutte etter den andre fremtredende svingen av røret (kutt mellom svinger to og tre, ca. 1 cm i lengden). Til slutt kutter du den gjenværende delen til UTJ, som er det istemiske området (figur 3H).
- Umiddelbart snap fryse dissekert vev segmenter i flytende nitrogen for RNA isolasjon eller fikse og behandle hvert segment for orientert innebygging og immunohistological analyse.
- Tilsett 200 μL kaldt RNA ekstraksjonsreagens og 1:1 homogeniseringsperleblanding (se Materialtabell) i vevet hvis du fortsetter med RNA-ekstraksjon (se trinn 5.1).
4. Oviduct dissosiasjon
- Videreført fra trinn 3.1.1 ovenfor) For optimal dissosiasjon av epitelet, slit åpne ovidukten i områdene der det er mulig (dvs. infundibulum og ampulla) for å eksponere lysende epitel (figur 4A).
Figur 4: Oviduct celle dissosiasjon, del 1. Tegneserie som viser hvordan du eksponerer det distale epitelet for optimal celledissosiasjon (A) og et bilde som viser den enkleste måten å bruke 1 mm2-nettet (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Fra og med fimbrialområdet, ved hjelp av tang som giring, slit røret langsgående med vårform saks.
- Hakk de slit-åpne delene og den gjenværende ovidukten i segmenter (~1-2 mm i størrelse) og tilsett 5 ml varm, ikke-enzymatisk dissosiasjonsbuffer (se Materialtabell) og inkuber ved 37 °C.
- Resuspend vevsstykkene og dissosierte celler med en pære pipettor hver tredje min i 9-10 min. Fortynn dissosiasjonsbufferen 1:1 med kaldt avhandlingsmedium.
- Samle cellene ved sentrifugering (350 x g, 3 min, 4 °C). Resuspend cellene i 2 ml RBC lysis buffer i 2 min ved romtemperatur, og fortynn deretter 1:1 med kaldt disseksjonsmedium.
- Samle cellene ved sentrifugering (350 x g, 3 min, 4 °C) og resuspend i 5 ml kald pronaseoppløsning.
- Inkuber i pronase fordøyelsesmedium og resuspend celle klumpene med en pære pipettor hver 3-5 min til en enkelt celle suspensjon oppnås (~ 25-30 min).
MERK: Dette trinnet utføres best i en vevskulturplate eller kolbe for å tillate konstant observasjon som forhindrer unødvendig overeksponering for pronase.
- Inkuber i pronase fordøyelsesmedium og resuspend celle klumpene med en pære pipettor hver 3-5 min til en enkelt celle suspensjon oppnås (~ 25-30 min).
- Før cellene gjennom et sterilt makronett (1 mm x 1 mm nett festet til et konisk rør med et gummibånd (figur 4B)) for å fjerne eventuelle gjenværende udissosierte vevstykker. Samle cellene ved sentrifugering (350 x g, 3 min, 4 °C) og resuspender dem i et kaldt medium som passer for nedstrømsanalyse (f.eks. FACS-buffer hvis du fortsetter med farging for strømningscytometri).
5. RNA-ekstraksjon av oviduktsegmenter
- Homogeniser snap-frosne prøver i 200 μL RNA ekstraksjonsreagens i en perle bullet blender vev homogenisator på nivå 12 for to intervaller (3 min hver) ved 4 °C ved hjelp av beadblandingen i rustfritt stål.
MERK: For å bevare RNA-integriteten, bør prøvene umiddelbart flyttes fra snap-frossen tilstand til RNA-ekstraksjonsreagens og ikke veies. - Kort sentrifuger homogenat ved 100-200 x g i en bordplate sentrifuge i ca 5 s ved romtemperatur for å skille væsken fra perlene. Overfør supernatanten til et friskt rør.
- Tilsett ytterligere 200 μL RNA ekstraksjonsreagens til perlene for å gjenopprette flere prøver, etterfulgt av sentrifugering (100-200 x g, 5 s, romtemperatur). Kombiner supernatantene.
MERK: Bruk en liten pipettespiss (de fleste p200-spisser er egnet) for å forhindre perleoverbæring når du fjerner supernatanten. - Følg produsentens retningslinjer for å faseseparere og utfelle RNA. Representative prøver ble utfelt over natten ved -20 °C med 100 % isopropanol (ca. 2:1 volum, isopropanol: gjenvunnet vandig fase).
- Overfør hele RNA-bunnfallet sammen med løsningen til en RNA-bindende spinnkolonne og sentrifuge i 30 s ved 9500 x g. Rens RNA-kolonnen i henhold til produsentens retningslinjer, og elut RNA i 20 μL nukleasefritt vann. Vurder kvaliteten/kvantiteten på et mikrovolumspektrofotometer og/eller bioanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne dissosiasjonsprotokollen gir 100 000-120 000 celler per mus ved sammenslåing av begge oviduktene. Metoden er mild nok til å la multi-ciliated cellekantlinjer være intakte, noe som gir et skille mellom multi-ciliated celler og sekretoriske celler, og verifisere at fordøyelsesmetoden er mild nok til å forhindre avdifferensiering. Representative immunfluorescensbilder i figur 5 viser små celleklumper etter trinn 4.2.1, festet i 3 min i 4% paraformaldehyd (PFA)/ DPBS, vasket med 1% bovint serumalbumin (BSA)/ Tris-bufret saltvann-tween (BTBST) og farget i suspensjon. Kort sagt ble cellene gjennomsyret i 15 minutter ved romtemperatur i 0,5% TritonX-100/BTBST, vasket i BTBST, slukket for bakgrunnsfluorescens i 2 timer ved romtemperatur i 20 mM glycin / DPBS, vasket i BTBST, og deretter blokkert i 1 time ved romtemperatur i 5% BSA / 0,1% TritonX-100 / TBST. Celler ble deretter inkubert i det primære antistoffet ved 4 °C over natten i BTBST (mus antimus occludin (1:2000); kanin antimus acetylert tubulin (1:1000)) etterfulgt av flere vasker i BTBST. Sekundært antistoff ble tilsatt i 1 time ved romtemperatur i BTBST (geit antimus IgG Alexa Fluor 555 (1:1000); geit anti-kanin IgG Alexa Fluor 488 (1:1000)), vasket flere ganger i BTBST, en gang i DPBS, og deretter inkubert i kjernefysisk flekk i 20 min ved romtemperatur (1:2000, Hoescht 33342) etterfulgt av en vask i DPBS. Celler ble resuspendert i 80 μL antifade monteringsmedium og forlatt over natten i mørket før avbildning (figur 5A). Figur 5B viser celler på slutten av dissosiasjonsprotokollen. Levedyktighetsvurderinger ble gjort gjennom hele protokollen, og representative bilder vises i figur 5B-D. Propidiumjodid ble tilsatt ved 1:100 fortynning, og celler ble umiddelbart observert på et invertert sammensatt fluorescensmikroskop (figur 5C, rød flekk). Cilia forble intakt i små celleklynger (figur 5A) og enkeltcelle suspensjoner (figur 5E) med mange celler observert å ha cilia fortsatt slå (Suppl. Video 1).
Figur 5: Oviduct celle dissosiasjon, del 2. Fluorescerende og fasekontrastbilder av en celleklynge som er positive for okcludin (rød), kjerner (blå) og acetylert tubulin (grønn). Den ciliated apikale grensen (grønn i AI og AV) forblir intakt gjennom hele protokollen og tåler videre fordøyelse til enkeltceller (E). AI: slå sammen, AII: rød kanal, AIII: blå kanal, AIV: fasekontrast, AV: grønn kanal. Etter en kort pronase inkubasjon er flertallet av cellene enkle. Propidiumjodid (PI) farging viser ca. 93% levedyktighet. (B) Lys felt, (C) rød kanal PI positiv, (D) sammenslåing. (E) innfelt ved fletting viser en intakt ciliated kantlinje på en enkelt dissosiert celle. Slike celler hadde aktivt slått cilia (se Suppl. Video 1). Bilder ble tatt på et invertert sammensatt fluorescensmikroskop. Figur AI-V skala bar = 20 μm, B-D skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Den beskrevne RNA-isolasjonsprotokollen gir tilstrekkelig avkastning og renhet som er nødvendig for segmentell RT-qPCR og RNAseq. Resultatene viser at denne metoden gir 800-1200 ng RNA per segment (figur 6A) bortsett fra infundibulære prøver der sammenslåing fra to dyr kan være nødvendig for passende utbytte for nedstrømsanalyser. De presenterte resultatene for infundibulum er samlet fra to dyr, totalt fire infundibulære regioner (figur 6). Denne protokollen lykkes i å oppnå ren RNA, først analysert av mikrovolumspektrofotometer og videre av bioanalyse (figur 6B, C). Prøver har et absorpsjonsforhold på 260/280 nm mellom 1,8 og 2,0 (figur 6B) som er typisk for rene RNA-nukleotidarter19. Absorpsjonsforhold (260/230 nm) ble tatt for hver prøve med et inklusjonskriterium mellom 1 og 2,2, representativ for begrenset forurensning fra isolasjonsreagenser (data ikke vist)19. Bioanalysering av prøvene viste høy integritet i RNA, med vurdert RNA-integritetsnummer (RIN) over syv (figur 6C), egnet for nedstrømsuttrykk og sekvenseringsanalyse20.
Figur 6: Kvalitetsvurdering av segmentell RNA. Hele RNA ble vurdert for avkastning (A) og kvalitet (B,C) av mikrovolumspektrofotometer og bioanalyser. RIN: RNA-integritetsnummer, vurdert av bioanalysen. Stolper er gjennomsnittet ± standardavvik (SD), N = 12 utvalg per segment fra to separate RNA-ekstraksjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende video 1: Levende celleavbildning av å slå cilia på dissosierte celler. Slå cilia etter pronase fordøyelsen. Videoer ble tatt på et invertert sammensatt mikroskop. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De tre segmentene av ovidukten er histologisk, morfologisk og funksjonelt distinkte1,2,3. Epitelet varierer sterkt fra den ene enden av ovidukten til den andre. Ciliated celler dominerer i den fimbrial / infundibulære enden, mens sekretoriske celler dominerer i den istemiske regionen1. Selv om denne samlede gradienten har blitt anerkjent i noen tid, har nyere arbeid avdekket flere forskjeller blant oviduktsegmentene. Således, mens ciliated celler blir sjeldnere mot den proksimale enden av røret, er det en kraftig nedgang i antallet (fra ca. 60% til 10% ciliation) overgang fra ampulla til ampullær-isthmic krysset3. Videre er epitelcellepopulasjoner i de proksimale og distale segmentene avledet fra utviklingsmessig distinkte avgrensninger1,2,3. Distale epitelceller i infundibulum og ampulla bidrar ikke til proksimale epitelcellepopulasjoner i isthmus, som vist ved avgrensning av epitelmarkører. På embryonal dag 12,5 (E12,5) har oviduktale epitelceller en tydelig avstamning uavhengig av den proksimale epitelcellemarkøren, PAX22. Disse funnene, i tillegg til den mangfoldige cellepopulasjonen blant de ulike segmentene, understreker ytterligere nødvendigheten av å undersøke segmentene uavhengig. Den beskrevne metoden beskriver en trinnvis protokoll for avslapping og segmentidentifikasjon i henhold til de tre historisk beskrevne segmentene (infundibulum, ampulla og isthmus). På grunn av den nylige etableringen av det ampullære-istemiske krysset som et definitivt oviduktsegment, ble det prioritert identifisering og innsamling av de tre klassisk beskrevne områdene. Metoden kan imidlertid utvides til å omfatte en egen samling av det ampullære-istemiske krysset, som beskrevet ovenfor3.
Bruken av det blå fargestoffet og plasseringen av infundibulum er et kritisk skritt for å slappe av ovidukten på en rask og effektiv måte. Det blå fargestoffet fremhever ostium og spoler i røret, noe som gir en raskere og mer effektiv avpolering og samling. Den første plasseringen av ostium orienterer en til de distale (infundibulære) og proksimale (istemiske) områdene av ovidukten gjennom uncoiling. I tillegg, holde proksimal livmor horn delen festet til disseksjon plattform under uncoiling tillater kirurgen å bruke begge hender for delikat disseksjon trinn. Første fjerning av den spolede ovidukten og forsøk på å løsne denne strukturen uten å gjøre røret immobil eller uten bruk av fargestoffet kan lett føre til forvirring angående de distale og proksimale endene eller forårsake brudd på røret. Rørbrudd er enkelt, så forsiktighet må utvises når du løsner siden brudd vil gjøre reproduserbar segmentering uoppnåelig. Bruk av høykvalitets, vårformet mikrosaks anbefales på det sterkeste for å oppnå de beste resultatene.
Evaluering av genuttrykkssignaturen i de forskjellige segmentene av ovidukten, for eksempel under østrogensyklusen og som svar på administrerte hormoner og cytokiner, vil mest sannsynlig gi en mye bedre forståelse av hvordan ovidukten endres som svar på disse stimuliene. Disse dataene kan også belyse hvilke faktorer som bidrar til epiteltransformasjon. RNA-ekstraksjonsprotokollen heri ble utviklet for å oppnå høyest mulig mengde og kvalitet for dette vevet av begrenset størrelse og elastisk tubalstruktur. Den beskrevne homogeniseringen, RNA-utfellingen og konjunksjonell bruk av fenol: kloroform og rensemetoder på kolonne ble funnet å være mest effektive for å oppnå passende kvalitet og mengde RNA for nedstrømsanalyse. Oviduktsegmentene ble ikke veid, og hele segmenter ble umiddelbart behandlet for vevshomogenisering for å forhindre oppvarming av vevet som førte til RNA-nedbrytning. I tillegg, fordi de små tubal segmentene krever flere homogeniseringstrinn, er det viktig å sikre at homogenisering utføres ved 4 °C for å bevare prøveintegriteten. Fordi denne metoden er tilstrekkelig til å produsere passende utbytte for nedstrømsanalyse, vil en fremtidig anvendelse av denne teknikken være å utføre segmentell RNAseq, tidligere ikke rapportert, noe som vil bidra sterkt til vår forståelse av oviduktfysiologi.
Under utviklingen av celledissosiasjonsprotokollen fant vi ut at robuste og/eller lange enzymatiske fordøyelser forårsaket demonstrerbart tap av cilia. Vi konsentrerte oss derfor om utviklingen av, og oppnådde, en metode som bevarte cellemorfologi. Forbedringer i enkeltcelleutbyttet, som beskrevet her, vil tillate mer robuste og umiddelbare multipleksede analyser av de forskjellige epitel- og stromale celletypene ved strømningscytometri. Bruken av en ikke-enzymatisk dissosiasjonsprotokoll etterfulgt av en kort inkubasjon i pronase vil også sannsynligvis forbedre bevaringen av celleoverflateantigener over dissosiasjonsmetoder ved hjelp av lange eller robuste fordøyelsesmetoder2,18. Enkeltcellesekvenseringsanalyse krever langt færre celler sammenlignet med multipleksede strømningscytometripaneler2,21. Så enkeltcellesekvensering av de tre beskrevne segmentene av ovidukten kan være mulig med den beskrevne protokollen.
Fordi ovidukten ikke kan arkiveres langs hele lengden, kan en potensiell begrensning av den nåværende metoden være at celler som danner epitelet til den smalere isthmus ville ha redusert eksponeringen for dissosiasjonsreagensene, og derfor kan det ikke være til stede i den endelige suspensjonen i samme andel som in vivo.
På grunn av ovikanalens spoling kan orientering for immunhiistokjemiske analyser av alle oviduktsegmenter være utfordrende3. Den beskrevne segmentredisen etterfulgt av orientert innebygging av oviduktsegmentene gir imidlertid mulighet for mer omfattende langsgående og tverrsnittsbildeanalyse uten å måtte segmentere gjennom hele det intakte spolede røret. Videre, det blå fargestoffet som brukes til uncoiling, hjelper i riktig orientering under innbygging av de små tubal segmentene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av en DoD Breakthrough Award til AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). KCR ble delvis støttet av intramurale stipender: Pease Cancer Pre-Doctoral Fellowship og Mary Galvin Burden Pre-Doctoral Fellowship in Biomedical Sciences and University of California, Riverside, intramural awards: Graduate Council Fellowship Committee Dissertation Research Grant og Graduate Division Dissertation Year Program Award. Forfatterne takker Gillian M. Wright og Alyssa M. Kumari for hjelp i tidlig feilsøking av denne metoden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB05 | Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized |
| 1.4 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB14B | Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized |
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS) | Gibco | 21600-010 | Cold, sterile |
| 25G needle | BD | 305122 | |
| 60 mm sterile petri dishes | Corning | 430166 | |
| 70 μm cell meshes | Fisherbrand | 22-636-548 | |
| Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit | Agilent 2100 Bioanalyzer | 5067-1513 | |
| Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
| Bioanlyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer | ||
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Cold plate/pack/surface of choice | N/A | N/A | Kept at -20 °C for dissection |
| Dental wax | Polysciences Inc. | 403 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12 | Corning | 10-090-CV | Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015CV | |
| Fine point forceps of choice | N/A | N/A | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G712b | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21422 | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Immunocytochemical validation images |
| Hepes | Sigma Aldrich | H-3784 | |
| Hoescht 33342 | Cell Signaling Technologies | 4082S | Immunocytochemical validation images |
| Inverted compound microscope | Keyence BZ-X700 | ||
| Mouse anti-mouse Occludin | Invitrogen | 33-1500 | Immunocytochemical validation images |
| Non-enzymatic dissociation buffer | N/A | 5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS | |
| Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm | Thomas Scientific | 1210U04 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P-6148 | Immunocytochemical validation images |
| Pen-Strep | MP Biomedicals | 10220-718 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technologies | 9071S | Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | Prepare pronase digestion medium: 0.15% pronase in DMEM/Ham's F12, sterile |
| Propidium Iodide | Roche | 11 348 639 001 | Viability validation images |
| Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin | Abcam | ab179484 | Immunocytochemical validation images |
| RBC lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | Utilized for on-column purification in text |
| Spring form microdissection scissors | Roboz Surgical | RS-5610 | |
| Sterile 3 mL bulb pipettors | Globe Scientific | 137135 | |
| Toluidine blue | Alfa Aesar | J66015 | Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile |
| Tris-Buffered Saline-Tween (TBST) | N/A | N/A | Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20 |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Inc. | 3555 | Immunocytochemical validation images |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Invitrogen | 15596026 | Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines |
References
- Stewart, C. A., et al. Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. Kubiak, J. Z., et al. , Springer. Berlin Heidelberg. 247-262 (2012).
- Ford, M. J., et al. Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis. Cell Reports. 36 (10), 109677 (2021).
- Harwalkar, K., et al. Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development. Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).
- Agduhr, E. Studies on the structure and development of the bursa ovarica and the tuba uterina in the mouse. Acta Zoologica. 8 (1), 1 (1927).
- Pulkkinen, M. O. Oviductal function is critical for very early human life. Annals of Medicine. 27 (3), 307-310 (1995).
- Kindelberger, D. W., et al. Intraepithelial carcinoma of the fimbria and pelvic serous carcinoma: Evidence for a causal relationship. American Journal of Surgical Pathology. 31 (2), 161-169 (2007).
- Ghosh, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. In vivo genetic cell lineage tracing reveals that oviductal secretory cells self-renew and give rise to ciliated cells. Development. 144 (17), 3031-3041 (2017).
- Lee, Y., et al. A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube. Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).
- Kim, J., et al. High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3921-3926 (2012).
- Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).
- Sherman-Baust, C. A., et al. A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development. Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).
- Zhai, Y. L., et al. High-grade serous carcinomas arise in the mouse oviduct via defects linked to the human disease. Journal of Pathology. 243 (1), 16-25 (2017).
- Karthikeyan, S., et al. Prolactin signaling drives tumorigenesis in human high grade serous ovarian cancer cells and in a spontaneous fallopian tube derived model. Cancer Letters. 433, 221-231 (2018).
- Shao, R., et al. Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: Evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice. Biology of Reproduction. 79 (4), 748-757 (2008).
- Alwosaibai, K., et al. PAX2 maintains the differentiation of mouse oviductal epithelium and inhibits the transition to a stem cell-like state. Oncotarget. 8 (44), 76881-76897 (2017).
- Peri, L. E., et al. A novel class of interstitial cells in the mouse and monkey female reproductive tracts. Biology of Reproduction. 92 (4), 102 (2015).
- Lõhmussaar, K., et al. Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids. Nature Communications. 11 (1), 2660 (2020).
- Chen, S., et al. An air-liquid interphase approach for modeling the early embryo-maternal contact zone. Scientific Reports. 7, 42298 (2017).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2565 (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- McGlade, E. A., et al. Cell-type specific analysis of physiological action of estrogen in mouse oviducts. The FASEB Journal. 35 (5), 21563 (2021).
