Summary
Viene presentato un metodo per la microdissezione dell'ovidotto di topo che consente la raccolta dei singoli segmenti mantenendo l'integrità dell'RNA. Inoltre, viene descritta la procedura di dissociazione delle cellule oviduttali non enzimatiche. I metodi sono appropriati per la successiva analisi genica e proteica dei segmenti oviduttali funzionalmente diversi e delle cellule oviduttali dissociate.
Abstract
I sistemi di modelli murini non hanno eguali per l'analisi dei processi patologici a causa della loro manipolabilità genetica e del basso costo dei trattamenti sperimentali. Tuttavia, a causa delle loro piccole dimensioni corporee, alcune strutture, come l'ovidotto con un diametro di 200-400 μm, si sono dimostrate relativamente difficili da studiare se non con l'immunoistochimica. Recentemente, studi immunoistochimici hanno scoperto differenze più complesse nei segmenti dell'ovidotto di quanto precedentemente riconosciuto; quindi, l'ovidotto è diviso in quattro segmenti funzionali con rapporti diversi di sette distinti tipi di cellule epiteliali. Le diverse origini embriologiche e i rapporti dei tipi di cellule epiteliali probabilmente rendono le quattro regioni funzionali differenzialmente suscettibili alle malattie. Ad esempio, le lesioni precursori dei carcinomi intraepiteliali sierosi derivano dall'infundibulum nei modelli murini e dalla corrispondente regione fimbriale nella tuba di Falloppio umana. Il protocollo qui descritto descrive un metodo per la microdissezione per suddividere l'ovidotto in modo tale da produrre una quantità e una purezza sufficienti di RNA necessarie per l'analisi a valle come la PCR quantitativa a trascrizione inversa (RT-qPCR) e il sequenziamento dell'RNA (RNAseq). Viene inoltre descritto un metodo di dissociazione tissutale per lo più non enzimatico appropriato per la citometria a flusso o l'analisi RNAseq a singola cellula di cellule oviduttali completamente differenziate. I metodi descritti faciliteranno ulteriori ricerche utilizzando l'ovidotto murino nel campo della riproduzione, della fertilità, del cancro e dell'immunologia.
Introduction
L'ovidotto murino è simile per funzione e morfologia alla tuba di Falloppio umana1. Entrambi sono costituiti da un epitelio ciliato pseudostratificato, costituito da due cellule residenti epiteliali storicamente descritte: cellule ciliate e cellule secretorie1,2. L'ovidotto ha tre segmenti classicamente riconosciuti: l'infundibulum, l'ampolla e l'istmo. In un recente studio, Harwalkar et al. 3 hanno studiato la morfologia dell'ovidotto e l'espressione genica che ha portato all'espansione della categorizzazione delle cellule epiteliali residenti a sette popolazioni distinte. Inoltre, hanno stabilito la giunzione ampollare-istmo come un segmento distinto dell'ovidotto3. Il metodo qui descritto, che si concentra sull'infundibulum, l'ampolla e l'istmo, potrebbe essere facilmente esteso per includere anche la giunzione ampollare-istmmica2,3. La regione infundibolare contiene l'ostio, o apertura dell'ovidotto, e comprende la regione fimbriale e il gambo prossimale. Spostandosi verso l'utero, il prossimo è l'ampolla, e poi l'istmo. Le cellule ciliate sono più prominenti nell'estremità distale della regione, prossimali all'ovaio o all'infundibulum, mentre le cellule secretorie sono più prominenti nell'estremità prossimale o nel segmento dell'istmo1. A differenza della tuba di Falloppio umana, l'ovidotto murino è una struttura a spirale sostenuta dal mesosalpinx, un'estensione del legamento largo peritoneo1,4. Inoltre, l'ovidotto di topo è racchiuso in un sacco bursale che aumenta la probabilità di trasferimento di ovociti nell'ovidotto4. L'ampolla è identificata come il luogo della fecondazione, da cui gli embrioni in via di sviluppo passano nell'istmo prima di entrare nell'utero5. I segmenti tubarici hanno un diametro di 200-400 μm e le regioni ampollari e istmo più lunghe sono lunghe circa 0,5-1,0 cm4. L'ovidotto si distende durante il ciclo estrale e l'ampolla e l'infundibulum sono più distensibili dell'istmo1.
L'eccessiva proliferazione delle cellule, in particolare le cellule secretorie, caratterizza le lesioni precursori dei tumori sierosi presenti nella cavità pelvica6. Queste lesioni intraepiteliali sierose precursori insorgono nell'epitelio dell'ovidotto esclusivamente nella regione fimbriale; non è noto il motivo per cui la formazione di lesioni è limitata a questa regione dove normalmente il tipo cellulare predominante è ciliato, non secretorio2,7,8. La regionalità in termini di normale funzione fisiologica, nonché l'accresciuto interesse per l'origine oviduttale del carcinoma ovarico9,10,11,12,13, sottolinea l'importanza di una valutazione separata dei segmenti dell'ovidotto.
Il metodo qui descritto descrive in dettaglio la raccolta di segmenti oviduttali separati per le successive analisi a valle dell'espressione genica specifica del segmento e della funzione delle cellule dissociate. Tradizionalmente, molti tessuti vengono elaborati per l'estrazione dell'RNA intero seguendo il metodo del cloroformio fenolo: o un metodo di estrazione completo su colonna; tuttavia, abbiamo scoperto che la qualità dell'RNA è stata mantenuta producendo una resa sufficiente con il metodo di combinazione descritto. Utilizzando questo metodo, segmenti funzionali molto piccoli dell'ovidotto possono essere elaborati per analisi a valle piuttosto che indagare l'ovidotto nel suo complesso, il che può mascherare risultati rappresentativi dei diversi segmenti14.
Le cellule oviduttali murine dissociate sono state raramente studiate mediante citometria a flusso, molto probabilmente a causa della resa cellulare limitante di questo tessuto. Un approccio per superare questo problema è stato quello di dissociare le cellule, farle crescere in coltura e quindi stimolare la ri-differenziazione in vitro per ottenere numeri di cellule appropriati per l'analisi cellulare a valle15,16,17,18. Una limitazione a questo approccio è il tempo ex vivo e il microambiente alterato in coltura, entrambi i quali probabilmente cambiano l'espressione genica. C'è anche l'ipotesi che il ridis differenziato morfologico abbia la stessa firma trascrizionale e proteomica presente nell'animale intatto. L'attuale metodo di dissociazione è stato progettato per ottenere il maggior numero di cellule epiteliali in una popolazione eterogenea di cellule oviduttali, mantenendo la differenziazione a singola cellula. Inoltre, l'approccio per lo più non enzimatico probabilmente limita la perdita di proteine di superficie cellulare.
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Protocol
Tutte le procedure e la manipolazione degli animali sono state approvate dall'Università della California, dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di Riverside ed erano conformi alle linee guida dell'American Association for Laboratory Animal Care, del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti e del National Institutes of Health. Il metodo descritto ha utilizzato C57BL/6 topi adulti, femmine. Tutti gli animali sono stati sottoposti a eutanasia per decapitazione prima della raccolta dei tessuti.
NOTA: Una panoramica del protocollo, che utilizza un colorante blu per aiutare a dissezione e srotolamento efficienti dell'ovidotto, è mostrata nella prima figura (Figura 1).
Figura 1: Panoramica del metodo di microdissezione. (A) Il pannello di sinistra mostra la struttura intatta da cui sono stati rimossi la maggior parte del cuscinetto di grasso ovarico e i resti di tessuto connettivo che circondano l'ovidotto. Dopo questo, l'aggiunta di toluidina blu aiuta a distinguere le bobine dell'ovidotto (pannello centrale). Il pannello di destra mostra le strutture dopo la rimozione dell'ovaio. (B) Un ovidotto non arrotolato con giri interni per determinare dove inizia e finisce ogni segmento. (C) Fumetto della segmentazione utilizzata (non disegnato in scala). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
1. Preparazione della superficie di dissezione
- Applicare un pezzo di cera dentale su una capsula di Petri con adesivo e lasciarlo asciugare (Figura 2A). Igienizzare il piatto con il 70% di etanolo. La superficie è pronta per la dissezione.
2. Macrodissezione dell'ovaio, dell'ovidotto e dell'utero
- Immobilizzare la capsula di Petri contenente la cera dentale su una piattaforma fredda a scelta (ad esempio, un impacco di ghiaccio mantenuto a -20 °C prima dell'uso) al microscopio di dissezione quando è pronto per la dissezione (Figura 2A).
- Disinfettare la superficie ventrale dell'animale con il 70% di etanolo. Aprire la cavità addominale e pelvica con forbici da dissezione sterili e spostare il tratto gastrointestinale su un lato per individuare l'utero bihornale dorsale. Seguire ogni corno uterino rostralmente per localizzare ogni ovidotto e ovaio avvolto nel cuscinetto di grasso uterino, che si trova appena sotto il rene (Figura 2B, C).
- Asportare entrambi gli ovidotti laterali con le ovaie e una porzione del corno uterino distale ancora attaccato usando le forbici di dissezione. Tagliare ogni corno uterino laterale con circa 1-2 cm del corno ancora attaccato all'ovidotto e all'ovaio arrotolati (Figura 2D). Immergere immediatamente il tessuto in 2 ml di terreno di dissezione a freddo (vedere Tabella dei materiali).
Figura 2: Macrodissezione dell'ovaio e configurazione della dissezione. L'ovidotto si trova dorsalmente nella cavità pelvica alla base del rene all'interno del cuscinetto di grasso ovarico (B). Individuare la biforcazione uterina nella cavità pelvica (C) e seguire il corno uterino laterale per individuare il continuum utero-ovidotto-ovaio (B). Rimuovere queste strutture tagliando un corno uterino e la dissezione grossolana. Posizionare sulla piattaforma di dissezione (A) e apporre la porzione uterina alla cera dentale con un ago (A e D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
NOTA: Lasciare abbastanza corno uterino intatto e attaccato all'ovidotto per consentire l'apposizione alla piattaforma di dissezione (Figura 2D).
- Applicare il tessuto uterino alla cera dentale con un ago sterile da 25 G per fissare il tessuto per la dissezione (Figura 2A, D e Figura 3A). Lavorando sotto il microscopio di dissezione, pulire e sezionare il cuscinetto di grasso ovarico e il tessuto connettivo per consentire una chiara visualizzazione dell'ovidotto (Figura 3B).
Figura 3: Passo dopo passo microdissezione dell'ovidotto. Dopo la rimozione del grasso residuo e del tessuto connettivo (A, B), aggiungere il blu di toluidina al tessuto (C), quindi lavare via per facilitare la visualizzazione e la successiva rimozione dell'ovaio e lo srotolamento del tubo (D-H). L'infundibulum può essere trovato accanto all'istmo prossimale e alla giunzione uterino-tubarica (UTJ). Tirare leggermente l'estremità distale mentre si taglia al mesosalpinx per srotolare e rivelare le curve endogene dell'ovidotto (H) per orientarsi per una segmentazione appropriata. Figura barra scala A-C = 500 μm, barra scala D-H = 400 μm (I) Vignetta dei vari segmenti (non disegnata in scala). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Utilizzando una siringa da 1 mL, erogare e incubare l'ovidotto apposto sull'utero in 1-2 gocce di soluzione sterile di colorante blu toluidina all'1% per 30 s-1 min. Risciacquare con soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbecco freddo e rimuovere tutto il liquido (Figura 3C).
- Estrarre leggermente l'ovaio dall'ovidotto arrotolato e tagliare via la membrana borsale e il legamento largo per rimuovere l'ovaio dall'ovidotto senza compromettere il tessuto tubarico (Figura 3D, E).
NOTA: L'ovaio non è attaccato all'ovidotto ma racchiuso nella membrana borsale con l'ovidotto (Figura 2D) e collegato al lato laterale dell'utero attraverso il legamento largo.
3. Microdissezione e segmentazione dell'ovidotto
- Individuare l'estremità distale e fimbriale dell'ovidotto che si trova lateralmente alla giunzione uterino-tubarica (UTJ). L'ovidotto si avvolge su se stesso; quindi l'estremità fibriale può essere localizzata lateralmente all'estremità prossimale ed è un punto di partenza appropriato da orientare per lo srotolamento dell'ovidotto (Figura 3F,I).
- Mentre si tira delicatamente il tubo, tagliare via il mesosalpinx (Figura 3I) con microforbici a molla per srotolare l'ovidotto (Figura 3G).
- Una volta srotolato, tagliare il tubo per produrre le regioni infundibolare, ampollare e istmmica (Figura 3H).
- Dopo l'escissione dell'infundibulum (estremità fibriale e gambo prossimale), asportare la regione ampollare tagliando dopo il secondo giro prominente del tubo (tagliato tra i giri due e tre, circa 1 cm di lunghezza). Infine, tagliare la parte rimanente all'UTJ, che è la regione istmica (Figura 3H).
NOTA: l'ovidotto non si srotola completamente in una struttura diritta. Il tubo manterrà i suoi giri (Figura 3H)3. Sulla base delle successive svolte che seguono la regione ampollare, si può ulteriormente segmentare il tubo rimanente nella giunzione ampollare-istmmica e nell'istmo3. Dopo l'escissione ampolla, tagliare tra le curve cinque e sei per ottenere la giunzione ampollare-istmmica; il tubo rimanente (svolta sei all'inizio dell'UTJ) è l'istmo3.
- Dopo l'escissione dell'infundibulum (estremità fibriale e gambo prossimale), asportare la regione ampollare tagliando dopo il secondo giro prominente del tubo (tagliato tra i giri due e tre, circa 1 cm di lunghezza). Infine, tagliare la parte rimanente all'UTJ, che è la regione istmica (Figura 3H).
- Immediatamente congelare i segmenti di tessuto sezionati in azoto liquido per l'isolamento dell'RNA o fissare ed elaborare ogni segmento per l'incorporamento orientato e l'analisi immunoistologica.
- Aggiungere 200 μL di reagente per l'estrazione dell'RNA freddo e una miscela di perline di omogeneizzazione 1:1 (vedere Tabella dei materiali) al tessuto se si procede per l'estrazione dell'RNA (vedere il punto 5.1).
4. Dissociazione dell'ovidotto
- Continua dal punto 3.1.1 di cui sopra) Per una dissociazione ottimale dell'epitelio, aprire l'ovidotto nelle aree dove possibile (cioè infundibulum e ampulla) per esporre l'epitelio luminale (Figura 4A).
Figura 4: Dissociazione delle cellule dell'ovidotto, parte 1. Cartone animato che mostra come esporre l'epitelio distale per una dissociazione cellulare ottimale (A) e un'immagine che mostra il modo più semplice per utilizzare la rete 1 mm2 (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Partendo dalla regione fibriale, usando la pinza come leva, taglia il tubo longitudinalmente con forbici a molla.
- Tritare le porzioni aperte a fessura e l'ovidotto rimanente in segmenti (~ 1-2 mm di dimensione) e aggiungere 5 ml di tampone di dissociazione caldo e non enzimatico (vedere Tabella dei materiali) e incubare a 37 °C.
- Risospese i pezzi di tessuto e le cellule dissociate con un pipettor a bulbo ogni 3 minuti per 9-10 minuti. Diluire il tampone di dissociazione 1:1 con un mezzo di dissezione a freddo.
- Raccogliere le cellule per centrifugazione (350 x g, 3 min, 4 °C). Risospesciare le cellule in 2 mL di tampone di lisi RBC per 2 minuti a temperatura ambiente, quindi diluire 1:1 con mezzo di dissezione a freddo.
- Raccogliere le cellule per centrifugazione (350 x g, 3 min, 4 °C) e risospese in 5 mL di soluzione di pronasi fredda.
- Incubare nel mezzo di digestione della pronasi e risospese i grumi cellulari con un pipettor a bulbo ogni 3-5 minuti fino a raggiungere una sospensione a singola cellula (~ 25-30 min).
NOTA: questa fase viene eseguita al meglio in una piastra di coltura tissutale o in un pallone per consentire un'osservazione costante che impedisce una sovraesposizione non necessaria alla pronasi.
- Incubare nel mezzo di digestione della pronasi e risospese i grumi cellulari con un pipettor a bulbo ogni 3-5 minuti fino a raggiungere una sospensione a singola cellula (~ 25-30 min).
- Passare le cellule attraverso una macro-mesh sterile (1 mm x 1 mm mesh fissata a un tubo conico con un elastico (Figura 4B)) per rimuovere eventuali pezzi di tessuto non dissociati rimanenti. Raccogliere le cellule per centrifugazione (350 x g, 3 min, 4 °C) e risospescerle in un mezzo freddo appropriato per l'analisi a valle (ad esempio, tampone FACS se si procede con la colorazione per la citometria a flusso).
5. Estrazione di RNA di segmenti oviduttali
- Omogeneizzare campioni congelati a scatto in 200 μL di reagente di estrazione dell'RNA in un omogeneizzatore di tessuto per frullatori a proiettile di perline al livello 12 per due intervalli (3 minuti ciascuno) a 4 °C utilizzando la miscela di perline in acciaio inossidabile.
NOTA: per preservare l'integrità dell'RNA, i campioni devono essere immediatamente spostati dallo stato congelato a scatto nel reagente di estrazione dell'RNA e non pesati. - Centrifugare brevemente omogeneizzato a 100-200 x g in una centrifuga da tavolo per circa 5 s a temperatura ambiente per separare il liquido dalle perline. Trasferire il surnatante in un tubo fresco.
- Aggiungere altri 200 μL di reagente di estrazione dell'RNA alle perline per recuperare più campioni, seguiti dalla centrifugazione (100-200 x g, 5 s, temperatura ambiente). Combina i supernatanti.
NOTA: utilizzare una piccola punta della pipetta (la maggior parte delle punte p200 sono adatte) per evitare il riporto del tallone durante la rimozione del surnatante. - Seguire le linee guida del produttore per separare in fase e precipitare l'RNA. I campioni rappresentativi sono stati precipitati durante la notte a -20 °C con isopropanolo al 100% (circa 2:1 volume, isopropanolo: fase acquosa recuperata).
- Trasferire il precipitato di RNA completo insieme alla soluzione in una colonna di spin legante l'RNA e centrifugare per 30 s a 9.500 x g. Purificare l'RNA sulla colonna secondo le linee guida del produttore e quindi eluire l'RNA in 20 μL di acqua priva di nucleasi. Valutare la qualità/quantità su uno spettrofotometro microvolume e/o bioanalizzatore.
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Representative Results
Il protocollo di dissociazione descritto produce 100.000-120.000 cellule per topo con raggruppamento di entrambi gli ovidotti. Il metodo è abbastanza delicato da lasciare intatti i bordi delle cellule multi-ciliate, consentendo una distinzione tra cellule multi-ciliate e cellule secretorie e verificando che il metodo di digestione sia abbastanza delicato da prevenire la de-differenziazione. Le immagini rappresentative di immunofluorescenza nella Figura 5 mostrano grumi di piccole cellule dopo la fase 4.2.1, fissati per 3 minuti in paraformaldeide al 4% (PFA)/DPBS, lavati con albumina sierica bovina all'1% (BSA)/ Interpolazione salina tamponata con Tris (BTBST) e colorati in sospensione. In breve, le cellule sono state permeabilizzate per 15 minuti a temperatura ambiente in 0,5% TritonX-100 / BTBST, lavate in BTBST, temprate per fluorescenza di fondo per 2 ore a temperatura ambiente in 20 mM glicina / DPBS, lavate in BTBST e quindi bloccate per 1 ora a temperatura ambiente in 5% BSA / 0,1% TritonX-100 / TBST. Le cellule sono state poi incubate nell'anticorpo primario a 4 °C durante la notte in BTBST (occludina anti-topo di topo (1:2000); tubulina acetilata anti-topo di coniglio (1:1000)) seguita da diversi lavaggi in BTBST. L'anticorpo secondario è stato aggiunto per 1 ora a temperatura ambiente in BTBST (capra anti-topo IgG Alexa Fluor 555 (1:1000); capra anti-coniglio IgG Alexa Fluor 488 (1:1000)), lavato più volte in BTBST, una volta in DPBS, e poi incubato in colorazione nucleare per 20 minuti a temperatura ambiente (1:2000, Hoescht 33342) seguito da un lavaggio in DPBS. Le cellule sono state risospese in 80 μL di terreno di montaggio antideflagrante e lasciate durante la notte al buio prima dell'imaging (Figura 5A). La Figura 5B mostra le celle alla fine del protocollo di dissociazione. Le valutazioni di fattibilità sono state effettuate in tutto il protocollo e le immagini rappresentative sono mostrate nella Figura 5B-D. Lo ioduro di propidio è stato aggiunto alla diluizione 1:100 e le cellule sono state immediatamente osservate su un microscopio a fluorescenza composta invertita (Figura 5C, macchia rossa). Le ciglia sono rimaste intatte nei piccoli cluster cellulari (Figura 5A) e nelle sospensioni a singola cellula (Figura 5E) con molte cellule osservate con ciglia che ancora battono (Suppl. Video 1).
Figura 5: Dissociazione delle cellule dell'ovidotto, parte 2. Immagini fluorescenti e a contrasto di fase di un cluster cellulare positivo per occludina (rosso), nuclei (blu) e tubulina acetilata (verde). Il bordo apicale ciliato (verde in AI e AV) rimane intatto per tutto il protocollo e resiste a un'ulteriore digestione alle singole cellule (E). AI: merge, AII: canale rosso, AIII: canale blu, AIV: contrasto di fase, AV: canale verde. Dopo una breve incubazione della pronasi, la maggior parte delle cellule sono singole. La colorazione allo ioduro di propidio (PI) mostra una vitalità di circa il 93%. (B) Campo luminoso, (C) canale rosso PI positivo, (D) unione. (E) l'inserto sulla fusione mostra un bordo ciliato intatto su una singola cella dissociata. Tali cellule avevano ciglia che battevano attivamente (vedi Suppl. Video 1). Le immagini sono state scattate su un microscopio a fluorescenza composta invertita. Figura BARRA SCALA AI-V = 20 μm, Barra scala B-D = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Il protocollo di isolamento dell'RNA descritto fornisce la resa e la purezza sufficienti necessarie per RT-qPCR segmentale e RNAseq. I risultati mostrano che questo metodo produce 800-1200 ng RNA per segmento (Figura 6A) ad eccezione dei campioni infundibolari in cui può essere necessario il pooling di due animali per una resa appropriata per i saggi a valle. I risultati presentati per l'infundibulum sono raggruppati da due animali, per un totale di quattro regioni infundibolari (Figura 6). Questo protocollo ha successo nel raggiungimento dell'RNA puro, inizialmente analizzato dallo spettrofotometro a microvolume e successivamente dal bioanalizzatore (Figura 6B,C). I campioni hanno un rapporto di assorbimento di 260/280 nm compreso tra 1,8 e 2,0 (Figura 6B) tipico delle specie di nucleotidi di RNA puro19. Per ciascun campione sono stati prelevati rapporti di assorbimento (260/230 nm) con un criterio di inclusione compreso tra 1 e 2,2, rappresentativo di una contaminazione limitata da reagenti di isolamento (dati non mostrati)19. La bioanalisi dei campioni ha mostrato un'elevata integrità dell'RNA, con un numero di integrità dell'RNA (RIN) valutato superiore a sette (Figura 6C), appropriato per l'espressione a valle e l'analisi di sequenziamento20.
Figura 6: Valutazione della qualità dell'RNA segmentale. L'RNA intero è stato valutato per la resa (A) e la qualità (B, C) mediante spettrofotometro a microvolume e bioanalizzatore. RIN: numero di integrità dell'RNA, valutato dal bioanalizzatore. Le barre sono la deviazione standard media ± (SD), N = 12 campioni per segmento da due estrazioni di RNA separate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video supplementare 1: Imaging cellulare vivo di ciglia battenti su cellule dissociate. Battere le ciglia dopo la digestione della pronasi. I video sono stati girati su un microscopio composto invertito. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
I tre segmenti dell'ovidotto sono istologicamente, morfologicamente e funzionalmente distinti1,2,3. L'epitelio varia notevolmente da un'estremità all'altra dell'ovidotto. Le cellule ciliate dominano all'estremità fibriale/infundibolare, mentre le cellule secretorie dominano nella regione istmica1. Mentre questo gradiente complessivo è stato riconosciuto per qualche tempo, lavori recenti hanno scoperto più distinzioni tra i segmenti oviduttali. Così, mentre le cellule ciliate diventano meno frequenti verso l'estremità prossimale del tubo, c'è un forte calo del loro numero (da circa il 60% al 10% di ciliazione) che passa dall'ampolla alla giunzione ampollare-istmmica3. Inoltre, le popolazioni di cellule epiteliali nei segmenti prossimale e distale derivano da lignaggi distinti per lo sviluppo1,2,3. Le cellule epiteliali distali dell'infundibulum e dell'ampulla non contribuiscono alle popolazioni di cellule epiteliali prossimali nell'istmo, come mostrato dal tracciamento del lignaggio dei marcatori epiteliali. Al giorno embrionale 12,5 (E12,5), le cellule epiteliali oviduttali hanno un lignaggio distinto indipendente dal marcatore delle cellule epiteliali prossimali, PAX22. Queste scoperte, oltre alla diversa popolazione cellulare tra i vari segmenti, sottolineano ulteriormente la necessità di indagare i segmenti in modo indipendente. Il metodo descritto descrive in dettaglio un protocollo di svolgimento e identificazione del segmento passo-passo secondo i tre segmenti storicamente descritti (infundibulum, ampulla e istmo). A causa della recente istituzione della giunzione ampollare-istmmica come segmento definitivo dell'ovidotto, è stata data priorità all'identificazione e alla raccolta delle tre aree descritte classicamente. Tuttavia, il metodo può essere esteso per includere una raccolta separata della giunzione ampollare-istmmica, come descritto sopra3.
L'uso del colorante blu e la posizione dell'infundibulum è un passo fondamentale per srotolare l'ovidotto in modo rapido ed efficiente. Il colorante blu evidenzia l'ostio e le bobine del tubo, consentendo una sverniciatura e una raccolta più rapide ed efficienti. La posizione iniziale dell'ostio orienta le aree distale (infundibolare) e prossimale (istmmica) dell'ovidotto durante lo srotolamento. Inoltre, mantenere la porzione prossimale del corno uterino apposta sulla piattaforma di dissezione durante lo srotolamento consente al chirurgo di utilizzare entrambe le mani per le delicate fasi di dissezione. La rimozione iniziale dell'ovidotto arrotolato e i tentativi di srotolare questa struttura senza rendere il tubo immobile o senza l'uso del colorante possono facilmente portare a confusione per quanto riguarda le estremità distale e prossimale o causare la rottura del tubo. La rottura del tubo è facile, quindi è necessario prestare attenzione durante lo srotolamento poiché la rottura renderà irraggiungibile la segmentazione riproducibile. L'uso di micro-forbici a molla di alta qualità è altamente raccomandato per ottenere i migliori risultati.
La valutazione della firma dell'espressione genica nei diversi segmenti dell'ovidotto, ad esempio, durante il ciclo estrale e in risposta agli ormoni e alle citochine somministrati, molto probabilmente produrrà una comprensione molto migliore di come l'ovidotto cambia in risposta a questi stimoli. Questi dati possono anche far luce su quali fattori contribuiscono alla trasformazione epiteliale. Il protocollo di estrazione dell'RNA qui è stato sviluppato per ottenere la massima quantità e qualità possibile per questo tessuto di dimensioni limitate e struttura tubarica resiliente. L'omogeneizzazione descritta, la precipitazione dell'RNA e l'uso congiunzionale del fenolo: i metodi di purificazione del cloroformio e sulla colonna sono risultati più efficienti nel raggiungere la qualità e la quantità appropriate di RNA per l'analisi a valle. I segmenti oviduttali non sono stati pesati e interi segmenti sono stati immediatamente elaborati per l'omogeneizzazione dei tessuti al fine di prevenire qualsiasi riscaldamento del tessuto che porta alla degradazione dell'RNA. Inoltre, poiché i piccoli segmenti tubarici richiedono più fasi di omogeneizzazione, è fondamentale garantire che l'omogeneizzazione sia condotta a 4 °C per preservare l'integrità del campione. Poiché questo metodo è sufficiente per produrre una resa appropriata per l'analisi a valle, una futura applicazione di questa tecnica sarebbe quella di eseguire RNAseq segmentale, precedentemente non riportato, che contribuirebbe notevolmente alla nostra comprensione della fisiologia dell'ovidotto.
Durante lo sviluppo del protocollo di dissociazione cellulare, abbiamo scoperto che le digestioni enzimatiche robuste e / o lunghe causavano una perdita dimostrabile di ciglia. Ci siamo quindi concentrati sullo sviluppo e sul raggiungimento di un metodo che ha preservato la morfologia cellulare. I miglioramenti nella resa delle singole cellule, come descritto nel presente documento, consentiranno analisi multiplexate più robuste e immediate dei diversi tipi di cellule epiteliali e stromali mediante citometria a flusso. L'uso di un protocollo di dissociazione non enzimatica seguito da una breve incubazione nella pronasi è anche in grado di migliorare la conservazione degli antigeni di superficie cellulare rispetto ai metodi di dissociazione che utilizzano metodi di digestione lunghi o robusti2,18. L'analisi di sequenziamento a singola cellula richiede molte meno cellule rispetto ai pannelli di citometria a flusso multiplexed2,21. Quindi il sequenziamento a singola cellula dei tre segmenti descritti dell'ovidotto può essere possibile con il protocollo descritto.
Poiché l'ovidotto non può essere limato lungo tutta la sua lunghezza, una potenziale limitazione del metodo attuale potrebbe essere che le cellule che formano l'epitelio dell'istmo più stretto avrebbero ridotto l'esposizione ai reagenti di dissociazione e, quindi, potrebbero non essere presenti nella sospensione finale nella stessa proporzione di in vivo.
A causa dell'avvolgimento dell'ovidotto, l'orientamento per le analisi immunoistochimiche di tutti i segmenti oviduttali può essere impegnativo3. Tuttavia, la dissezione del segmento descritta seguita dall'incorporamento orientato dei segmenti oviduttali consente un'analisi dell'immagine longitudinale e trasversale più completa senza dover sezionare in serie l'intero tubo a spirale intatto. Inoltre, il colorante blu utilizzato per lo srotolamento, aiuta nel corretto orientamento durante l'incorporamento dei piccoli segmenti tubarici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato in parte da un DoD Breakthrough Award ad AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). KCR è stato parzialmente supportato da borse di studio intramurali: la Pease Cancer Pre-Doctoral Fellowship e la Mary Galvin Burden Pre-Doctoral Fellowship in Biomedical Sciences e University of California, Riverside, premi intramurali: il Graduate Council Fellowship Committee Dissertation Research Grant e il Graduate Division Dissertation Year Program Award. Gli autori ringraziano Gillian M. Wright e Alyssa M. Kumari per l'assistenza nella risoluzione precoce di questo metodo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB05 | Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized |
| 1.4 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB14B | Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized |
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS) | Gibco | 21600-010 | Cold, sterile |
| 25G needle | BD | 305122 | |
| 60 mm sterile petri dishes | Corning | 430166 | |
| 70 μm cell meshes | Fisherbrand | 22-636-548 | |
| Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit | Agilent 2100 Bioanalyzer | 5067-1513 | |
| Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
| Bioanlyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer | ||
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Cold plate/pack/surface of choice | N/A | N/A | Kept at -20 °C for dissection |
| Dental wax | Polysciences Inc. | 403 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12 | Corning | 10-090-CV | Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015CV | |
| Fine point forceps of choice | N/A | N/A | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G712b | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21422 | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Immunocytochemical validation images |
| Hepes | Sigma Aldrich | H-3784 | |
| Hoescht 33342 | Cell Signaling Technologies | 4082S | Immunocytochemical validation images |
| Inverted compound microscope | Keyence BZ-X700 | ||
| Mouse anti-mouse Occludin | Invitrogen | 33-1500 | Immunocytochemical validation images |
| Non-enzymatic dissociation buffer | N/A | 5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS | |
| Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm | Thomas Scientific | 1210U04 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P-6148 | Immunocytochemical validation images |
| Pen-Strep | MP Biomedicals | 10220-718 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technologies | 9071S | Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | Prepare pronase digestion medium: 0.15% pronase in DMEM/Ham's F12, sterile |
| Propidium Iodide | Roche | 11 348 639 001 | Viability validation images |
| Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin | Abcam | ab179484 | Immunocytochemical validation images |
| RBC lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | Utilized for on-column purification in text |
| Spring form microdissection scissors | Roboz Surgical | RS-5610 | |
| Sterile 3 mL bulb pipettors | Globe Scientific | 137135 | |
| Toluidine blue | Alfa Aesar | J66015 | Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile |
| Tris-Buffered Saline-Tween (TBST) | N/A | N/A | Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20 |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Inc. | 3555 | Immunocytochemical validation images |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Invitrogen | 15596026 | Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines |
References
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