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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

माइक्रोडिसेक्शन और म्यूरीन ओविडक्ट का पृथक्करण: व्यक्तिगत खंड पहचान और एकल सेल अलगाव

Published: November 4, 2021 doi: 10.3791/63168
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Division of Biomedical Sciences, School of Medicine, University of California, Riverside, 2Microscopy and Imaging Core Facility, University of California, Riverside

Summary

माउस ओविडक्ट के माइक्रोडिसेक्शन के लिए एक विधि जो आरएनए अखंडता को बनाए रखते हुए व्यक्तिगत खंडों के संग्रह की अनुमति देती है, प्रस्तुत की जाती है। इसके अलावा, गैर-एंजाइमेटिक ओविडक्टल सेल पृथक्करण प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। विधियाँ कार्यात्मक रूप से अलग-अलग ओविडक्टल खंडों और विघटित ओविडक्टल कोशिकाओं के बाद के जीन और प्रोटीन विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं।

Abstract

माउस मॉडल सिस्टम रोग प्रक्रियाओं के विश्लेषण के लिए बेजोड़ हैं क्योंकि उनकी आनुवंशिक मैनिपुलेबिलिटी और प्रयोगात्मक उपचार की कम लागत है। हालांकि, उनके छोटे शरीर के आकार के कारण, कुछ संरचनाएं, जैसे कि 200-400 μm के व्यास के साथ ओविडक्ट, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री को छोड़कर अध्ययन करने के लिए अपेक्षाकृत कठिन साबित हुई हैं। हाल ही में, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अध्ययनों ने पहले से मान्यता प्राप्त की तुलना में ओविडक्ट सेगमेंट में अधिक जटिल अंतरों को उजागर किया है; इस प्रकार, ओविडक्ट को सात अलग-अलग उपकला सेल प्रकारों के विभिन्न अनुपातों के साथ चार कार्यात्मक खंडों में विभाजित किया गया है। उपकला सेल प्रकारों के विभिन्न भ्रूणीय मूल और अनुपात संभवतः चार कार्यात्मक क्षेत्रों को बीमारी के लिए अलग-अलग अतिसंवेदनशील बनाते हैं। उदाहरण के लिए, सीरस इंट्राएपिथेलियल कार्सिनोमा के अग्रदूत घाव माउस मॉडल में इनफंडिबुलम से और मानव फैलोपियन ट्यूब में संबंधित फिम्ब्रियल क्षेत्र से उत्पन्न होते हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल में डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए आवश्यक आरएनए की पर्याप्त मात्रा और शुद्धता जैसे रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-मात्रात्मक पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर) और आरएनए अनुक्रमण (आरएनएसेक) के लिए आवश्यक आरएनए की पर्याप्त मात्रा और शुद्धता उत्पन्न करने के लिए ओवीडक्ट को उप-विभाजित करने के लिए माइक्रोडिसेक्शन के लिए एक विधि का विवरण दिया गया है। इसके अलावा वर्णित एक ज्यादातर गैर एंजाइमेटिक ऊतक पृथक्करण विधि प्रवाह cytometry या पूरी तरह से विभेदित oviductal कोशिकाओं के एकल सेल RNAseq विश्लेषण के लिए उपयुक्त है। वर्णित तरीके प्रजनन, प्रजनन क्षमता, कैंसर और इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में मुरीन ओविडक्ट का उपयोग करके आगे के शोध की सुविधा प्रदान करेंगे।

Introduction

मुरीन ओविडक्ट मानव फैलोपियन ट्यूब 1 के लिए कार्य और आकृति विज्ञान में समान है। दोनों में एक छद्म स्तरीकृत सिलिएटेड उपकला होती है, जिसमें दो ऐतिहासिक रूप से वर्णित उपकला निवासी कोशिकाएं होती हैं: सिलिएटेड कोशिकाएं और स्रावी कोशिकाएं 1,2। ओविडक्ट में तीन शास्त्रीय रूप से मान्यता प्राप्त खंड हैं: इनफंडिबुलम, एम्पुला और इस्थमस। हाल के एक अध्ययन में, हरवलकर एट अल। 3 ने ओविडक्ट आकृति विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति की जांच की, जिससे सात अलग-अलग आबादी के लिए निवासी उपकला कोशिकाओं के वर्गीकरण का विस्तार हुआ। इसके अलावा, उन्होंने एम्पुलेरी-इस्थमस जंक्शन को ओविडक्ट 3 के एक अलग खंड के रूप में स्थापित किया। यहां वर्णित विधि, जो इनफंडिबुलम, एम्पुला और इस्थमस पर केंद्रित है, को आसानी से एम्पुलरी-इस्थमिक जंक्शन के साथ-साथ 2,3 को शामिल करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। इनफंडिबुलर क्षेत्र में ऑस्टियम, या ओविडक्ट का उद्घाटन होता है, और इसमें फिम्ब्रियल क्षेत्र के साथ-साथ समीपस्थ डंठल भी शामिल होता है। गर्भाशय की ओर बढ़ते हुए, अगला एम्पुला है, और फिर इस्थमस। सिलिटेड कोशिकाएं क्षेत्र के डिस्टल छोर में सबसे प्रमुख होती हैं, अंडाशय के समीपस्थ, या इनफंडिबुलम के लिए, जबकि स्रावी कोशिकाएं समीपस्थ अंत या इस्थमस सेगमेंट 1 में सबसे प्रमुख होती हैं। मानव फैलोपियन ट्यूब के विपरीत, मुरीन ओविडक्ट मेसोसाल्पिंक्स द्वारा समर्थित एक कुंडलित संरचना है, जो व्यापक स्नायुबंधन पेरिटोनियम 1,4 का विस्तार है। इसके अलावा, माउस ओविडक्ट को एक बर्सल थैली में संलग्न किया जाता है जो ओविडक्ट 4 में ओसाइट स्थानांतरण की संभावना को बढ़ाता है। एम्पुला को निषेचन के स्थान के रूप में पहचाना जाता है, जिसमें से विकासशील भ्रूण गर्भाशय 5 में प्रवेश करने से पहले इस्थमस में गुजरते हैं। ट्यूबल खंड व्यास में 200-400 μm हैं और लंबे ampullary और इस्थमस क्षेत्रों की लंबाई लगभग 0.5-1.0 सेमी है। ओविडक्ट एस्ट्रोस चक्र के दौरान विघटित होता है और एम्पुला और इनफंडिबुलम इस्थमस 1 की तुलना में अधिक डिस्टेनेबल होते हैं।

कोशिकाओं के प्रसार पर, विशेष रूप से स्रावी कोशिकाएं, श्रोणि गुहा 6 में पाए जाने वाले सीरस ट्यूमर के अग्रदूत घावों की विशेषता है। ये अग्रदूत सीरस इंट्राएपिथेलियल घाव ओविडक्ट एपिथेलियम में पूरी तरह से फिम्ब्रियल क्षेत्र में उत्पन्न होते हैं; यह अज्ञात है कि घाव का गठन इस क्षेत्र तक सीमित क्यों है जहां आमतौर पर प्रमुख सेल प्रकार सिलिएट होता है, न कि स्रावी 2,7,8। सामान्य शारीरिक कार्य के संदर्भ में क्षेत्रीयता, साथ ही डिम्बग्रंथि के कैंसर 9,10,11,12,13 के ओविडक्टल मूल में बढ़ी हुई रुचि, ओविडक्ट खंडों के अलग-अलग मूल्यांकन के महत्व को रेखांकित करती है।

यहां वर्णित विधि खंड-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति और विघटित कोशिकाओं के कार्य के बाद के डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए अलग-अलग ओविडक्टल खंडों के संग्रह का विवरण देती है। परंपरागत रूप से, कई ऊतकों को या तो फिनोल के बाद पूरे आरएनए निष्कर्षण के लिए संसाधित किया जाता है: क्लोरोफॉर्म विधि या एक ऑन-कॉलम पूर्ण निष्कर्षण विधि; हालांकि, हमने पाया कि वर्णित संयोजन विधि के साथ पर्याप्त उपज का उत्पादन करते समय आरएनए गुणवत्ता को बनाए रखा गया था। इस विधि का उपयोग करते हुए, ओवीडक्ट के बहुत छोटे कार्यात्मक खंडों को पूरे के रूप में ओविडक्ट की जांच करने के बजाय डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए संसाधित किया जा सकता है, जो विभिन्न खंडों के परिणामों के प्रतिनिधि को मुखौटा कर सकता है।

विघटित मुरीन ओविडक्टल कोशिकाओं को शायद ही कभी प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा जांच की गई है, सबसे अधिक संभावना इस ऊतक से सीमित सेल उपज के कारण। इस समस्या को दूर करने के लिए एक दृष्टिकोण कोशिकाओं को अलग करना, उन्हें संस्कृति में विकसित करना, और फिर डाउनस्ट्रीम सेल विश्लेषण 15,16,17,18 के लिए उपयुक्त सेल नंबर प्राप्त करने के लिए विट्रो में पुन: भेदभाव को प्रोत्साहित करना है। इस दृष्टिकोण की एक सीमा वह समय है जब पूर्व विवो और संस्कृति में माइक्रोएन्वायरमेंट को बदल दिया गया है, जिनमें से दोनों जीन अभिव्यक्ति को बदलने की संभावना रखते हैं। एक धारणा यह भी है कि रूपात्मक पुन: विभेदन में एक ही ट्रांसक्रिप्शनल और प्रोटिओमिक हस्ताक्षर होता है जो बरकरार जानवर में मौजूद था। वर्तमान पृथक्करण विधि को एकल सेल भेदभाव को बनाए रखते हुए एक विषमजनित ओवीडक्टल सेल आबादी में उपकला कोशिकाओं की उच्चतम संख्या को प्राप्त करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। इसके अलावा, ज्यादातर गैर-एंजाइमेटिक दृष्टिकोण संभवतः सेल सतह प्रोटीन के नुकसान को सीमित करता है।

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Protocol

सभी पशु हैंडलिंग और प्रक्रियाओं को कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, रिवरसाइड संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और अमेरिकन एसोसिएशन फॉर लेबोरेटरी एनिमल केयर, संयुक्त राज्य अमेरिका के कृषि विभाग और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के दिशानिर्देशों के अनुसार थे। वर्णित विधि ने C57BL/6 वयस्क, मादा चूहों का उपयोग किया। ऊतक कटाई से पहले सभी जानवरों को विच्छेदन द्वारा euthanized किया गया था।

नोट: प्रोटोकॉल का एक सिंहावलोकन, जो कुशल विच्छेदन में सहायता करने के लिए एक नीले रंग की डाई का उपयोग करता है और oviduct के uncoiling, पहले चित्र (चित्रा 1) में दिखाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: microdissection विधि का अवलोकन। (ए) बाएं पैनल बरकरार संरचना को दर्शाता है जिसमें से अधिकांश डिम्बग्रंथि वसा पैड और ओविडक्ट के आसपास संयोजी ऊतक के अवशेषों को हटा दिया गया है। इसके बाद, टोलुइडीन ब्लू के अलावा ओविडक्ट (मध्य पैनल) के कॉइल को अलग करने में मदद करता है। दायां पैनल अंडाशय को हटाने के बाद संरचनाओं को दिखाता है। (बी) यह निर्धारित करने के लिए आंतरिक मोड़ के साथ एक अनकोइल्ड ओविडक्ट जहां प्रत्येक खंड शुरू होता है और समाप्त होता है। (सी) उपयोग किए गए विभाजन का कार्टून (पैमाने पर तैयार नहीं)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

1. विच्छेदन सतह की तैयारी

  1. चिपकने वाला के साथ एक पेट्री डिश के लिए दंत मोम का एक टुकड़ा चिपकाएं और इसे सूखने दें (चित्रा 2 ए)। डिश को 70% इथेनॉल के साथ सैनिटाइज करें। सतह विच्छेदन के लिए तैयार है।

2. अंडाशय, oviduct, और गर्भाशय के macrodissection

  1. विच्छेदन के लिए तैयार होने पर विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत पसंद के ठंडे मंच पर दंत मोम वाले पेट्री डिश को स्थिर करें (उदाहरण के लिए, उपयोग से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया एक आइस पैक)।
  2. 70% इथेनॉल के साथ जानवर की वेंट्रल सतह को कीटाणुरहित करें। बाँझ विच्छेदन कैंची के साथ पेट और श्रोणि गुहा खोलें और पृष्ठीय बिहोर्नल गर्भाशय का पता लगाने के लिए जठरांत्र संबंधी मार्ग को एक तरफ ले जाएं। गर्भाशय वसा पैड में लिपटे प्रत्येक अंडाशय और अंडाशय का पता लगाने के लिए प्रत्येक गर्भाशय सींग rostrally का पालन करें, गुर्दे के ठीक नीचे पाया जाता है (चित्रा 2 बी, सी)।
  3. अंडाशय और डिस्टल गर्भाशय सींग के एक हिस्से के साथ दोनों पार्श्व oviducts उत्पाद शुल्क अभी भी विच्छेदन कैंची का उपयोग कर संलग्न. सींग के लगभग 1-2 सेमी के साथ प्रत्येक पार्श्व गर्भाशय सींग को काटें जो अभी भी कुंडलित ओविडक्ट और अंडाशय (चित्रा 2 डी) से जुड़ा हुआ है। ऊतक को ठंडे विच्छेदन माध्यम के 2 मिलीलीटर में तुरंत डुबोएं ( सामग्री की तालिका देखें)।

Figure 2
चित्रा 2: अंडाशय और विच्छेदन सेटअप के macrodissection. ओविडक्ट डिम्बग्रंथि वसा पैड (बी) के भीतर गुर्दे के आधार पर श्रोणि गुहा में पृष्ठीय रूप से स्थित है। श्रोणि गुहा (सी) में गर्भाशय विभाजन का पता लगाएं और गर्भाशय-ओविडक्ट-अंडाशय निरंतरता (बी) का पता लगाने के लिए पार्श्व गर्भाशय सींग का पालन करें। एक गर्भाशय सींग और मोटे विच्छेदन के माध्यम से काटने से इन संरचनाओं को हटा दें। विच्छेदन मंच (ए) पर रखें और एक सुई (ए और डी) के साथ दंत मोम के लिए गर्भाशय के हिस्से को चिपकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नोट: पर्याप्त गर्भाशय सींग बरकरार छोड़ दें और विच्छेदन मंच (चित्रा 2 डी) को चिपकाने की अनुमति देने के लिए ओविडक्ट से जुड़ा हुआ है।

  1. विच्छेदन के लिए ऊतक को सुरक्षित करने के लिए एक बाँझ 25 जी सुई के साथ दंत मोम के लिए गर्भाशय के ऊतक को चिपकाएं (चित्रा 2 ए, डी, और चित्रा 3 ए)। विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत काम करना, डिम्बग्रंथि वसा पैड और संयोजी ऊतक को साफ और विच्छेदन करने के लिए ओविडक्ट (चित्रा 3 बी) के स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देने के लिए।

Figure 3
चित्रा 3: कदम से कदम oviduct microdissection. अवशेष वसा और संयोजी ऊतक (ए, बी) को हटाने के बाद, ऊतक (सी) में टोलुइडिन ब्लू जोड़ें, और फिर दृश्य की सुविधा के लिए धोएं और बाद में अंडाशय को हटाने और ट्यूब (डी-एच) के अनकोइलिंग को हटाने के लिए धोएं। इनफंडिबुलम समीपस्थ इस्थमस और गर्भाशय-ट्यूबल जंक्शन (यूटीजे) के बगल में पाया जा सकता है। हल्के से दूरस्थ अंत खींचते समय mesosalpinx पर काटने के लिए uncoil और oviduct (एच) के अंतर्जात बदल जाता है उचित विभाजन के लिए उन्मुख करने के लिए प्रकट करते हैं। चित्र A-C स्केल बार = 500 μm, D-H स्केल बार = 400 μm (I) विभिन्न खंडों का कार्टून (स्केल करने के लिए तैयार नहीं)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. एक 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करते हुए, 30 एस -1 मिनट के लिए बाँझ 1% टोल्यूइडिन ब्लू डाई समाधान की 1-2 बूंदों में गर्भाशय से चिपके हुए ओवीडक्ट को वितरित और इनक्यूबेट करें। ठंडे Dulbecco के फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (DPBS) के साथ कुल्ला और सभी तरल (चित्रा 3 C) को हटा दें।
  2. हल्के से कुंडलित oviduct से अंडाशय खींचें और bursal झिल्ली और व्यापक स्नायुबंधन पर दूर कटौती करने के लिए ट्यूबल ऊतक (चित्रा 3 डी, ई) से समझौता किए बिना अंडाशय को अंडाशय को ओविडक्ट से हटाने के लिए।
    नोट: अंडाशय oviduct से जुड़ा नहीं है, लेकिन oviduct (चित्रा 2 डी) के साथ bursal झिल्ली में encased और व्यापक स्नायुबंधन के माध्यम से गर्भाशय के पार्श्व पक्ष से जुड़ा हुआ है।

3. Microdissection और oviduct के विभाजन

  1. गर्भाशय-ट्यूबल जंक्शन (यूटीजे) के पार्श्व में पाए जाने वाले ओविडक्ट के डिस्टल, फिम्ब्रियल छोर का पता लगाएं। Oviduct coils अपने आप पर वापस; इसलिए fimbrial अंत समीपस्थ अंत के पार्श्व में स्थित किया जा सकता है और oviduct (चित्रा 3F, I) के uncoiling के लिए उन्मुख करने के लिए एक उपयुक्त प्रारंभिक बिंदु है।
    1. ट्यूब को धीरे से खींचते समय, मेसोसाल्पिंक्स (चित्रा 3I) पर स्प्रिंग-फॉर्म माइक्रो-कैंची के साथ काट लें ताकि ओवीडक्ट (चित्रा 3 जी) को अनकॉइल किया जा सके।
  2. एक बार अनकॉइल होने के बाद, इनफंडिबुलर, एम्पुलररी और इस्थमिक क्षेत्रों (चित्रा 3 एच) का उत्पादन करने के लिए ट्यूब को काट लें।
    1. infundibulum (fimbrial अंत और समीपस्थ डंठल) के उच्छेदन के बाद, ट्यूब के दूसरे प्रमुख मोड़ के बाद काटने के द्वारा ampullary क्षेत्र उत्पाद शुल्क (दो और तीन बदल जाता है, लंबाई में लगभग 1 सेमी के बीच कटौती)। अंत में, शेष भाग को यूटीजे में काटें, जो इस्थमिक क्षेत्र (चित्रा 3 एच) है।
      नोट: oviduct पूरी तरह से एक सीधी संरचना में uncoil नहीं होगा। ट्यूब अपने मोड़ (चित्रा 3H)3 बनाए रखेगा। ampullary क्षेत्र के बाद के मोड़ के आधार पर, एक और ampullary-isthmic जंक्शन और isthmus3 में शेष ट्यूब खंड कर सकते हैं. ampulla उच्छेदन के बाद, ampullary-isthmic जंक्शन प्राप्त करने के लिए पांच और छह बारी के बीच कटौती; शेष ट्यूब (UTJ की शुरुआत के लिए छह बारी) isthmus3 है.
  3. तुरंत आरएनए अलगाव के लिए तरल नाइट्रोजन में विच्छेदित ऊतक खंडों को फ्रीज करें या उन्मुख एम्बेडिंग और इम्यूनोहिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए प्रत्येक खंड को ठीक करें और संसाधित करें।
    1. आरएनए निष्कर्षण के लिए आगे बढ़ने पर ऊतक में ठंडे आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक और 1: 1 समरूपता मनका मिश्रण ( सामग्री की तालिका देखें) के 200 μL जोड़ें (चरण 5.1 देखें)।

4. Oviduct पृथक्करण

  1. ऊपर दिए गए चरण 3.1.1 से जारी) उपकला के इष्टतम पृथक्करण के लिए, स्लिट ल्यूमिनल एपिथेलियम (चित्रा 4 ए) को उजागर करने के लिए उन क्षेत्रों में ओविडक्ट खोलें जहां संभव हो (यानी, इनफंडिबुलम और एम्पुला)।

Figure 4
चित्रा 4: Oviduct सेल पृथक्करण, भाग 1. कार्टून दिखा रहा है कि इष्टतम सेल पृथक्करण (ए) के लिए डिस्टल एपिथेलियम को कैसे उजागर किया जाए और एक छवि जो 1 मिमी 2 मेष (बी) का उपयोग करने का सबसे आसान तरीका दिखाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. Fimbrial क्षेत्र में शुरू, उत्तोलन के रूप में संदंश का उपयोग करते हुए, वसंत-रूप कैंची के साथ अनुदैर्ध्य रूप से ट्यूब को भट्ठा।
  1. भट्ठा-खुले भागों और शेष oviduct को खंडों (~ 1-2 मिमी आकार में) में कीमा बनाते हैं और गर्म, गैर-एंजाइमेटिक पृथक्करण बफर के 5 एमएल जोड़ते हैं ( सामग्री की तालिका देखें) और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    1. 9-10 मिनट के लिए हर 3 मिनट में एक बल्ब पिपेटर के साथ ऊतक के टुकड़ों और विघटित कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। ठंड विच्छेदन माध्यम के साथ पृथक्करण बफर 1: 1 को पतला करें।
  2. centrifugation (350 x g, 3 मिनट, 4 °C) द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें। कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए आरबीसी लाइसिस बफर के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और फिर ठंडे विच्छेदन माध्यम के साथ 1: 1 पतला करें।
  3. centrifugation (350 x g, 3 मिनट, 4 °C) द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें और 5 मिलीलीटर ठंडे प्रोनेस समाधान में पुन: निलंबित करें।
    1. प्रोनेस पाचन माध्यम में इनक्यूबेट करें और हर 3-5 मिनट में एक बल्ब पिपेटर के साथ सेल clumps को फिर से निलंबित करें जब तक कि एक एकल सेल निलंबन प्राप्त नहीं किया जाता है (~ 25-30 मिनट)।
      नोट: यह चरण एक ऊतक संस्कृति प्लेट या फ्लास्क में सबसे अच्छा प्रदर्शन किया जाता है ताकि प्रोनेस के लिए अनावश्यक ओवरएक्सपोजर को रोकने के लिए निरंतर अवलोकन को रोका जा सके।
  4. किसी भी शेष अविच्छिन्न ऊतक टुकड़ों को हटाने के लिए एक बाँझ मैक्रो-जाल (1 मिमी x 1 मिमी जाल) एक रबर बैंड (चित्रा 4 बी)) के साथ एक शंक्वाकार ट्यूब से चिपके हुए) के माध्यम से कोशिकाओं को पास करें। सेंट्रीफ्यूजेशन (350 x g, 3 मिनट, 4 °C) द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें और उन्हें डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए उपयुक्त ठंडे माध्यम में फिर से निलंबित करें (उदाहरण के लिए, FACS बफर यदि प्रवाह साइटोमेट्री के लिए धुंधला के साथ आगे बढ़ रहा है)।

5. Oviductal खंडों के आरएनए निष्कर्षण

  1. आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक के 200 μL में दो अंतराल (3 मिनट प्रत्येक) के लिए दो अंतराल (3 मिनट प्रत्येक) के लिए दो अंतराल (3 मिनट प्रत्येक) के लिए स्तर 12 पर स्टेनलेस स्टील मनका मिश्रण का उपयोग कर 200 μL में स्नैप-जमे हुए नमूने homogenize.
    नोट: आरएनए अखंडता को संरक्षित करने के लिए, नमूनों को तुरंत स्नैप-फ्रोजन राज्य से आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक में ले जाया जाना चाहिए और वजन नहीं किया जाना चाहिए।
  2. संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज होमोजेनेट 100-200 x g पर एक टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज में कमरे के तापमान पर लगभग 5 s के लिए तरल को मोतियों से अलग करने के लिए। supernatant एक ताजा ट्यूब के लिए स्थानांतरण.
  3. अधिक नमूनों को पुनर्प्राप्त करने के लिए मोतियों में आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक का एक और 200 μL जोड़ें, इसके बाद सेंट्रीफ्यूजेशन (100-200 x g, 5 s, कमरे का तापमान) होता है। supernatants गठबंधन.
    नोट: एक छोटे से पिपेट टिप का उपयोग करें (अधिकांश p200 युक्तियाँ उपयुक्त हैं) मनका कैरीओवर को रोकने के लिए जब supernatant को हटाने.
  4. चरण को अलग करने और आरएनए को अवक्षेपित करने के लिए निर्माता के दिशानिर्देशों का पालन करें। प्रतिनिधि नमूनों को 100% आइसोप्रोपेनॉल (लगभग 2: 1 मात्रा, आइसोप्रोपेनॉल: बरामद जलीय चरण) के साथ -20 डिग्री सेल्सियस पर रातभर अवक्षेपित किया गया था।
  5. समाधान के साथ-साथ पूर्ण आरएनए अवक्षेप को आरएनए-बाइंडिंग स्पिन कॉलम में स्थानांतरित करें और 9,500 x g पर 30 s के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार आरएनए ऑन-कॉलम को शुद्ध करें, और फिर न्यूक्लिएज-मुक्त पानी के 20 μL में आरएनए को समाप्त करें। माइक्रोवोल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और / या बायोएनालाइजर पर गुणवत्ता / मात्रा का आकलन करें।

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Representative Results

वर्णित पृथक्करण प्रोटोकॉल दोनों oviducts के पूलिंग के साथ प्रति माउस 100,000-120,000 कोशिकाओं उपज. यह विधि बहु-सिलिटेड सेल सीमाओं को बरकरार रखने के लिए पर्याप्त कोमल है, जिससे बहु-सिलिटेड कोशिकाओं और स्रावी कोशिकाओं के बीच अंतर की अनुमति मिलती है, और यह सत्यापित किया जाता है कि पाचन विधि डी-भेदभाव को रोकने के लिए पर्याप्त कोमल है। चित्रा 5 में प्रतिनिधि immunofluorescence छवियों चरण 4.2.1 के बाद छोटे सेल clumps दिखाते हैं, 4% paraformaldehyde (PFA) / DPBS में 3 मिनट के लिए तय, 1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के साथ धोया / Tris-buffered खारा-tween (BTBST) और निलंबन में दाग। संक्षेप में, कोशिकाओं को 0.5% ट्राइटनएक्स -100 / बीटीबीएसएसटी में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए परमेबिलाइज्ड किया गया था, बीटीबीएसएसटी में धोया गया था, 20 एमएम ग्लाइसिन / डीपीबीएस में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए बुझाया गया था, बीटीबीएसएसटी में धोया गया था, और फिर 5% बीएसए / 0.1% ट्राइटनएक्स -100 / टीबीएसटी में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अवरुद्ध किया गया था। कोशिकाओं को तब प्राथमिक एंटीबॉडी में बीटीबीएसटी (माउस एंटी-माउस ऑक्लुडिन (1: 2000) में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था; खरगोश एंटी-माउस एसिटाइलेटेड ट्यूबुलिन (1: 1000)) के बाद बीटीबीएसटी में कई वॉश। द्वितीयक एंटीबॉडी को बीटीबीएसटी (बकरी विरोधी माउस आईजीजी एलेक्सा फ्लोर 555 (1: 1000) में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए जोड़ा गया था; बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी एलेक्सा फ्लोर 488 (1: 1000)), बीटीबीएस में कई बार धोया गया, एक बार डीपीबीएस में, और फिर कमरे के तापमान (1: 2000, होशट 33342) पर 20 मिनट के लिए परमाणु दाग में इनक्यूबेट किया गया, इसके बाद डीपीबीएस में धोया गया। कोशिकाओं को एंटीफ़ेड बढ़ते माध्यम के 80 μL में फिर से निलंबित कर दिया गया था और इमेजिंग (चित्रा 5 ए) से पहले अंधेरे में रात भर छोड़ दिया गया था। चित्र 5B पृथक्करण प्रोटोकॉल के अंत में कोशिकाओं को दर्शाता है। व्यवहार्यता मूल्यांकन पूरे प्रोटोकॉल में किए गए थे, और प्रतिनिधि छवियों को चित्र 5B-D में दिखाया गया है। प्रोपिडियम आयोडाइड को 1:100 कमजोर पड़ने पर जोड़ा गया था, और कोशिकाओं को तुरंत एक उल्टे यौगिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (चित्रा 5 सी, लाल दाग) पर देखा गया था। सिलिया छोटे सेल क्लस्टर (चित्रा 5 ए) और एकल सेल निलंबन (चित्रा 5 ई) में बरकरार रही, जिसमें कई कोशिकाओं को सिलिया अभी भी धड़कते हुए देखा गया है (सप्पल वीडियो 1)।

Figure 5
चित्रा 5: Oviduct सेल पृथक्करण, भाग 2. occludin (लाल), नाभिक (नीला), और एसिटाइलेटेड ट्यूबुलिन (हरे) के लिए सकारात्मक एक सेल क्लस्टर की फ्लोरोसेंट और चरण-विपरीत छवियां। सिलिटेड एपिकल बॉर्डर (एआई और एवी में हरा) पूरे प्रोटोकॉल में बरकरार रहता है और एकल कोशिकाओं (ई) के लिए आगे के पाचन को रोकता है। एआई: मर्ज, एआईआई: लाल चैनल, एआईआईआई: नीला चैनल, एआईवी: चरण कंट्रास्ट, एवी: ग्रीन चैनल। एक संक्षिप्त प्रोनेस इनक्यूबेशन के बाद, अधिकांश कोशिकाएं एकल होती हैं। प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) धुंधला लगभग 93% व्यवहार्यता दिखाता है। (बी) उज्ज्वल क्षेत्र, (सी) लाल चैनल पीआई सकारात्मक, (डी) विलय। (ई) विलय पर इनसेट एक एकल विघटित सेल पर एक बरकरार सिलिटेड बॉर्डर दिखाता है। इस तरह की कोशिकाओं ने सक्रिय रूप से सिलिया को हराया था ( देखें) सप्पल वीडियो 1)। छवियों को एक उल्टे यौगिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर लिया गया था। चित्रा AI-V स्केल बार = 20 μm, B-D स्केल बार = 50 μm। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वर्णित आरएनए अलगाव प्रोटोकॉल सेगमेंटल आरटी-क्यूपीसीआर और आरएनएसेक के लिए आवश्यक पर्याप्त उपज और शुद्धता देता है। परिणाम बताते हैं कि इस विधि से प्रति खंड 800-1200 एनजी आरएनए (चित्रा 6 ए) प्राप्त होता है, सिवाय इनफंडिबुलर नमूनों के, जहां डाउनस्ट्रीम एसेस के लिए उचित उपज के लिए दो जानवरों से पूलिंग आवश्यक हो सकती है। infundibulum के लिए प्रस्तुत परिणाम दो जानवरों से पूल किए जाते हैं, कुल चार infundibular क्षेत्रों (चित्रा 6)। यह प्रोटोकॉल शुद्ध आरएनए प्राप्त करने में सफल रहा है, शुरू में माइक्रोवोल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा और आगे बायोएनालाइज़र (चित्रा 6 बी, सी) द्वारा विश्लेषण किया गया था। नमूनों में 1.8 और 2.0 (चित्रा 6 बी) के बीच 260/280 एनएम अवशोषण अनुपात होता है जो शुद्ध आरएनए न्यूक्लियोटाइड प्रजातियों 19 का विशिष्ट होता है। अवशोषण अनुपात (260/230 एनएम) 1 और 2.2 के बीच एक समावेश मानदंड के साथ प्रत्येक नमूने के लिए लिया गया था, अलगाव अभिकर्मकों से सीमित संदूषण का प्रतिनिधि (डेटा नहीं दिखाया गया है)19। नमूनों के बायोएनालिसिस ने आरएनए की उच्च अखंडता दिखाई, जिसमें सात (चित्रा 6 सी) से ऊपर आरएनए अखंडता संख्या (आरआईएन) का मूल्यांकन किया गया था, जो डाउनस्ट्रीम अभिव्यक्ति और अनुक्रमण विश्लेषण 20 के लिए उपयुक्त था।

Figure 6
चित्रा 6: खंडीय आरएनए की गुणवत्ता मूल्यांकन। पूरे आरएनए का मूल्यांकन माइक्रोवोल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और बायोएनालाइजर द्वारा उपज (ए) और गुणवत्ता (बी, सी) के लिए किया गया था। RIN: आरएनए अखंडता संख्या, जैसा कि बायोएनालिजर द्वारा मूल्यांकन किया गया है। सलाखों का माध्य ± मानक विचलन (एसडी), एन = दो अलग-अलग आरएनए निष्कर्षण से प्रति खंड 12 नमूने हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो 1: विघटित कोशिकाओं पर सिलिया को मारने की लाइव सेल इमेजिंग। प्रोनेस पाचन के बाद सिलिया की पिटाई। वीडियो एक उल्टे यौगिक माइक्रोस्कोप पर लिए गए थे। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ओविडक्ट के तीन खंड हिस्टोलॉजिकल, रूपात्मक रूप से, और कार्यात्मक रूप से अलग-अलग हैं1,2,3। उपकला ओविडक्ट के एक छोर से दूसरे छोर तक बहुत भिन्न होती है। सिलिटेड कोशिकाएं फिम्ब्रियल / इनफंडिबुलर अंत में हावी होती हैं, जबकि स्रावी कोशिकाएं इस्थमिक क्षेत्र 1 में हावी होती हैं। हालांकि इस समग्र ढाल को कुछ समय के लिए मान्यता दी गई है, हाल के काम ने ओविडक्टल सेगमेंट के बीच अधिक अंतर को उजागर किया है। इस प्रकार, जबकि सिलिटेड कोशिकाएं ट्यूब के समीपस्थ छोर की ओर कम लगातार हो जाती हैं, उनकी संख्या में तेज गिरावट होती है (लगभग 60% से 10% सिलिएशन तक) एम्पुला से एम्पुलरी-इस्थमिक जंक्शन 3 में संक्रमण होता है। इसके अलावा, समीपस्थ और डिस्टल खंडों में उपकला कोशिका आबादी विकासात्मक रूप से अलग-अलग वंशों 1,2,3 से व्युत्पन्न होती है। infundibulum और ampulla की दूरस्थ उपकला कोशिकाएं इस्थमस में समीपस्थ उपकला कोशिका आबादी में योगदान नहीं करती हैं, जैसा कि उपकला मार्करों के वंश अनुरेखण द्वारा दिखाया गया है। भ्रूण दिवस 12.5 (E12.5) पर, ओविडक्टल उपकला कोशिकाओं में समीपस्थ उपकला कोशिका मार्कर, PAX22 से स्वतंत्र एक अलग वंश होता है। ये खोजें, विभिन्न खंडों के बीच विविध सेल आबादी के अलावा, स्वतंत्र रूप से खंडों की जांच करने की आवश्यकता पर जोर देती हैं। वर्णित विधि तीन ऐतिहासिक रूप से वर्णित खंडों (infundibulum, ampulla, और isthmus) के अनुसार एक चरण-दर-चरण unwinding और सेगमेंट पहचान प्रोटोकॉल का विवरण देती है। एक निश्चित ओवीडक्ट सेगमेंट के रूप में एम्पुलरी-इस्थमिक जंक्शन की हाल ही में स्थापना के कारण, तीन शास्त्रीय रूप से वर्णित क्षेत्रों की पहचान और संग्रह को प्राथमिकता दी गई थी। हालांकि, विधि ampullary-इस्थमिक जंक्शन के एक अलग संग्रह को शामिल करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है, जैसा कि ऊपर वर्णित है3।

नीली डाई का उपयोग और infundibulum के स्थान एक तेजी से और कुशल तरीके से oviduct खोलना करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। नीली डाई ओस्टियम और ट्यूब के कॉइल पर प्रकाश डालती है, जिससे एक तेज और अधिक कुशल डी-कॉइलिंग और संग्रह की अनुमति मिलती है। ostium का प्रारंभिक स्थान एक दूरस्थ (infundibular) और समीपस्थ (isthmic) uncoiling भर में oviduct के क्षेत्रों के लिए उन्मुख. इसके अलावा, समीपस्थ गर्भाशय सींग भाग को अनकोइलिंग के दौरान विच्छेदन मंच पर चिपकाए रखने से सर्जन को नाजुक विच्छेदन चरणों के लिए दोनों हाथों का उपयोग करने की अनुमति मिलती है। कुंडलित oviduct के प्रारंभिक हटाने और ट्यूब immobilize प्रतिपादन के बिना या डाई के उपयोग के बिना इस संरचना uncoil करने का प्रयास आसानी से डिस्टल और समीपस्थ सिरों के बारे में भ्रम पैदा कर सकते हैं या ट्यूब के टूटने का कारण बन सकते हैं। ट्यूब टूटना आसान है, इसलिए ध्यान रखा जाना चाहिए जब uncoiling के बाद से टूटना पुनरुत्पादक विभाजन अप्राप्य बना देगा. उच्च गुणवत्ता वाले, वसंत-रूप माइक्रो-कैंची का उपयोग सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करने के लिए अत्यधिक अनुशंसित है।

ओविडक्ट के विभिन्न खंडों में जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर का मूल्यांकन करना, उदाहरण के लिए, एस्ट्रोस चक्र के दौरान और प्रशासित हार्मोन और साइटोकिन्स के जवाब में, सबसे अधिक संभावना है कि इन उत्तेजनाओं के जवाब में ओविडक्ट कैसे बदलता है, इसकी बेहतर समझ पैदा करेगा। ये डेटा इस बात पर भी प्रकाश डाल सकते हैं कि कौन से कारक उपकला परिवर्तन में योगदान करते हैं। आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल यहां सीमित आकार और लचीला ट्यूबल संरचना के इस ऊतक के लिए संभव उच्चतम मात्रा और गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया था। वर्णित समरूपता, आरएनए वर्षा, और फिनोल का संयोजनात्मक उपयोग: क्लोरोफॉर्म और ऑन-कॉलम शुद्धिकरण विधियों को डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए आरएनए की उचित गुणवत्ता और मात्रा प्राप्त करने में सबसे कुशल पाया गया। ओविडक्टल खंडों का वजन नहीं किया गया था और पूरे खंडों को तुरंत ऊतक समरूपता के लिए संसाधित किया गया था ताकि आरएनए गिरावट के लिए अग्रणी ऊतक के किसी भी वार्मिंग को रोका जा सके। इसके अलावा, क्योंकि छोटे ट्यूबल खंडों को कई समरूपता चरणों की आवश्यकता होती है, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि नमूना अखंडता को संरक्षित करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर होमोजेनाइजेशन किया जाता है। क्योंकि यह विधि डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए उचित उपज का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त है, इस तकनीक का एक भविष्य का अनुप्रयोग सेगमेंटल आरएनएसेक प्रदर्शन करने के लिए होगा, जो पहले रिपोर्ट नहीं किया गया था, जो ओविडक्ट फिजियोलॉजी की हमारी समझ में बहुत योगदान देगा।

सेल पृथक्करण प्रोटोकॉल के विकास के दौरान, हमने पाया कि मजबूत और / या लंबे समय तक एंजाइमेटिक पाचन ने सिलिया के प्रदर्शनीय नुकसान का कारण बना। इसलिए, हमने सेल आकृति विज्ञान को संरक्षित करने वाली एक विधि के विकास पर ध्यान केंद्रित किया, और हासिल किया। एकल सेल उपज में सुधार, जैसा कि यहां वर्णित है, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विभिन्न उपकला और स्ट्रोमल सेल प्रकारों के अधिक मजबूत और तत्काल मल्टीप्लेक्स किए गए विश्लेषण की अनुमति देगा। प्रोनेस में एक छोटी इनक्यूबेशन के बाद एक गैर-एंजाइमेटिक पृथक्करण प्रोटोकॉल का उपयोग भी लंबे या मजबूत पाचन विधियों का उपयोग करके पृथक्करण विधियों पर सेल सतह एंटीजन के संरक्षण में सुधार करने की संभावना है2,18। एकल सेल अनुक्रमण विश्लेषण को मल्टीप्लेक्स्ड फ्लो साइटोमेट्री पैनल2,21 की तुलना में बहुत कम कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। तो ओवीडक्ट के तीन वर्णित खंडों का एकल सेल अनुक्रमण वर्णित प्रोटोकॉल के साथ संभव हो सकता है।

क्योंकि ओविडक्ट को इसकी पूरी लंबाई के साथ फाइल नहीं किया जा सकता है, वर्तमान विधि की एक संभावित सीमा यह हो सकती है कि संकीर्ण इस्थमस के उपकला बनाने वाली कोशिकाओं ने पृथक्करण अभिकर्मकों के संपर्क को कम कर दिया होगा और इसलिए, विवो के समान अनुपात में अंतिम निलंबन में मौजूद नहीं हो सकता है।

ओवीडक्ट के कॉइलिंग के कारण, सभी ओवीडक्टल सेगमेंट के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण के लिए अभिविन्यास चुनौतीपूर्ण हो सकता है3। हालांकि, वर्णित खंड विच्छेदन के बाद oviductal खंडों के उन्मुख एम्बेडिंग के बाद पूरे बरकरार coiled ट्यूब के माध्यम से क्रमिक रूप से अनुभाग करने के लिए बिना अधिक व्यापक अनुदैर्ध्य और पार अनुभागीय छवि विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, नीली डाई uncoiling के लिए उपयोग किया जाता है, छोटे ट्यूबल खंडों के एम्बेडमेंट के दौरान सही अभिविन्यास में सहायता करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एएमडब्ल्यू (BCRP W81XWH-14-1-0425) के लिए एक DoD ब्रेकथ्रू अवार्ड द्वारा भाग में समर्थित किया गया था। केसीआर को आंशिक रूप से इंट्राम्यूरल फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था: पीज़ कैंसर प्री-डॉक्टरेट फैलोशिप और मैरी गैल्विन बर्डन प्री-डॉक्टरेट फैलोशिप बायोमेडिकल साइंसेज और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, रिवरसाइड, इंट्राम्यूरल अवार्ड्स में मैरी गैल्विन बर्डन प्री-डॉक्टरल फैलोशिप फैलोशिप: ग्रेजुएट काउंसिल फैलोशिप कमेटी शोध प्रबंध अनुसंधान अनुदान और स्नातक डिवीजन शोध प्रबंध वर्ष कार्यक्रम पुरस्कार। लेखक इस विधि के शुरुआती समस्या निवारण में सहायता के लिए गिलियन एम राइट और एलिसा एम कुमारी को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mm Stainless steel bead mix Next Advance SSB05 Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized
1.4 mm Stainless steel bead mix Next Advance SSB14B Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS) Gibco 21600-010 Cold, sterile
25G needle BD 305122
60 mm sterile petri dishes Corning 430166
70 μm cell meshes Fisherbrand 22-636-548
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit Agilent 2100 Bioanalyzer 5067-1513
Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer Next Advance BBY24M
Bioanlyzer Agilent 2100 Bioanalyzer
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A7906
Cold plate/pack/surface of choice N/A N/A Kept at -20 °C for dissection
Dental wax Polysciences Inc. 403
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12 Corning 10-090-CV Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep
Fetal Bovine Serum Corning 35-015CV
Fine point forceps of choice N/A N/A
Glycine Sigma Aldrich G712b Immunocytochemical validation images
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555 Invitrogen A-21422 Immunocytochemical validation images
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11001 Immunocytochemical validation images
Hepes Sigma Aldrich H-3784
Hoescht 33342 Cell Signaling Technologies 4082S Immunocytochemical validation images
Inverted compound microscope Keyence BZ-X700
Mouse anti-mouse Occludin Invitrogen 33-1500 Immunocytochemical validation images
Non-enzymatic dissociation buffer N/A 5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS
Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm Thomas Scientific 1210U04
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P-6148 Immunocytochemical validation images
Pen-Strep MP Biomedicals 10220-718
Prolong Gold Antifade Reagent Cell Signaling Technologies 9071S Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium
Pronase Sigma Aldrich 10165921001 Prepare pronase digestion medium: 0.15% pronase in DMEM/Ham's F12, sterile
Propidium Iodide Roche 11 348 639 001 Viability validation images
Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin Abcam ab179484 Immunocytochemical validation images
RBC lysis buffer BD Biosciences 555899
RNeasy Mini Kit Qiagen 74134 Utilized for on-column purification in text
Spring form microdissection scissors Roboz Surgical RS-5610
Sterile 3 mL bulb pipettors Globe Scientific 137135
Toluidine blue Alfa Aesar J66015 Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST) N/A N/A Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20
Triton-X-100 Mallinckrodt Inc. 3555 Immunocytochemical validation images
Trizol RNA Extraction Reagent Invitrogen 15596026 Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 177
माइक्रोडिसेक्शन और म्यूरीन ओविडक्ट का पृथक्करण: व्यक्तिगत खंड पहचान और एकल सेल अलगाव
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Radecki, K. C., Lorenson, M. Y.,… More

Radecki, K. C., Lorenson, M. Y., Carter, D. G., Walker, A. M. Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation. J. Vis. Exp. (177), e63168, doi:10.3791/63168 (2021).

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