Microdissezione e dissociazione dell'ovidotto murino: identificazione del segmento individuale e isolamento di singole cellule

Kelly C. Radecki; Mary Y. Lorenson; David G. Carter; Ameae M. Walker

doi:10.3791/63168

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Articolo metodologico

Microdissezione e dissociazione dell'ovidotto murino: identificazione del segmento individuale e isolamento di singole cellule

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DOI:

10.3791/63168

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4 novembre 2021

Kelly C. Radecki¹ , Mary Y. Lorenson¹ , David G. Carter² , Ameae M. Walker¹

¹Division of Biomedical Sciences, School of Medicine, University of California, Riverside, ²Microscopy and Imaging Core Facility, University of California, Riverside

In questo articolo

Sommario

Viene presentato un metodo per la microdissezione dell'ovidotto di topo che consente la raccolta dei singoli segmenti mantenendo l'integrità dell'RNA. Inoltre, viene descritta la procedura di dissociazione delle cellule oviduttali non enzimatiche. I metodi sono appropriati per la successiva analisi genica e proteica dei segmenti oviduttali funzionalmente diversi e delle cellule oviduttali dissociate.

Abstract

I sistemi di modelli murini non hanno eguali per l'analisi dei processi patologici a causa della loro manipolabilità genetica e del basso costo dei trattamenti sperimentali. Tuttavia, a causa delle loro piccole dimensioni corporee, alcune strutture, come l'ovidotto con un diametro di 200-400 μm, si sono dimostrate relativamente difficili da studiare se non con l'immunoistochimica. Recentemente, studi immunoistochimici hanno scoperto differenze più complesse nei segmenti dell'ovidotto di quanto precedentemente riconosciuto; quindi, l'ovidotto è diviso in quattro segmenti funzionali con rapporti diversi di sette distinti tipi di cellule epiteliali. Le diverse origini embriologiche e i rapporti dei tipi di cellule epiteliali probabilmente rendono le quattro regioni funzionali differenzialmente suscettibili alle malattie. Ad esempio, le lesioni precursori dei carcinomi intraepiteliali sierosi derivano dall'infundibulum nei modelli murini e dalla corrispondente regione fimbriale nella tuba di Falloppio umana. Il protocollo qui descritto descrive un metodo per la microdissezione per suddividere l'ovidotto in modo tale da produrre una quantità e una purezza sufficienti di RNA necessarie per l'analisi a valle come la PCR quantitativa a trascrizione inversa (RT-qPCR) e il sequenziamento dell'RNA (RNAseq). Viene inoltre descritto un metodo di dissociazione tissutale per lo più non enzimatico appropriato per la citometria a flusso o l'analisi RNAseq a singola cellula di cellule oviduttali completamente differenziate. I metodi descritti faciliteranno ulteriori ricerche utilizzando l'ovidotto murino nel campo della riproduzione, della fertilità, del cancro e dell'immunologia.

Introduzione

L'ovidotto murino è simile per funzione e morfologia alla tuba di Falloppio ^umana1. Entrambi sono costituiti da un epitelio ciliato pseudostratificato, costituito da due cellule residenti epiteliali storicamente descritte: cellule ciliate e cellule ^{secretorie1,2}. L'ovidotto ha tre segmenti classicamente riconosciuti: l'infundibulum, l'ampolla e l'istmo. In un recente studio, Harwalkar et al. ³ hanno studiato la morfologia dell'ovidotto e l'espressione genica che ha portato all'espansione della categorizzazione delle cellule epiteliali residenti a sette p....