Summary
Patientenabgeleitete Organoide (PDOs) sind ein leistungsfähiges Werkzeug in der translationalen Krebsforschung, das sowohl die genetische als auch die phänotypische Heterogenität der Krankheit und das Ansprechen auf personalisierte Krebstherapien widerspiegelt. Hier wird ein konsolidiertes Protokoll zur Erzeugung von PDOs für primären Blasenkrebs beim Menschen in Vorbereitung auf die Bewertung von phänotypischen Analysen und Arzneimittelreaktionen detailliert beschrieben.
Abstract
Aktuelle therapeutische In-vitro-Testplattformen haben keine Relevanz für die Tumorpathophysiologie, da sie typischerweise Krebszelllinien verwenden, die als zweidimensionale (2D) Kulturen auf Gewebekulturplastik etabliert sind. Es besteht ein kritischer Bedarf an repräsentativeren Modellen der Tumorkomplexität, die das therapeutische Ansprechen und die Sensitivität genau vorhersagen können. Die Entwicklung einer dreidimensionalen (3D) Ex-vivo-Kultur von patientenabgeleiteten Organoiden (PDOs), die aus frischem Tumorgewebe gewonnen werden, zielt darauf ab, diese Mängel zu beheben. Organoidkulturen können parallel zum routinemäßigen klinischen Management als Tumorsurrogate verwendet werden, um therapeutische Entscheidungen zu treffen, indem potenziell wirksame Interventionen identifiziert und Therapien angezeigt werden, die möglicherweise nutzlos sind. Hier zielt dieses Verfahren darauf ab, Strategien und ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll zu beschreiben, um Blasenkrebs-PDOs aus frischem, lebensfähigem klinischem Gewebe zu etablieren. Unsere gut etablierten, optimierten Protokolle sind praktisch, um 3D-Kulturen für Experimente mit begrenztem und vielfältigem Ausgangsmaterial direkt aus Patienten oder patientenabgeleitetem Xenotransplantat-Tumormaterial (PDX) einzurichten. Dieses Verfahren kann auch von den meisten Labors angewendet werden, die mit Standard-Gewebekulturgeräten ausgestattet sind. Die mit diesem Protokoll erzeugten Organoide können als Ex-vivo-Surrogate verwendet werden, um sowohl die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der urologischen Krebspathologie zugrunde liegen, als auch Behandlungen zu bewerten, um das klinische Management zu informieren.
Introduction
Blasenkrebs ist der am weitesten verbreitete Harnwegskrebs und der zehnthäufigste menschliche Malignitätskarzinom weltweit1. Es umfasst ein genetisch vielfältiges und phänotypisch komplexes Krankheitsspektrum2. Urotheliale nicht-muskel-invasive Formen von Blasenkrebs (NMIBC) sind die häufigsten Blasenkrebsdiagnosen (70%-80%), und diese Krebsarten weisen eine beträchtliche biologische Heterogenität und variable klinische Ergebnisseauf 2,3,4. Patienten mit NMIBC haben typischerweise ein hohes Risiko für ein Wiederauftreten der Krankheit (50-70%) und ein Drittel der Krebserkrankungen wird fortschreiten und sich zu signifikant aggressiverem muskelinvasivem Blasenkrebs (MIBC) entwickeln2. Obwohl die 5-Jahres-Überlebensraten für NMIBC hoch sind (>90%), müssen sich diese Patienten einem langfristigen klinischen Managementunterziehen 5. Auf der anderen Seite wird lokal fortgeschrittene (insektierbare) oder metastasierende MIBC im Allgemeinen als unheilbarangesehen 6. Folglich hat Blasenkrebs eine der höchsten lebenslangen Behandlungskosten in der Krebsbehandlung und ist eine erhebliche Belastung sowohl für den Einzelnen als auch für das Gesundheitssystem 3,7. Die zugrunde liegenden genetischen Aberrationen bei fortgeschrittenen Erkrankungen machen die therapeutische Behandlung von Blasenkrebs zu einer klinischen Herausforderung, und die therapeutischen Optionen für invasive Urotheltumoren haben sich erst kürzlich seit der Zulassung von Immuntherapien für fortgeschrittene und Hochrisiko-NMIBC 8,9 verbessert. Derzeit wird die klinische Entscheidungsfindung von konventionellen klinischen und histopathologischen Merkmalen geleitet, obwohl einzelne Blasenkrebstumoren große Unterschiede in der Krankheitsaggressivität und dem Ansprechen auf die Therapiezeigen 10. Es ist dringend notwendig, die Erforschung klinisch nützlicher Modelle zu beschleunigen, um die Vorhersage der individuellen Patientenprognose und die Identifizierung wirksamer Behandlungen zu verbessern.
Dreidimensionale (3D) Organoide zeigen ein großes Potenzial als Tumormodelle aufgrund ihrer Fähigkeit, die intrinsische In-vivo-Architektur und das pharmakogenomische Profil des ursprünglichen Tumors selbst zu organisieren und zu rekapitulieren, und ihrer Fähigkeit, die native zelluläre Funktionalität des ursprünglichen Gewebes, aus dem sie abgeleitet wurden, zu spiegeln11,12,13 . Obwohl etablierte Blasenkrebs-Zelllinien leicht verfügbar, relativ kostengünstig, skalierbar und einfach zu manipulieren sind, können die In-vitro-Zelllinien das Spektrum verschiedener genetischer und epigenetischer Veränderungen, die bei klinischen Blasenkrebserkrankungen beobachtet wurden, weitgehend nicht nachahmen12,14 und wurden alle unter 2D-, adhärenten Kulturbedingungen etabliert und aufrechterhalten. Darüber hinaus weisen Zelllinien, die von primären und metastasierten Blasentumoren stammen, eine signifikante genetische Divergenz vom ursprünglichen Tumormaterial auf. 8,15
Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung gentechnisch veränderter und karzinogeninduzierter Mausmodelle. Während diese Modelle jedoch einige der natürlichen onkogenen Kaskaden rekapitulieren, die an der menschlichen Neoplasie beteiligt sind (überprüft in Refs 16, 17, 18), fehlt es ihnen an Tumorheterogenität, sie sind teuer, stellen invasiven und metastasierenden Blasenkrebs schlecht dar und sind nicht für schnelle Medikamententests geeignet, da die Entwicklung von Tumoren viele Monate dauern kann 14,19 . Von Patienten abgeleitete Krebsmodelle (einschließlich Organoide, bedingt umprogrammierte primäre Zellkultur und Xenotransplantate) bieten unschätzbare Möglichkeiten, die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung vor der klinischen Behandlungzu verstehen 20. Trotzdem verwenden nur wenige Gruppen routinemäßig diese patientenproximalen Modelle, da der Zugang zu frischem primärem Patientengewebe begrenzt ist und eine umfassende Optimierung erforderlich ist, um reproduzierbare Bedingungen für die Kultur von Patienten abgeleitete Organoide (PDO) zu erzeugen. In einer In-vivo-Umgebung können onkogene Zellen mit verschiedenen Zusammensetzungen der umgebenden Bestandteile interagieren und kommunizieren, einschließlich Stromazellen, gewebeinfiltrierende Immunzellen und Matrix12. In ähnlicher Weise kann bei PDOs, die in einem 3D-Format gezüchtet werden, die Zell-/Matrixkomplexität angepasst werden, um andere relevante Komponenten einzubeziehen. PDOs können schnell erzeugt werden und können oft extensiv durchgelassen oder für die spätere Verwendung kryokonserviert werden, obwohl sie eine begrenzte Lebensdauervon 21,22,23 haben. Die Pharmakodynamik (d. h. das Ansprechen auf ein Arzneimittel) kann anhand mehrerer Auslesungen bewertet werden, einschließlich der Organoidlebensfähigkeit und -morphologie sowie der Charakterisierung von immunhistochemischen Zielen oder transkriptionellen Veränderungen.
Hier werden die Verfahren zur Etablierung von Blasenkrebs-Organoiden aus Patientenmaterial beschrieben, das bei der transurethralen Resektion von Blasentumoren (TURBT) oder der chirurgischen Entfernung der Blase (radikale Zystektomie) gesammelt wurde. Die Methode zur Generierung von g.U. wird unter Verwendung leicht verfügbarer nasser Labormaterialien und -werkzeuge veranschaulicht. Endpunkte sind Veränderungen der morphologischen Eigenschaften und der Lebensfähigkeit der Zellen. Diese wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie, In-vitro-Lebensfähigkeit (metabolische und Zellmembranintegrität) und histopathologische Analyse gemessen. Abbildung 1 zeigt den Workflow zur Etablierung menschlicher Blasenkrebs-PDOs aus klinischem Material, das während einer elektiven Operation erhalten wurde.
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Protocol
Die Patienten haben dieser Studie zugestimmt, nachdem sie im Rahmen des Urologie-Teams am Princess Alexandra Hospital, Brisbane, Australien, aufgenommen wurden. Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Erklärung von Helsinki und innerhalb ethischer und institutioneller Richtlinien (Ethiknummer HREC/05/QPAH/95, QUT 1000001165) durchgeführt.
HINWEIS: Als Zulassungskriterien waren die Patienten im Alter von ≥ 18 Jahren mit Krebs und in der Lage, zu verstehen und ihre Zustimmung zu geben. Diejenigen, die nicht in der Lage waren, eine Einwilligung nach Aufklärung zu geben, wurden ausgeschlossen. Personen, die eine andere Hauptsprache als Englisch hatten, wurden ausgeschlossen, da die Bereitstellung von Dolmetschern aus logistischen und budgetären Gründen nicht möglich war. Ebenfalls ausgeschlossen waren Patienten, deren Tumore für eine Biopsie nicht zugänglich waren oder nach einer Routinepathologie wahrscheinlich nicht in ausreichender Menge verfügbar waren.
1. Vorbereitung des Organoidmediums
HINWEIS: Menschliches Blasenkrebs-Organoid-Medium erfordert Wachstumsfaktoren, die das Überleben, das Wachstum und die kontinuierliche Expansion von Organoiden aus dissoziiertem klinischem Material unterstützen (Tabelle 1). Ausführliche Informationen zu jeder in diesem Verfahren verwendeten Ergänzung finden Sie in der Materialtabelle.
- Gefrorene Zutaten auf Eis oder im Kühlschrank bei 2-8 °C auftauen. Vermeiden Sie wiederholte Frost-/Tauzyklen und arbeiten Sie mit gefrorenen Aliquots (gelagert bei -20 °C).
- Basalmedium: Bereiten Sie das Basalmedium vor, indem Sie das modifizierte Adlermedium von Dulbecco/Ham's F-12 (adDMEM/F12) mit HEPES (10 mM) und Glutamin (2 mM) ergänzen. Dies wird auch als Transportmedium und bei organoiden Waschschritten verwendet.
HINWEIS: Advanced DMEM/F-12 wird als basales Medium verwendet, um die Expansion von Organoiden in Gegenwart von begrenztem Serum zu unterstützen; Es erfordert jedoch eine Supplementierung mit HEPES und L-Glutamin. - Zentrifugieren Sie kurz den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 10 (FGF-10), den Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF-2), den Epithelwachstumsfaktor (EGF), SB202190, das Prostaglandin E2 (PGE2) und A 83-01 vor dem Öffnen, um sicherzustellen, dass sich die Komponenten am Boden der Durchstechflasche befinden.
- Vollständiges Organoidmedium: Ergänzung des basalen Mediums mit humanem Noggin- und R-Spondin-1-konditioniertem Medium in einer Endkonzentration von 5% v/v, humanem EGF (50 ng/ml), humanem FGF-2 (5 ng/ml), humanem FGF-10 (20 ng/ml), A 83-01 (500 nM), SB202190 (10 μM), B27 (1x), Nicotinamid (10 mM), N-Acetylcystein (1,25 mM), Y-27632 (10 μM), PGE2 (1 μM) und einer Breitbandantibiotikabildung in der vom Hersteller angegebenen Konzentration.
- Lagern Sie Organoidmedien bei 4 °C im Dunkeln und verwenden Sie sie innerhalb von 2 Wochen (maximal 1 Monat). Nicht einfrieren. Vermeiden Sie eine längere Exposition gegenüber Lichtquellen.
HINWEIS: Das Organoidmedium wird serumfrei hergestellt; Serum und Penicillin/Streptomycin könnten jedoch bei Bedarf von Benutzer zu Benutzer ergänzt werden.
2. Einen Tag vor dem Verfahren, wie in 3 beschrieben.
- Auftauwachstumsfaktor reduzierte Basalmembran (BME; siehe Materialtabelle) über Nacht für mindestens 12 h, bevor sie in einem 4 °C Kühlschrank oder Kühlraum verwendet werden. Geben Sie BME bei Bedarf in 1 ml Aliquots in einem 1,5 ml Polypropylen-Einwegröhrchen ab, um Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.
- Legen Sie gefilterte Pipettenspitzen in einen 4 ° C-Kühlschrank oder Kühlraum.
HINWEIS: Dieser Abschnitt bezieht sich auf Pipettenspitzen, die bei der Handhabung von BME verwendet werden, um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern und die Beschichtung von BME auf der Oberfläche der Spitzen zu reduzieren. - Sterilisieren Sie alle chirurgischen Geräte, die für den Eingriff erforderlich sind.
3. Generierung von Blasentumor-Organoiden
HINWEIS: Dies ist ein erster Schritt für die Etablierung von PDO-Mitteln aus Primärpatiententumoren. Dieses Verfahren ist für Blasenkrebsgewebe aus Methoden angepasst, die von Gao et al.24 festgelegt wurden.
- Verwenden Sie eine Biohazard-Haube der Klasse II, um die Probe vorzubereiten. Rufen Sie trockenes und nasses Eis auf und drucken Sie das Verarbeitungsblatt für Patientenproben (Supplemental File).
- Rufen Sie das Forschungspersonal in den Operationssaal, wenn die chirurgische Resektion fast abgeschlossen ist.
HINWEIS: Bestätigen Sie, dass der Patient die Zulassungskriterien erfüllt und die Einverständniserklärung des Teilnehmers unterschrieben hat. Gewebe wird nur dann für die Forschung bereitgestellt, wenn es die Anforderungen für die klinische histopathologische Beurteilung übersteigt. - Sammeln Sie eine frische makroskopisch lebensfähige Tumorprobe aus der Operation. Stellen Sie sicher, dass die Probe während des Transports in ein Transportmedium (entweder 1x adDMEM/F12 oder 1x Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)) in ein steriles 50 ml konisches Röhrchen oder Urinprobenglas eingetaucht wird.
HINWEIS: In einigen klinischen Zentren muss Gewebe möglicherweise in ein Pathologielabor transportiert werden, um für die Forschung zugewiesen zu werden. Unter diesen Umständen wird empfohlen, dem Transportmedium Antibiotika und Antimykotika zuzusetzen. Gewebe kann bei 4 °C in basalem Medium für bis zu 24 h nach der Operation gelagert werden und dennoch lebensfähige Organoidkulturen erzeugen. - Notieren Sie Probendetails, einschließlich Gewebegewicht (g oder mg), Probenbeschreibung und Details zu Blut- und Urinproben auf dem Patientenprobenverarbeitungsblatt (Zusatzakte).
- Entfernen Sie vorsichtig das Transportmedium und ersetzen Sie es durch 10 ml Basalmedien. Lassen Sie das Tumorgewebe durch Schwerkraft absetzen.
HINWEIS: Transportmedium gilt als klinischer Abfall und muss in einem entsprechend gekennzeichneten Abfallbehälter in einer angemessenen Menge Dekontaminationslösung gesammelt werden. Sobald die Flüssigkeit chemisch dekontaminiert wurde, kann sie gemäß den institutionellen Richtlinien für gefährliche Abfälle entsorgt werden. - Entfernen Sie das Tumorgewebe mit einer Pinzette und legen Sie es in eine sterile 90 mm Petrischale (Abbildung 2A). Notieren Sie das Gewicht des Gewebes in mg oder g auf dem klinischen Probenverarbeitungsblatt und dem Dissektionsgitter (Abbildung 2B).
- Entfernen Sie nicht krebsartiges Gewebe (einschließlich Fettgewebe) und makroskopisch sichtbare nekrotische Regionen mit steriler Pinzette und Einweg-Skalpellklinge, die am Skalpellgriff montiert ist (Abbildung 2C). Tumorstücke 1-2 mal mit kaltem 1x DPBS waschen. Sammeln Sie die Tumorstücke und geben Sie sie in eine neue sterile 90 mm Petrischale.
HINWEIS: Da Skalpellklingen scharf sind, seien Sie vorsichtig, wenn Sie manuell schneiden. Tumorbenachbartes Fettgewebe kann durch deutlich weiche, gallertartige, blasse Bereiche identifiziert werden, die unmittelbar an den visuellen Tumorumfang angrenzen. Makroskopisches Fettgewebe und fokal dunkle Regionen, die Bereiche der Nekrose darstellen, erfordern ein persönliches Urteilsvermögen, wenn sie von einer Exzisionsblasentumorbiopsie getrennt werden. - Machen Sie ein Foto, zeichnen Sie ein Diagramm des Gewebes und planen Sie die Gewebedissektion auf einem klinischen Verarbeitungsraster (Abbildung 2B und Abbildung 2C).
HINWEIS: Es ist wichtig, eine visuelle Aufzeichnung und grobe Skizze der einzelnen makroskopischen Tumormerkmale und der Dissektion für jeden spezifischen Fall zu führen. - Zerlegen Sie Tumorgewebestücke und ordnen Sie sie für histopathologische (Abbildung 2D) und molekulare Analysen (Abbildung 2E) zu.
- Für histologische Analysen: Geben Sie etwa 50 mg Tumorgewebe in eine markierte Einweg-Histologiekassette (Abbildung 2D). Tauchen Sie die Histologiekassette in einen Behälter mit 5x bis 10x Volumen von 10% neutralem gepuffertem Formalin (NBF). Inkubieren Sie über Nacht bei RT.
- Entfernen Sie 10% NBF und ersetzen Sie es am nächsten Tag durch 70% (w / w) Ethanol für die Lagerung bei 4 ° C, bis das Gewebe mit dem routinemäßigen Gewebeverarbeitungsprotokoll verarbeitet werden kann
- Für molekulare Analysen: Mindestens ein 1-3 mm3 Tumorstück in einem RNase/DNase-freien 1,5 ml Kryo mit flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern (Abbildung 2E).
- 5 ml Organoidmedium (Tabelle 1) werden in die 90-mm-Petrischale gegeben, die das/die verbleibende(n) Tumorstück(e) enthält.
- Zerkleinern Sie das Gewebe mechanisch so fein wie möglich (0,5-1 mm3 Stück oder kleiner) mit einer sterilen #10 Skalpellklinge.
HINWEIS: Größere Fragmente oder ganze Gewebestücke (>3 mm3) benötigen erheblich länger, um verdaut zu werden, und verringern die Lebensfähigkeit der Probe. Lassen Sie den obigen Schritt weg, wenn das Gewebe disaggregiert ist und die Fragmente klein genug sind, um mit einer serologischen 5-ml-Pipettenspitze zu pipettieren. - Übertragen Sie fein gehacktes Gewebe in einen 50 ml konischen Schlauch und fügen Sie 4 ml Organoidmedium, 1 ml 10x Kollagenase / Hyaluronidas und 0,1 mg / ml Desoxyribonuklease 1 (DNase 1) hinzu, um Zellverklumpungen zu vermeiden.
HINWEIS: Enzymlösung sollte jedes Mal frisch zubereitet werden. Erhöhen Sie das Volumen des Mediums auf etwa das 10-fache der sichtbaren Menge der Tumorfragmente für große Proben. - Inkubieren Sie das gehackte Tumorgewebe und die Enzymlösung für 1-2 h auf einem Orbitalschüttler oder Rotator (150 U / min) in einem Inkubator (37 ° C, 5% CO2), um Fragmente in eine Zellsuspension zu dissoziieren und Kollagen abzubauen. Dies kann mit einer histologischen Analyse überprüft werden (Abbildung 3A).
HINWEIS: Wenn die Gewebemenge groß ist oder nach 1-1,5 h keine offensichtliche Dissoziation beobachtet wird, erhöhen Sie die Inkubationszeit und überprüfen Sie den Grad der Dissoziation alle 30 Minuten. Der Zeitpunkt für diesen Schritt hängt von der Probe ab und muss jedes Mal empirisch bestimmt werden. Eine merklich klarere Lösung mit für das Auge nicht erkennbaren Gewebefragmenten (oder sehr wenigen Fragmenten) weist auf eine erfolgreiche Verdauung hin. - Beenden Sie den Aufschluss mit der Zugabe von 2x Volumen (20 ml) Basalmedium zur Probe.
- Die Probe bei 261 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren, absaugen und den Überstand verwerfen.
- Um kontaminierende rote Blutkörperchen (RBCs) zu lysieren, resuspendieren Sie das aus dem obigen Schritt erhaltene Pellet in 5 ml Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) -Puffer. Inkubieren Sie die Tube bei RT für 3 min oder bis die vollständige Lyse der RBCs gesehen wird (Suspension wird deutlich).
HINWEIS: Wenn RBCs nicht als kleiner roter Klumpen im Pellet beobachtet werden, kann dieser Schritt weggelassen werden. - Geben Sie 20 ml des Basalmediums in die Röhre. Zentrifen Sie das Röhrchen bei 261 x g für 5 min bei RT und saugen Sie den Überstand ab.
- In diesem Schritt ein 10 ml Aliquot aus 2x und 1x Organoidmedium in ein 37 °C warmes Wasserbad geben.
- Filtern Sie die Probe durch ein vornasses reversibles 100-μm-Sieb in ein neues 50-ml-Rohr, um großes unlösliches Material zu entfernen.
HINWEIS: Großes, unverdautes Material (>100 μm), das vom Filter gesammelt wird, kann Zellen von Interesse enthalten und kann in einer 90-mm-Petrischale oder einer 6-Well-Zellkulturplatte in Organoidmedium kultiviert werden, um 2D-Kulturen abzuleiten (Abbildung 1 (Schritt 5) und Abbildung 3B). - Filtern Sie das Eluat durch ein vornasses reversibles 37-μm-Sieb, um einzelne Zellen und kleine Cluster für die Einzelzell- und Immunzellisolierung zu sammeln (Tube 37-1; Abbildung 1 (Schritt 6) und Abbildung 3B).
HINWEIS: Die Ausbeute an Tumorzellen während dieses Schrittes kann erhöht werden, indem die gefilterte Zellsuspension erneut durch das Sieb geleitet wird. - Kehren Sie das 37-μm-Sieb um und verwenden Sie 10 ml Basalmedien, um kleine und mittelgroße Cluster (37-100 μm) (Röhrchen 70-1; Abbildung 3B).
- Füllen Sie jede der neuen 50-ml-Röhren (Röhren 70-1 und 37-1) mit DPBS auf 40 ml auf. Zentrifen Sie die Suspension bei 261 x g für 5 min bei RT. Aspirieren und verwerfen Sie den Überstand.
- Fügen Sie 10 ml Basalmedien in Tube 37-1 hinzu und zählen Sie die Zellen mit Trypanblau-Ausschlussfarbstoff und einem automatisierten Zellzähler (gemäß den Angaben des Herstellers). Bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit von Zellen.
- Zentrifugieren Sie den Rest der Probe bei 261 x g für 5 min bei RT. Saugen Sie das Medium ab und ersetzen Sie es durch Zellgefrierlösung oder Basalmedien, die 10% fetales Rinderserum (FBS), 1% Penicillin/Streptomycin und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) enthalten.
- Proben in 1,5 ml Kryovitale geben und in einem Zellgefrierbehälter aufbewahren. Den Behälter sofort in einen Gefrierschrank von -80 °C geben, um eine optimale Abkühlrate zu erzielen. Nach der Nachtlagerung im Gefrierschrank bei -80 °C werden die Kryofrüchte zur Langzeitlagerung in eine kryogene Flüssigkeits- oder Luftphasenlagerung (-196 °C) überführt.
- Resuspendieren Sie Zellen aus Röhrchen 70-1 mit 500 μL vorerwärmtem 2x-Organoidmedium.
HINWEIS: Die Aussaatdichte muss für eine erfolgreiche Organoidvermehrung hoch sein. Das Volumen des Organoidmediums und anschließend der BME sollte empirisch an der Anzahl der aus dem Filtrationsschritt isolierten Zellen verändert werden. Dieser Schritt bietet einen relevanten Ausgangspunkt basierend auf Studien in unserem Labor. - Fügen Sie BME zu den Zellen (im Verhältnis 1: 1 mit 2x Organoidmedium) mit eiskalten P1000 sterilen Filterpipettenspitzen hinzu und mischen Sie vorsichtig, um die Zellen zu suspendieren. Pipettieren Sie schnell und vorsichtig 100 μL rekonstituierte Zellen / BME-Mischung in Vertiefungen einer extrem niedrigen Befestigung mit 96-Well-Platte mit flachem Boden. Legen Sie die 96-Well-Platte in einen Inkubator (37 °C, 5% CO2) für 20-30 Minuten, um zu erstarren.
- Fügen Sie 1: 2 Verhältnis von 1x Organoidmedium auf BME-Zellsuspension hinzu, abhängig vom empirisch bewerteten Volumen. Fügen Sie im relevanten Ausgangspunkt 50 μL 1x organoide Medienmedien zu 100 μL rekonstituierter Zellen / BME-Mischung hinzu.
- Legen Sie die 96-Well-Platte in einen Inkubator (37 °C, 5% CO2) für 20 Minuten, um sich auszugleichen.
- Nehmen Sie die Zellkulturplatte aus dem Inkubator und montieren Sie sie auf einem Probenhalter auf dem Tisch eines Mikroskops. Beurteilen Sie Organoide visuell unter Phasenkontrast- oder Hellfeldeinstellungen.
HINWEIS: Die Bilder werden am besten mit einem invertierten Phasenkontrastmikroskop aufgenommen, das mit einer DIC-Optik (Differential Interference), einer Digitalkamera und der zugehörigen Software ausgestattet ist, um die Bildung sphärischer PDOs in Vorbereitung auf die Endpunktanalyse zu beobachten.- Wenn verschiedene Cluster sichtbar sind, platzieren Sie die Zellkulturplatte in einer elektronisch beheizten Mikroskopkammer auf der Bühne (37 °C, 5% CO2) für die Live-Cell-Bildgebung über die ersten 24-72 h.
- Stellen Sie sicher, dass der flexible beheizte Kragen an der Linse befestigt ist, um die thermische Drift zu reduzieren und der Luftbefeuchter mit dH2O gefüllt ist.
- Führen Sie die erste Bildgebung mit einem 4-fachen oder 10-fachen Objektiv (N.A. 0,30, B.D. 15,2 mm) durch. Zeitraffer alle 5-10 Minuten bei der Phasenkontrasteinstellung.
- Überprüfen Sie die erfolgreiche Isolierung, die durch das Auftreten von >10 selbstorganisierenden Organoiden pro Bohrung nach einer Periode von 24-72 h gekennzeichnet ist.
- Lassen Sie die Kulturen bis zu zwei Wochen weiterlaufen, wenn die Organoidzahlen niedrig sind (Abbildung 3C).
- Füllen Sie das Medium alle 2-3 Tage mit 50 μL vorerwärmtem Organoidmedium auf, um erschöpfte Wachstumsfaktoren und das Gesamtvolumen wieder aufzufüllen.
- Erfassen Sie Bilder (wie in Schritt 3.30 beschrieben) an den Tagen 1, 2 und 3 (Zeitrafferreihen) und an den Tagen 5, 7 und 10 vor dem Passieren (falls zutreffend).
HINWEIS: Organoide (beobachtet als im Allgemeinen runde Strukturen, bei denen Sie die Kanten einzelner Zellen nicht sehen können) werden typischerweise 7-10 Tage nach dem Aufbau durchlaufen, abhängig vom Erfolg der Isolierung. Vor oder nach dem Passieren können Organoide bis zu 6 Tage lang mit Zytostatika oder Therapeutika behandelt und die Arzneimittelreaktion mit Hilfe von Zelllebensfähigkeits- und Zytotoxizitätstests gemessen werden. Alternativ können Organoide aus BME (unter Verwendung von 1 mg/ml Dispase) entnommen und kryokonserviert (biobanked), für molekulare Tests vorbereitet oder histologisch eingebettet und bewertet werden (Abbildung 4).
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Representative Results
3D-Organoide wurden erfolgreich aus humanem Blasenkrebspatienten TURBT und Zystektomiegewebe nachgewiesen. Kurz gesagt, diese Technik hebt eine schnelle Bildung von 3D-multizellulären Strukturen hervor, die sowohl lebensfähig als auch für andere Endpunktanalysen wie histologische Bewertung, molekulare Charakterisierung (durch Immunhistochemie oder quantitative Echtzeit-PCR) und Wirkstoffscreening geeignet sind. Während des Verfahrens (Abbildung 1) konnten die verschiedenen Eluate während unserer Filtrationsphasen (Abbildung 1, Schritte 1-6) genutzt werden, um einzelne Zellen für die Isolierung von tumorinfiltrierenden Immunzellen (TILs) und die Erzeugung einer einzelligen Biobank zu kryokonservieren. Das Verfahren ermöglicht es, mehrere Aspekte eines heterogenen Primärtumors angemessen und auf eine Weise zu biobankieren, die patientenübergreifend verfolgt werden kann (Abbildung 2A, B), einschließlich Histologie (Abbildung 2C, D) und frisch gefrorener Proben (Abbildung 2E).
Eine 2-stündige Verdauung mit kommerziell erhältlicher Kollagenase/Hyaluronidase und DNase 1 ermöglicht eine ausreichende Verdauung von 0,5-1 mm3 Teilen des komplexeren Cystektomie-Biopsiegewebes, einschließlich der neoplastischen Zellen in der Lamina propria und den Muskelschichten der Blase (Abbildung 3A). Größere Post-Digestion-Fragmente (>100 Mikrometer) haben sich für die Kultur in Standard-Gewebekulturplatten beliebiger Größe für die Isolierung neuartiger 2D-Kulturen als geeignet erwiesen (Abbildung 3B). Eine umfangreiche molekulare Charakterisierung ist jedoch erforderlich, um den Krebsursprung solcher Zelllinien zu validieren. Organoide, die mit diesem Protokoll erfolgreich erzeugt werden, durchlaufen Prozesse der dynamischen Selbstorganisation, einschließlich Phasen der Aggregation, Verdichtung und endgültigen Bildung, wobei sie sich zu engen zellulären Strukturen bilden (Abbildung 3C), die auf das Ansprechen auf Standardtherapien untersucht werden können. Abbildung 3C zeigt die effizienten Selbstorganisationseigenschaften der Organoide. Histologisch rekapitulieren diese Strukturen den ursprünglichen Patiententumor (Abbildung 4). Die in diesem Verfahren erzeugten Organoide eignen sich für eine Vielzahl von Zwecken, einschließlich weiterer Charakterisierung, Biobanking und Arzneimittelwirksamkeitstests (Abbildung 5).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der organoiden Gewebekultur von der Entnahme von Tumorproben aus der Operation bis zur Endpunktanalyse. URN, Einheitendatensatznummer; TIL, Tumor-infiltrierender Lymphozyt. (1) Gewebe wird in einer 90 mm Petrischale so fein wie möglich mit einer sterilen Skalpellklinge (0,5-1 mm3 Stück) mechanisch zerkleinert. (2) Tumorstücke werden in einem enzymatischen Dissoziationsmedium resuspendiert, das aus dem Organoidmedium, Kollagenase/Hyaluronidase und DNase 1 besteht. (3) Gehacktes Tumorgewebe und Enzymlösung werden für 1-2 h auf einem Rotatorinkubator (150 U/min, 37 °C, 5% CO2) inkubiert und anschließend pelletiert (4), um Fragmente in eine feinere Zellsuspension zu dissoziieren. Die Probe wird durch vornasse reversible (5) 100-μm- und (6) 37-μm-Siebe in neue 50-ml-Rohre filtriert, um großes unlösliches Material zu entfernen und 37-100-μm-Cluster zu isolieren. Nach (7) Zentrifugation der Fraktion, die aus der Rückseite des 37-μm-Siebs isoliert wurde, werden die Zellcluster in (8) BME- und Organoidmedien vor (9) Lebendzellbildgebung suspendiert. Erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Handhabung von sterilem Tumorgewebe für die Organoidetablierung. (A) Nach der Exzision und dem Transport ins Labor wird die Probe in eine sterile Petrischale gegeben, gewogen und anschließend seziert. (B) Ein Probendissektionsgitter wird verwendet, um die Probe für verschiedene Prozesse zu markieren. Ein Beispiel für eine Dissektion ist in (C) gezeigt, wo Proben so weit wie möglich aus der Tumorperipherie entnommen werden, um Bereiche der zentralen Nekrose zu vermeiden, und annotiert (Inset), bevor (D) das Gewebe vor der Gewebefixierung gebrutzelt wird. Maßstab: 6 mm. Maßstabsleiste des Einschubs: 4 mm. (E) Kleine frische Fragmente werden für das anschließende Einfrieren und Biobanking entnommen. Maßstab: 5 mm. Elemente dieses Bildes wurden mit BioRender.com erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Enzymatische Ableitung und dynamische Anordnung von Blasentumor-Organoiden. (A) Repräsentative Bilder von Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbtem elterlichem Blasenkrebsgewebe (Pathologie als T3bN0 überprüft) bei sofortiger Fixierung (links) und 2 h nach der Verdauung mit 1x Kollagenase / Hyaluronidase (rechts). Maßstab: 500 μm. Maßstabsstab: 50 μm. (B) Repräsentative Bilder der Isolationen >100 μm, 37-1 und 70-1 (Tag 2). Maßstabsbalken werden innerhalb des Bildes angezeigt. (C) Repräsentative Bilder werden für die Organoid-Isolierung von Blasenkrebs über 48 h und Tag 7 Organoid H & E-Färbung gezeigt. Maßstabsstab: 50 μm. Maßstabsleiste für das Bild im Einschub: 20 μm. DIC: differentieller Interferenzkontrast. Elemente dieses Bildes wurden mit BioRender.com Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Von Blasenkrebs abgeleitete Organoidkulturen erhalten die histologische Architektur von elterlichen Tumoren. Repräsentatives H & E-Bild von niedriggradigem Blasenkrebs (Ta) und entsprechendem Hellfeldbild des Organoids am Tag 7 der Kultur. Das ganz rechte Panel zeigt die zugehörige H & E-Färbung des Tag 7-Organoids. Maßstabsbalken sind in der Abbildung angegeben. LG: niedriggradig, BC: Blasenkrebs, H & E: Hämatoxylin und Eosin und DIC: differentieller Interferenzkontrast. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Nachgelagerte Anwendungen mit von Patienten stammenden Organoiden für Blasenkrebs. Erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Additiv | Endabschluss | Lagerbestand | Lösungsmittel | |
| Basale Medien | Glutamax | 2 mM | 1 Mio. | NaCl |
| HEPES | 10 mM | 1 Mio. | NaCl/NaHPO4 gepufferte Lösung | |
| Ergänzungen für komplette Medien | R-spondin 1 konditioniertes Medium | 5% v/v | Konditionierte Medien | Erweitertes DMEM/F-12 |
| Noggin-konditionierte Medien | 5% v/v | Konditionierte Medien | Erweitertes DMEM/F-12 | |
| EGF | 50 ng/ml | 0,5 mg/ml | PBS/0,1% BSA | |
| FGF-10 | 20 ng/ml | 100 μg/ml | PBS/0,1% BSA | |
| FGF-2 | 5 ng/ml | 50 μg/ml | PBS/0,1% BSA | |
| Nicotinamid | 10 mM | 1 Mio. | 1 g in 8,2 ml ddH20 | |
| N-Acetyl-L-Cystein | 1,25 mM | 500 mM | 40 ml ddH20 | |
| A 83-01 | 0,5 μM | 50 mM | DMSO | |
| SB202190 | 10 μM | 50 mM | DMSO | |
| Y27632 | 10 μM | 100 mM | ddH20 | |
| B-27 Additiv | 1X | 50-fach | ||
| Prostaglandin E2 | 1 μM | 10 mM | DMSO | |
| Primocin | 100 μg/ml | 50mg / ml | ||
Tabelle 1: Nahrungsergänzungsmittel für basale und vollständige Organoidmedien
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Discussion
Während 3D-Organoidprotokolle, die aus Blasenkrebsgewebe gewonnen werden, noch in den Kinderschuhen stecken, sind sie ein Bereich der aktiven Forschung und klinischen Untersuchung. Hier wird ein optimiertes Protokoll zur erfolgreichen Etablierung von Blasenkrebs-PDOs beschrieben, die sowohl für NMIBC- als auch für MIBC-Proben geeignet sind. Dieser Workflow integriert sich parallel in klinische Studien im Krankenhaus und berücksichtigt die Rückstellung von Biobankproben, einschließlich der histologischen Probenverarbeitung und des frisch gefrorenen Gewebebankings, was eine wichtige Überlegung für klinische Organoid-Pipelines darstellt. Dieses Protokoll baut auf bestehenden Methoden auf und bietet eine konsolidierte Methodik zum Aufbau einer organoiden Präzisionsmedizin-Pipeline.
Die aktuelle Erfolgsquote dieses Protokolls liegt - wie andere - bei ca. 70%25. Es wird erwartet, dass sich dies mit der Entwicklung der Isolationstechniken und der Charakterisierung der Mikroumgebung des Blasenkrebstumors verbessern wird. Erwartungsgemäß beeinflusst die Qualität der Ausgangsprobe die Erfolgsquote und ist ein wichtiger limitierender Schritt. Proben, die von naiven Chemotherapie-Patienten erhalten wurden, bieten die höchste Erfolgsrate, während diejenigen von Patienten, die eine neoadjuvante Chemotherapie erhalten haben, eine reduzierte Anzahl lebensfähiger Zellenhaben können 26,27. Typischerweise liefern Blasenkrebsproben (sowohl aus TURBT als auch aus Zystektomien) eine große Menge an Proben mit hoher Tumorzellularität. Dies ermöglicht eine robuste Erzeugung von Organoiden im Bereich zwischen 30-100 μm innerhalb einer Wachstumsperiode von 24-72 h (vorausgesetzt, einige <40-μm-Cluster bleiben in den Filtrationsschritten erhalten). Wichtig ist, dass die in Organoidproben (d.h. zystische Formationen und dichtere Strukturen) beobachtete Heterogenität darauf hindeutet, dass dieses Protokoll Bedingungen bietet, die geeignet sind, heterogene Tumorzellpopulationen abzuleiten.
Unser optimiertes Protokoll kann an begrenztem Ausgangsmaterial durchgeführt werden (wie es bei einigen elektiven Operationen der Fall ist, einschließlich TURBT-Verfahren oder Proben, die von Patienten in einer klinischen Studie erworben wurden), was die Einbeziehung mehrerer Analysen zur Maximierung des Probenwerts ermöglicht. Dieses Protokoll enthält Methoden zur Beschreibung von Schritten zum Züchten von 2D-Kultur aus fremden Tumorzellen von Interesse, die sich in großen unlöslichen Geweben befinden können, die während des ersten Filtrationsschritts verarbeitet wurden. Wie andere Forschungsgruppen, die vorschlagen, Proben innerhalb von 24 h nach der Operationzu verarbeiten 28,29, wird beobachtet, dass Gewebehypoxie, die innerhalb dieses Zeitrahmens auftritt, die Erzeugung lebensfähiger Organoide nicht ausschließt. Eine Optimierung ist erforderlich, um die Dichte der Zellaussaat (native Cluster) pro Bohrloch zu bestimmen. Nach unserer Erfahrung kann eine übermäßige Anzahl von Clustern zu einem schlechten Wachstum der Kulturen führen, während Kulturen mit geringer visueller Dichte zum Zelltod führen können. Dies kann vom Anwender empirisch im Kontext seiner Volumina ermittelt werden, die bei Bedarf innerhalb eines Bereichs verdünnt werden können. Darüber hinaus enthalten TURBT-Proben aufgrund des Resektionsprozesses häufig verbrannte Kanten, die sich als prominente nekrotische Regionen zeigen. Ein kritischer Schritt ist die sorgfältige Isolierung von makroskopischem Tumorgewebe und die anschließende Dissektion. Dies ist von größter Bedeutung für die Ableitung lebensfähiger Kulturen und muss mit dem chirurgischen Team kommuniziert werden. In einigen Fällen kann dies eine anfängliche Einschränkung des Verfahrens sein.
Eine zusätzliche Einschränkung der derzeitigen Technik ist das Fehlen der Tumormikroumgebung parallel zu den Organoiden. Eine notwendige Entwicklung werden zukünftige Kokultursysteme sein, um die zelluläre Komplexität zu erhöhen und andere Komponenten der Tumormikroumgebung (d.h. Stroma und Immunzellen) bereitzustellen. Da Organoide als selbstorganisierende Strukturen mit der Fähigkeit definiert sind, ihr Wachstum selbst aufrechtzuerhalten, werden weitere Arbeiten erforderlich sein, um die diskreten Krebsstammzellen (wie CD44 und CD49) aufzuklären, die verbesserte In-vitro-Wachstumseigenschaften ermöglichen können 31,32,33. Es ist von entscheidender Bedeutung, mit Sicherheit festzustellen, dass die PDOs aus Tumorgewebe stammen, da der Beitrag normaler Urothelzellen in funktionellen und molekularen Analysen die Untersuchungen zur Arzneimittelresistenz erschweren wird. Manchmal ist der Tumorursprung der Urothelzellen in den PDOs aufgrund der Verwendung von metastasierendem Gewebe oder papillären Tumoren klar (wie es hier der Fall ist; siehe Abbildung 4), aber wenn das Quellgewebe aus der Blasenschleimhaut herausgeschnitten wird und somit Ränder des gutartigen Urothels enthält, ist es wichtig zu bestätigen, dass die resultierenden PDOs aus Tumorzellen bestehen, die molekulare Techniken verwenden. Daher sind immunhistochemische und genomische Vergleiche zwischen den etablierten Organoiden und dem Primärtumor, von dem sie abgeleitet wurden, erforderlich 30.
In Bezug auf die Anzahl und Größenverteilung der Organoide pro Bohrung ist es schwierig, eine gleichmäßige Beschichtungsdichte von 3D-Organoiden für die Zytotoxizitätsanalyse aufrechtzuerhalten. Dies wird durch die Isolierung definierter Bereiche mithilfe der Filter leicht gemildert, ist jedoch immer noch eine Einschränkung, wenn kleine Cluster und größere Organoide im selben Bohrloch isoliert werden. Große Partikelsortierer können dieses Problem mildern, sind aber in medizinischen Forschungslabors nicht weit verbreitet. Nichtsdestotrotz wurden Techniken zur Messung von Lebensfähigkeitssignalen vor und nach der Behandlung erfolgreich in Blasenkrebs-Organoideneingesetzt 34. Mit dem Fortschritt dieser Technologie wird dies den Forschern ermöglichen, eine Bibliothek von Blasenkrebs-PDOs mit unterschiedlichen genomischen Profilen und pharmakodynamischen Reaktionen zu entwickeln, die zur Untersuchung neuartiger Therapien untersucht werden können. Darüber hinaus ermöglichen das hierin beschriebene Probenentnahmeverfahren und das Dissoziationsverfahren gleichzeitige Präparate für die räumliche Profilierung von Tumoren, die multiparametrische Durchflusszytometrie und die Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Zusammengenommen ermöglicht dies eine Vielzahl von leistungsstarken Endpunkten, die zusammengeführt werden können, um die Tumorheterogenität eines Patienten und die Anwendbarkeit von Medikamenten wie Immuntherapien zu untersuchen.
Zusammenfassend beschreiben wir ein Protokoll zur Etablierung und Bewertung von Kulturen von 3D-Patienten-abgeleiteten Blasenkrebs-Organoiden im Aufkommen von Endpunkten der Präzisionsmedizin. Es ist wichtig zu beachten, dass es sich bei den hier beschriebenen Schritten und Hinweisen um Routineansätze handelt, die zur Isolierung von Blasenkrebs-PDOs in unserem Labor verwendet werden. Das in unserem Verfahren verwendete Kulturmedium wurde ursprünglich für Prostatakrebszellen beschrieben und hat sich nun als geeignet für die Kultur von Blasenkrebs erwiesen. Wichtig ist, dass dieses Protokoll zentralisiert ist, für den routinemäßigen Einsatz in Labors geeignet ist und allgemein auf urologische Krebsarten anwendbar ist. In Kombination mit molekularer High-Fidelity-Phänotypisierung und Arzneimittelreaktionsendpunkten wird diese Technik ein nützliches Werkzeug sein, um das präzise therapeutische Management von Blasenkrebspatienten schnell zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken der technischen Unterstützung des Translational Research Institute Histology Core und der Biological Resource Facility. Diese Forschung wurde durch Mittel aus einem Preis der Princess Alexandra Research Foundation (I.V., E.D.W.) und dem Medical Research Future Fund (MRFF) Rapid Applied Research Translation Program (Centre for Personalised Analysis of Cancers (CPAC; E.D.W., I.V.). Das Translational Research Institute wird von der australischen Regierung unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma-Aldrich | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
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