Summary
本文提出了一种小鼠输卵管显微解剖方法，该方法允许在保持RNA完整性的同时收集单个片段。此外，描述了非酶促卵管细胞解离过程。这些方法适用于功能不同的输卵管节段和解离的输卵管细胞的后续基因和蛋白质分析。
Abstract
小鼠模型系统在疾病过程分析方面是无与伦比的，因为它们具有遗传可操纵性和实验性治疗的低成本。然而，由于它们的体型小，一些结构，如直径为200-400μm的输卵管，已被证明相对难以研究，除非通过免疫组织化学。最近，免疫组织化学研究揭示了输卵管段比以前认识到的更复杂的差异;因此，输卵管被分为四个功能段，具有七种不同上皮细胞类型的不同比例。上皮细胞类型的不同胚胎起源和比例可能使这四个功能区域对疾病有不同的易感性。例如，浆液性上皮内癌的前体病变来自小鼠模型中的内底和人类输卵管中的相应腓肠区域。这里描述的方案详细介绍了一种显微解剖方法，以产生下游分析所需的足够量和纯度的RNA，例如逆转录定量PCR（RT-qPCR）和RNA测序（RNAseq）。还描述了一种大部分非酶解组织解离方法，适用于流式细胞术或单细胞RNAseq分析的完全分化的输卵管细胞。所描述的方法将促进在生殖，生育，癌症和免疫学领域利用小鼠输卵管的进一步研究。
Introduction
小鼠输卵管在功能和形态上与人类输卵管相似1。两者都由假分层的纤毛上皮组成，由两个历史上描述的上皮常驻细胞组成：纤毛细胞和分泌细胞1，2。输卵管有三个经典公认的部分：腹腔，壶腹和峡部。在最近的一项研究中，Harwalkar等人。3 研究了输卵管形态和基因表达，导致将常驻上皮细胞的分类扩展到七个不同的群体。此外，他们建立了壶腹 - 地峡连接处作为输卵管3的独特部分。本文描述的方法侧重于腹足、壶腹和峡部，可以很容易地扩展到包括壶腹-峡部交界处2，3。腹股沟区域包含输卵管的开口，包括腓肠区域以及近端茎。向子宫移动，接下来是壶腹，然后是峡部。纤毛细胞在该区域的远端、卵巢近端或足底最为突出，而分泌细胞在近端或峡部最为突出1。与人类输卵管不同，小鼠输卵管是由腹膜宽韧带的延伸中脉支撑的盘绕结构1，4。此外，小鼠输卵管被包裹在滑囊中，这增加了卵母细胞转移到输卵管中的可能性4。壶腹被确定为受精的位置，发育中的胚胎在进入子宫之前从该位置进入地峡5。输卵管节段直径为200-400μm，较长的壶腹和峡部区域的长度约为0.5-1.0厘米4。输卵管在发情周期期间膨胀，腹扩和腹股沟比峡更易扩张1。
细胞（尤其是分泌细胞）的过度增殖是盆腔中发现的浆液性肿瘤的前体病变的特征6。这些前体浆液性上皮内病变仅在腓骨区域出现在输卵管上皮中;目前尚不清楚为什么病变形成仅限于该区域，其中通常主要细胞类型是纤毛的，而不是分泌的2，7，8。正常生理功能的区域性以及对卵巢癌输卵管起源的兴趣增加9，10，11，12，13，强调了单独评估输卵管段的重要性。
这里描述的方法详细介绍了单独输卵管片段的收集，用于随后对片段特异性基因表达和解离细胞的功能进行下游分析。传统上，许多组织按照苯酚：氯仿法或柱上完全提取法进行全RNA提取;然而，我们发现RNA质量得以维持，同时使用所述的组合方法产生了足够的产量。利用这种方法，可以处理输卵管的非常小的功能段以进行下游分析，而不是将输卵管作为一个整体进行研究，这可以掩盖代表不同段的结果14。
分离的小鼠输卵管细胞很少通过流式细胞术进行研究，很可能是由于该组织的细胞产量有限。克服这个问题的一种方法是解离细胞，在培养物中培养它们，然后在 体外 刺激再分化，以获得适当的细胞数用于下游细胞分析15，16，17，18。这种方法的局限性是培养物中 离体 时间和微环境的改变，这两者都可能改变基因表达。还有一种假设是，形态学上的再分化具有与完整动物相同的转录和蛋白质组学特征。目前的解离方法旨在实现异质性输卵细胞群中最高数量的上皮细胞，同时保持单细胞分化。此外，大多数非酶的方法可能会限制细胞表面蛋白的损失。
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Protocol
所有动物处理和程序均由加州大学河滨分校机构动物护理和使用委员会批准，并符合美国实验动物护理协会，美国农业部和美国国立卫生研究院的指南。所述方法利用C57BL/6成年雌性小鼠。所有动物在组织收获前都通过斩首实施了安乐死。
注：该方案的概述，使用蓝色染料来帮助有效解剖和解开输卵管，如第一图所示（图1）。
图 1：显微切割方法概述。 （A）左图显示了完整的结构，从中移除了大部分卵巢脂肪垫和输卵管周围的结缔组织残留物。在此之后，添加甲苯胺蓝有助于区分输卵管（中间面板）的线圈。右图显示了卵巢切除后的结构。（B） 具有内转弯的无螺旋输卵管，用于确定每个段的起点和终点。（三）卡通的分割所用（不按比例绘制）。 请点击此处查看此图的放大版本。
1. 解剖面的准备
- 用粘合剂将一块牙蜡贴在培养皿上，让它干燥（图2A）。用70%乙醇消毒盘子。表面已准备好进行解剖。
2. 卵巢、输卵管和子宫的大切除术
- 准备解剖时，将含有牙科蜡的培养皿固定在所选的冷平台上（例如，使用前保持在-20°C的冰袋）上，置于解剖显微镜下（图2A）。
- 用70%乙醇消毒动物的腹侧表面。用无菌解剖剪刀打开腹腔和盆腔，将胃肠道移动到一侧以定位背侧双角子宫。沿着每个子宫角向喙方向移动，找到包裹在子宫脂肪垫中的每个输卵管和卵巢，位于肾脏正下方（图2B，C）。
- 使用解剖剪刀切除卵巢和仍然附着的远端子宫角的一部分外侧输卵管。切开每个子宫外侧角，约1-2厘米的角仍然附着在盘绕的输卵管和卵巢上（图2D）。立即将组织浸没在2mL冷解剖培养基中（见 材料表）。
图2：卵巢的大切除术和夹层设置。 输卵管位于卵巢脂肪垫（B）内肾脏底部的盆腔背侧。定位盆腔（C）中的子宫分叉，并沿着子宫外侧角定位子宫 - 输卵管 - 卵巢连续体（B）。通过切开一个子宫角和粗解剖来去除这些结构。放在解剖平台（A）上，并用针头（A 和 D）将子宫部分贴在牙蜡上。 请点击此处查看此图的放大版本。
注意：保持足够的子宫角完好无损并连接到输卵管上，以便贴在解剖平台上（图2D）。
- 用无菌的25 G针将子宫组织贴在牙蜡上，以固定组织进行解剖（图2A，D和 图3A）。在解剖显微镜下工作，清洁并解剖卵巢脂肪垫和结缔组织，以清晰地观察输卵管（图3B）。
图3：逐步输卵管显微切割。 去除残余脂肪和结缔组织（A，B）后，向组织（C）中加入甲苯胺蓝，然后洗去，以促进卵巢的可视化和随后的切除和试管（D-H）的开卷。足底位于近端峡部和子宫-输卵管交界处 （UTJ） 旁边。在中输卵管处切开时，轻轻拉动远端，以展开并显示输卵管（H）的内源性转弯，以定向以进行适当的分割。图A-C比例尺=500μm，D-H比例尺=400μm（I）各段的卡通（未按比例绘制）。 请点击此处查看此图的放大版本。
- 使用1 mL注射器，将附着在子宫上的输卵管在1-2滴无菌1%甲苯胺蓝色染料溶液中分配并孵育30 s-1分钟。用冷杜尔贝克的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）冲洗并除去所有液体（图3C）。
- 轻轻地将卵巢从盘绕的输卵管中拉出，并在滑囊膜和宽韧带上切开，以在不损害输卵管组织的情况下将卵巢从输卵管中取出（图3D，E）。
注意：卵巢不附着在输卵管上，而是用输卵管包裹在滑囊膜中（图2D），并通过宽韧带连接到子宫的外侧。
3. 输卵管的显微切割和分割
- 定位输卵管的远端，腓肠末端位于子宫 - 输卵管连接处（UTJ）的侧面。输卵管线圈重新盘绕在自身上;因此，纤膜末端可以位于近端的侧面，并且是定向输卵管开卷的适当起点（图3F，I）。
- 在轻轻拉动管子的同时，用弹簧形微型剪刀切开中胚层（图3I）以解开输卵管（图3G）。
- 一旦解开后，切开管以产生腹肌，壶腹和峡部区域（图3H）。
- 切除内底（腓肠末端和近端柄）后，通过在管子的第二个突出转动（在2到3圈之间切割，长约1厘米）来切除壶腹区域。最后，将剩余部分切入UTJ，即峡部区域（图3H）。
注意：输卵管不会完全展开后拉成直结构。管子将保持其转动（图3H）3。根据壶腹区域之后的后续转弯，可以进一步将剩余的管切入壶腹-峡部交界处和峡部3。在壶腹切除后，在五到六圈之间切开以获得壶腹 - 峡部连接处;剩下的管子（转六到UTJ的起点）是地峡3。
- 切除内底（腓肠末端和近端柄）后，通过在管子的第二个突出转动（在2到3圈之间切割，长约1厘米）来切除壶腹区域。最后，将剩余部分切入UTJ，即峡部区域（图3H）。
- 立即在液氮中冷冻冷冻解剖的组织片段以进行RNA分离，或固定并处理每个片段以进行定向包埋和免疫组织学分析。
- 如果进行RNA提取，则向组织中添加200μL冷RNA提取试剂和1：1均质化微球混合物（见 材料表）（见步骤5.1）。
4. 输卵管解离
- 从上面的步骤3.1.1继续）为了最佳地解离上皮，在可能的区域（即，腹腔和腹甋）切开输卵管以暴露腔内上皮（图4A）。
图4：输卵管细胞解离，第1部分。 展示如何暴露远端上皮以获得最佳细胞解离的漫画（A）和显示使用1 mm 2 网格的最简单方法的图像（B）。 请点击此处查看此图的放大版本。
- 从腓骨区域开始，使用镊子作为杠杆，用弹簧式剪刀纵向切割管子。
- 将裂开部分和剩余的输卵管切成段（〜1-2mm大小），并加入5mL温热的非酶解解缓冲液（见 材料表）并在37°C下孵育。
- 用灯泡移液器重悬组织块和解离细胞，每3分钟一次，持续9-10分钟。用冷解剖培养基以1：1稀释解离缓冲液。
- 通过离心（350× g，3分钟，4°C）收集细胞。将细胞在室温下重悬于2mL红细胞裂解缓冲液中2分钟，然后用冷解剖培养基以1：1稀释。
- 通过离心（350× g，3分钟，4°C）收集细胞并重悬于5mL冷前叉酶溶液中。
- 在pronase消化培养基中孵育，每3-5分钟用球形移液器重悬细胞团块，直到达到单个细胞悬浮液（〜25-30分钟）。
注意：此步骤最好在组织培养板或烧瓶中进行，以便持续观察，防止不必要的过度暴露于丙酶。
- 在pronase消化培养基中孵育，每3-5分钟用球形移液器重悬细胞团块，直到达到单个细胞悬浮液（〜25-30分钟）。
- 将细胞通过无菌的大网格（1 mm x 1 mm的网格，用橡皮筋固定在锥形管上（图4B））以除去任何剩余的未解离组织块。通过离心（350× g，3分钟，4°C）收集细胞，并将它们重悬于适合下游分析的冷培养基中（例如，如果继续进行流式细胞术染色，则为FACS缓冲液）。
5. 输卵管片段的RNA提取
- 使用不锈钢微珠混合物在12级的珠子弹混合器组织均质器中，在200μLRNA提取试剂中匀浆速冻样品，间隔两次（每次3分钟）。
注意：为了保持RNA的完整性，应立即将样品从快速冷冻状态移至RNA提取试剂中，并且不要称量。 - 在台式离心机中以100-200× g 在室温下短暂离心约5秒，以将液体从珠子中分离出来。将上清液转移到新鲜管中。
- 向磁珠中再加入200μLRNA提取试剂以回收更多样品，然后离心（100-200× g， 5 s，室温）。混合上清液。
注意：使用小移液器吸头（大多数p200吸头是合适的），以防止在去除上清液时残留珠子。 - 遵循制造商的指南，对 RNA 进行相分离和沉淀。将代表性样品在-20°C下用100%异丙醇（约2：1体积，异丙醇：回收水相）沉淀过夜。
- 将完整的RNA沉淀物与溶液一起转移到RNA结合离心柱中，并在9，500×g下离心30 秒。根据制造商的指南在色谱柱上纯化RNA，然后在20μL无核酸酶水中洗脱RNA。评估微量分光光度计和/或生物分析仪的质量/数量。
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Representative Results
所描述的解离方案每只小鼠产生100，000-120，000个细胞，两个输卵管池化。该方法足够温和，可以保持多纤毛细胞边界完整，从而可以区分多纤毛细胞和分泌细胞，并验证消化方法是否足够温和以防止去分化。图5中的代表性免疫荧光图像显示了步骤4.2.1之后的小细胞团块，在4%多聚甲醛（PFA）/ DPBS中固定3分钟，用1%牛血清白蛋白（BSA）/Tris缓冲盐水补间（BTBST）洗涤并在悬浮液中染色。简而言之，将细胞在室温下在0.5%TritonX-100 / BTBST中透化15分钟，在BTBST中洗涤，在20mM甘氨酸/ DPBS中在室温下淬灭背景荧光2小时，在BTBST中洗涤，然后在室温下以5%BSA / 0.1%TritonX-100 / TBST封闭1小时。然后将细胞在BTBST（小鼠抗小鼠闭塞素（1：2000）;兔抗小鼠乙酰化微管蛋白（1：1000））中在4°C下孵育一抗中过夜，然后在BTBST中洗涤几次。将二抗在室温下加入BTBST（山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 555（1：1000）;山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488（1：1000））1小时，在BTBST中洗涤几次，一次在DPBS中，然后在室温下在核染色中孵育20分钟（1：2000，Hoescht 33342），然后在DPBS中洗涤。将细胞重悬于80μL抗淬灭安装培养基中，并在成像前在黑暗中过夜（图5A）。图5B显示了解离方案结束时的细胞。在整个实验方案中进行了可行性评估，代表性图像如图5B-D所示。以1：100稀释加入碘化丙啶，并立即在倒置的化合物荧光显微镜上观察细胞（图5C，红色染色）。纤毛在小细胞簇（图5A）和单细胞悬浮液（图5E）中保持完整，观察到许多细胞的纤毛仍在跳动（增刊视频1）。
图5：输卵管细胞解离，第2部分。 闭塞素（红色）、细胞核（蓝色）和乙酰化微管蛋白（绿色）阳性细胞簇的荧光和相差图像。纤毛顶端边界（在AI和AV中为绿色）在整个方案中保持完整，并承受对单细胞（E）的进一步消化。 AI：合并， AII：红色通道， AIII：蓝色通道， AIV：相差， AV：绿色通道。经过短暂的蛋白酶孵育后，大多数细胞是单一的。碘化丙啶 （PI） 染色显示约 93% 的活力。（B） 亮场，（C）红色通道PI正，（D）合并。（E） 合并时的插图在单个解离的单元格上显示完整的纤毛边框。这些细胞具有活跃的跳动纤毛（见 增补视频1）。在倒置的复合荧光显微镜上拍摄图像。图 AI-V 比例尺 = 20 μm，B-D 比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看此图的放大版本。
所描述的RNA分离方案为节段RT-qPCR和RNAseq提供了足够的产量和纯度。结果表明，该方法每节产生800-1200ng RNA（图6A），但输液管内样品除外，其中可能需要从两只动物中汇集以获得下游测定的适当产量。所述的腹股沟结果来自两只动物，共四个腹股沟区域（图6）。该协议成功地实现了纯RNA，最初通过微量分光光度计进行分析，然后通过生物分析仪进行分析（图6B，C）。样品的吸收比为260/280 nm，介于1.8和2.0之间（图6B），是纯RNA核苷酸物种的典型值19。对每个样品的吸收比（260/230 nm）进行，纳入标准在1和2.2之间，代表分离试剂的有限污染（数据未显示）19。生物分析样品显示RNA具有高完整性，评估的RNA完整性数（RIN）高于7（图6C），适合下游表达和测序分析20。
图6：节段RNA的质量评估。 通过微量分光光度计和生物分析仪评估整个RNA的产量（A）和质量（B，C）。RIN：由生物分析仪评估的RNA完整性编号。条形图是平均±标准差（SD），N = 来自两个单独RNA提取的每个片段12个样品。 请点击此处查看此图的放大版本。
补充视频1：解离细胞上跳动纤毛的活细胞成像。在蛋白酶消化后击败纤毛。视频是在倒置的复合显微镜上拍摄的。 请点击此处下载此视频。
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Discussion
输卵管的三个节段在组织学上，形态学上和功能上是不同的1，2，3。上皮从输卵管的一端到另一端变化很大。纤毛细胞在腓肠/腹肌末端占主导地位，而分泌细胞在峡部区域占主导地位1。虽然这种总体梯度已经被认识到了一段时间，但最近的工作已经发现了输卵管节段之间的更多区别。因此，虽然纤毛细胞在管的近端变得不那么频繁，但它们从壶腹过渡到壶腹-峡部交界处的数量急剧下降（从大约60%到10%）3。此外，近端和远端段的上皮细胞群来自发育上不同的谱系1，2，3。腹腔和腹甉的远端上皮细胞对地峡的近端上皮细胞群没有贡献，如上皮标志物的谱系追踪所示。在胚胎第12.5天（E12.5），输卵管上皮细胞具有独立于近端上皮细胞标志物PAX22的独特谱系。这些发现，除了各个片段中细胞群的多样性之外，还进一步强调了独立研究这些片段的必要性。所描述的方法详细介绍了根据三个历史描述的片段（腹腔，壶腹和峡部）的分步放开和片段识别协议。由于最近建立了壶腹-峡部交界处作为明确的输卵管段，因此优先考虑识别和收集三个经典描述的区域。然而，该方法可以扩展为包括截流-峡部结的单独集合，如上所述3。
蓝色染料的使用和输卵管的位置是以快速有效的方式展开输卵管的关键步骤。蓝色染料突出了管的钄和线圈，从而可以更快，更有效地进行脱卷和收集。在整个开卷过程中，窦口的初始位置将一个人定向到输卵管的远端（腹底）和近端（峡部）区域。此外，在开卷期间将近端子宫角部分固定在解剖平台上，允许外科医生使用双手进行精细的解剖步骤。最初移除盘绕的输卵管并尝试在不使管不动或不使用染料的情况下解开该结构，很容易导致远端和近端的混淆或导致管子断裂。管子很容易断裂，因此在开卷时必须小心，因为断裂会使可重复的分割无法实现。强烈建议使用高质量的弹簧形微型剪刀，以达到最佳效果。
评估输卵管不同片段中的基因表达特征，例如，在发情周期期间以及对施用激素和细胞因子的反应，很可能会更好地了解输卵管如何响应这些刺激而变化。这些数据也可能揭示哪些因素有助于上皮转化。本文开发的RNA提取方案旨在为这种有限尺寸和弹性输卵管结构的组织获得最高的数量和质量。所述的匀浆，RNA沉淀和苯酚的结合使用：氯仿和柱上纯化方法被发现在实现下游分析的适当质量和数量的RNA方面最有效。不称量输卵管片段，并立即处理整个片段以进行组织均质化，以防止组织变暖导致RNA降解。此外，由于小输卵管段需要多个均质步骤，因此确保在4°C下进行均质以保持样品完整性至关重要。由于这种方法足以为下游分析产生适当的产量，因此该技术的未来应用将是进行以前未报道的节段RNAAseq，这将大大有助于我们对输卵管生理学的理解。
在细胞解离方案的发展过程中，我们发现稳健和/或长时间的酶消化导致纤毛的明显损失。因此，我们专注于开发并实现了一种保留细胞形态的方法。如本文所述，单细胞产量的提高将允许通过流式细胞术对不同的上皮和基质细胞类型进行更强大和即时的多重分析。使用非酶解离方案，然后在pronase中进行短时间孵育，与使用长而稳健的消化方法的解离方法相比，也可能改善细胞表面抗原的保存2，18。与多重流式细胞术面板相比，单细胞测序分析需要的细胞要少得多2，21。因此，使用所述方案可以对输卵管的三个所述片段进行单细胞测序。
由于输卵管不能沿其整个长度锉削，因此当前方法的潜在局限性可能是形成较窄地峡上皮的细胞会减少对解离试剂的暴露，因此，可能无法以与体内相同的比例存在于最终悬浮液 中。
由于输卵管盘绕，所有输卵管段的免疫组织化学分析方向可能具有挑战性3。然而，所描述的段解剖，然后取向嵌入输卵管段，可以进行更全面的纵向和横截面图像分析，而不必连续剖面整个完整的盘管。此外，用于展开卷的蓝色染料有助于在小输卵管节段的嵌入过程中的正确方向。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国防部对AMW突破奖（BCRP W81XWH-14-1-0425）的部分支持。KCR部分得到了校内奖学金的支持：Pease癌症博士预科奖学金和Mary Galvin Burden生物医学科学博士前奖学金以及加州大学河滨分校，校内奖：研究生理事会奖学金委员会论文研究补助金和研究生部论文年度计划奖。作者感谢Gillian M. Wright和Alyssa M. Kumari在这种方法的早期故障排除方面的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB05 | Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized |
| 1.4 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB14B | Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized |
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS) | Gibco | 21600-010 | Cold, sterile |
| 25G needle | BD | 305122 | |
| 60 mm sterile petri dishes | Corning | 430166 | |
| 70 μm cell meshes | Fisherbrand | 22-636-548 | |
| Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit | Agilent 2100 Bioanalyzer | 5067-1513 | |
| Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
| Bioanlyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer | ||
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Cold plate/pack/surface of choice | N/A | N/A | Kept at -20 °C for dissection |
| Dental wax | Polysciences Inc. | 403 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12 | Corning | 10-090-CV | Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015CV | |
| Fine point forceps of choice | N/A | N/A | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G712b | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21422 | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Immunocytochemical validation images |
| Hepes | Sigma Aldrich | H-3784 | |
| Hoescht 33342 | Cell Signaling Technologies | 4082S | Immunocytochemical validation images |
| Inverted compound microscope | Keyence BZ-X700 | ||
| Mouse anti-mouse Occludin | Invitrogen | 33-1500 | Immunocytochemical validation images |
| Non-enzymatic dissociation buffer | N/A | 5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS | |
| Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm | Thomas Scientific | 1210U04 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P-6148 | Immunocytochemical validation images |
| Pen-Strep | MP Biomedicals | 10220-718 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technologies | 9071S | Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | Prepare pronase digestion medium: 0.15% pronase in DMEM/Ham's F12, sterile |
| Propidium Iodide | Roche | 11 348 639 001 | Viability validation images |
| Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin | Abcam | ab179484 | Immunocytochemical validation images |
| RBC lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | Utilized for on-column purification in text |
| Spring form microdissection scissors | Roboz Surgical | RS-5610 | |
| Sterile 3 mL bulb pipettors | Globe Scientific | 137135 | |
| Toluidine blue | Alfa Aesar | J66015 | Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile |
| Tris-Buffered Saline-Tween (TBST) | N/A | N/A | Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20 |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Inc. | 3555 | Immunocytochemical validation images |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Invitrogen | 15596026 | Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines |
References
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