Summary
RNA 무결성을 유지하면서 개별 세그먼트의 수집을 허용하는 마우스 배반의 미세 절제 방법이 제시된다. 또한, 비효소 성 배관 세포 해리 절차가 설명된다. 이 방법은 기능적으로 상이한 배반 분과 및 해리된 배관 세포의 후속 유전자 및 단백질 분석에 적합합니다.
Abstract
마우스 모델 시스템은 유전적 절만성과 실험 적 치료의 저렴한 비용으로 인해 질병 프로세스의 분석에 대한 타의 추종을 불허합니다. 그러나, 그들의 작은 체내에서, 200-400 μm의 직경을 가진 oviduct와 같은 몇몇 구조물은 면역작용화학을 제외하고는 연구하기 상대적으로 어려운 것으로 입증되었습니다. 최근, 면역히토화학 연구는 이전에 인식된 것보다 oviduct 세그먼트에 있는 더 복잡한 다름을 발견했습니다; 따라서, oviduct는 7개의 명백한 상피 세포 모형의 상이한 비율을 가진 4개의 기능적인 세그먼트로 분할됩니다. 상피 세포 모형의 상이한 배아 기원 및 비율은 가능성이 4개의 기능적인 지구가 질병에 분화하기 쉽게 만듭니다. 예를 들어, 전구체 병변은 마우스 모델의 농가 에서 발생하며 인간 나팔관의 상응하는 피모브리알 영역에서 발생한다. 여기서 설명된 프로토콜은 역전사-정량PCR(RT-qPCR) 및 RNA 시퀀싱(RNAseq)과 같은 다운스트림 분석에 필요한 RNA의 충분한 양및 순도를 산출하는 방식으로 마이크로절이 배관을 세분화하는 방법을 상세히 기술한다. 또한 완전히 분화된 난관 세포의 유동 세포측정 또는 단일 세포 RNAeq 분석에 적합한 대부분 비 효소 조직 해리 방법이 기재되어 있다. 설명된 방법은 생식, 불임, 암 및 면역학 분야에서 뮤린 배관을 활용하는 추가 연구를 촉진할 것입니다.
Introduction
뮤린 배관은 인간 나팔관1과 기능 및 형태학에서 유사합니다. 둘 다 역사적으로 설명된 두 개의 상피 상피 상피 세포로 구성된 의사 섬광 상부로 구성됩니다: 양모 세포 및 분비 세포1,2. oviduct는 세 가지 고전적으로 인식 세그먼트가 있습니다 : fundibulum, 암풀라, 그리고 isthmus. 최근 연구에서, 하와카르 외. 3 7개의 명백한 인구로 상피 세포의 분류의 확장으로 이끌어 내는 oviduct 형태학 및 유전자 발현을 조사했습니다. 또한, 그들은 oviduct3의 뚜렷한 세그먼트로 ampullary-isthmus 접합을 설립했다. 본 명세서에서 기재된 방법은, 농가, 암풀라 및 isthmus에 초점을 맞추고, ampullary-isthmic 접합뿐만 아니라 2,3을 포함하도록 쉽게 확장될 수 있었다. 기금 부족 영역은 오시덕트의 오스티움 또는 개방을 포함하고 있으며, 근접 줄기뿐만 아니라 피모브리알 영역을 포함한다. 자궁쪽으로 이동, 다음 암풀라, 그리고 isthmus입니다. Ciliated 세포는 이 지역의 단부 끝에서 가장 두드러지며, 난소에 근접하거나, 또는 fundibulum이 있는 반면, 분비 세포는 근위 말쪽 또는 isthmus 세그먼트1에서 가장 두드러집니다. 인간 나팔관과는 달리, 뮤린 배관은 메소살핀스, 넓은 인대 복막1,4의 연장에 의해 지원되는 코일 구조입니다. 또한, 마우스 oviduct는 oviduct4로 oocyte 전송의 가능성을 증가 bursal 낭에 싸여있다. 암풀라는 자궁5에 들어가기 전에 개발 배아가 isthmus로 통과하는 수정의 위치로 확인됩니다. 관 세그먼트는 직경 200-400 μm이고 더 긴 ampullary 및 isthmus 영역은 길이가 약 0.5-1.0cm입니다4. oviduct는 에스스트라이스트 사이클 동안 불협화음과 암풀라와 인펀드티불룸은 isthmus1보다 더 현명하지 못합니다.
세포의 증식, 특히 분비 세포는 골반 구멍에서 발견되는 장종양에 전구체 병변을 특성화합니다6. 이러한 전구체 장피상피성 병변은 피모브리알 영역에서만 난소 상피에서 발생합니다. 병변 형성이 일반적으로 우세한 세포 유형이 분모가 아닌 분비2,7,8이 되는 이 부위로 제한되는 이유는 알려지지 않았다. 정상적인 생리적 기능 측면에서 지역성은 난소암의 난소 기원에 대한 관심이 높아졌을 뿐만 아니라, 난소암의 분비성 기원에 대한 관심이 높아지고 있다9,10,11,12,13, 난소 세그먼트의 별도 평가의 중요성을 강조한다.
여기서 설명된 방법은 분할 특이적 유전자 발현 및 해리된 세포의 기능의 후속 다운스트림 분석을 위한 별도의 배반 세그먼트의 수집을 자세히 설명합니다. 전통적으로, 많은 조직은 페놀에 따라 전체 RNA 추출을 위해 처리됩니다: 클로로폼 방법 또는 온컬럼 완전 추출 방법; 그러나, 우리는 RNA 품질이 설명된 조합 방법으로 충분한 수율을 생성하는 동안 유지되었다는 것을 것을을 발견했습니다. 이 방법을 활용하면, oviduct의 매우 작은 기능 세그먼트는 서로 다른 세그먼트를 대표하는 결과를 마스크 할 수있는 전체 oviduct을 조사하는 대신 다운스트림 분석을 위해 처리 될 수있다14.
해리된 뮤린 오비덕탈 세포는 이 조직에서 세포 수율을 제한하기 때문에 혈류 세포측정에 의해 거의 조사되지 않았습니다. 이 문제를 극복하기 위한 한 가지 접근법은 세포를 해리화하고, 배양에서 성장한 다음, 다운스트림 세포 분석을 위한 적절한 세포 수를 얻기 위해 시험관에서 재분화를 자극하는 것입니다15,16,17,18. 이 접근법에 대한 제한은 배양에서 전 생체 및 변경 된 미세 환경이며, 둘 다 유전자 발현을 바꿀 가능성이 있습니다. 또한 형태학적 재분화가 그대로 동물에 존재하는 것과 동일한 전사 및 프로테오믹 시그니처를 가지고 있다는 가정도 있습니다. 현재 해리 방법은 단일 세포 분화를 유지하면서 이성수 배반 세포 집단에서 가장 많은 상피 세포를 달성하도록 설계되었습니다. 추가, 대부분 비 효소 접근은 가능성이 세포 표면 단백질의 손실을 제한.
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Protocol
모든 동물 취급 및 절차는 캘리포니아 대학, 리버사이드 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되고 실험실 동물 관리를 위한 미국 협회, 미국 농무부 및 건강의 국가 학회에서 지침에 따라 이었습니다. 설명된 방법은 C57BL/6 성인, 여성 마우스를 활용하였다. 모든 동물은 조직 수확 전에 참수에 의해 안락사되었다.
참고: 파란색 염료를 사용하여 배반의 효율적인 해부 및 코일링을 지원하는 프로토콜에 대한 개요가 첫 번째 그림(그림 1)에 표시됩니다.
그림 1: 미세 절제 방법의 개요입니다. (A) 왼쪽 패널은 난소 지방 패드의 대부분과 난소를 둘러싼 결합 조직의 잔재가 제거된 그대로 구조를 나타낸다. 그 후, toluidine 블루의 추가는 oviduct (중간 패널)의 코일을 구별하는 데 도움이됩니다. 오른쪽 패널은 난소를 제거 한 후 구조를 보여줍니다. (B) 각 세그먼트가 시작되고 끝나는 위치를 결정하기 위한 내부 회전이 있는 코이징 되지 않은 배반입니다. (C) 사용되는 세분화의 만화 (확장에 그려지지 않음). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1. 해부 표면의 준비
- 접착제와 페트리 접시에 치과 왁스 조각을 부착하고 건조하게 (그림 2A). 70%의 에탄올로 접시를 소독합니다. 서피스는 해부할 준비가 되어 있습니다.
2. 난소, 난소 및 자궁의 매크로 절
- 선단 현미경하에서 치과 왁스를 포함하는 페트리 접시를 냉장 플랫폼(예: 사용하기 전에 -20°C에 보관한 얼음 팩)을 해부(그림 2A)에 사용할 준비가 되면 정차합니다.
- 동물의 복부 표면을 70%의 에탄올로 소독합니다. 멸균 해부 가위로 복부와 골반 구멍을 열고 위장관을 한쪽으로 이동하여 등쪽 양혼 자궁을 찾습니다. 각 자궁 뿔을 따라 신장 바로 아래에 있는 자궁 지방 패드에 둘러싸인 각 난소와 난소를 찾습니다(그림 2B, C).
- 난소와 말단 배관의 일부를 모두 절제 된 가위를 사용하여 부착. 각 측면 자궁 경적을 코일 난기와 난소에 부착된 뿔의 약 1-2cm로 자릅니다(도 2D). 차가운 해부 배지의 2mL에 즉시 조직을 침수 ( 재료의 표 참조).
그림 2: 난소 및 해부 설정의 매크로 절제. oviduct는 난소 지방 패드 (B) 내신장의 기지에서 골반 구멍에 등등으로 위치하고 있습니다. 골반 구멍(C)에서 자궁 분비를 찾아 내고 측면 자궁 경적을 따라 자궁-oviduct-난소 연속체(B)를 찾습니다. 하나의 자궁 경적과 거친 해부를 절단하여 이러한 구조를 제거합니다. 해부 플랫폼(A)에 놓고 자궁 부분을 바늘(A 및 D)으로 치과 용 왁스에 부착합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
참고: 충분한 자궁 경적을 그대로 두고 배부 플랫폼에 부착할 수 있도록 배분에 부착합니다(그림 2D).
- 자궁 조직을 멸균 25 G 바늘로 치과 왁스에 부착하여 해부 조직을 확보합니다(도 2A, D 및 도 3A). 해부 현미경하에서 작업, 깨끗 하 고 난소 지방 패드와 결합 조직을 멀리 해부 oviduct의 명확한 시각화를 허용 (그림 3B).
그림 3: 단계별 oviduct 미세 절제. 잔재 지방 및 결합 조직 (A,B)을 제거 한 다음, 조직 (C)에 toluidine 파란색을 추가 한 다음 난소의 시각화 및 후속 제거및 튜브 (D-H)의 제거를 용이하게합니다. 인펀디불룸은 근위 협소와 자궁관 접합부(UTJ) 옆에 있습니다. 메소살핀스를 절단하는 동안 탈단 끝을 가볍게 당기고 굴(H)의 내인성 회전을 적절한 세분화를 위해 방향을 드러냅니다. 그림 A-C 스케일 바 = 500 μm, D-H 스케일 바 = 400 μm (I) 다양한 세그먼트의 만화 (스케일에 그려지지 않음). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 1 mL 주사기를 사용하여, 1-2 방울의 멸균 1 % 톨루이딘 블루 염료 용액으로 자궁에 부착 된 oviduct를 30 s-1 분 동안 배양한다. 차가운 덜벡코의 인산완충식염(DPBS)으로 헹구고 모든 액체(그림 3C)를 제거합니다.
- 코일 난소에서 난소를 가볍게 당기고 관 조직을 손상시키지 않고 oviduct에서 난소를 제거하기 위해 활액막과 넓은 인대에서 잘라냅니다 (그림 3D, E).
참고 : 난소는 oviduct에 부착되지 않지만 oviduct (도 2D)와 bursal 막에 싸여 넓은 인대를 통해 자궁의 측면에 연결됩니다.
3. 마이크로 디스섹션 및 배반의 세분화
- 자궁 관 접합 (UTJ)에 측면 발견 oviduct의 탈, fimbrial 끝을 찾습니다. oviduct 는 그 자체로 다시 코일; 따라서 피모브리알 끝은 근해 끝에 측면으로 위치할 수 있으며, oviduct의 코일링을 위한 방향을 지정하는 적절한 출발점입니다(그림 3F,I).
- 튜브를 부드럽게 당기면서, 메소살핀스(그림 3I)에서 스프링 형태의 마이크로 가위를 잘라 배란을 풀게 합니다(그림 3G).
- 일단 코이알이 생기지 않고 튜브를 잘라 내어 빈약하고, 암풀하고, isthmic 영역을 생성한다(그림 3H).
- 인펀드티불룸(fimbrial end 및 근위 줄기)을 절제한 후, 튜브의 두 번째 눈에 띄는 회전 후 절단하여 암풀 영역을 소비합니다(2번과 3번, 길이 약 1cm 사이 절단). 마지막으로, 나머지 부분을 ISthmic 영역인 UTJ로 잘라냅니다(그림 3H).
참고: 배반은 완전히 직선 구조로 코일되지 않습니다. 튜브는 회전을 유지합니다 (그림 3H)3. 암풀 리전 다음후속 회전에 기초하여, 하나는 남은 튜브를 암풀-협합 및 isthmus3로 더 세분화할 수 있다. 암풀라 절제 후, 암풀리-isthmic 접합을 얻기 위해 5~6회전 사이를 잘라; 나머지 튜브(UTJ의 시작까지 6회전)는 isthmus3이다.
- 인펀드티불룸(fimbrial end 및 근위 줄기)을 절제한 후, 튜브의 두 번째 눈에 띄는 회전 후 절단하여 암풀 영역을 소비합니다(2번과 3번, 길이 약 1cm 사이 절단). 마지막으로, 나머지 부분을 ISthmic 영역인 UTJ로 잘라냅니다(그림 3H).
- RNA 절연을 위해 액체 질소에서 해부된 조직 세그먼트를 즉시 스냅하거나 지향적인 임베딩 및 면역 조직 분석을 위해 각 세그먼트를 수정하고 처리합니다.
- RNA 추출 시약200 μL과 1:1 균질화 비드 믹스( 재료 표 참조)를 RNA 추출을 진행하면 조직에 추가합니다(5.1단계 참조).
4. 오비덕트 해리
- 3.1.1 단계에서 계속) 상피의 최적의 해리를 위해, 슬릿은 가능한 한 영역(즉, fundibulum 및 ampulla)에서 난소를 열어 발광 상피(그림 4A)를 노출한다.
그림 4: Oviduct 세포 해리, 1부. 최적의 세포 해리(A)를 위해 해실 상피를 노출하는 방법과 1mm2 메쉬(B)를 가장 쉽게 사용하는 방법을 보여주는 이미지를 보여주는 만화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 피프브리알 지역에서 시작하여 집게를 레버리지로 사용하여 스프링 형태의 가위로 튜브를 세로로 슬릿합니다.
- 슬릿 열린 부분과 나머지 oviducts를 세그먼트(크기 1-2mm)로 다진 다음 5mL의 따뜻하고 비 효소 적 해리 버퍼( 재료 표 참조)를 추가하고 37°C에서 배양합니다.
- 조직 조각과 전구 피펫으로 3 분마다 9-10 분 동안 분리 된 세포를 다시 중단하십시오. 차가운 해부 배지로 해리 버퍼 1:1을 희석합니다.
- 원심분리(350xg, 3분, 4°C)로 세포를 수집한다. RBC 용해 버퍼2mL에서 세포를 실온에서 2분 동안 재연한 다음 냉부 배지로 1:1을 희석시 보입니다.
- 원심분리(350xg, 3분, 4°C)로 세포를 수집하고 5mL의 냉간 pronase 용액으로 재연한다.
- pronase 소화 매체에서 배양하고 단일 셀 현탁액이 달성 될 때까지 3-5 분마다 전구 파이펫으로 세포 덩어리를 다시 분리합니다 (~25-30 분).
참고: 이 단계는 pronase에 불필요한 과다 노출을 방지하는 일정한 관측을 허용하기 위하여 조직 배양 판 또는 플라스크에서 가장 잘 수행됩니다.
- pronase 소화 매체에서 배양하고 단일 셀 현탁액이 달성 될 때까지 3-5 분마다 전구 파이펫으로 세포 덩어리를 다시 분리합니다 (~25-30 분).
- 멸균 매크로 메시(고무 대역(그림 4B)가 있는 원적 튜브에 부착된 1mm x 1mm 메쉬)를 통해 세포를 통과하여 남은 비소 조직 조각을 제거합니다. 원심분리(350xg, 3분, 4°C)로 세포를 수집하고 다운스트림 분석에 적합한 냉기 에서 재보설(예: 유동 세포측정을 위한 염색을 진행하는 경우 FACS 버퍼).
5. oviductal 세그먼트의 RNA 추출
- 스테인레스 스틸 비드 믹스를 사용하여 4°C에서 2개의 간격(각 3분)에 대해 12레벨에 있는 비드 탄환 블렌더 조직 균질화에서 RNA 추출 시약의 200 μL에서 스냅 냉동 샘플을 균질화한다.
참고: RNA 무결성을 보존하기 위해 샘플은 스냅 냉동 상태에서 RNA 추출 시약으로 즉시 이동해야 하며 계량하지 않아야 합니다. - 상온에서 약 5초 동안 상온에서 약 5초 동안 탁상 원심분리기에서 100-200 x g 의 원심분리기 균등하게 하여 액체를 구슬과 분리합니다. 상체를 신선한 튜브로 옮기.
- 더 많은 샘플을 복구하기 위해 비드에 RNA 추출 시약의 또 다른 200 μL을 추가하고 원심 분리 (100-200 x g, 5 s, 실온)가 뒤따릅니다. 슈퍼네티츠를 결합합니다.
참고: 작은 파이펫 팁(대부분의 p200 팁이 적합)을 사용하여 상퍼를 제거할 때 비드 이월을 방지합니다. - 제조업체의 지침을 따라 분리 및 침전 RNA를 단계화하십시오. 대표적인 샘플은 -20°C에서 100% 이소프로판올(약 2:1 부피, 이소프로파놀: 수성상 회복)으로 하룻밤 사이에 침전되었다.
- 9,500 x g에서 30s에 대한 RNA 결합 스핀 컬럼 및 원심분리기로 용액과 함께 완전한 RNA 침전을 전달 한다. 제조업체의 지침에 따라 RNA 온컬럼을 정화한 다음 핵이 없는 물의 20 μL에서 RNA를 유동합니다. 마이크로 볼륨 분광광계 및/또는 생체 분석기의 품질/양을 평가합니다.
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Representative Results
설명된 해리 프로토콜은 두 oviducts의 풀링으로 마우스 당 100,000-120,000 세포를 산출합니다. 이 방법은 다중 모액 세포 테두리를 그대로 두고 다중 모액 세포와 분비 세포를 구별할 수 있게 하고 소화 방법이 탈분화를 방지할 만큼 충분히 부드럽다는 것을 확인할 수 있을 만큼 부드럽습니다. 도 5의 대표적인 면역불성 이미지는 4.2.1 단계 다음 의 작은 세포 덩어리를 나타내며, 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)/ DPBS에서 3 분 동안 고정되어 1 % 소 세럼 알부민 (BSA)/ 트리스 버퍼링 식염수 -tween (BTBST)로 세척및 정지에 얼룩이 있습니다. 간단히, 세포는 0.5% TritonX-100/BTBST에서 실온에서 15분 동안 투약되었고, BTBST에서 20m 글리신/DPBS에서 실온에서 2시간 동안 배경 형광을 위해 담금질한 다음, BTBST에서 세척한 다음, 5% BSAA/TBSTXXX의 실내 온도에서 1시간 동안 차단하였다. 세포는 BTBST에서 하룻밤 사이에 4°C에서 1차 항체에서 배양(마우스 항마우스 폐백(1:2000); 토끼 항마우스 아세틸레이션 튜룰린(1:1000))에서 배양한 후 BTBST에서 여러 개의 세차재를 하였다. 이차 항체는 BTBST에서 실온에서 1 시간 동안 추가되었습니다 (염소 안티 마우스 IgG 알렉사 플루어 555 (1:1000); 염소 안티 토끼 IgG 알렉사 플루어 488 (1:1000)), BTBST에서 여러 번 세척, DPBS에 한 번, 그리고 실온에서 20 분 동안 핵 얼룩에 배양 (1:2000, Hoescht 33342) DPBS에서 세척 다음. 세포는 안티페이드 장착 매체의 80 μL에서 재중단되었고 이미징 전에 어둠 속에서 하룻밤 동안 방치하였다(그림 5A). 도 5B는 해리 프로토콜의 끝에 있는 세포를 나타낸다. 생존 능력 평가는 프로토콜 전반에 걸쳐 이루어졌으며, 대표적인 이미지는 그림 5B-D에 표시됩니다. 프로피듐 요오드제를 1:100 희석에 첨가하였고, 세포는 반전된 화합물 형광 현미경(도 5C, 적색 얼룩)에서 즉시 관찰되었다. Cilia는 작은 세포 클러스터(그림 5A) 및 단일 세포 현탁액(그림 5E)에서 그대로 남아 있으며, 많은 세포가 여전히 치닝된 것으로 관찰되었다(Suppl. Video 1).
그림 5: Oviduct 세포 해리, 2부. 폐백 (빨강), 핵 (파란색), 및 아세틸레이션 튜룰린 (녹색)에 대한 양성 세포 클러스터의 형광 및 위상 대비 이미지. 섬광 형 테두리 (AI 및 AV의 녹색)는 프로토콜 전체에 걸쳐 그대로 유지되며 단일 세포 (E)에 대한 추가 소화를 견딜 수 있습니다. AI: 병합, AII: 레드 채널, AIII: 블루 채널, AIV: 위상 대비, AV: 녹색 채널. 짧은 pronase 인큐베이션 후, 세포의 대부분은 단일. 프로피듐 요오드 (PI) 염색은 약 93 %의 생존력을 보여줍니다. (B) 밝은 필드, (C) 적색 채널 PI 양성, (D) 병합. (E) 병합시 개시는 단일 해리 셀에 그대로 섬모테두리를 나타낸다. 이러한 세포는 적극적으로 섬모를 치고 있었다 ( 참조 Suppl. 비디오 1). 이미지는 반전 된 화합물 형광 현미경에 촬영되었다. 그림 AI-V 스케일 바 = 20 μm, B-D 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
설명된 RNA 절연 프로토콜은 세그먼트 RT-qPCR 및 RNAeq에 필요한 충분한 수율 및 순도를 제공합니다. 결과는 이 방법이 다운스트림 에세이에 적합한 수율에 필요할 수 있는 2개의 동물에게서 풀링이 필요할 수 있는 기금 식 견본을 제외하고 세그먼트 당 800-1200 ng RNA를 산출한다는 것을 보여줍니다 (그림 6A). Infundibulum에 대 한 제시 된 결과 두 동물에서 풀링, 총 4 가지 fundiular 지역 (그림 6). 이 프로토콜은 순수 RNA를 달성하는 데 성공하며, 처음에는 미세량 분광계에 의해 분석되고 생체 분석기(그림 6B, C)에 의해 더 많은 것을 분석합니다. 시료는 순수 RNA 뉴클레오티드 종의 전형적인 1.8 과 2.0 (도 6B) 사이의 260/280 nm 흡수비를 가지고 있다19. 흡수비(260/230 nm)는 1과 2.2 사이의 포함 기준을 가진 각 시료에 대해 취해졌으며, 이는 격리 시약으로부터의 제한된 오염을 나타내며(본선불은 도시되지 않은 데이터). 시료를 생체 분석하는 것은 RNA의 높은 무결성을 보였으며, 다운스트림 발현 및 시퀀싱 분석에 적합한 7개(도 6C) 이상의 평가된 RNA 무결성 수(RIN)를 보였다20.
그림 6: 세그먼트 RNA의 품질 평가. 전체 RNA는 마이크로볼륨 분광광계 및 생체 분석기별로 수율(A) 및 품질(B,C)을 평가하였다. RIN: RNA 무결성 번호, 바이오 분석기에 의해 평가. 바는 두 개의 별도 RNA 추출에서 세그먼트당 표준 편차(SD), N = 12개의 샘플에 ± 평균이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 1: 해리 된 세포에 치는 섬모의 라이브 세포 이미징. pronase 소화 다음 섬모를 이길. 비디오는 반전 된 화합물 현미경으로 촬영되었습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
oviduct의 세 세그먼트는 조직학적으로, 형태학적으로, 및 기능적으로 구별1,2,3이다. 상피는 oviduct의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝까지 크게 다릅니다. Ciliated 세포는 fimbrial/fundibular 끝에 지배, 분비 세포는 isthmic 지역에서 지배 하는 동안1. 이 전반적인 그라데이션은 한동안 인정되었지만, 최근 연구는 oviductal 세그먼트 중 더 많은 구별을 발견했습니다. 따라서, 모온 세포가 관의 근위쪽 끝으로 덜 빈번해지는 동안, 암풀라에서 암풀리-isthmic 접합3로 이동하는 그들의 수(약 60%에서 10% ciliation)의 급격한 하락이 있다3. 또한, 근위 및 탈산 세그먼트에서 상피 세포 집단은 발달적으로 구별되는 계보1,2,3에서 파생된다. 복부비부룸과 암풀라의 실상상세포는 상피 마커의 혈통 추적에 의해 나타난 바와 같이, isthmus에서 근접 상피 세포 집단에 기여하지 않는다. 배아 일 12.5 (E12.5)에서, 배반 상피 세포는 근위 상피 세포 마커, PAX22와 무관하게 뚜렷한 계보를 갖는다. 이러한 발견은 다양한 세그먼트 중 다양한 세포 인구 외에도 세그먼트를 독립적으로 조사 할 필요성을 더욱 강조합니다. 설명된 방법은 역사적으로 설명된 세 세그먼트(infundibulum, ampulla 및 isthmus)에 따라 단계별 해제 및 세그먼트 식별 프로토콜을 자세히 설명합니다. 최근 ampullary-isthmic 접합을 최종 oviduct 세그먼트로 설립했기 때문에, 고전적으로 설명된 세 영역의 식별 및 수집에 우선순위가 부여되었다. 그러나, 상기 전술한 바와 같이, 상기 와 같이 암풀리-isthmic 접합의 별도의 컬렉션을 포함하도록 방법을 확장할 수 있다3.
청색 염료와 인펀드티불룸의 위치를 사용하는 것은 빠르고 효율적인 방법으로 oviduct를 풀기 위한 중요한 단계입니다. 파란색 염료는 튜브의 오스티움과 코일을 강조하여 더 빠르고 효율적인 코일링 및 수집을 가능하게 합니다. 타륨 오리엔트의 초기 위치는 코일링을 통해 배반의 탈구 (fundibular) 및 근위 (isthmic) 영역에 하나를 지향한다. 또한, 코일 을 풀기 동안 해부 플랫폼에 부착 된 근위 자궁 뿔 부분을 유지하면 외과 의사는 섬세한 해부 단계에 양손을 사용할 수 있습니다. 코일 난간의 초기 제거 및 튜브를 움직이지 않거나 염료를 사용하지 않고이 구조를 풀려고 시도하면 튜브의 탈구 및 근위 말단 또는 튜브의 파손에 대한 혼란으로 쉽게 이어질 수 있습니다. 튜브 파손은 간단하므로 파손으로 인해 재현 가능한 세분화를 달성할 수 없기 때문에 코일링을 해제할 때주의를 기울여야 합니다. 고품질의 스프링 폼 마이크로 가위 사용은 최상의 결과를 얻는 데 매우 좋습니다.
oviduct의 다양 한 세그먼트에서 유전자 발현 서명을 평가, 예를 들어, estrous 주기 동안 및 관리 된 호르몬및 사이토카인에 대 한 응답, 가장 가능성이 이러한 자극에 대 한 응답에 oviduct 변경 하는 방법의 훨씬 더 나은 이해를 생산할 것 이다. 이러한 데이터는 또한 어떤 요인이 상피 변환에 기여하는지에 대한 빛을 비출 수 있습니다. 본 원에 있는 RNA 추출 프로토콜은 제한된 크기와 탄력적인 관 구조의 이 조직에 대해 가능한 최고 양과 품질을 얻기 위해 개발되었다. 설명된 균질화, RNA 침수, 및 페놀의 결합 사용: 클로로폼 및 온컬럼 정제 방법은 다운스트림 분석을 위한 RNA의 적절한 품질 과 양을 달성하는 데 가장 효율적인 것으로 나타났다. oviductal 세그먼트는 RNA 분해로 이끌어 내는 조직의 온난화를 방지하기 위하여 조직 균질화를 위해 즉시 처리되지 않았고 전체 세그먼트는 조직 균질화를 위해 즉시 처리되었습니다. 또한, 작은 관 세그먼트는 다중 균질화 단계가 필요하기 때문에, 균질화가 샘플 무결성을 유지하기 위해 4 °C에서 수행되도록하는 것이 중요합니다. 이 방법은 다운스트림 분석을 위한 적당한 수율을 생성하기에 충분하기 때문에, 이 기술의 미래 응용은 이전에 보고되지 않은 세그먼트 RNAeq를 능력을 발휘하는 것이고, 이는 oviduct 생리학의 우리의 이해에 크게 기여할 것입니다.
세포 해리 프로토콜의 개발 하는 동안, 우리는 강력한 및/또는 긴 효소 소화 섬모의 입증 가능한 손실을 발생 발견. 따라서 우리는 세포 형태를 보존하는 방법의 개발에 집중하고 달성했습니다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 단하나 세포 수율의 개선은 유동 세포측정에 의한 상이한 상피 및 기질 세포 유형의 보다 강력하고 즉각적인 멀티플렉스 분석을 가능하게 할 것이다. pronase에서 짧은 배양 뒤에 비 효소 해리 프로토콜의 사용은 또한 긴 또는 강력한 소화 방법을 활용 하는 해리 방법을 통해 세포 표면 항원보존을 향상 시킬 가능성이 2,18. 단일 세포 염기서열 분석은 멀티플렉스 유동 세포측정패널2,21에 비해 훨씬 적은 세포를 필요로 한다. 따라서 배반의 세 가지 설명된 세그먼트의 단일 세포 시퀀싱은 기재된 프로토콜을 통해 가능할 수 있다.
배강은 전체 길이에 따라 포동할 수 없기 때문에, 현재 방법의 잠재적 한계는 더 좁은 isthmus의 상피를 형성하는 세포가 해리 시약에 대한 노출을 감소시킬 수 있고, 따라서 , 생체 내와 동일한 비율로 최종 현탁액에 존재하지 않을 수 있다는 것입니다.
oviduct의 코일로 인해, 모든 oviductal 세그먼트의 면역 조직 화학 적 분석을위한 방향은 도전적 일 수있다3. 그러나, 상기 기재된 세그먼트 해부는 배강 세그먼트의 지향적 포함에 선행되어 전체 그대로 코일 튜브를 통해 직렬적으로 절개하지 않고도 보다 포괄적인 종방향 및 단면 이미지 분석을 가능하게 한다. 또한, 파랑 염료는 코일링을 풀기 위해 활용되고, 작은 관 세그먼트를 임베딩하는 동안 올바른 방향으로 보조한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425)에 대한 DoD 획기적인 상에 의해 부분적으로 지원되었다. KCR은 교내 펠로우십에 의해 부분적으로 지원되었다: Pease 암 전 박사 과정 펠로우십과 메리 갈빈 부담 생물 의학 과학 및 캘리포니아 대학, 리버 사이드, 교내 상에서 박사 전 펠로우십: 대학원 위원회 펠러십 위원회 논문 연구 보조금 및 대학원 부문 논문 연도 프로그램 상. 저자는 길리안 M. 라이트와 알리사 M. 쿠마리에게 이 방법의 초기 문제 해결에 도움을 준 것에 대해 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB05 | Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized |
| 1.4 mm Stainless steel bead mix | Next Advance | SSB14B | Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized |
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS) | Gibco | 21600-010 | Cold, sterile |
| 25G needle | BD | 305122 | |
| 60 mm sterile petri dishes | Corning | 430166 | |
| 70 μm cell meshes | Fisherbrand | 22-636-548 | |
| Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit | Agilent 2100 Bioanalyzer | 5067-1513 | |
| Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | BBY24M | |
| Bioanlyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer | ||
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Cold plate/pack/surface of choice | N/A | N/A | Kept at -20 °C for dissection |
| Dental wax | Polysciences Inc. | 403 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12 | Corning | 10-090-CV | Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-015CV | |
| Fine point forceps of choice | N/A | N/A | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G712b | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21422 | Immunocytochemical validation images |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Immunocytochemical validation images |
| Hepes | Sigma Aldrich | H-3784 | |
| Hoescht 33342 | Cell Signaling Technologies | 4082S | Immunocytochemical validation images |
| Inverted compound microscope | Keyence BZ-X700 | ||
| Mouse anti-mouse Occludin | Invitrogen | 33-1500 | Immunocytochemical validation images |
| Non-enzymatic dissociation buffer | N/A | 5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS | |
| Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm | Thomas Scientific | 1210U04 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P-6148 | Immunocytochemical validation images |
| Pen-Strep | MP Biomedicals | 10220-718 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technologies | 9071S | Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium |
| Pronase | Sigma Aldrich | 10165921001 | Prepare pronase digestion medium: 0.15% pronase in DMEM/Ham's F12, sterile |
| Propidium Iodide | Roche | 11 348 639 001 | Viability validation images |
| Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin | Abcam | ab179484 | Immunocytochemical validation images |
| RBC lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | Utilized for on-column purification in text |
| Spring form microdissection scissors | Roboz Surgical | RS-5610 | |
| Sterile 3 mL bulb pipettors | Globe Scientific | 137135 | |
| Toluidine blue | Alfa Aesar | J66015 | Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile |
| Tris-Buffered Saline-Tween (TBST) | N/A | N/A | Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20 |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Inc. | 3555 | Immunocytochemical validation images |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Invitrogen | 15596026 | Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines |
References
- Stewart, C. A., et al. Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. Kubiak, J. Z., et al. , Springer. Berlin Heidelberg. 247-262 (2012).
- Ford, M. J., et al. Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis. Cell Reports. 36 (10), 109677 (2021).
- Harwalkar, K., et al. Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development. Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).
- Agduhr, E. Studies on the structure and development of the bursa ovarica and the tuba uterina in the mouse. Acta Zoologica. 8 (1), 1 (1927).
- Pulkkinen, M. O. Oviductal function is critical for very early human life. Annals of Medicine. 27 (3), 307-310 (1995).
- Kindelberger, D. W., et al. Intraepithelial carcinoma of the fimbria and pelvic serous carcinoma: Evidence for a causal relationship. American Journal of Surgical Pathology. 31 (2), 161-169 (2007).
- Ghosh, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. In vivo genetic cell lineage tracing reveals that oviductal secretory cells self-renew and give rise to ciliated cells. Development. 144 (17), 3031-3041 (2017).
- Lee, Y., et al. A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube. Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).
- Kim, J., et al. High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3921-3926 (2012).
- Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).
- Sherman-Baust, C. A., et al. A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development. Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).
- Zhai, Y. L., et al. High-grade serous carcinomas arise in the mouse oviduct via defects linked to the human disease. Journal of Pathology. 243 (1), 16-25 (2017).
- Karthikeyan, S., et al. Prolactin signaling drives tumorigenesis in human high grade serous ovarian cancer cells and in a spontaneous fallopian tube derived model. Cancer Letters. 433, 221-231 (2018).
- Shao, R., et al. Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: Evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice. Biology of Reproduction. 79 (4), 748-757 (2008).
- Alwosaibai, K., et al. PAX2 maintains the differentiation of mouse oviductal epithelium and inhibits the transition to a stem cell-like state. Oncotarget. 8 (44), 76881-76897 (2017).
- Peri, L. E., et al. A novel class of interstitial cells in the mouse and monkey female reproductive tracts. Biology of Reproduction. 92 (4), 102 (2015).
- Lõhmussaar, K., et al. Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids. Nature Communications. 11 (1), 2660 (2020).
- Chen, S., et al. An air-liquid interphase approach for modeling the early embryo-maternal contact zone. Scientific Reports. 7, 42298 (2017).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2565 (2010).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- McGlade, E. A., et al. Cell-type specific analysis of physiological action of estrogen in mouse oviducts. The FASEB Journal. 35 (5), 21563 (2021).
