Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة تربية حشرات الآفات التورتسيد في المختبرات. يتم تحديد إجراءات التمييز بين جنس الحشرات واستخراج الأحماض النووية لتسلسل الإنتاجية العالية باستخدام آفتين ممزقتين.
Abstract
Tortricidae (Lepidoptera) ، المعروف باسم tortrix أو عث الأسطوانة الورقية ، يضم العديد من الآفات الزراعية والحرجية ، والتي تسبب خسائر زراعية خطيرة. لفهم بيولوجيا عث الآفات هذه ، كان هناك طلب كبير على التقنيات الأساسية. هنا ، يتم تطوير طرق للتربية الجماعية والملاحظات والدراسات الجزيئية باستخدام اثنين من تورتريكس الشاي ، Homona magnanima و Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). تم تربية الحشرات على نطاق واسع مع نظام غذائي اصطناعي شرائح والحفاظ عليها عن طريق زواج الأقارب لأكثر من 100 جيل من خلال النظر في خصائصها البيولوجية. الحشرات لديها إزدواج الشكل الجنسي المختلفة. وبالتالي من الصعب التمييز بين الجنس خلال مراحل النمو ، والتي حالت دون إجراء فحوصات لاحقة. وأبرز هذا العمل أنه يمكن تحديد جنس يرقات التورتريسيدات من خلال مراقبة الخصيتين أو تلطيخ أورسين اللاكتيك - الخليك لتصور كروموسوم W الخاص بالإناث. علاوة على ذلك ، باستخدام طرق تحديد الجنس ، مكنت هذه الدراسة من استخراج الأحماض النووية من الأجنة المحددة جنسيا وتطبيقها نحو تسلسل الإنتاجية العالية. هذه النصائح قابلة للتطبيق على حشرات الآفات الأخرى وستسهل المزيد من الدراسات المورفولوجية والجينية.
Introduction
تمثل حشرات Lepidopteran أكثر من 10٪ من جميع الأنواع الحية الموصوفة1 ، وتسبب بعض أنواع الأنواع أضرارا جسيمة للنباتات وخسائر زراعية خطيرة 2,3. على الرغم من أن الدراسات الجزيئية والجينية قد تم تطويرها باستخدام الحشرات النموذجية مثل دودة القز Bombyx mori4,5 ، إلا أن حشرات الآفات لا تزال غير محققة ، ويرجع ذلك جزئيا إلى صعوبات تربية ومناولة 6,7. لذلك ، فإن الدراسات والتقنيات الأساسية ضرورية لفهم بيولوجيا حشرات الآفات غير النموذجية هذه.
يضم Tortricidae (Lepidoptera) ، المعروف باسم tortrix أو عث أسطوانة الأوراق ، العديد من الآفات الزراعية والحرجية8. من بين أنواع الحشرات ، فإن تورتريكس الشاي الشرقي Homona magnanima Diakonoff و tortrix الفاكهة الصيفية Adoxophyes honmai Yasuda هي آفات polyphagous خطيرة معروفة بإتلاف أشجار الشاي في شرق آسيا7. يضع النوعان مجموعات بيض مسطحة وبيضاوية تشبه المقياس (أو كتل البيض) تتكون من بيض رقيق وناعم وهش تغطيه إفرازات الأمهات. على الرغم من أن مراحل التكوين الجنيني حاسمة لتطور الحشرات وتحديد الجنس9 ، إلا أن هياكل البيض تمنع إجراء مزيد من التحليل من فهم بيولوجيا الحشرات. من المهم التغلب على الصعوبات لإجراء مزيد من الدراسة حول الآفات التي تبيض مثل هذه الكتلة البيضاء المعقدة.
هنا ، لفهم بيولوجيا tortricids ، تم تطوير طرق للتربية الجماعية ، والملاحظات ، والدراسات الجزيئية باستخدام A. honmai و H. magnanima. أولا ، تحافظ طرق التربية الجماعية على كل من tortricids على مدى 100 جيل عن طريق التنشئة. وقد سهل فصل البيض عن كتلة البيض المتسلسلة الشبيهة بالمقياس مراقبة التكوين الجنيني للتورتريسيدات باستخدام المذيبات القلوية والعضوية التي تم تطويرها سابقا من التقنيات المستخدمة في الذباب10. بالإضافة إلى ذلك ، أثبتت هذه الدراسة التمييز الجنسي للأجنة الصغيرة من خلال تطوير طرق تلطيخ الكروماتين الجنسي للإناث lepidopteran باستخدام orcein اللاكتيك الخليك11. من خلال الجمع بين هذه الطرق ، تم استخراج الأحماض النووية عالية الجودة والكمية من الأجنة المحددة للجنس ، والتي كان من الصعب تأسيسها6. تم استخدام الحمض النووي الريبي المستخرج لتسلسل الجيل التالي. بشكل جماعي ، تنطبق الطرق المعروضة هنا على حشرات lepidopteran الأخرى وأنواع الحشرات الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جمع الحشرات والتربية الجماعية
- جمع الحشرات tortricid من الحقول التالية نشرت سابقا المراجع 8,12.
ملاحظة: تجمع يرقات H. magnanima و A. honmai من أوراق الشاي التالفة (الشكل 1A) ؛ ينجذب البالغون باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية المحمول 4 واط (الطول الموجي 365 نانومتر ، انظر جدول المواد ، الشكل 1 ب). - قم بتربية اليرقات التي تم جمعها (الشكل 1C ، D) بشكل فردي على قطعة من النظام الغذائي الاصطناعي في كوب 1/2 أوقية لمدة 2-3 أسابيع حتى إكلوزيون البالغين (الشكل 1E ، F). تأكد من جنس الشرانق والبالغين عن طريق السمات المورفولوجية (الشكل 1G ، I).
- تزاوج الذكور والإناث في صندوق بلاستيكي (30 سم × 20 سم × 5 سم) إلى كتل بيض البيض على ورق البارافين (الشكل 1J-L). ضع أنثى واثنين من الذكور في كوب بلاستيكي سعة 120 مل مع قطعة من ورق البارافين لإنشاء خط أمومي.
ملاحظة: من المهم عمل تجاعيد على ورق البارافين. بالنسبة ل H. magnanima، يجب أن يكون ورق البارافين في أسفل العلبة. وفي الوقت نفسه ، بالنسبة ل A. honmai ، ضع ورقة على سقف العلبة لجمع البيض (الشكل 1L) لأن كتلة بيض H. magnanima oviposit على الجانب العلوي من أوراق الشاي ، لكن A. honmai يضع البيض على الجانب السفلي من الأوراق8. تم التحقق من الإجراءات أيضا في الأنواع الأخرى الممزقة ، ومن الأفضل وضع أوراق على كلا الجانبين إذا كانت بيئة وسلوك الأنواع المستهدفة غير واضحة. - قطع كتل البيض (حوالي 100-200 بيضة لكل كتلة بيضة12 ، الشكل 1M) على ورقة البارافين مع مقص. ضع البيض في كوب 1/2 أوقية مع ورق ملقى لمدة 5-7 أيام.
ملاحظة: يظهر الجنين الناضج كبسولة سوداء الرؤوس (الشكل 1N). تعزى فترات التكوين الجنيني بشكل متنوع إلى الأنواع الممزقة ، ولكن بشكل عام بعد 5 أيام من وضع البيض (dpo) ل H. magnanima و 4 dpo ل A. honmai عند 25 درجة مئوية مع رطوبة نسبية 60٪ ، 16 ساعة ضوء / 8 ساعات دورات مظلمة7. - تخزين كتل البيض التي تظهر كبسولات الرأس الأسود في 4-8 درجة مئوية لمدة 7 أيام.
- شريحة ~ 60 غرام من الوجبات الغذائية الاصطناعية باستخدام مبشرة للتربية الجماعية. ضع كتلة البيض المملوءة بالأجنة الناضجة على النظام الغذائي الاصطناعي المقطع في وعاء بلاستيكي (23 سم × 16 سم × 8 سم). ضع أوراق البارافين على كتلة البيض مع الوجبات الغذائية المقطعة إلى شرائح (الشكل 10).
ملاحظة: تعتبر الرطوبة النسبية أقل من 30٪ جافة ، في حين أن أكثر من 70٪ رطبة جدا. من الأفضل إنشاء ثقوب على غطاء الحاوية البلاستيكية لتمكين تهوية أفضل. املأ الثقوب بالقطن لمنع هروب اليرقات الصغيرة. - للقضاء على الملوثات السطحية من البيض ، نقع كتلة البيض في 3 ٪ من الفورمالين و 0.2 ٪ من محلول كلوريد البنزالكونيوم لمدة 5 دقائق ، على التوالي12. للقضاء على الأمعاء أو البكتيريا داخل الخلايا ، استخدم نظاما غذائيا اصطناعيا مكملا ب 0.05٪ (ث / ث) هيدروكلوريد التتراسيكلين أو 0.06٪ (ث / ث) ريفامبيسين بدلا من اتباع نظام غذائي اصطناعي عادي (انظر جدول المواد).
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية. من المهم أن يعجن Silk Mate 2S و 0.05٪ (ث / ث) هيدروكلوريد التتراسيكلين أو 0.06٪ (ث / ث) ريفامبيسين بالتساوي من أجل الاتساق. - جمع الشرانق من الحاوية البلاستيكية وتمييز الجنس على أساس الخصائص المورفولوجية12 (الشكل 1G-I).
ملاحظة: بشكل عام ، تقدم tortricids 5-6 instars حتى الجرو12. تستغرق يرقات H. magnanima و A. honmai 3 أسابيع و 2 أسابيع ، على التوالي ، بعد الفقس حتى الجرو. - ضع 15 ذكرا و 10 إناث في صندوق بلاستيكي (30 سم × 20 سم × 5 سم ، الشكل 1K) للتزاوج مع 25 درجة مئوية ، 16 لتر / 8 د. جمع البيض كل 5-7 أيام وكرر الخطوات 1.4-1.9. لكل جيل.
ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى جمع كتل البيض البيضية حديثا للتحليل اللاحق ، فقم بتعيين بداية الفترة المظلمة ونهايتها ، على سبيل المثال ، من الساعة 9 صباحا إلى الساعة 5 مساء. في هذه الحالة ، عادة ما يقوم H. magnanima و A. honami ببيض البيض بعد 5 ساعات (2 مساء).
2. فصل البيض ويرقات الفارات عن كتل البيض للتثبيت والتخلل والتلطيخ
- نقع كتلة البيض في 1000 ميكرولتر من محلول مائي هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 1.2٪ لمدة 10 دقائق أو في 1000 ميكرولتر من محلول مائي من هيدروكسيد البوتاسيوم 5 م لمدة 30 دقيقة لفصل البيض.
- اغسل البيض المنفصل في 1000 ميكرولتر من PBSt (137 mM NaCl ، 8.1 mM Na 2 HPO 4 ، 2.68 mM KCl ، 1.47 mM KH2PO 4 ، 0.05٪من Polyoxyethylene (20) Sorbitan Monolaurate [Tween-20] pH7.4 ، انظر جدول المواد) بعد التقريرالمنشور سابقا 7.
- نقع البيض في خليط من 500 ميكرولتر من الهيبتان 100 ٪ و 500 ميكرولتر من محلول 4 ٪ paraformaldehyde-PBSt (ث / v). امزج لمدة 10 دقائق عند 1500 دورة في الدقيقة باستخدام خلاط دوامة.
- نقع البيض في خليط من 500 ميكرولتر من الهيبتان 100٪ و 500 ميكرولتر من الميثانول 100٪. امزج لمدة 10 دقائق عند 1500 دورة في الدقيقة.
- اغسل البيض مرتين ب 1000 ميكرولتر من الميثانول بنسبة 100٪ وخزنه عند 4 درجات مئوية في الميثانول بنسبة 100٪ حتى إجراء المزيد من التجارب (الشكل 2A).
ملاحظة: يمكن تخزين البيض لمدة 1 سنة على الأقل عند 4 درجات مئوية. - نقع البيض بالتتابع في 99٪ ، 70٪ ، 50٪ من الإيثانول ، و PBSt لمدة 5 دقائق لكل منهما للتحلل المائي بعد التقريرالمنشور سابقا 7.
- اغسل البيض باستخدام PBSt ، واغمر البيض في 1 ميكروغرام / مل من محلول DAPI لمدة 5 دقائق ، ثم اغسل البيض باستخدام 1x PBS مرتين. نقع البيض في 20 ميكرولتر من محلول أورسين لاكتيك أسيتيك أسيتيك بنسبة 1.25٪ (ث / ث) (انظر جدول المواد)11 لتصور الهيتيروكروماتين حتى تظهر النوى لونا أحمر لامعا (وهذا يتراوح من 5-60 دقيقة) (الشكل 2B ، C).
ملاحظة: تعتمد فترات تلطيخ أورسين اللاكتيك والخليك على درجة الحرارة والرطوبة. من الأفضل التحقق من التلطيخ المناسب باستخدام المجهر مع تكبير 4x-10x. - انقل البيض الملون باستخدام ماصة إلى شريحة زجاجية. أرفق البيض الملون بكاشف مضاد للتلاشي (انظر جدول المواد) وزجاج غطاء7.
- استخراج يرقات H. magnanima و A. honmai (4-5 أيام بعد وضع البيض (dpo)) من كتل البيض باستخدام ملقط (الشكل 2D). تقسيم اليرقات على شريحة زجاجية (الشكل 2E).
- إصلاح أي أنسجة (على سبيل المثال ، العقدة تحت المريء ، العقد الصدرية ، نبيب malpighian ، إلخ) بمزيج من 1: 3 (v / v) 99.7٪ حمض الخليك / 100٪ ميثانول لمدة 5 دقائق. قم بتلطيخ تلك التي تحتوي على محلول أورسين لاكتيك أسيتيكبنسبة 1.25 ٪ (ث / ث) 11 حتى تلطخ النوى (قد يستغرق ذلك 5-60 دقيقة ، اعتمادا على درجة الحرارة والرطوبة).
- حدد جنس كل عينة من خلال ملاحظة وجود (أنثى) أو غياب (ذكر) من heterochromatin (كروموسوم W ، الشكل 2F ، G) تحت المجهر.
ملاحظة: يتم تحديد الجنس عن طريق تصور كروماتين الجنس. تمثل كل خلية الكروماتين الجنسي كنقطة في الإناث 11,12 ، في حين أن الجزء المتبقي من أنسجة يرقات الفارات (غير الثابتة) يجب أن يكون مغمورا على الفور في مخزن تحلل الخلاياالمخزن المؤقت 12 (10 mM Tris-HCl ،100 mM EDTA ، و 1٪ SDS ، الرقم الهيدروجيني 8.0) أو كواشف استخراج الحمض النووي الريبي المحتوية على الفينول إما لاستخراج الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي. قبل التشريح ، قم بتوزيع 20 ميكرولتر من الكواشف في أنابيب PCR سعة 0.2 مل مقدما (الشكل 3A). اغمر العينات وخزنها عند -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخراج. يمكن تخزين العينات لمدة 3 أشهر على الأقل ، ولكن من الأفضل المضي قدما في التجارب النهائية لمنع تدهور الأحماض النووية.
3. استخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي من يرقات الفارات المحددة جنسيا
- تجمع 12 يرقات الفارات الذكور أو الإناث المحددة حسب الجنس (5 جنين dpo) وأضف إما المخزن المؤقت لتحلل الخلايا أو كواشف استخراج الحمض النووي الريبي (انظر الخطوة 2.11 وجدول المواد) في أنبوب واحد 1.5 مل.
ملاحظة: اتبع الخطوات 3.2-3.7 لاستخراج الحمض النووي والخطوات 3.8-3.11 لاستخراج الحمض النووي الريبي. - تجانس الأنسجة في 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا (10 mM Tris-HCl و 100 mM EDTA و 1٪ SDS و pH 8.0) ، وطرد مركزي للعينات عند 10000 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- جمع supernatant (500 ميكرولتر) باستخدام ماصة وحضانت عند 50 درجة مئوية مع 1.5 ميكرولتر من Proteinase K (20 ملغ / مل ، انظر جدول المواد) لمدة 5 ساعات على كتلة حرارية.
- عالج العينات ب 1.0 ميكرولتر من محلول RNase 10 ملغم / مل (انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- أضف 200 ميكرولتر من محلول ترسيب البروتين (انظر جدول المواد) إلى الأنابيب7 ، متبوعا بجهاز طرد مركزي عند 17000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- امزج السوبرناتانت (500 ميكرولتر) مع 500 ميكرولتر من الأيزوبروبانول بنسبة 100٪ ، ثم جهاز طرد مركزي عند 20400 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- اغسل الحمض النووي الحبيبي مرتين باستخدام 1000 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪. ثم ، جافة في الهواء (5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة) ، قم بإذابة الحمض النووي في 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت Tris-Cl 10 mM (الرقم الهيدروجيني 8.5).
- تجانس الأنسجة في 600 ميكرولتر من كواشف استخراج الحمض النووي الريبي وإضافة 240 ميكرولتر من الماء المقطر فائق النقاء إلى الأنبوب. جهاز طرد مركزي للأنابيب عند 12000 × g لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- امزج السوبرناتانت (600 ميكرولتر) مع 600 ميكرولتر من الأيزوبروبانول بنسبة 100٪ وانقل الخليط إلى عمود دوران السيليكا (انظر جدول المواد). جهاز الطرد المركزي للأنابيب عند 17900 × g لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- اغسل العمود ب 750 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪ ، وقم بالطرد المركزي للعمود مرتين عند 17900 × g لمدة 1 دقيقة لكل منهما عند 4 درجات مئوية.
- قم بتحميل 15 ميكرولتر من الماء المقطر فائق النقاء إلى العمود. جهاز الطرد المركزي للأنابيب عند 17900 × g لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية لتقوية الحمض النووي الريبي.
- حساب والتحقق من نوعية وكمية الحمض النووي والحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي القائم على الأشعة فوق البنفسجية. تقييم نقاء الأحماض النووية باستخدام نسب A260/A280 (الأحماض النووية/البروتين) و A260/A230 (الأحماض النووية/الأملاح والملوثات الأخرى)13.
ملاحظة: بالنسبة لاستخراج الحمض النووي الريبي، تم اتباع الإجراء12 المنشور سابقا، مما أدى إلى تلوث الفينول (الجدول 1). ينتج الحمض النووي المستخرج والحمض النووي الريبي من جنين واحد أو يرقات الفارات عينات منخفضة الكمية ومنخفضة الجودة. عادة ، ينتج عن استخراج الحمض النووي من 12 يرقات الطور 100-600 نانوغرام ، في حين أن استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام الطريقة الحالية يولد 900-1500 نانوغرام ، كما هو موضح في الجدول 1.
ملاحظة: الخطوات من 3.13 إلى 3.15 اختيارية لإجراء المزيد من الفحوصات لتسلسلات الإنتاجية العالية. - احسب كميات الحمض النووي والحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي القائم على التألق.
ملاحظة: تم حساب نسبة كميات الحمض النووي الريبي (التركيز القائم على الأشعة فوق البنفسجية (ng/μL)/التركيز القائم على التألق (ng/μL)) لتقييم الجودة لمزيد من التطبيق التجريبي. فعلى سبيل المثال، عندما تكون التركيزات القائمة على الأشعة فوق البنفسجية والتألق 80 نانوغرام/لتر و60 نانوغرام/سولتر، على التوالي، ستكون النسبة 1.5 (80/60). وعادة ما تشير النسب التي تقل عن 1.5 إلى النقاء الكافي للتطبيقات النهائية باستخدام تسلسل الإنتاجية العالية13. - تحليل جودة الحمض النووي الريبي باستخدام الرحلان الكهربائي للرقاقة الدقيقة14.
- استخدم الحمض النووي الريبي المؤهل لإعداد مكتبة الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة إعداد مكتبة الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد). تسلسل المكتبات باستخدام منصة مناسبة للمكتبات المعدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إنشاء الخطوط المضيفة وصيانتها
وتعزى صلاحية اليرقات المجمعة ميدانيا بشكل مختلف إلى الموقع الميداني والمواسم وظروف التربية (على سبيل المثال، 90٪ من قابلية البقاء في تايوان، تاويوان، كما هو موضح في Arai et al.12). ما يقرب من 30٪ -50٪ من الأزواج ستولد الجيل التالي كالمعتاد. بالنسبة ل H. magnanima و A. honmai ، تم الحفاظ على سلالات الأمهات عن طريق زواج الأقارب لأكثر من 100 جيل.
الملاحظات المورفولوجية وتحديد الجنس
العلاج إما بهيدروكسيد البوتاسيوم (3 أو 5 M KOH) أو هيبوكلوريت الصوديوم (1.2٪ Cl2 أو NaClO) يفصل البيض عن كتل البيض المتسلسلة (الشكل 2A). التركيز المنخفض للكواشف لا يمكن أن يحقق الفصل. مكنت جميع خطوات التثبيت والاختراق والتلطيخ من تصور النوى باستخدام محلول DAPI. لم يكن البيض المعالج ب KOH أو NaClO فقط (منفصلا) بدون خطوات التثبيت والتخلل ملطخا بهذه الأصباغ7. لم تكن كتل بيض H. magnanima غير المعالجة ملطخة. يصبغ أورسين اللاكتيك الخليك هيتيروكروماتين (كروموسوم W) بلون أحمر داكن ونوى ذات لون أحمر فاتح كالمعتاد (الشكل 3A). يتيح هذا التلطيخ تحديد الجنس بسهولة وسرعة من 4 جنين dpo إلى يرقات instar السادسة. على الرغم من تصور النوى في أجنة 0-3 dpo ، كان من الصعب مراقبة كروموسوم W مع تكبير 400x.
تم الحصول على الحمض النووي عالي الجودة والحمض النووي الريبي من الأجنة المحددة جنسيا والمجمعة
من 12 يرقات مرحلية ، حمض نووي عالي الجودة (A260 / A280 = 1.7-2.0 ؛ A260/A230 = 1.7-2.4) تم استخراجها بكمية إجمالية تتراوح بين 100 و 600 نانوغرام (الجدول 1). على الرغم من أن الحمض النووي الريبي المستخرج باتباع الطريقة المنشورة سابقا12 أنتج منتجا يتراوح بين 500 و 1000 نانوغرام بجودة منخفضة: A260 / A280 = 1.7-2.1 ؛ A260/A230 = 0.1-0.5 (الجدول 1)، أدت البروتوكولات المعدلة باستخدام عمود الدوران إلى تحسين جودة الحمض النووي الريبي، حيث أنتجت منتجا يتراوح حجمه بين 900 و1500 نانوغرام مع A260/A280 = 1.9-2.1 وA260/A230 = 1.9-2.3 (الجدول 1). وعلاوة على ذلك، كانت نسبة تركيز الحمض النووي الريبي (القيم القائمة على الأشعة فوق البنفسجية/التألق Qbit) للبروتوكول المعدل أقل من 1.2، مما يفي بمتطلبات الجودة للجيل التالي من التسلسل13. وعلى العكس من ذلك، كانت نوعية وكمية الأحماض النووية المستخرجة من جنين واحد منخفضة جدا بحيث لا يمكن حسابها. كما تم تأكيد سلامة الحمض النووي الريبي المستخرج من يرقات الطور المحددة حسب الجنس باستخدام البروتوكول المعدل باستخدام الرحلان الكهربائي للرقاقة الدقيقة (الشكل 3B). وتم التأكد من أن المكتبات المعدة حققت درجات عالية من نقاط الربع 30 (الجدول 2).
الشكل 1: نظرة عامة على جمع الحشرات والتربية الجماعية ل H. magnanima و A. honmai. (A) أوراق الشاي والأعشاش التي تضررت من اليرقات. (ب) مصيدة الضوء مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. (ج، د) أنثى (C) وذكر (D) 6اليرقة instar من H. magnanima. يشير المثلث البرتقالي إلى الخصية. (E,F) تم تربية اليرقات التي تم جمعها بشكل فردي في كوب 1/2 أوقية مع قطعة من النظام الغذائي الاصطناعي. (ز، ح) شرنقاء H. magnanima (G) و A. honmai (H). تظهر الأنثى على اليسار ، بينما يظهر الذكر على اليمين. (I) البالغون من H. magnanima (أعلاه) و A. honmai (أدناه). يظهر كل من الذكور والإناث على اليمين واليسار ، على التوالي. (ي، ك) كيس بلاستيكي (J) أو كيس بلاستيكي (K) لجمع كتلة البيض. (L) بيض A. honmai oviposit على ورق البارافين الموضوع على الغطاء ، و H. magnanima وضع البيض على ورق البارافين الموضوع في الجزء السفلي من القضية. (م، ن) كتلة البيض من H. magnanima. تظهر الأجنة الناضجة كبسولات رأس سوداء موضحة بأسهم بيضاء (N). (O) شرائح الوجبات الغذائية الاصطناعية مع مبشرة للتربية الجماعية. ستشكل اليرقات التي تفقس من البيض ، الموضوعة على النظام الغذائي المقطع ، شرانق بعد 3-4 أسابيع من الفقس عند 25 درجة مئوية (أقل من 16 ساعة ضوء / 8 ساعات دورة مظلمة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ملاحظات الأجنة . (أ) البيض المنفصل والثابت والمتخلل من H. magnanima باستخدام 5 N KOH ، 4٪ PFA / heptane ، الميثانول / الهيبتان ، والميثانول. يتم تمييز بيضة منفصلة بخطوط مكسورة. (ب) كان الجنين 3 dpo ملطخا بأورسين لاكتيك أسيتيك. يشير رأس السهم الأسود إلى الجنين. (ج) كان الجنين 4 dpo ملطخا ب DAPI. يشير رأس السهم الأبيض إلى الجنين. (دال، هاء) تشريح يرقات الفارات (5 dpo) باستخدام الملقط. يتم استخراج يرقات الفارات من كتلة البيض (D) ، مقسمة على شريحة زجاجية (E). (F,G) تلطيخ أورسين اللاكتيك الخليك باستخدام يرقات الفيرات التشريحية. تظهر الإناث heterochromatin كنقطة (يشار إليها برأس السهم الأسود ، (F) ، ولكن الذكور يفتقرون إلى heterochromatin (G). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: ملخص بياني لاستخراج الحمض النووي باستخدام يرقات الفارات المحددة حسب الجنس وخصائص الحمض النووي الريبي ل H. magnanima و A. honmai. (أ) تم تلطيخ أنسجة يرقات الفارات المشوهة على الشرائح الزجاجية بأورسين اللاكتيك - الخليك لتحديد جنسها. تم نقع الأنسجة المتبقية في الكواشف ، وتجميعها في أنبوب واحد تم فرزه حسب جنس الأفراد ، ثم تم إخضاعها لاستخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي. (ب) تم تقييم نوعية الحمض النووي الريبي المستخرج من 12 ذكرا من H. magnanima أو A. honmai باستخدام نظام الرحلان الكهربائي للرقاقة الدقيقة. الاختصارات: [nt], حجم النيوكليوتيدات; [FU]، وحدة التألق؛ M ، علامة جزيئية ؛ صاحب الجلالة ، ه. ماغناميما. Ad, A. honmai. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: تركيز ونوعية الأحماض النووية المستخرجة من يرقات الفارات المحددة جنسيا من H. magnanima. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: صفات البيانات الخام لتسلسل الحمض النووي الريبي. 1 تشير Q20 (٪) إلى احتمال القراءة بدقة قراءة تبلغ 99٪. 2 تشير Q30 (٪) إلى احتمال القراءة بدقة قراءة تبلغ 99.9٪. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يضم Tortricid العديد من الآفات الزراعية والحرجية. قدمت هذه الدراسة طرقا لتربية التورتريكس على مر الأجيال، ومراقبة التكوين الجنيني وجنس الحشرات، وإجراء التحليل الجزيئي باستخدام الأجنة الناضجة.
واحدة من العقبات التي تحول دون دراسة الحشرات الآفات هي إنشاء طرق التربية. على وجه الخصوص ، يؤثر زواج الأقارب في بعض الأحيان على لياقة الأنواع بشكل سلبي. وقد لوحظ على نطاق واسع انخفاض اللياقة البدنية من قبل المولودين ، ويسمى اكتئاب زواج الأقارب ، في مختلف النباتات والحيوانات ، بما في ذلك الحشرات15،16،17،18. كما لوحظ ، تم الحفاظ على كل من H. magnanima و A. honmai لأكثر من 100 جيل (أكثر من 10 سنوات) دون أي تكاليف واضحة للياقة البدنية. على الرغم من أنه لا يكفي تقييم ما إذا كانت التورتريسيدات الأخرى لديها أيضا قدرة عالية على تحمل زواج الأقارب بشكل عام ، إلا أن النوعين ربما طورا الخصائص من خلال تكييف الظروف البيئية الرتيبة (أي مزارع الشاي) وضد العديد من الكائنات الحية الدقيقة التكافلية الداخلية (على سبيل المثال ، Wolbachia11,12 ). يمكن الحصول على بيض النوعين بسهولة ، ولكن سلوكيات وضع البيض تعزى بشكل مختلف إلى بيئتهما. في الواقع ، يبدو أن الرطوبة واتجاه التجعد يؤثران بشكل مباشر على عدد البيض البيضي ، والذي قد يعكس التاريخ الطبيعي للحشرات في الحقول. من المهم تعديل طرق التربية للأنواع فيما يتعلق بخصائصها البيولوجية في الطبيعة.
مكنت البروتوكولات التي تم وضعها في هذه الدراسة من مراقبة التكوين الجنيني والدراسات الجزيئية باستخدام الأجنة واليرقات الناضجة المحددة حسب الجنس. يتم طلاء بيض الحشرات بشكل عام بعدة طبقات قذيفة10,19. علاوة على ذلك ، يتم تغطية بيض H. magnanima و A. honmai بإفرازات الأمهات. لتلطيخ البيض بمثل هذه البنية المعقدة ، يبدو أن الفصل والتثبيت والتخلل أمر ضروري. في Ostrinia furnacalis (Crambidae) ، التي تبيض كتلة البيض الشبيهة بالمقياس مثل H. magnanima و A. honmai ، تم اقتراح بروتوكولات تحديد الجنس القائمة على PCR باستخدام أجنة مفردة ، ولكن انخفاض جودة وكمية الأحماض النووية كانت مشكلة للتحليل اللاحق 6,20. في المقابل، اقترحت هذه الدراسة استخراج الأحماض النووية من الأجنة المجمعة المحددة للجنس بعد مراقبة الكروماتين الجنسي الخاص بالإناث. يتحلل الحمض النووي الريبي بسهولة ، ولم يؤثر إجراء الاستخراج الموضح هنا على جودة الحمض النووي الريبي ، والذي تم تأكيده أيضا من خلال تحليل النسخ (RNA-seq). التقنيات الموضحة هنا قابلة للتطبيق لدراسات التكوين الجنيني لأنواع الحشرات المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البروتوكولات لديها إمكانات لاستخدامها لتقييم آثار المبيدات الحشرية الكيميائية أو الميكروبات داخل الخلايا مثل Wolbachia ، والتي تسبب عيوبا خاصة بالجنس أثناء تكوين الأجنة6،11،12.
وتنطوي هذه الدراسة على عدة قيود. أولا ، كان من الصعب تحديد جنس الأجنة غير الناضجة (0-3 dpo) باستخدام تلطيخ أورسين اللاكتيك الخليك في H. magnanima و A. honmai. وذلك لأن عدد وحجم النوى صغيران بشكل عام خلال التكوين الجنيني المبكر ، مما يجعل من الصعب مراقبة كروموسوم W. لتوضيح جنس التورتريسيدات أثناء التكوين الجنيني المبكر ، يمكن أن يكون الكشف عن العلامات على الكروموسومات الجنسية 6,20 وتحديدها كميا نهجا بديلا. ثانيا، كان من الصعب استخراج الأحماض النووية ذات النقاء العالي من فرد واحد بعد تحديد الجنس، ربما بسبب العدد الصغير من الخلايا. ومع ذلك ، قد ينطبق الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي المستخرج من جنين واحد على التحليلات اللاحقة مثل اختبارات PCR وتسلسل الخلية الواحدة.
وباختصار، يصف هذا البروتوكول التربية الجماعية، والملاحظات المورفولوجية، والتحليلات الجينية لبيض حشرتين غير نموذجيتين من آفات ليبيدوبتيران، هما H. magnanima و A. honmai. ومن المتوقع أن تكون هذه التقنيات البسيطة قابلة للتطبيق لمزيد من البحوث على tortricid ، والحشرات lepidopterans الأخرى ، وغيرها من الأصناف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يود المؤلفون الاعتراف بالدعم المقدم من زمالات أبحاث الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) للعلماء الشباب [رقم المنحة 19J13123 و 21J00895].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 ounce cup | FP CHUPA | CP070009 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2 ounce cup lid | FP CHUPA | CP070011 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99.7% acetic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| benzalkonium chloride solution | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Cotton | AOUME | 8-1611-02 | insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| DAPI solution | Dojindo, Tokyo, Japan | 340-07971 | stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Disodium Hydrogenphosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS quantification kit | Invitrogen | Q33231 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II column | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Ethanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Glassine paper | HEIKO | 2100010 | insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw |
| heat block WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japan | 4002620 | incubation; https://www.attoeng.site/ |
| heptane | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Lactic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| methanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photometer NP 80 | Implen | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7770S | Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | not shown | Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Potassium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinase K Solution | Merck | 71049-4CN | DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| protein precipitation solution | Qiagen | 158912 | DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| rifampicin | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| RNA HS quantification kit | Invitrogen | Q32855 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase solution | Nippon Gene | 313-01461 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Sodium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Sodium Dodecyl Sulfate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| sodium hypochlorite aqueous solution | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Tetracycline Hydrochloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977023 | RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
References
- Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
- Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1 (2002).
- Matsuura, H., Naito, A. Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan. Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).
- Mita, K., et al. The construction of an EST database for Bombyx mori and its application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).
- Kawamoto, M., et al. High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).
- Fukui, T., et al. In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).
- Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis. Entomological Science. 25 (1), 12497 (2022).
- vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. Tortricid pests: their biology, natural enemies and control. , Elsevier Science Publishers. Amsterdam. (1991).
- Kiuchi, T., et al. A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm. Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).
- Kageyama, D., Traut, W. Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis. Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).
- Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima. Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).
- Schalamun, M., et al. Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora. Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).
- Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10 (1), 159 (2010).
- Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments. Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).
- Saccheri, I., et al. Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation. Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).
- Crnokrak, P., Roff, D. A.
- Keller, L. F., Waller, D. M.
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).
- Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host. Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).
