Summary
En metode til mikrodissektion af museovidukten, der tillader indsamling af de enkelte segmenter, samtidig med at RNA-integriteten opretholdes, præsenteres. Derudover beskrives ikke-enzymatisk oviduktal celle dissociationsprocedure. Metoderne er egnede til efterfølgende gen- og proteinanalyse af de funktionelt forskellige oviduktale segmenter og dissocierede oviduktale celler.
Abstract
Musemodelsystemer er uovertrufne til analyse af sygdomsprocesser på grund af deres genetiske manipulerbarhed og de lave omkostninger ved eksperimentelle behandlinger. På grund af deres lille kropsstørrelse har nogle strukturer, såsom ovidukten med en diameter på 200-400 μm, vist sig at være relativt vanskelige at studere undtagen ved immunhistokemi. For nylig har immunohistokemiske undersøgelser afdækket mere komplekse forskelle i oviduktsegmenter end tidligere anerkendt; ovidukten er således opdelt i fire funktionelle segmenter med forskellige forhold mellem syv forskellige epitelcelletyper. De forskellige embryologiske oprindelser og forhold mellem epitelcelletyperne gør sandsynligvis de fire funktionelle regioner forskelligt modtagelige for sygdom. For eksempel opstår prækursorlæsioner til serøse intraepiteliale carcinomer fra infundibulum i musemodeller og fra den tilsvarende fimbriale region i den humane æggeleder. Protokollen beskrevet her beskriver en metode til mikrodissektion til at opdele ovidukten på en sådan måde, at der opnås en tilstrækkelig mængde og renhed af RNA, der er nødvendig til downstream-analyse, såsom omvendt transkription-kvantitativ PCR (RT-qPCR) og RNA-sekventering (RNAseq). Også beskrevet er en for det meste ikke-enzymatisk vævssociationsmetode, der er egnet til flowcytometri eller enkeltcelle-RNAseq-analyse af fuldt differentierede oviduktale celler. De beskrevne metoder vil lette yderligere forskning ved hjælp af murine ovidukt inden for reproduktion, fertilitet, kræft og immunologi.
Introduction
Murinovidukten er ens i funktion og morfologi til det menneskelige æggeleder1. Begge består af et pseudostratificeret cilieret epitel, der består af to historisk beskrevne epitelceller: cilierede celler og sekretoriske celler1,2. Ovidukten har tre klassisk anerkendte segmenter: infundibulum, ampulla og isthmus. I en nylig undersøgelse, Harwalkar et al. 3 undersøgte oviduktmorfologi og genekspression, hvilket førte til udvidelsen af kategoriseringen af hjemmehørende epitelceller til syv forskellige populationer. Derudover etablerede de det ampullære-isthmus-kryds som et særskilt segment af ovidukten3. Metoden beskrevet heri, som fokuserer på infundibulum, ampulla og isthmus, kunne let udvides til også at omfatte det ampullære-istmiske kryds2,3. Den infundibulære region indeholder ostium eller åbning af ovidukten og omfatter den fimbriale region såvel som den proksimale stilk. Bevæger sig mod livmoderen, næste er ampulla, og derefter isthmus. Cilierede celler er mest fremtrædende i den distale ende af regionen, proksimal til æggestokken eller infundibulum, mens sekretoriske celler er mest fremtrædende i den proksimale ende eller isthmussegmentet1. I modsætning til det menneskelige æggeleder er murine-ovidukten en oprullet struktur understøttet af mesosalpinxen, en forlængelse af det brede ledbåndsperitoneum1,4. Derudover er museovidukten indkapslet i en bursal sæk, der øger sandsynligheden for oocytoverførsel til ovidukten4. Ampulla er identificeret som befrugtningsstedet, hvorfra udviklende embryoner passerer ind i isthmusen, inden de kommer ind i livmoderen5. Tubalsegmenter er 200-400 μm i diameter, og de længere ampullære og isthmusregioner er ca. 0,5-1,0 cm lange4. Ovidukten distenderne under østruscyklussen og ampulla og infundibulum er mere distensible end isthmus1.
Overproliferation af celler, især sekretoriske celler, karakteriserer forløberlæsioner til serøse tumorer, der findes i bækkenhulen6. Disse forløber serøse intraepitellæsioner opstår i oviduktepitelet udelukkende i fimbrialområdet; det er ukendt, hvorfor læsionsdannelse er begrænset til denne region, hvor den fremherskende celletype normalt er cilieret, ikke sekretorisk2,7,8. Regionaliteten med hensyn til normal fysiologisk funktion samt øget interesse for oviduktal oprindelse af æggestokkræft9,10,11,12,13 understreger vigtigheden af separat evaluering af oviduktsegmenterne.
Metoden, der beskrives her, beskriver indsamlingen af separate oviduktale segmenter til efterfølgende downstream-analyser af segmentspecifik genekspression og funktion af dissocierede celler. Traditionelt behandles mange væv til hel RNA-ekstraktion efter enten phenol: chloroformmetoden eller en komplet ekstraktionsmetode på kolonnen; Vi fandt imidlertid, at RNA-kvaliteten blev opretholdt, samtidig med at der blev produceret tilstrækkeligt udbytte med den beskrevne kombinationsmetode. Ved hjælp af denne metode kan meget små funktionelle segmenter af ovidukten behandles til downstream-analyser i stedet for at undersøge ovidukten som helhed, hvilket kan maskere resultater, der er repræsentative for de forskellige segmenter14.
Dissocierede murin oviduktale celler er sjældent blevet undersøgt ved flowcytometri, sandsynligvis på grund af det begrænsende celleudbytte fra dette væv. En tilgang til at overvinde dette problem har været at dissociere celler, dyrke dem i kultur og derefter stimulere redifferentiering in vitro for at opnå passende celletal til nedstrøms celleanalyse15,16,17,18. En begrænsning af denne tilgang er tiden ex vivo og ændret mikromiljø i kultur, som begge sandsynligvis ændrer genekspression. Der er også en antagelse om, at morfologisk redifferentiering har den samme transkriptionelle og proteomiske signatur, som var til stede i det intakte dyr. Den nuværende dissociationsmetode blev designet til at opnå det højeste antal epitelceller i en heterogen oviduktal cellepopulation, samtidig med at enkeltcelledifferentiering opretholdes. Desuden begrænser den for det meste ikke-enzymatiske tilgang sandsynligvis tabet af celleoverfladeproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrehåndtering og procedurer blev godkendt af University of California, Riverside institutionelle dyrepleje- og brugsudvalg og var i overensstemmelse med retningslinjer fra American Association for Laboratory Animal Care, United States Department of Agriculture og National Institutes of Health. Den beskrevne metode anvendte C57BL/6 voksne hunmus. Alle dyr blev aflivet ved halshugning forud for vævshøst.
BEMÆRK: En oversigt over protokollen, der bruger et blåt farvestof til at hjælpe med effektiv dissektion og udrugning af ovidukten, er vist i den første figur (figur 1).
Figur 1: Oversigt over mikrodissektionsmetoden. (A) Venstre panel viser den intakte struktur, hvorfra det meste af æggestokkens fedtpude og rester af bindevæv, der omgiver ovidukten, er blevet fjernet. Herefter hjælper tilsætningen af toluidinblå med at skelne oviduktens spoler (midterpanelet). Højre panel viser strukturer efter fjernelse af æggestokken. B) En uoptrøbt ovidukt med indvendige sving til bestemmelse af, hvor hvert segment begynder og slutter. (C) Tegneserie af den anvendte segmentering (ikke tegnet i skala). Klik her for at se en større version af denne figur.
1. Forberedelse af dissektionsoverfladen
- Anbring et stykke tandvoks på en petriskål med klæbemiddel og lad det tørre (figur 2A). Rens fadet med 70% ethanol. Overfladen er klar til dissektion.
2. Makrodissektion af æggestokken, ovidukten og livmoderen
- Immobiliser petriskålen, der indeholder tandvoks, på en kold platform efter eget valg (f.eks. en ispose, der opbevares ved -20 °C før brug) under et dissektionsmikroskop, når den er klar til dissektion (figur 2A).
- Desinficere dyrets ventrale overflade med 70% ethanol. Åbn mave- og bækkenhulen med steril dissektionssaks og flyt mave-tarmkanalen til den ene side for at lokalisere den dorsale bihornale livmoder. Følg hvert livmoderhorn rostralt for at lokalisere hver ovidukt og æggestok indhyllet i livmoderfedtpuden, der findes lige under nyrerne (figur 2B, C).
- Punktafgift begge laterale ovidukter med æggestokkene og en del af det distale livmoderhorn, der stadig er fastgjort ved hjælp af dissektionssaks. Skær hvert lateralt livmoderhorn med ca. 1-2 cm af hornet, der stadig er fastgjort til den oprullede ovidukt og æggestok (figur 2D). Nedsænk vævet straks i 2 ml kolddissektionsmedium (se materialetabel).
Figur 2: Makrodissektion af æggestokken og dissektionsopsætningen. Ovidukten er placeret dorsalt i bækkenhulen ved bunden af nyrerne inden for æggestokkens fedtpude (B). Find livmoderbifurcationen i bækkenhulen (C) og følg det laterale livmoderhorn for at lokalisere livmoder-ovidukt-ovariekontinuummet (B). Fjern disse strukturer ved at skære gennem et livmoderhorn og grov dissektion. Anbring på dissekeringsplatformen (A), og anbring livmoderdelen på tandvoks med en nål (A og D). Klik her for at se en større version af denne figur.
BEMÆRK: Lad nok livmoderhorn være intakt og fastgjort til ovidukten til at tillade anbringelse på dissektionsplatformen (figur 2D).
- Anbring livmodervævet på tandvoks med en steril 25 G nål for at sikre væv til dissektion (figur 2A, D og figur 3A). Arbejd under dissektionsmikroskopet, rengør og dissekere æggestokkens fedtpude og bindevæv for at muliggøre klar visualisering af ovidukten (figur 3B).
Figur 3: Trin for trin oviduktmikrodissektion. Efter fjernelse af resterende fedt og bindevæv (A,B), tilsættes toluidinblåt til vævet (C), og vaskes derefter væk for at lette visualisering og efterfølgende fjernelse af æggestokken og udløsning af røret (D-H). Infundibulum kan findes ved siden af den proksimale isthmus og livmoder-tubal junction (UTJ). Træk let i den distale ende, mens du skærer i mesosalpinxen for at vikle den ud og afsløre oviduktens (H) endogene drejninger for at orientere sig for passende segmentering. Figur A-C skalabjælke = 500 μm, D-H skalabjælke = 400 μm (I) Tegneserie af de forskellige segmenter (ikke tegnet i skala). Klik her for at se en større version af denne figur.
- Brug en 1 ml sprøjte til at dispensere og inkubere ovidukten, der er fastgjort til livmoderen, i 1-2 dråber steril 1% toluidinblå farvestofopløsning i 30 s-1 min. Skyl med koldt Dulbeccos fosfatbufrede saltvand (DPBS), og fjern al væsken (figur 3C).
- Træk let æggestokken fra den oprullede ovidukt og skær den væk ved bursalmembranen og det brede ledbånd for at fjerne æggestokken fra ovidukten uden at gå på kompromis med det tubale væv (figur 3D,E).
BEMÆRK: Æggestokken er ikke fastgjort til ovidukten, men indkapslet i bursalmembranen med ovidukten (figur 2D) og forbundet med den laterale side af livmoderen via det brede ledbånd.
3. Mikrodissektion og segmentering af ovidukten
- Find den distale, fimbriale ende af ovidukten, der findes lateralt til livmoder-tubal krydset (UTJ). Ovidukten spoler tilbage på sig selv; derfor kan den fimbriale ende placeres lateralt til den proksimale ende og er et passende udgangspunkt for at orientere sig for afkobling af ovidukten (figur 3F,I).
- Mens du forsigtigt trækker i røret, skal du skære væk ved mesosalpinxen (figur 3I) med fjederformet mikrosaks for at vikle ovidukten ud (figur 3G).
- Når røret er kylt ud, skal du skære røret for at producere de infundibulære, ampullære og istmiske regioner (figur 3H).
- Efter udskæring af infundibulum (fimbrial ende og proksimal stilk) skal du beskære det ampullære område ved at skære efter den anden fremtrædende drejning af røret (skåret mellem sving to og tre, ca. 1 cm i længden). Til sidst skæres den resterende del til UTJ, som er den isthmiske region (figur 3H).
BEMÆRK: Ovidukten vil ikke helt vikle sig ud i en lige struktur. Røret vil opretholde sine sving (figur 3H)3. Baseret på de efterfølgende sving efter det ampullære område kan man yderligere segmentere det resterende rør i det ampullære-isthmiske kryds og isthmus3. Efter ampulla excision skæres mellem sving fem og seks for at opnå det ampullære-isthmiske kryds; det resterende rør (drej seks til starten af UTJ) er isthmus3.
- Efter udskæring af infundibulum (fimbrial ende og proksimal stilk) skal du beskære det ampullære område ved at skære efter den anden fremtrædende drejning af røret (skåret mellem sving to og tre, ca. 1 cm i længden). Til sidst skæres den resterende del til UTJ, som er den isthmiske region (figur 3H).
- Snap freeze straks dissekerede vævssegmenter i flydende nitrogen til RNA-isolering eller fix og behandle hvert segment til orienteret indlejring og immunohistologisk analyse.
- Tilsæt 200 μL koldt RNA-ekstraktionsreagens og 1:1 homogeniseringsperleblanding (se tabel over materialer) til vævet, hvis der fortsættes med RNA-ekstraktion (se trin 5.1).
4. Ovidukt dissociation
- Fortsat fra trin 3.1.1 ovenfor) For optimal dissociation af epitelet skal ovidukten åbnes i de områder, hvor det er muligt (dvs. infundibulum og ampulla) for at eksponere luminalepitelet (figur 4A).
Figur 4: Oviduktcellesociation, del 1. Tegneserie, der viser, hvordan man udsætter det distale epitel for optimal cellesociation (A) og et billede, der viser den nemmeste måde at bruge 1 mm2 mesh (B) på. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Start ved fimbrialområdet, ved hjælp af tang som gearing, slid røret i længderetningen med fjederformet saks.
- Hak de spalteåbne dele og den resterende ovidukt i segmenter (~ 1-2 mm i størrelse) og tilsæt 5 ml varm, ikke-enzymatisk dissociationsbuffer (se materialetabel) og inkuber ved 37 °C.
- Resuspend vævsstykkerne og dissocierede celler med en pærepipettor hvert 3. minut i 9-10 minutter. Fortynd dissociationsbufferen 1:1 med koldt dissektionsmedium.
- Opsaml cellerne ved centrifugering (350 x g, 3 min, 4 °C). Resuspend cellerne i 2 ml RBC-lysisbuffer i 2 minutter ved stuetemperatur, og fortynd derefter 1: 1 med koldt dissektionsmedium.
- Opsaml cellerne ved centrifugering (350 x g, 3 min, 4 °C) og resuspend i 5 ml kold pronaseopløsning.
- Inkuber i pronase fordøjelsesmedium og resuspend celleklumperne med en pærepipettor hvert 3-5 minut, indtil der opnås en enkeltcellesuspension (~ 25-30 min).
BEMÆRK: Dette trin udføres bedst i en vævskulturplade eller kolbe for at muliggøre konstant observation, der forhindrer unødvendig overeksponering for pronase.
- Inkuber i pronase fordøjelsesmedium og resuspend celleklumperne med en pærepipettor hvert 3-5 minut, indtil der opnås en enkeltcellesuspension (~ 25-30 min).
- Cellerne føres gennem et sterilt makronet (1 mm x 1 mm net fastgjort til et konisk rør med et gummibånd (figur 4B)) for at fjerne eventuelle resterende udissocierede vævsstykker. Opsaml cellerne ved centrifugering (350 x g, 3 min, 4 °C), og resuspend dem i et koldt medium, der er egnet til downstream-analyse (f.eks. FACS-buffer, hvis der fortsættes med farvning til flowcytometri).
5. RNA-ekstraktion af oviduktale segmenter
- Homogeniser snapfrosne prøver i 200 μL RNA-ekstraktionsreagens i en perlekugleblendervævshomogenisator på niveau 12 i to intervaller (3 minutter hver) ved 4 ° C ved hjælp af perleblandingen i rustfrit stål.
BEMÆRK: For at bevare RNA-integriteten skal prøver straks flyttes fra snapfrosset tilstand til RNA-ekstraktionsreagens og ikke vejes. - Kort centrifugehomogenat ved 100-200 x g i en bordpladecentrifuge i ca. 5 s ved stuetemperatur for at adskille væsken fra perlerne. Overfør supernatanten til et nyt rør.
- Tilsæt yderligere 200 μL RNA-ekstraktionsreagens til perlerne for at genvinde flere prøver efterfulgt af centrifugering (100-200 x g, 5 s, stuetemperatur). Kombiner supernatanterne.
BEMÆRK: Brug en lille pipettespids (de fleste p200-spidser er egnede) for at forhindre perleoverførning, når du fjerner supernatanten. - Følg producentens retningslinjer for at fase separat og udfælde RNA. Repræsentative prøver blev udfældet natten over ved -20 °C med 100 % isopropanol (ca. 2:1 volumen, isopropanol: genvundet vandig fase).
- Overfør det komplette RNA-bundfald sammen med opløsningen til en RNA-bindende spinsøjle og centrifuge i 30 s ved 9.500 x g. Rens RNA'et på kolonnen i henhold til producentens retningslinjer, og eluer derefter RNA'et i 20 μL nukleasefrit vand. Vurder kvaliteten/mængden på et mikrovolumspektrofotometer og/eller bioanalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne dissociationsprotokol giver 100.000-120.000 celler pr. Mus med pooling af begge ovidukter. Metoden er skånsom nok til at efterlade multicilierede cellegrænser intakte, hvilket giver mulighed for at skelne mellem multicilierede celler og sekretoriske celler og verificere, at fordøjelsesmetoden er skånsom nok til at forhindre dedifferentiering. Repræsentative immunfluorescensbilleder i figur 5 viser småcelleklumper efter trin 4.2.1, fastgjort i 3 minutter i 4% paraformaldehyd (PFA)/ DPBS, vasket med 1% bovin serumalbumin (BSA)/ Tris-bufferet saltvand-tween (BTBST) og farvet i suspension. Kort fortalt blev celler permeabiliseret i 15 minutter ved stuetemperatur i 0,5% TritonX-100 / BTBST, vasket i BTBST, slukket til baggrundsfluorescens i 2 timer ved stuetemperatur i 20 mM glycin / DPBS, vasket i BTBST og derefter blokeret i 1 time ved stuetemperatur i 5% BSA / 0,1% TritonX-100 / TBST. Celler blev derefter inkuberet i det primære antistof ved 4 °C natten over i BTBST (muse-anti-mus occludin (1:2000); kanin-anti-mus acetyleret tubulin (1:1000)) efterfulgt af flere vaske i BTBST. Sekundært antistof blev tilsat i 1 time ved stuetemperatur i BTBST (gede-anti-mus IgG Alexa Fluor 555 (1:1000); ged anti-kanin IgG Alexa Fluor 488 (1:1000)), vasket flere gange i BTBST, en gang i DPBS, og derefter inkuberet i nuklear plet i 20 minutter ved stuetemperatur (1:2000, Hoescht 33342) efterfulgt af en vask i DPBS. Celler blev resuspended i 80 μL antifade monteringsmedium og efterladt natten over i mørket før billeddannelse (figur 5A). Figur 5B viser celler i slutningen af dissociationsprotokollen. Levedygtighedsvurderinger blev foretaget i hele protokollen, og repræsentative billeder er vist i figur 5B-D. Propidiumiodid blev tilsat ved 1:100 fortynding, og celler blev straks observeret på et omvendt sammensat fluorescensmikroskop (figur 5C, rød plet). Cilia forblev intakte i små celleklynger (figur 5A) og enkeltcellesuspensioner (figur 5E) med mange celler observeret at have cilier, der stadig slår (Suppl. Video 1).
Figur 5: Oviduktcelle dissociation, del 2. Fluorescerende og fasekontrastbilleder af en celleklynge, der er positiv for occludin (rød), kerner (blå) og acetyleret tubulin (grøn). Den cilierede apikale kant (grøn i AI og AV) forbliver intakt i hele protokollen og modstår yderligere fordøjelse til enkeltceller (E). AI: fusionere, AII: rød kanal, AIII: blå kanal, AIV: fasekontrast, AV: grøn kanal. Efter en kort pronaseinkubation er flertallet af celler single. Propidiumiodid (PI) farvning viser ca. 93% levedygtighed. (B) Lyst felt, (C) rød kanal PI positiv, (D) fletning. (E) inset ved fletning viser en intakt cilieret kant på en enkelt dissocieret celle. Sådanne celler havde aktivt slået cilier (se Suppl. Video 1). Billeder blev taget på et omvendt sammensat fluorescensmikroskop. Figur AI-V skalabjælke = 20 μm, B-D skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Den beskrevne RNA-isolationsprotokol giver tilstrækkeligt udbytte og renhed, der er nødvendigt for segmental RT-qPCR og RNAseq. Resultaterne viser, at denne metode giver 800-1200 ng RNA pr. segment (figur 6A), bortset fra infundibulære prøver, hvor pooling fra to dyr kan være nødvendig for passende udbytte til downstream-assays. De præsenterede resultater for infundibulum er samlet fra to dyr, i alt fire infundibulære regioner (figur 6). Denne protokol har succes med at opnå rent RNA, oprindeligt analyseret af mikrovolumspektrofotometer og yderligere af bioanalysator (figur 6B,C). Prøver har et absorptionsforhold på 260/280 nm mellem 1,8 og 2,0 (figur 6B), der er typisk for rene RNA-nukleotidarter19. Absorptionsforhold (260/230 nm) blev udtaget for hver prøve med et inklusionskriterium mellem 1 og 2,2, der er repræsentativt for begrænset kontaminering fra isolationsreagenser (data ikke vist)19. Bioanalyse af prøverne viste høj integritet af RNA'et med vurderet RNA-integritetstal (RIN) over syv (figur 6C), der er egnet til downstream-ekspression og sekventeringsanalyse20.
Figur 6: Kvalitetsvurdering af segmentalt RNA. Hele RNA blev vurderet for udbytte (A) og kvalitet (B,C) ved hjælp af mikrovolumspektrofotometer og bioanalytiker. RIN: RNA-integritetsnummer, som vurderet af bioanalyseren. Søjler er gennemsnittet ± standardafvigelse (SD), N = 12 prøver pr. Segment fra to separate RNA-ekstraktioner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende video 1: Levende cellebilleddannelse af at slå cilier på dissocierede celler. Slå cilier efter pronase fordøjelse. Videoer blev taget på et omvendt sammensat mikroskop. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De tre segmenter af ovidukten er histologisk, morfologisk og funktionelt forskellige1,2,3. Epitelet varierer meget fra den ene ende af ovidukten til den anden. Cilierede celler dominerer i den fimbriale/infundibulære ende, mens sekretoriske celler dominerer i det istmiske område1. Mens denne samlede gradient er blevet anerkendt i nogen tid, har nyere arbejde afdækket flere forskelle mellem de oviductale segmenter. Mens cilierede celler bliver mindre hyppige mod den proksimale ende af røret, er der således et kraftigt fald i deres antal (fra ca. 60% til 10% ciliering), der overgår fra ampulla til det ampullære-istmiske kryds3. Endvidere er epitelcellepopulationer i de proksimale og distale segmenter afledt af udviklingsmæssigt forskellige slægter1,2,3. Distale epitelceller i infundibulum og ampulla bidrager ikke til proksimale epitelcellepopulationer i isthmus, som det fremgår af slægtssporing af epitelmarkører. På embryonal dag 12,5 (E12,5) har oviduktale epitelceller en særskilt afstamning uafhængig af den proksimale epitelcellemarkør, PAX22. Disse opdagelser, ud over den forskelligartede cellepopulation blandt de forskellige segmenter, understreger yderligere nødvendigheden af at undersøge segmenterne uafhængigt. Den beskrevne metode beskriver en trinvis afviklings- og segmentidentifikationsprotokol i henhold til de tre historisk beskrevne segmenter (infundibulum, ampulla og isthmus). På grund af den nylige etablering af det ampullære-istmiske kryds som et definitivt oviduktsegment blev der givet prioritet til identifikation og indsamling af de tre klassisk beskrevne områder. Metoden kan dog udvides til at omfatte en separat samling af det ampullære-isthmiske kryds som beskrevet ovenfor3.
Brugen af det blå farvestof og placeringen af infundibulum er et kritisk skridt til at slappe af ovidukten på en hurtig og effektiv måde. Det blå farvestof fremhæver rørets ostium og spoler, hvilket muliggør en hurtigere og mere effektiv de-coiling og opsamling. Ostiumets oprindelige placering orienterer en mod de distale (infundibulære) og proksimale (isthmiske) områder af ovidukten gennem hele viklingen. Derudover holder den proksimale livmoderhornsdel fastgjort til dissektionsplatformen under vikling kirurgen mulighed for at bruge begge hænder til de sarte dissektionstrin. Indledende fjernelse af den oprullede ovidukt og forsøg på at vikle denne struktur ud uden at gøre røret ubevægeligt eller uden brug af farvestoffet kan let føre til forvirring med hensyn til de distale og proksimale ender eller forårsage brud på røret. Rørbrud er let, så der skal udvises omhu ved vikling, da brud vil gøre reproducerbar segmentering uopnåelig. Brug af højkvalitets, fjederformet mikrosaks anbefales stærkt for at opnå de bedste resultater.
Evaluering af genekspressionssignaturen i de forskellige segmenter af ovidukten, for eksempel under østruscyklussen og som reaktion på administrerede hormoner og cytokiner, vil sandsynligvis give en meget bedre forståelse af, hvordan ovidukten ændres som reaktion på disse stimuli. Disse data kan også kaste lys over, hvilke faktorer der bidrager til epiteltransformation. RNA-ekstraktionsprotokollen heri blev udviklet for at opnå den højest mulige mængde og kvalitet for dette væv af begrænset størrelse og elastisk tubalstruktur. Den beskrevne homogenisering, RNA-udfældning og konjunktionel anvendelse af phenolen: chloroform og on-column oprensningsmetoder viste sig at være mest effektive til at opnå passende kvalitet og mængde RNA til downstream-analyse. De oviduktale segmenter blev ikke vejet, og hele segmenter blev straks behandlet til vævshomogenisering for at forhindre enhver opvarmning af vævet, der førte til RNA-nedbrydning. Fordi de små rørsegmenter kræver flere homogeniseringstrin, er det desuden vigtigt at sikre, at homogenisering udføres ved 4 °C for at bevare prøvens integritet. Fordi denne metode er tilstrækkelig til at producere passende udbytte til downstream-analyse, ville en fremtidig anvendelse af denne teknik være at udføre segmental RNAseq, der tidligere ikke er rapporteret, hvilket i høj grad ville bidrage til vores forståelse af oviduktfysiologi.
Under udviklingen af celledsociationsprotokollen fandt vi, at robuste og/eller lange enzymatiske fordøjelser forårsagede påviseligt tab af cilier. Vi koncentrerede os derfor om udviklingen af og opnåede en metode, der bevarede cellemorfologi. Forbedringer i enkeltcelleudbyttet, som beskrevet heri, vil muliggøre mere robuste og umiddelbare multiplexerede analyser af de forskellige epitel- og stromalcelletyper ved flowcytometri. Anvendelsen af en ikke-enzymatisk dissociationsprotokol efterfulgt af en kort inkubation i pronase vil sandsynligvis også forbedre bevarelsen af celleoverfladeantigener i forhold til dissociationsmetoder ved hjælp af lange eller robuste fordøjelsesmetoder2,18. Enkeltcellesekventeringsanalyse kræver langt færre celler sammenlignet med multiplexerede flowcytometripaneler2,21. Så enkeltcellesekventering af de tre beskrevne segmenter af ovidukten kan være mulig med den beskrevne protokol.
Fordi ovidukten ikke kan fileteres i hele sin længde, kan en potentiel begrænsning af den nuværende metode være, at celler, der danner epitelet af den smallere isthmus, ville have reduceret eksponeringen for dissociationsreagenserne og derfor muligvis ikke er til stede i den endelige suspension i samme forhold som in vivo.
På grund af oviduktens opviklelse kan orientering for immunhistokemiske analyser af alle oviduktale segmenter være udfordrende3. Den beskrevne segmentdissektion efterfulgt af orienteret indlejring af de oviduktale segmenter giver imidlertid mulighed for mere omfattende langsgående og tværsnitsbilledanalyse uden at skulle serielt sektionere gennem hele det intakte oprullede rør. Endvidere hjælper det blå farvestof, der anvendes til afkylning, med korrekt orientering under indlejring af de små tubale segmenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af en DoD Breakthrough Award til AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). KCR blev delvist støttet af intramurale stipendier: Pease Cancer Pre-Doctoral Fellowship og Mary Galvin Burden Pre-Doctoral Fellowship in Biomedical Sciences og University of California, Riverside, intramurale priser: Graduate Council Fellowship Committee Dissertation Research Grant og Graduate Division Dissertation Year Program Award. Forfatterne takker Gillian M. Wright og Alyssa M. Kumari for hjælp til tidlig fejlfinding af denne metode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB05 | Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized |
| 1.4 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB14B | Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized |
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS) | Gibco | 21600-010 | Cold, sterile |
| 25G needle | BD | 305122 | |
| 60 mm sterile petri dishes | Corning | 430166 | |
| 70 μm cell meshes | Fisherbrand | 22-636-548 | |
| Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit | Agilent 2100 Bioanalyzer | 5067-1513 | |
| Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
| Bioanlyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer | ||
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Cold plate/pack/surface of choice | N/A | N/A | Kept at -20 °C for dissection |
| Dental wax | Polysciences Inc. | 403 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12 | Corning | 10-090-CV | Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015CV | |
| Fine point forceps of choice | N/A | N/A | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G712b | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21422 | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Immunocytochemical validation images |
| Hepes | Sigma Aldrich | H-3784 | |
| Hoescht 33342 | Cell Signaling Technologies | 4082S | Immunocytochemical validation images |
| Inverted compound microscope | Keyence BZ-X700 | ||
| Mouse anti-mouse Occludin | Invitrogen | 33-1500 | Immunocytochemical validation images |
| Non-enzymatic dissociation buffer | N/A | 5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS | |
| Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm | Thomas Scientific | 1210U04 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P-6148 | Immunocytochemical validation images |
| Pen-Strep | MP Biomedicals | 10220-718 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technologies | 9071S | Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | Prepare pronase digestion medium: 0.15% pronase in DMEM/Ham's F12, sterile |
| Propidium Iodide | Roche | 11 348 639 001 | Viability validation images |
| Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin | Abcam | ab179484 | Immunocytochemical validation images |
| RBC lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | Utilized for on-column purification in text |
| Spring form microdissection scissors | Roboz Surgical | RS-5610 | |
| Sterile 3 mL bulb pipettors | Globe Scientific | 137135 | |
| Toluidine blue | Alfa Aesar | J66015 | Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile |
| Tris-Buffered Saline-Tween (TBST) | N/A | N/A | Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20 |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Inc. | 3555 | Immunocytochemical validation images |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Invitrogen | 15596026 | Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines |
References
- Stewart, C. A., et al. Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. Kubiak, J. Z., et al. , Springer. Berlin Heidelberg. 247-262 (2012).
- Ford, M. J., et al. Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis. Cell Reports. 36 (10), 109677 (2021).
- Harwalkar, K., et al. Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development. Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).
- Agduhr, E. Studies on the structure and development of the bursa ovarica and the tuba uterina in the mouse. Acta Zoologica. 8 (1), 1 (1927).
- Pulkkinen, M. O. Oviductal function is critical for very early human life. Annals of Medicine. 27 (3), 307-310 (1995).
- Kindelberger, D. W., et al. Intraepithelial carcinoma of the fimbria and pelvic serous carcinoma: Evidence for a causal relationship. American Journal of Surgical Pathology. 31 (2), 161-169 (2007).
- Ghosh, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. In vivo genetic cell lineage tracing reveals that oviductal secretory cells self-renew and give rise to ciliated cells. Development. 144 (17), 3031-3041 (2017).
- Lee, Y., et al. A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube. Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).
- Kim, J., et al. High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3921-3926 (2012).
- Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).
- Sherman-Baust, C. A., et al. A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development. Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).
- Zhai, Y. L., et al. High-grade serous carcinomas arise in the mouse oviduct via defects linked to the human disease. Journal of Pathology. 243 (1), 16-25 (2017).
- Karthikeyan, S., et al. Prolactin signaling drives tumorigenesis in human high grade serous ovarian cancer cells and in a spontaneous fallopian tube derived model. Cancer Letters. 433, 221-231 (2018).
- Shao, R., et al. Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: Evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice. Biology of Reproduction. 79 (4), 748-757 (2008).
- Alwosaibai, K., et al. PAX2 maintains the differentiation of mouse oviductal epithelium and inhibits the transition to a stem cell-like state. Oncotarget. 8 (44), 76881-76897 (2017).
- Peri, L. E., et al. A novel class of interstitial cells in the mouse and monkey female reproductive tracts. Biology of Reproduction. 92 (4), 102 (2015).
- Lõhmussaar, K., et al. Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids. Nature Communications. 11 (1), 2660 (2020).
- Chen, S., et al. An air-liquid interphase approach for modeling the early embryo-maternal contact zone. Scientific Reports. 7, 42298 (2017).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2565 (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- McGlade, E. A., et al. Cell-type specific analysis of physiological action of estrogen in mouse oviducts. The FASEB Journal. 35 (5), 21563 (2021).
