Summary
Mevcut protokol, tortricid haşere böceklerinin laboratuvarlarda yetiştirilme yöntemini açıklamaktadır. Böceklerin cinsiyetini ayırt etme ve yüksek verimli dizileme için nükleik asitleri çıkarma prosedürleri, iki tortricid zararlısı kullanılarak oluşturulmuştur.
Abstract
Genellikle tortrix veya yaprak silindiri güveleri olarak bilinen Tortricidae (Lepidoptera), ciddi tarımsal kayıplara neden olan birçok tarım ve ormancılık zararlısını içerir. Bu tür haşere güvelerinin biyolojisini anlamak için, temel teknikler yüksek talep görmüştür. Burada, kütle yetiştirme, gözlemler ve moleküler çalışmalar için yöntemler iki çay tortrix, Homona magnanima ve Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae) kullanılarak geliştirilmiştir. Böcekler dilimlenmiş yapay diyetle kitlesel olarak yetiştirildi ve biyolojik özellikleri göz önünde bulundurularak 100'den fazla kuşak boyunca akrabalık yoluyla sürdürüldü. Böceklerin çeşitli cinsiyet dimorfizmleri vardır; bu nedenle, sonraki tahlilleri önleyen gelişim aşamalarında cinsiyeti ayırt etmek zordur. Bu çalışma, tortrisid larvalarının cinsiyetinin, kadına özgü W kromozomunu görselleştirmek için testislerin veya laktik-asetik orsin boyamasının gözlemlenmesiyle belirlenebileceğini vurgulamıştır. Ayrıca, cinsiyet belirleme yöntemlerini kullanarak, bu çalışma cinsiyet tarafından belirlenen embriyolardan nükleik asit ekstraksiyonlarını ve yüksek verimli dizilemeye doğru uygulamayı mümkün kılmıştır. Bu ipuçları diğer haşere böcekleri için geçerlidir ve daha fazla morfolojik ve genetik çalışmayı kolaylaştıracaktır.
Introduction
Lepidopteran böcekleri, tanımlanan tüm canlı türlerinin %10'undan fazlasını temsil eder1 ve bazı takson türleri bitkilerde ciddi hasara ve ciddi tarımsal kayıplara neden olur 2,3. İpekböceği Bombyx mori4,5 gibi model böcekler kullanılarak moleküler ve genetik çalışmalar geliştirilmiş olmasına rağmen, haşere böcekleri, kısmen 6,7 yetiştirme ve idare etme zorlukları nedeniyle araştırılmamıştır. Bu nedenle, bu tür model olmayan haşere böceklerinin biyolojisini anlamak için temel çalışmalar ve teknikler gereklidir.
Genellikle tortrix veya yaprak silindiri güveleri olarak bilinen Tortricidae (Lepidoptera), birçok tarım ve ormancılık zararlısını içerir8. Böcek taksonlarından, oryantal çay tortrix Homona magnanima Diakonoff ve yaz meyvesi tortrix Adoxophyes honmai Yasuda, Doğu Asya'daki çay ağaçlarına zarar verdiği bilinen ciddi polifagot zararlılardır7. İki tür, maternal sekresyonlarla kaplı ince, yumuşak ve kırılgan yumurtalardan oluşan düz ve oval ölçek benzeri yumurta kümeleri (veya yumurta kütleleri) bırakır. Her ne kadar embriyogenez aşamaları böcek gelişimi ve cinsiyet tayini için çok önemli olsa da9, yumurtaların yapıları daha fazla analizin böceklerin biyolojisini anlamasını engellemektedir. Bu tür karmaşık yumurta kütlesini ortaya çıkaran zararlılar üzerinde daha fazla çalışma için zorlukların üstesinden gelmek önemlidir.
Burada, tortrisidlerin biyolojisini anlamak için, kitle yetiştirme yöntemleri, gözlemler ve moleküler çalışmalar A. honmai ve H. magnanima kullanılarak geliştirilmiştir. İlk olarak, kütle yetiştirme yöntemleri, her iki tortricidi de 100 nesil boyunca yetiştirilerek korur. Yumurtaların birleştirilmiş ölçek benzeri yumurta kütlesinden ayrılması, daha önce sineklerde kullanılan tekniklerden geliştirilen alkali ve organik çözücüler kullanılarak tortrisidlerin embriyogenez gözlemini kolaylaştırdı10. Ek olarak, bu çalışma, laktik-asetik orsin 11 kullanılarak lepidopteran dişilerin cinsiyet kromatininin boyama yöntemlerini geliştirerek küçük embriyoların cinsiyet ayrımcılığını ortayakoymuştur. Bu yöntemler birleştirilerek, cinsiyete göre belirlenmiş embriyolardan yüksek kalitede ve miktarda nükleik asitler çıkarıldı, aksi takdirde kurulması zor olan6. Ekstrakte edilen RNA, yeni nesil dizileme için kullanıldı. Toplu olarak, burada sunulan yöntemler diğer lepidopteran böceklerine ve diğer böcek taksonlarına uygulanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Böcek toplama ve kütle yetiştiriciliği
- Daha önce yayınlanmış Referanslar 8,12'yi takip eden alanlardan tortrisid böcekleri toplayın.
NOT: H. magnanima ve A. honmai larvaları hasarlı çay yapraklarından toplanır (Şekil 1A); yetişkinler 4 W taşınabilir UV ışığı kullanılarak çekilir (365 nm dalga boyu, bakınız Malzeme Tablosu, Şekil 1B). - Toplanan larvaları (Şekil 1C, D) yetişkin eklozyona kadar 2-3 hafta boyunca 1/2 oz'luk bir bardakta bir yapay diyet parçası üzerinde ayrı ayrı destekleyin (Şekil 1E, F). Pupa ve yetişkinlerin cinsiyetini morfolojik özelliklerle doğrulayın (Şekil 1G, I).
- Erkekleri ve dişileri plastik bir kutuda (30 cm x 20 cm x 5 cm) bir parafin kağıdı üzerinde yumurta kütlelerini ovipozite etmek için eşleştirin (Şekil 1J-L). Bir dişi ve iki erkeği, bir matrilin oluşturmak için bir parça parafin kağıdı ile 120 mL'lik plastik bir kaba yerleştirin.
NOT: Parafin kağıdı üzerinde kırışıklıklar yapmak önemlidir. H. magnanima için, parafin kağıdının kasanın altında olması gerekir. Bu arada, A. honmai için, çay yapraklarının üst tarafındaki H. magnanima oviposit yumurta kütlesinden yumurta toplamak için kasa tavanına bir kağıt koyun (Şekil 1L), ancak A. honmai yaprakların alt tarafına yumurta bırakır8. Prosedürler diğer tortrisid türlerinde de doğrulanmıştır ve hedef türün ekolojisi ve davranışı açıklığa kavuşturulmuşsa, her iki tarafa da kağıtlar yerleştirmek daha iyidir. - Parafin kağıdı üzerindeki yumurta kütlelerini (yumurta kütlesi başına yaklaşık 100-200 yumurta12, Şekil 1M) makasla kesin. Yumurtaları 5-7 gün boyunca dökülmüş kağıtla 1/2 oz bardağa koyun.
NOT: Olgunlaşmış embriyo siyah nokta kapsülü sergiler (Şekil 1N). Embriyogenez dönemleri tortrisid türlerine çeşitli şekillerde atfedilir, ancak genellikle H. magnanima için yumurtlamadan 5 gün sonra (dpo) ve A. honmai için 4 dpo 25 ° C'de% 60 bağıl nem, 16 saat ışık / 8 saat karanlık döngüler7. - Siyah kafa kapsülleri gösteren yumurta kütlelerini 7 gün boyunca 4-8 ° C'de saklayın.
- Kitle yetiştiriciliği için bir rende kullanarak ~ 60 g yapay diyetleri dilimleyin. Olgunlaşmış embriyolarla doldurulmuş yumurta kütlesini dilimlenmiş yapay diyete plastik bir kaba (23 cm x 16 cm x 8 cm) yerleştirin. Dilimlenmiş diyetlerle yumurta kütlesi üzerine parafin kağıtları yerleştirin (Şekil 10).
NOT: %30'un altında bağıl nem aşırı kuru kabul edilirken, %70'in üzerinde çok nemli olduğu kabul edilir. Plastik kabın kapağında delikler oluşturmak, daha iyi havalandırma sağlamak için daha iyidir. Küçük larvaların kaçışını önlemek için delikleri pamukla doldurun. - Yumurtalardan yüzey kirleticilerini ortadan kaldırmak için, yumurta kütlesini sırasıyla 5 dakika boyunca% 3 formalin ve% 0.2 Benzalkonyum klorür çözeltisine batırın,12. Bağırsak veya hücre içi bakterileri yok etmek için, normal bir yapay diyet yerine% 0.05 (w / w) Tetrasiklin hidroklorür veya% 0.06 (w / w) rifampisin ile desteklenmiş yapay bir diyet kullanın (bkz.
NOT: Bu adım isteğe bağlıdır. Tutarlılık için Silk Mate 2S ve% 0.05 (w / w) Tetrasiklin hidroklorür veya% 0.06 (w / w) rifampisin yoğurmak önemlidir. - Pupaları plastik kaptan toplayın ve cinsiyeti morfolojik12 özelliğe göre ayırt edin (Şekil 1G-I).
NOT: Genel olarak, tortrisidler yavru12'ye kadar 5-6 instar sunar. H. magnanima ve A. honmai larvaları, yavrulaşmaya kadar yumurtadan çıktıktan sonra sırasıyla 3 hafta ve 2 hafta sürer. - 25 °C, 16 L/8 D ile çiftleşmek için 15 erkek ve 10 dişi plastik bir kutuya (30 cm x 20 cm x 5 cm, Şekil 1K) yerleştirin. her nesil için.
NOT: Daha sonraki analizler için yeni yumurtalanmış yumurta kütlelerinin toplanması gerekiyorsa, karanlık dönemin başlangıcını ve sonunu ayarlayın, örneğin sabah 9'dan akşam 5'e kadar. Bu durumda, H. magnanima ve A. honami genellikle 5 saat (14:00) sonra yumurtaları oviposit eder.
2. Fiksasyon, geçirgenlik ve boyama için yumurta ve fazat larvalarının yumurta kütlelerinden ayrılması
- Yumurtaları ayırmak için yumurta kütlesini 10 dakika boyunca 1.000 μL% 1.2 sodyum hipoklorit sulu çözeltisine veya 30 dakika boyunca 1.000 μL 5 M potasyum hidroksit sulu çözeltisine batırın.
- Ayrılmış yumurtaları, daha önceyayınlanan rapor 7'yi takiben, 1.000 μL PBSt (137 mM NaCl, 8.1 mM Na 2 HPO 4,2.68mM KCl,1.47 mM KH2PO 4,% 0.05 Polioksietilen (20) Sorbitan Monolaurat [Ara-20] pH7.4, bkz.
- Yumurtaları 500 μL% 100 heptan ve 500 μL% 4 paraformaldehit-PBSt çözeltisi (w / v) karışımına batırın. Bir vorteks mikseri kullanarak 1.500 rpm'de 10 dakika boyunca karıştırın.
- Yumurtaları 500 μL% 100 heptan ve 500 μL% 100 metanol karışımına batırın. 1.500 rpm'de 10 dakika boyunca karıştırın.
- Yumurtaları 1.000 μL% 100 metanol ile iki kez yıkayın ve 4 ° C'de% 100 metanol içinde% 100 metanol içinde saklayın (Şekil 2A).
NOT: Yumurtalar 4 °C'de en az 1 yıl saklanabilir. - Daha önce yayınlanan rapor7'yi takiben hidrofilizasyon için yumurtaları sırasıyla% 99,% 70,% 50 etanol ve PBSt'ye 5 dakika bekletin.
- Yumurtaları PBSt ile yıkayın, yumurtaları 5 dakika boyunca 1 μg / mL DAPI çözeltisine batırın ve ardından yumurtaları iki kez 1x PBS ile yıkayın. Çekirdekler parlak kırmızı bir renk sergileyene kadar heterokromatini görselleştirmek için yumurtaları %1,25 (w/w) laktik-asetik orsin çözeltisinin 20 μL'sine batırın (bkz. Malzeme Tablosu)11 (bu 5-60 dakika arasında değişir) (Şekil 2B,C).
NOT: Laktik-asetik orcein boyama dönemleri sıcaklık ve neme bağlıdır. 4x-10x büyütmeli bir mikroskop kullanarak uygun boyama olup olmadığını kontrol etmek daha iyidir. - Vitray yumurtaları pipet kullanarak cam bir slayta aktarın. Lekeli yumurtaları antifade reaktifi (bakınız Malzeme Tablosu) ve bir kapak camı7 ile kapatın.
- Forseps kullanarak yumurta kütlelerinden H. magnanima ve A. honmai larvalarını (yumurtlamadan 4-5 gün sonra (dpo)) farate çıkarın (Şekil 2D). Cam bir slayt üzerinde bisekt larvaları (Şekil 2E).
- Herhangi bir dokuyu (örneğin, subözofageal ganglion, torasik gangliyon, malpighian tübül, vb.) 5 dakika boyunca 1:3 (v / v)% 99.7 asetik asit / % 100 metanol karışımı ile sabitleyin. Çekirdekler lekeleninceye kadar% 1.25 (w / w) laktik-asetik orcein çözeltisi11 olanları lekeleyin (bu, sıcaklığa ve neme bağlı olarak 5-60 dakika sürebilir).
- Mikroskop altında heterokromatinin (W kromozomu, Şekil 2F, G) varlığını (dişi) veya yokluğunu (erkek) gözlemleyerek her bir örneğin cinsiyetini belirleyin.
NOT: Cinsiyet, cinsiyet kromatini görselleştirerek belirlenir. Her hücre, cinsiyet kromatinini11,12 dişilerinde bir nokta olarak temsil ederken, fazat larva dokularının kalan kısmı (sabit değil) derhal hücre lizis tamponu 12'ye (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA ve% 1 SDS, pH 8.0) veya DNA veya RNA ekstraksiyonu için fenol içeren RNA ekstraksiyon reaktiflerine daldırılmalıdır. Diseksiyonlardan önce, reaktiflerin 20 μL'sini önceden 0.2 mL PCR tüplerine dağıtın (Şekil 3A). Daha fazla ekstraksiyona kadar numuneleri -80 ° C'de daldırın ve saklayın. Numuneler en az 3 ay saklanabilir, ancak nükleik asitlerin bozulmasını önlemek için aşağı akış deneylerine devam etmek daha iyidir.
3. Cinsiyetten DNA ve RNA ekstraksiyonları fazat larvalarını belirledi
- 12 cinsiyet tarafından belirlenen erkek veya dişi fazat larvalarını (5 dpo embriyo) havuzlayın ve 1.5 mL'lik bir tüpe hücre lizis tamponu veya RNA ekstraksiyon reaktifleri (bkz. adım 2.11 ve Malzeme Tablosu) ekleyin.
NOT: DNA ekstraksiyonu için 3.2-3.7 adımlarını ve RNA ekstraksiyonu için 3.8-3.11 adımlarını izleyin. - Hücre lizis tamponunun 600 μL'sinde (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA ve %1 SDS, pH 8.0) dokuları homojenize edin ve numuneleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj edin.
- Bir pipet kullanarak süpernatantı (500 μL) toplayın ve 50 ° C'de 1,5 μL Proteinaz K (20 mg / mL, Malzeme Tablosuna bakınız) ile bir ısı bloğu üzerinde 5 saat boyunca inkübe edin.
- Numuneleri 30 dakika boyunca 37 °C'de 1.0 μL 10 mg/mL RNaz çözeltisi (bkz. Malzeme Tablosu) ile işleyin.
- 7 tüplerine 200 μL protein çökeltme çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin, ardından 4 ° C'de 10 dakika boyunca 17.000 x g'de bir santrifüj ekleyin.
- Süpernatantı (500 μL) 500 μL% 100 izopropanol ile karıştırın ve ardından 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20.400 x g'de santrifüj yapın.
- Pelet edilmiş DNA'yı 1.000 μL% 70 etanol ile iki kez yıkayın. Daha sonra, hava ile kurutun (oda sıcaklığında 5-10 dakika), DNA'yı 10 mM Tris-Cl tamponunun 30 μL'sinde (pH 8.5) çözün.
- Dokuları 600 μL RNA ekstraksiyon reaktiflerinde homojenize edin ve tüpe 240 μL ultra saf damıtılmış su ekleyin. Tüpleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın.
- Süpernatantı (600 μL) 600 μL% 100 izopropanol ile karıştırın ve karışımı bir silika spin kolonuna aktarın (bkz. Tüpleri 4 ° C'de 1 dakika boyunca 17.900 x g'de santrifüj yapın.
- Kolonu 750 μL% 70 etanol ile yıkayın ve sütunu 4 ° C'de her biri 1 dakika boyunca 17.900 x g'de iki kez santrifüj yapın.
- Kolona 15 μL Ultra saf damıtılmış su yükleyin. RNA'yı süzmek için tüpleri 17.900 x g'de 4 ° C'de 1 dakika boyunca santrifüj yapın.
- UV tabanlı bir spektrofotometre kullanarak DNA ve RNA'nın kalitesini ve miktarını hesaplayın ve doğrulayın. A260/A280 (Nükleik asitler/protein) ve A260/A230 (Nükleik asitler/tuzlar ve diğer kirleticiler) oranlarını kullanarak nükleik asitlerin saflığını değerlendirin13.
NOT: RNA ekstraksiyonu için, daha önce yayınlanmış prosedür12 izlendi ve bu da fenol kontaminasyonu ile sonuçlandı (Tablo 1). Tek bir embriyo veya farat larvasından ekstrakte edilen DNA ve RNA, düşük miktarda ve düşük kaliteli örnekler verir. Tipik olarak, 12 fazat larvasından DNA ekstraksiyonu 100-600 ng verirken, mevcut yöntemi kullanan RNA ekstraksiyonu, Tablo 1'de gösterildiği gibi 900-1.500 ng üretir.
NOT: Adım 3.13-3.15, yüksek verimli dizilemelerin daha fazla tahlili için isteğe bağlıdır. - Floresan bazlı spektrofotometre kullanarak DNA ve RNA miktarlarını hesaplayın.
NOT: RNA miktarlarının oranı (UV bazlı konsantrasyon (ng/μL)/floresan bazlı konsantrasyon (ng/μL)) daha ileri deneysel uygulamaların kalitesini değerlendirmek için hesaplanmıştır. Örneğin, UV ve floresan bazlı konsantrasyonlar sırasıyla 80 ng / uL ve 60 ng / uL olduğunda, oran 1.5 (80/60) olacaktır. Genellikle, 1,5'in altındaki oranlar, yüksek verim sıralaması13 kullanan aşağı akış uygulamaları için yeterli saflığı gösterir. - Mikroçip elektroforezi kullanarak RNA'nın kalitesini analiz edin14.
- Bir RNA kütüphanesi hazırlama kiti kullanarak RNA kütüphanesini hazırlamak için nitelikli RNA'ları kullanın (bakınız Malzeme Tablosu). Hazırlanan kütüphaneler için uygun bir platform kullanarak kütüphaneleri sıralayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ana hatların kurulması ve bakımları
Tarlada toplanan larvaların yaşayabilirliği, tarla konumuna, mevsimlere ve yetiştirme koşullarına farklı şekilde atfedilir (örneğin, Arai ve ark.12'de gösterildiği gibi, Tayvan, Taoyuan'daki canlılığın% 90'ı). Çiftlerin yaklaşık% 30-50'si her zamanki gibi yeni nesli üretecektir. H. magnanima ve A. honmai için, matrilinler 100'den fazla kuşak boyunca akrabalık yoluyla korunmuştur.
Morfolojik gözlemler ve cinsiyet belirleme
Potasyum hidroksit (3 veya 5 M KOH) veya sodyum hipoklorit (% 1.2 Cl2 veya NaClO) ile yapılan tedavi, yumurtaları birleştirilmiş yumurta kütlelerinden ayırır (Şekil 2A). Reaktiflerin düşük konsantrasyonu ayırmayı başaramadı. Tüm fiksasyon, geçirgenleştirme ve boyama adımları, çekirdeklerin DAPI çözeltisi ile görselleştirilmesini sağladı. Fiksasyon ve geçirgenlik basamakları olmadan sadece KOH veya NaClO (ayrılmış) ile muamele edilen yumurtalar bu boyalarla lekelenmemiştir7. Tedavi edilmeyen H. magnanima yumurta kitleleri lekelenmedi. Laktik-asetik orsein, heterokromatini (W kromozomu) koyu kırmızı renkle ve çekirdekleri her zamanki gibi parlak kırmızı renkle boyar (Şekil 3A). Bu boyama, 4 dpo embriyodan altıncı instar larvalarına kadar kolay ve hızlı cinsiyet tayini sağlar. Çekirdekler 0-3 dpo embriyolarda görselleştirilse de, W kromozomunu 400x büyütme ile gözlemlemek zordu.
Cinsiyet belirlenmiş, havuzlanmış embriyolardan yüksek kaliteli DNA ve RNA elde edildi
12 fazat larvadan, yüksek kaliteli DNA (A260 / A280 = 1.7-2.0; A260/A230 = 1.7-2.4) toplam miktarı 100-600 ng ile ekstrakte edildi (Tablo 1). Daha önce yayınlanan yöntem12'yi takiben ekstrakte edilen RNA, düşük kalitede 500-1.000 ng ürün vermesine rağmen: A260 / A280 = 1.7-2.1; A260 / A230 = 0.1-0.5 (Tablo 1), bir spin sütunu kullanan değiştirilmiş protokoller, RNA'nın kalitesini artırdı ve A260 / A280 = 1.9-2.1 ve A260 / A230 = 1.9-2.3 ile 900-1.500 ng ürün üretti (Tablo 1). Ayrıca, modifiye protokol için RNA konsantrasyon oranı (UV bazlı / Qbit floresan bazlı değerler) 1.2'nin altındaydı ve yeni nesil dizileme13 için kalite gereksinimlerini karşıladı. Tersine, tek bir embriyodan ekstrakte edilen nükleik asitlerin kalitesi ve miktarı hesaplanamayacak kadar düşüktü. Modifiye protokol kullanılarak cinsiyet tarafından belirlenen fazat larvalarından ekstrakte edilen RNA'nın sağlamlığı da mikroçip elektroforezi kullanılarak doğrulandı (Şekil 3B). Hazırlanan kütüphanelerin yüksek Q30 skoru okumaları sağladığı doğrulandı (Tablo 2).
Şekil 1: H. magnanima ve A. honmai'nin böcek toplanması ve toplu yetiştirilmesine genel bakış. (A) Bir larva tarafından zarar görmüş çay yaprakları ve yuvaları. (B) UV ışıklı ışık tuzağı. (C,D) H. magnanima'nın bir dişi (C) ve bir erkek (D) 6. instar larvası. Turuncu üçgen testisi gösterir. (E,F) Toplanan larvalar, bir parça yapay diyet ile 1/2 oz'luk bir bardakta ayrı ayrı yetiştirildi. (G,H) H. magnanima (G) ve A. honmai'nin (H) pupaları. Dişi solda, erkek ise sağda gösterilir. (I) H. magnanima (yukarıda) ve A. honmai (aşağıda) yetişkinleri. Hem erkekler hem de dişiler sırasıyla sağda ve solda gösterilir. (J,K) Yumurta kütlesi toplama için plastik bir torba (J) veya plastik kasa (K). (L) A. honmai oviposit yumurtalarını kapağa yerleştirilmiş parafin kağıdına koyar ve H. magnanima kasanın altına yerleştirilmiş parafin kağıdına yumurta bırakır. (M,N) H. magnanima'nın yumurta kütlesi. Olgunlaşmış embriyolar, beyaz oklarla (N) belirtilen siyah başlı kapsüller sergiler. (O) Kitle yetiştiriciliği için rende ile dilimlenmiş yapay diyetler. Yumurtadan çıkan larvalar, dilimlenmiş diyete yerleştirilir, yumurtadan çıktıktan 3-4 hafta sonra 25 ° C'de (16 saat ışık / 8 saat karanlık döngünün altında) pupa oluşturur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Embriyoların gözlemleri. (A) H. magnaima'nın 5 N KOH,% 4 PFA / heptan, metanol / heptan ve metanol kullanılarak ayrılmış, sabit ve geçirgen yumurtaları. Ayrılmış bir yumurta kırık çizgilerle vurgulanır. (B) 3 dpo embriyo laktik-asetik orsin ile boyandı. Siyah ok ucu embriyoyu gösterir. (C) 4 dpo embriyo DAPI ile boyandı. Beyaz ok ucu embriyoyu gösterir. (D,E) Forseps kullanılarak farat larvalarının (5 dpo) diseksiyonu. Farat larvaları, bir cam slayt (E) üzerinde ikiye bölünen yumurta kütlesinden (D) ekstrakte edilir. (F,G) Disseke edilmiş fazat larvalarını kullanarak laktik-asetik orcein boyaması. Dişiler heterokromatini bir nokta olarak sergiler (siyah ok ucu (F) ile gösterilir), ancak erkeklerde heterokromatin (G) yoktur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: H. magnanima ve A. honmai'nin cinsiyete göre belirlenmiş fazat larvaları ve RNA nitelikleri kullanılarak nükleik asit ekstraksiyonunun grafiksel özeti. (A) Cam slaytlar üzerindeki disseke edilmiş fazat larvalarının dokuları, cinsiyetlerini belirlemek için laktik-asetik orcein ile boyandı. Kalan dokular reaktiflere batırıldı, bireylerin cinsiyetine göre sıralanmış bir tüp halinde toplandı ve daha sonra DNA / RNA ekstraksiyonuna tabi tutuldu. (B) 12 erkek H. magnanima veya A. honmai'den ekstrakte edilen RNA'nın kalitesi, bir mikroçip elektroforez sistemi kullanılarak değerlendirildi. Kısaltmalar: [nt], nükleotid boyutu; [FU], floresan ünitesi; M, moleküler belirteç; Hm, H. magnanima; Ad, A. honmai. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: H. magnanima'nın cinsiyetten ekstrakte edilen nükleik asitlerin konsantrasyonu ve kalitesi fazat larvalarını belirledi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: RNA dizileme ham verilerinin nitelikleri. 1 adet Q20 (%), %99 okuma doğruluğu ile okuma olasılığını gösterir. 2 adet Q30 (%), %99,9 okuma doğruluğu ile okuma olasılığını gösterir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tortricid çeşitli tarım ve ormancılık zararlılarından oluşur; Bu çalışmada tortriksin nesiller boyunca arka plana çıkarılması, böceklerin embriyogenezini ve cinsiyetinin gözlemlenmesi ve olgunlaşmış embriyolar kullanılarak moleküler analiz yapılması için yöntemler sunulmuştur.
Haşere böcek çalışmasının önündeki engellerden biri, yetiştirme yöntemleri oluşturmaktır. Özellikle akrabalık bazen türlerin uygunluğunu olumsuz yönde etkiler. Akrabalık depresyonu olarak adlandırılan inbreed tarafından yapılan zindelik azalması, böcekler15,16,17,18 dahil olmak üzere çeşitli bitki ve hayvanlarda yaygın olarak gözlenmiştir. Belirtildiği gibi, hem H. magnanima hem de A. honmai, belirgin bir fitness maliyeti olmadan 100 nesilden fazla (10 yıldan fazla) boyunca muhafaza edilmiştir. Diğer tortrisidlerin de genel olarak akrabalığa karşı yüksek toleransa sahip olup olmadıklarını değerlendirmek yeterli olmasa da, iki tür monoton çevresel koşullara (yani çay tarlalarına) ve çeşitli endosimbiyotik mikroorganizmalara (örneğin, Wolbachia11,12) uyum sağlayarak özellikleri geliştirmiş olabilir. ). İki türün yumurtaları kolayca elde edilir, ancak yumurtlama davranışları ekolojilerine farklı şekilde atfedilir. Gerçekten de, nem ve kırışıklık yönü, tarlalardaki böceklerin doğal tarihçelerini yansıtabilecek olan yumurtaların sayısını doğrudan etkiliyor gibi görünmektedir. Yetiştirme yöntemlerinin doğadaki biyolojik özelliklerine göre türlere göre ayarlanması önemlidir.
Bu çalışmada oluşturulan protokoller, cinsiyet tarafından belirlenen olgunlaşmış embriyo ve larvaları kullanarak embriyogenezin ve moleküler çalışmaların gözlemlenmesini sağlamıştır. Böcek yumurtaları genellikle birkaç kabuk tabakası10,19 ile kaplanır. Ayrıca, H. magnanima ve A. honmai'nin yumurtaları maternal sekresyonlarla kaplıdır. Yumurtaları bu kadar karmaşık bir yapıyla lekelemek için ayırma, sabitleme ve geçirgenlik gerekli görünmektedir. H. magnanima ve A. honmai gibi ölçek benzeri yumurta kütlesini ovipozitleyen Ostrinia furnacalis'te (Crambidae), tek embriyoları kullanan PCR tabanlı cinsiyet belirleme protokolleri önerilmiştir, ancak nükleik asitlerin düşük kalitesi ve miktarı sonraki analizler için bir sorun olmuştur 6,20. Buna karşılık, bu çalışma, kadına özgü cinsiyet kromatinini gözlemledikten sonra, havuzlanmış cinsiyet tarafından belirlenen embriyolardan nükleik asitlerin çıkarılmasını önerdi. RNA'lar kolayca parçalanır ve burada gösterilen ekstraksiyon prosedürü, transkriptom analizi (RNA-seq) ile de doğrulanan RNA'nın kalitesini etkilememiştir. Burada gösterilen teknikler, çeşitli böcek türlerinin embriyogenez çalışmaları için geçerlidir. Ek olarak, protokoller, embriyogenez 6,11,12 sırasında cinsiyete özgü kusurlara neden olan kimyasal pestisitlerin veya Wolbachia gibi hücre içi mikropların etkilerini değerlendirmek için kullanılabilecek potansiyellere sahiptir.
Bu çalışmanın bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, olgunlaşmamış embriyoların cinsiyetini (0-3 dpo) H. magnanima ve A. honmai'de laktik-asetik orcein boyaması kullanılarak belirlemek zordu. Bunun nedeni, erken embriyogenez sırasında çekirdeklerin sayısının ve boyutunun genellikle küçük olması ve W kromozomunun gözlemlenmesini zorlaştırmasıdır. Erken embriyogenez sırasında tortrisidlerin cinsiyetini açıklığa kavuşturmak için, cinsiyet kromozomları 6,20 üzerindeki belirteçlerin tespiti ve nicelleştirilmesi alternatif bir yaklaşım olabilir. İkincisi, muhtemelen az sayıda hücre nedeniyle, cinsiyet belirlemeden sonra tek bir bireyden yüksek saflıkta nükleik asitleri çıkarmak zordu. Bununla birlikte, tek bir embriyodan ekstrakte edilen RNA veya DNA, PCR testleri ve tek hücreli dizilemeler gibi sonraki analizlere uygulanabilir.
Özetle, bu protokol kütle yetiştirme, morfolojik gözlemler ve model olmayan iki lepidopteran haşere böceğinin, H. magnanima ve A. honmai'nin yumurtalarının genetik analizlerini açıklamaktadır. Bu basit tekniklerin tortrisid, diğer lepidopterans böcekleri ve diğer taksonlar hakkında daha fazla araştırma için uygulanabilir olması beklenmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Japonya Bilimi Geliştirme Derneği (JSPS) Genç Bilim İnsanları için Araştırma Bursu'nun desteğini kabul etmek istemektedir [Hibe Numarası 19J13123 ve 21J00895].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 ounce cup | FP CHUPA | CP070009 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2 ounce cup lid | FP CHUPA | CP070011 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99.7% acetic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| benzalkonium chloride solution | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Cotton | AOUME | 8-1611-02 | insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| DAPI solution | Dojindo, Tokyo, Japan | 340-07971 | stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Disodium Hydrogenphosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS quantification kit | Invitrogen | Q33231 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II column | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Ethanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Glassine paper | HEIKO | 2100010 | insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw |
| heat block WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japan | 4002620 | incubation; https://www.attoeng.site/ |
| heptane | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Lactic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| methanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photometer NP 80 | Implen | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7770S | Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | not shown | Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Potassium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinase K Solution | Merck | 71049-4CN | DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| protein precipitation solution | Qiagen | 158912 | DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| rifampicin | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| RNA HS quantification kit | Invitrogen | Q32855 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase solution | Nippon Gene | 313-01461 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Sodium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Sodium Dodecyl Sulfate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| sodium hypochlorite aqueous solution | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Tetracycline Hydrochloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977023 | RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
References
- Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
- Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1 (2002).
- Matsuura, H., Naito, A. Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan. Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).
- Mita, K., et al. The construction of an EST database for Bombyx mori and its application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).
- Kawamoto, M., et al. High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).
- Fukui, T., et al. In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).
- Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis. Entomological Science. 25 (1), 12497 (2022).
- vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. Tortricid pests: their biology, natural enemies and control. , Elsevier Science Publishers. Amsterdam. (1991).
- Kiuchi, T., et al. A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm. Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).
- Kageyama, D., Traut, W. Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis. Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).
- Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima. Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).
- Schalamun, M., et al. Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora. Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).
- Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10 (1), 159 (2010).
- Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments. Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).
- Saccheri, I., et al. Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation. Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).
- Crnokrak, P., Roff, D. A.
- Keller, L. F., Waller, D. M.
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).
- Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host. Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).
