Summary
Het huidige protocol beschrijft de kweekmethode van tortricid plaaginsecten in de laboratoria. De procedures om het geslacht van insecten te onderscheiden en nucleïnezuren te extraheren voor sequencing met hoge doorvoer worden vastgesteld met behulp van twee tortricid-plagen.
Abstract
Tortricidae (Lepidoptera), algemeen bekend als tortrix of bladrollermotten, bevat veel land- en bosbouwplagen, die ernstige landbouwverliezen veroorzaken. Om de biologie van dergelijke plaagmotten te begrijpen, zijn fundamentele technieken erg in trek geweest. Hier worden methoden voor massa-opfok, observaties en moleculaire studies ontwikkeld met behulp van twee theetort, Homona magnanima en Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Insecten werden massaal gekweekt met gesneden kunstmatig dieet en onderhouden door inteelt gedurende meer dan 100 generaties door rekening te houden met hun biologische kenmerken. Insecten hebben verschillende geslachtsdimorfismen; daarom is het moeilijk om het geslacht te onderscheiden tijdens de ontwikkelingsstadia, die latere assays hebben voorkomen. Het huidige werk benadrukte dat het geslacht van tortricidslarven kon worden bepaald door testikels of melk-azijnachtige orceïnekleuring te observeren om het vrouwspecifieke W-chromosoom te visualiseren. Bovendien maakte de huidige studie, met behulp van de geslachtsbepalingsmethoden, nucleïnezuurextracties uit geslachtsbepaalde embryo's en toepassing op high throughput sequencing mogelijk. Deze tips zijn toepasbaar op andere plaaginsecten en zullen verdere morfologische en genetische studies vergemakkelijken.
Introduction
Lepidopteran insecten vertegenwoordigen meer dan 10% van alle beschreven levende soorten1, en bepaalde taxa soorten veroorzaken ernstige schade aan planten en ernstige landbouwverliezen 2,3. Hoewel moleculaire en genetische studies zijn ontwikkeld met behulp van modelinsecten zoals de zijderups Bombyx mori 4,5, blijven plaaginsecten onbeproefd, mede vanwege de moeilijkheden voor het fokken en hanterenvan 6,7. Daarom zijn fundamentele studies en technieken nodig om de biologie van dergelijke niet-model plaaginsecten te begrijpen.
De Tortricidae (Lepidoptera), algemeen bekend als tortrix of bladrollermotten, omvat veel land- en bosbouwplagen8. Van de insectentaxa zijn de oosterse theeschildpad Homona magnanima Diakonoff en de zomerfruittort Adoxophyes honmai Yasuda ernstige polyfagote plagen waarvan bekend is dat ze theebomen in Oost-Azië beschadigen7. De twee soorten leggen platte en ovale schubachtige eierclusters (of eimassa's) bestaande uit dunne, zachte en fragiele eieren bedekt met maternale afscheidingen. Hoewel embryogenesestadia cruciaal zijn voor de ontwikkeling van insecten en geslachtsbepalingen9, verhinderen structuren van de eieren verdere analyse om de biologie van de insecten te begrijpen. Het is belangrijk om de moeilijkheden te overwinnen voor verder onderzoek naar plagen die zo'n complexe eimassa verankeren.
Hier, om de biologie van tortriciden te begrijpen, zijn methoden voor massa-opfok, observaties en moleculaire studies ontwikkeld met behulp van A. honmai en H. magnanima. Ten eerste onderhouden massafokmethoden beide tortriciden gedurende 100 generaties door inteelt. De scheiding van eieren van de aaneengeschakelde schubachtige eimassa vergemakkelijkte embryogenese-observatie van de tortriciden met behulp van alkalische en organische oplosmiddelen die eerder waren ontwikkeld op basis van technieken die bij vliegenwerden gebruikt 10. Bovendien stelde de huidige studie geslachtsdiscriminatie van kleine embryo's vast door kleuringsmethoden van het geslachtschromatine van lepidoptera-vrouwtjes te ontwikkelen met behulp van melkzuur-azijn orceïne11. Door deze methoden te combineren, werden nucleïnezuren van hoge kwaliteit en kwantiteit geëxtraheerd uit geslachtsbepaalde embryo's, wat anders moeilijk vast te stellen was6. Het geëxtraheerde RNA werd gebruikt voor sequencing van de volgende generatie. Gezamenlijk zijn de hier gepresenteerde methoden van toepassing op andere lepidoptera-insecten en andere insectentaxa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Insectenverzameling en massale kweek
- Verzamel tortricid insecten uit velden volgens eerder gepubliceerde referenties 8,12.
OPMERKING: De larven H. magnanima en A. honmai worden verzameld uit beschadigde theebladeren (figuur 1A); volwassenen worden aangetrokken met behulp van 4 W draagbaar UV-licht (365 nm golflengte, zie Tabel met materialen, figuur 1B). - Kweek de verzamelde larven (figuur 1C, D) individueel op een stuk kunstmatig dieet in een 1/2-oz cup gedurende 2-3 weken tot volwassen eclosie (figuur 1E, F). Bevestig het geslacht van poppen en volwassenen door morfologische kenmerken (figuur 1G,I).
- Paar de mannetjes en vrouwtjes in een plastic doos (30 cm x 20 cm x 5 cm) tot legoviposit-eimassa's op een paraffinepapier (figuur 1J-L). Plaats een vrouwtje en twee mannetjes in een plastic beker van 120 ml met een stuk paraffinepapier om een matriline vast te stellen.
OPMERKING: Het is belangrijk om vouwen op het paraffinepapier te maken. Voor H. magnanima moet paraffinepapier op de bodem van de behuizing liggen. Leg ondertussen voor A. honmai een papier op het kastplafond om eieren te verzamelen (figuur 1L) omdat H. magnanima oviposit eiermassa aan de bovenkant van theebladeren, maar A. honmai legt eieren aan de onderkant van de bladeren8. De procedures werden ook geverifieerd in andere tortricid-soorten en het is beter om papieren aan beide zijden te plaatsen als de ecologie en het gedrag van de doelsoort niet zijn aangegeven. - Knip de eimassa's (ongeveer 100-200 eieren per eimassa12, figuur 1M) op het paraffinepapier met een schaar uit. Plaats de eieren in een 1/2 oz kopje met gedumpt papier gedurende 5-7 dagen.
OPMERKING: Het gerijpte embryo vertoont een mee-eterskapsel (figuur 1N). De perioden van embryogenese worden divers toegeschreven aan tortricid-soorten, maar over het algemeen 5 dagen na ovipositie (dpo) voor H. magnanima en 4 dpo voor A. honmai bij 25 °C met 60% relatieve vochtigheid, 16 h licht / 8 h donkere cycli7. - Bewaar de eimassa's met zwarte kopcapsules bij 4-8 °C gedurende 7 dagen.
- Snijd ~ 60 g kunstmatige diëten met behulp van een rasp voor massale opfok. Plaats de met gerijpte embryo's gevulde eimassa op het gesneden kunstmatige dieet in een plastic bakje (23 cm x 16 cm x 8 cm). Leg paraffinepapierjes op de eimassa met de gesneden diëten (figuur 10).
OPMERKING: Minder dan 30% relatieve vochtigheid wordt als te droog beschouwd, terwijl meer dan 70% te vochtig is. Het maken van gaten in het deksel van de plastic container is beter om een betere ventilatie mogelijk te maken. Vul de gaten met katoen om het ontsnappen van kleine larven te voorkomen. - Om oppervlakteverontreinigingen uit de eieren te verwijderen, weekt u de eimassa gedurende 5 minuten in respectievelijk12 in 3% formaline en 0,2% benzalkoniumchlorideoplossing. Om darm- of intracellulaire bacteriën uit te roeien, gebruikt u een kunstmatig dieet aangevuld met 0,05% (w / w) Tetracycline hydrochloride of 0,06% (w / w) rifampicine in plaats van een normaal kunstmatig dieet (zie Tabel met materialen).
OPMERKING: Deze stap is optioneel. Het is belangrijk om Silk Mate 2S en 0,05% (w / w) Tetracycline hydrochloride of 0,06% (w / w) rifampicine gelijkmatig te kneden voor consistentie. - Verzamel de poppen uit de plastic container en onderscheid het geslacht op basis van morfologische12 kenmerken (figuur 1G-I).
OPMERKING: Over het algemeen presenteren tortriciden 5-6 instars tot verpopping12. De larven H. magnanima en A. honmai doen er respectievelijk 3 weken en 2 weken over na het uitkomen tot de verpopping. - Plaats 15 mannetjes en 10 vrouwtjes in een plastic doos (30 cm x 20 cm x 5 cm, figuur 1K) voor paring met 25 °C, 16 L/8 D. Verzamel eieren per 5-7 dagen en herhaal stappen 1,4-1,9. voor elke generatie.
OPMERKING: Als het verzamelen van nieuw oviposited eimassa's voor latere analyse nodig is, stel dan het begin en einde van de donkere periode in, bijvoorbeeld van 9.00 tot 17.00 uur. In deze toestand leggen H. magnanima en A. honami meestal eicellen na 5 uur (14.00 uur).
2. Scheiding van eieren en faraatlarven van eiermassa's voor fixatie, permeabilisatie en kleuring
- Week de eimassa gedurende 10 minuten in 1.000 μL 1,2% natriumhypochloriet-waterige oplossing of gedurende 30 minuten in 1.000 μL 5 M kaliumhydroxide-waterige oplossing om de eieren te scheiden.
- Was de gescheiden eieren in 1.000 μL PBSt (137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 0,05% Polyoxyethyleen (20) Sorbitan Monolauraat [Tween-20] pH 7,4, zie Materialentabel) na het eerder gepubliceerde rapport7.
- Week eieren in een mengsel van 500 μL van 100% heptaan en 500 μL van 4% paraformaldehyde-PBSt oplossing (w/v). Mix gedurende 10 minuten bij 1.500 rpm met behulp van een vortexmixer.
- Week de eieren in een mengsel van 500 μL 100% heptaan en 500 μL 100% methanol. Mix gedurende 10 min bij 1.500 rpm.
- Was de eieren tweemaal met 1.000 μL 100% methanol en bewaar bij 4 °C in 100% methanol tot verdere experimenten (figuur 2A).
LET OP: De eieren kunnen minstens 1 jaar bewaard worden bij 4 °C. - Week de eieren achtereenvolgens in 99%, 70%, 50% ethanol en PBSt gedurende 5 minuten elk voor hydrofilisatie volgens het eerder gepubliceerde rapport7.
- Was de eieren met PBSt, dompel de eieren gedurende 5 minuten onder in 1 μg/ml DAPI-oplossing en was de eieren vervolgens tweemaal met 1x PBS. Week de eieren in 20 μL van 1,25% (w/w) melk-azijnoplossing (zie Tabel met materialen)11 om heterochromatine te visualiseren totdat de kernen een schitterende rode kleur vertonen (dit varieert van 5-60 min) (Figuur 2B,C).
OPMERKING: De melkzuur-azijn orceïne kleuring periodes zijn afhankelijk van temperatuur en vochtigheid. Het is beter om te controleren op de juiste kleuring met behulp van een microscoop met 4x-10x vergroting. - Breng de bevlekte eieren met een pipet over op een glazen schuif. Omsluit de bevlekte eieren met antifadereagens (zie Materiaaltabel) en een afdekglas7.
- Extraheer pharaat H. magnanima en A. honmai larven (4-5 dagen na ovipositie (dpo)) uit de eimassa's met behulp van een tang (figuur 2D). Bisectlarven op een glasplaat (figuur 2E).
- Fixeer alle weefsels (bijv. subofoesofageaal ganglion, thoracale ganglia, malpighian tubulus, enz.) met een mengsel van 1:3 (v/v) 99,7% azijnzuur/100% methanol gedurende 5 minuten. Kleur die met 1,25% (w / w) melkzuur-azijnoplossing11 totdat de kernen zijn gekleurd (dit kan 5-60 minuten duren, afhankelijk van de temperatuur en vochtigheid).
- Bepaal het geslacht van elk monster door de aanwezigheid (vrouwelijk) of afwezigheid (mannelijk) van heterochromatine (het W-chromosoom, figuur 2F, G) onder een microscoop te observeren.
OPMERKING: Het geslacht wordt bepaald door het geslacht chromatine te visualiseren. Elke cel vertegenwoordigt het geslacht chromatine als een stip in vrouwtjes11,12, terwijl het resterende deel van faraat larvale weefsels (niet gefixeerd) onmiddellijk moet worden ondergedompeld in cellysisbuffer12 (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA en 1% SDS, pH 8,0) of fenolbevattende RNA-extractiereagentia voor DNA- of RNA-extractiereagentia. Geef vóór de dissecties vooraf 20 μL van de reagentia af in PCR-buizen van 0,2 ml (figuur 3A). Dompel de monsters onder en bewaar ze bij -80 °C tot verdere extractie. De monsters kunnen minstens 3 maanden worden bewaard, maar het is beter om door te gaan met de stroomafwaartse experimenten om de afbraak van nucleïnezuren te voorkomen.
3. DNA- en RNA-extracties uit geslachtsbepaalde faraatlarven
- Pool 12 geslachtsbepaalde mannelijke of vrouwelijke faraatlarven (5 dpo-embryo) en voeg cellysisbuffer of RNA-extractiereagentia (zie stap 2.11 en Tabel met materialen) toe aan één buis van 1,5 ml.
OPMERKING: Volg stap 3.2-3.7 voor DNA-extractie en stap 3.8-3.11 voor RNA-extractie. - Homogeniseer weefsels in 600 μL van de cellysisbuffer (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA en 1% SDS, pH 8,0) en centrifugeer de monsters bij 10.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Verzamel het supernatant (500 μL) met behulp van een pipet en incubeer bij 50 °C met 1,5 μL Proteinase K (20 mg/ml, zie Materiaaltabel) gedurende 5 uur op een warmteblok.
- Behandel de monsters met 1,0 μl 10 mg/ml RNase-oplossing (zie materiaaltabel) bij 37 °C gedurende 30 minuten.
- Voeg 200 μL eiwitprecipitatieoplossing (zie materiaaltabel) toe aan de buis7, gevolgd door een centrifuge bij 17.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Meng het supernatant (500 μL) met 500 μL 100% isopropanol en centrifugeer vervolgens bij 20.400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Was het gepelleteerde DNA tweemaal met 1.000 μL 70% ethanol. Vervolgens, aan de lucht drogen (5-10 min bij kamertemperatuur), los het DNA op in 30 μL van 10 mM Tris-Cl buffer (pH 8,5).
- Homogeniseer de weefsels in 600 μL RNA-extractiereagentia en voeg 240 μL ultrazuiver gedestilleerd water toe aan de buis. Centrifugeer de buizen bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
- Meng het supernatant (600 μL) met 600 μL 100% isopropanol en breng het mengsel over in een silica spinkolom (zie Tabel met materialen). Centrifugeer de buizen bij 17.900 x g gedurende 1 min bij 4 °C.
- Was de kolom met 750 μL 70% ethanol en centrifugeer de kolom tweemaal bij 17.900 x g gedurende 1 minuut elk bij 4 °C.
- Laad 15 μL ultrazuiver gedestilleerd water op de kolom. Centrifugeer de buisjes bij 17.900 x g gedurende 1 min bij 4 °C om het RNA te elueren.
- Bereken en verifieer de kwaliteit en kwantiteit van DNA en RNA met behulp van een UV-gebaseerde spectrofotometer. Beoordeel de zuiverheid van nucleïnezuren met behulp van de verhoudingen A260/A280 (nucleïnezuren/eiwitten) en A260/A230 (nucleïnezuren/zouten en andere verontreinigingen)13.
OPMERKING: Voor RNA-extractie werd de eerder gepubliceerde procedure12 gevolgd, wat resulteerde in fenolbesmetting (tabel 1). Het geëxtraheerde DNA en RNA van een enkel embryo of faraatlarven levert monsters van lage hoeveelheid en lage kwaliteit op. Typisch levert DNA-extractie uit 12 faraatlarven 100-600 ng op, terwijl RNA-extractie met behulp van de huidige methode 900-1.500 ng genereert, zoals tabel 1 laat zien.
OPMERKING: Stappen 3.13-3.15 zijn optioneel voor verdere testen van sequencings met hoge doorvoer. - Bereken de hoeveelheden DNA en RNA met behulp van een op fluorescentie gebaseerde spectrofotometer.
OPMERKING: De verhouding tussen RNA-grootheden (UV-gebaseerde concentratie (ng/μL)/fluorescentieconcentratie (ng/μL)) werd berekend om de kwaliteit voor verdere experimentele toepassing te beoordelen. Wanneer bijvoorbeeld uv- en fluorescentieconcentraties respectievelijk 80 ng / uL en 60 ng / uL zijn, is de verhouding 1,5 (80/60). Gewoonlijk geven verhoudingen onder 1,5 voldoende zuiverheid aan voor downstream-toepassingen met behulp van high throughput sequencing13. - Analyseer de kwaliteit van RNA met behulp van microchip-elektroforese14.
- Gebruik de gekwalificeerde RNA's om de RNA-bibliotheek voor te bereiden met behulp van een RNA-bibliotheekvoorbereidingskit (zie Tabel met materialen). Rangschik de bibliotheken met behulp van een platform dat geschikt is voor de voorbereide bibliotheken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Opzetten van host lines en het onderhoud ervan
De levensvatbaarheid van in het veld verzamelde larven wordt anders toegeschreven aan veldlocatie, seizoenen en opfokomstandigheden (bijv. 90% van de levensvatbaarheid in Taiwan, Taoyuan, zoals weergegeven in Arai et al.12). Ongeveer 30% -50% van de paren zal zoals gewoonlijk de volgende generatie genereren. Voor H. magnanima en A. honmai worden matrilines al meer dan 100 generaties onderhouden door inteelt.
Morfologische observaties en geslachtsbepalingen
De behandeling met kaliumhydroxide (3 of 5 M KOH) of natriumhypochloriet (1,2% Cl2 of NaClO) scheidt eieren van hun aaneengeschakelde eimassa's (figuur 2A). De lagere concentratie van de reagentia kon geen scheiding bereiken. Alle fixatie-, permeabilisatie- en kleuringsstappen maakten de visualisatie van kernen met DAPI-oplossing mogelijk. De eieren behandeld met alleen KOH of NaClO (gescheiden) zonder de fixatie- en permeabilisatiestappen waren niet gekleurd met deze kleurstoffen7. Niet-behandelde H. magnanima-eimassa's waren niet gekleurd. De melkzuur-azijn orceïne kleurt heterochromatine (W-chromosoom) met een donkerrode kleur en kernen met een felrode kleur zoals gewoonlijk (figuur 3A). Deze kleuring maakt een eenvoudige en snelle geslachtsbepaling mogelijk van 4 dpo embryo tot zesde instar larven. Hoewel kernen werden gevisualiseerd in 0-3 dpo-embryo's, was het moeilijk om het W-chromosoom met 400x vergroting waar te nemen.
Hoogwaardig DNA en RNA werden verkregen uit geslachtsbepaalde en gepoolde embryo's
Van 12 faraatlarven, hoogwaardig DNA (A260/A280 = 1,7-2,0; A260/A230 = 1,7-2,4) werden geëxtraheerd met een totale hoeveelheid van 100-600 ng (tabel 1). Hoewel het RNA geëxtraheerd volgens de eerder gepubliceerde methode12 500-1.000 ng product met lage kwaliteit opleverde: A260/A280 = 1,7-2,1; A260/A230 = 0,1-0,5 (tabel 1), de gewijzigde protocollen met behulp van een spinkolom verbeterden de kwaliteit van het RNA en produceerden 900-1.500 ng-producten met A260/A280 = 1,9-2,1 en A260/A230 = 1,9-2,3 (tabel 1). Bovendien was de RNA-concentratieverhouding (op UV-gebaseerde/Qbit-fluorescentie-gebaseerde waarden) voor het gewijzigde protocol lager dan 1,2, wat voldeed aan de kwaliteitseisen voor sequencing van de volgende generatie13. Omgekeerd waren de kwaliteit en kwantiteit van nucleïnezuren geëxtraheerd uit een enkel embryo te laag om te worden berekend. De intactheid van het RNA geëxtraheerd uit geslachtsbepaalde faraatlarven met behulp van het gemodificeerde protocol werd ook bevestigd met behulp van microchip-elektroforese (figuur 3B). Van de voorbereide bibliotheken werd bevestigd dat ze hoge Q30-scorecijfers opleverden (tabel 2).
Figuur 1: Overzicht van insectenverzameling en massale opfok van H. magnanima en A. honmai. (A) Theebladeren en nesten beschadigd door een larve. (B) Lichtvanger met UV-licht. (C,D) Een vrouwtje (C) en een mannetje (D) 6e instar larve van H. magnanima. De Oranje driehoek geeft de testis aan. (E,F) Verzamelde larven werden individueel gekweekt in een 1/2 oz kopje met een stuk kunstmatig dieet. (G,H) Poppen van H. magnanima (G) en A. honmai (H). Het vrouwtje wordt aan de linkerkant weergegeven, terwijl het mannetje aan de rechterkant wordt weergegeven. (I) Volwassenen van H. magnanima (boven) en A. honmai (onder). Zowel mannetjes als vrouwtjes worden respectievelijk rechts en links weergegeven. (J,K) Een plastic zak (J) of plastic behuizing (K) voor het verzamelen van eiermassa's. (L) A. honmai oviposit-eieren op paraffinepapier op het deksel en H. magnanima leggen eieren op paraffinepapier dat op de bodem van de behuizing is geplaatst. (M,N) Eiermassa van H. magnanima. De gerijpte embryo's vertonen zwarte kopcapsules aangegeven met witte pijlen (N). (O) Gesneden kunstmatige diëten met een rasp voor massale opfok. De larven die uit eieren komen, geplaatst op het gesneden dieet, zullen poppen vormen 3-4 weken na het uitkomen bij 25 °C (onder 16 uur lichte / 8 uur donkere cyclus). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Waarnemingen van embryo's. (A) De gescheiden, vaste en gepermeabiliseerde eieren van H. magnanima met behulp van 5 N KOH, 4% PFA / heptaan, methanol / heptaan en methanol. Een gescheiden ei wordt gemarkeerd met gebroken lijnen. (B) Het 3 dpo-embryo werd gekleurd met melkzuur-azijnzuur orceïne. De zwarte pijlpunt geeft het embryo aan. (C) Het 4 dpo-embryo werd gekleurd met DAPI. De witte pijlpunt geeft het embryo aan. (D,E) Dissectie van faraatlarven (5 dpo) met behulp van een tang. De faraatlarven worden gewonnen uit eimassa (D), doorsneden op een glasplaat (E). (F,G) Melk-azijnachtige orceïnekleuring met behulp van de ontlede faraatlarven. Vrouwtjes vertonen heterochromatine als een stip (aangegeven met zwarte pijlpunt, (F), maar mannetjes missen het heterochromatine (G). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Grafische samenvatting van nucleïnezuurextractie met behulp van geslachtsbepaalde faraatlarven en RNA-kwaliteiten van H. magnanima en A. honmai. (A) Weefsels van ontleedde faraatlarven op glazen platen werden gekleurd met melkzuur-azijn orceïne om hun geslacht te bepalen. De resterende weefsels werden gedrenkt in reagentia, samengevoegd in één buis gesorteerd op het geslacht van de individuen en vervolgens onderworpen aan DNA / RNA-extractie. (B) De kwaliteit van RNA geëxtraheerd uit 12 mannelijke H. magnanima of A. honmai werd beoordeeld met behulp van een microchip-elektroforesesysteem. Afkortingen: [nt], nucleotide grootte; [FU], fluorescentie-eenheid; M, moleculaire marker; Hm, H. magnanima; Ad, A. honmai. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Concentratie en kwaliteit van nucleïnezuren geëxtraheerd uit geslachtsbepaalde faraatlarven van H. magnanima. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Kwaliteiten van RNA-sequencing ruwe data. 1 Q20 (%) geeft de leeskans aan met 99% leesnauwkeurigheid. Arabisch cijfer Q30 (%) geeft de leeskans aan met een leesnauwkeurigheid van 99,9%. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tortricid bestaat uit verschillende land- en bosbouwplagen; de huidige studie presenteerde methoden om tortrix generaties lang te kweken, embryogenese en geslacht van de insecten te observeren en moleculaire analyse uit te voeren met behulp van gerijpte embryo's.
Een van de obstakels voor ongedierte-insectenstudie is het vaststellen van opfokmethoden. Vooral inteelt heeft soms een negatieve invloed op de fitheid van de soort. De fitheidsvermindering door de inteelt, inteeltdepressie genaamd, is op grote schaal waargenomen bij verschillende planten en dieren, waaronder insecten 15,16,17,18. Zoals opgemerkt, worden zowel H. magnanima als A. honmai al meer dan 100 generaties (meer dan 10 jaar) onderhouden zonder duidelijke fitnesskosten. Hoewel het niet voldoende is om te beoordelen of andere tortriciden ook een hoge tolerantie hebben voor inteelt in het algemeen, kunnen de twee soorten de kenmerken hebben ontwikkeld door monotone omgevingsomstandigheden aan te passen (d.w.z. theeplantages) en tegen verschillende endosymbiotische micro-organismen (bijv. Wolbachia11,12 ). De eieren van de twee soorten zijn gemakkelijk te verkrijgen, maar hun ovipositiegedrag wordt anders toegeschreven aan hun ecologie. Inderdaad, vochtigheid en kreukrichting lijken direct van invloed te zijn op het aantal eicelieren, wat de natuurlijke geschiedenis van de insecten in velden zou kunnen weerspiegelen. Het is belangrijk om de houderijmethoden aan te passen aan soorten met betrekking tot hun biologische kenmerken in de natuur.
De protocollen die in deze studie werden vastgesteld, maakten observatie van embryogenese en moleculaire studies mogelijk met behulp van geslachtsbepaalde gerijpte embryo's en larven. De insecteneieren zijn over het algemeen bedekt met verschillende schaallagen 10,19. Bovendien zijn de eieren van H. magnanima en A. honmai bedekt met maternale afscheidingen. Om de eieren met zo'n complexe structuur te bevlekken, lijkt scheiding, fixatie en permeabilisatie allemaal nodig te zijn. In Ostrinia furnacalis (Crambidae), dat schubachtige eimassa zoals H. magnanima en A. honmai oviposeert, zijn pcr-gebaseerde geslachtsbepalingsprotocollen met behulp van enkele embryo's voorgesteld, maar de lage kwaliteit en kwantiteit van nucleïnezuren zijn een probleem geweest voor latere analyse 6,20. Daarentegen suggereerde de huidige studie het extraheren van nucleïnezuren uit gepoolde geslachtsbepaalde embryo's na het observeren van vrouwspecifiek geslachtschromatine. RNA's worden gemakkelijk afgebroken en de hier getoonde extractieprocedure had geen invloed op de kwaliteit van RNA, wat ook is bevestigd door de transcriptoomanalyse (RNA-seq). De hier getoonde technieken zijn toepasbaar voor studies van embryogenese van verschillende insectensoorten. Bovendien hebben de protocollen het potentieel om te worden gebruikt om de effecten van chemische pesticiden of intracellulaire microben zoals Wolbachia te beoordelen, die geslachtsspecifieke defecten veroorzaken tijdens embryogenese 6,11,12.
De huidige studie heeft verschillende beperkingen. Ten eerste was het geslacht van onrijpe embryo's (0-3 dpo) moeilijk te bepalen met behulp van melk-azijnachtige orceïnekleuring in H. magnanima en A. honmai. Dit komt omdat het aantal en de grootte van de kernen over het algemeen klein zijn tijdens vroege embryogenese, waardoor het moeilijk is om het W-chromosoom te observeren. Om het geslacht van de tortriciden tijdens vroege embryogenese te verduidelijken, zou detectie en kwantificering van markers op geslachtschromosomen 6,20 een alternatieve benadering kunnen zijn. Ten tweede was het moeilijk om nucleïnezuren met een hoge zuiverheid van een enkel individu te extraheren na geslachtsbepaling, mogelijk vanwege het kleine aantal cellen. Het RNA of DNA dat uit een enkel embryo wordt geëxtraheerd, kan echter van toepassing zijn op latere analyses zoals PCR-assays en eencellige sequencings.
Samenvattend beschrijft het huidige protocol massale kweek, morfologische waarnemingen en genetische analyses van de eieren van twee niet-model lepidoptera plaaginsecten, H. magnanima en A. honmai. Deze eenvoudige technieken zullen naar verwachting toepasbaar zijn voor verder onderzoek naar tortricid, andere lepidopterans insecten en andere taxa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen de steun van de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Research Fellowships for Young Scientists erkennen [Grant Number 19J13123 and 21J00895].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 ounce cup | FP CHUPA | CP070009 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2 ounce cup lid | FP CHUPA | CP070011 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99.7% acetic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| benzalkonium chloride solution | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Cotton | AOUME | 8-1611-02 | insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| DAPI solution | Dojindo, Tokyo, Japan | 340-07971 | stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Disodium Hydrogenphosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS quantification kit | Invitrogen | Q33231 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II column | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Ethanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Glassine paper | HEIKO | 2100010 | insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw |
| heat block WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japan | 4002620 | incubation; https://www.attoeng.site/ |
| heptane | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Lactic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| methanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photometer NP 80 | Implen | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7770S | Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | not shown | Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Potassium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinase K Solution | Merck | 71049-4CN | DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| protein precipitation solution | Qiagen | 158912 | DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| rifampicin | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| RNA HS quantification kit | Invitrogen | Q32855 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase solution | Nippon Gene | 313-01461 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Sodium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Sodium Dodecyl Sulfate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| sodium hypochlorite aqueous solution | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Tetracycline Hydrochloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977023 | RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
References
- Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
- Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1 (2002).
- Matsuura, H., Naito, A. Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan. Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).
- Mita, K., et al. The construction of an EST database for Bombyx mori and its application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).
- Kawamoto, M., et al. High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).
- Fukui, T., et al. In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).
- Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis. Entomological Science. 25 (1), 12497 (2022).
- vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. Tortricid pests: their biology, natural enemies and control. , Elsevier Science Publishers. Amsterdam. (1991).
- Kiuchi, T., et al. A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm. Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).
- Kageyama, D., Traut, W. Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis. Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).
- Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima. Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).
- Schalamun, M., et al. Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora. Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).
- Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10 (1), 159 (2010).
- Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments. Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).
- Saccheri, I., et al. Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation. Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).
- Crnokrak, P., Roff, D. A.
- Keller, L. F., Waller, D. M.
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).
- Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host. Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).
