Summary
Den nåværende protokollen beskriver oppdrettsmetoden for tortricid skadedyrsinsekter i laboratoriene. Prosedyrene for å skille insekters kjønn og trekke ut nukleinsyrer for høy gjennomstrømningssekvensering etableres ved hjelp av to tortricid.
Abstract
Tortricidae (Lepidoptera), kjent som tortrix eller leafroller møll, består av mange landbruks- og skogbruk, noe som forårsaker alvorlige landbrukstap. For å forstå biologien til slike skadedyrmøller har grunnleggende teknikker vært etterspurt. Her utvikles metoder for masseoppdrett, observasjoner og molekylære studier ved hjelp av to te tortrix, Homona magnanima og Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Insekter ble masseoppdratt med skiver kunstig kosthold og opprettholdt ved innavl i over 100 generasjoner ved å vurdere deres biologiske egenskaper. Insekter har ulike sex dimorfismer; Derfor er det vanskelig å skille kjønn i utviklingsstadiene, noe som har forhindret etterfølgende analyser. Det nåværende arbeidet fremhevet at tortricids larver kan bestemmes ved å observere testikler eller melke-eddik-orceinfarging for å visualisere det kvinnespesifikke W-kromosomet. Videre, ved hjelp av kjønnsbestemmelsesmetodene, aktiverte den nåværende studien nukleinsyreekstraksjoner fra kjønnsbestemte embryoer og anvendelse mot høy gjennomstrømningssekvensering. Disse tipsene gjelder for andre skadedyrsinsekter og vil lette ytterligere morfologiske og genetiske studier.
Introduction
Lepidopteran insekter representerer mer enn 10% av alle beskrevne levende arter1, og visse taxa arter forårsaker alvorlig skade på planter og alvorlige landbrukstap 2,3. Selv om molekylære og genetiske studier er utviklet ved hjelp av modellinsekter som silkeorm bombyx mori 4,5, forblir skadedyrsinsekter uinvestert, delvis på grunn av vanskelighetene med oppdrett og håndteringav 6,7. Derfor er grunnleggende studier og teknikker nødvendige for å forstå biologien til slike ikke-modell skadedyrsinsekter.
Tortricidae (Lepidoptera), kjent som tortrix eller leafroller møll, består av mange landbruks- og skogbruk skadedyr8. Av insekt taxa er orientalsk te tortrix Homona magnanima Diakonoff og sommerfrukt tortrix Adoxophyes honmai Yasuda alvorlige polyfagiske kjent for å skade tetrær i Øst-Asia7. De to artene lå flate og ovale skalalignende eggklynger (eller eggmasser) bestående av tynne, myke og skjøre egg dekket av mors sekreter. Selv om embryogenesestadier er avgjørende for insektutvikling og kjønnsbestemmelse9, forhindrer eggstrukturer videre analyse fra å forstå insektens biologi. Det er viktig å overvinne vanskelighetene for videre studier på som ovipositing slike komplekse eggmasse.
Her, for å forstå biologien til tortricids, er metoder for masseoppdrett, observasjoner og molekylære studier utviklet ved hjelp av A. honmai og H. magnanima. For det første opprettholder masseoppdrettsmetoder begge tortricids over 100 generasjoner av innavl. Separasjonen av egg fra den sammenkoblede skalalignende eggmassen forenklet embryogeneseobservasjon av tortricidene ved hjelp av alkaliske og organiske løsningsmidler som tidligere ble utviklet fra teknikker som brukes i fluer10. I tillegg etablerte den nåværende studien kjønnsdiskriminering av små embryoer ved å utvikle fargingsmetoder for kjønnskromatin hos lepidopteran kvinner ved hjelp av melke-eddik-orcein11. Ved å kombinere disse metodene ble nukleinsyrer av høy kvalitet og kvantitet ekstrahert fra kjønnsbestemte embryoer, noe som ellers var vanskelig å etablere6. Den ekstraherte RNA ble brukt til neste generasjons sekvensering. Samlet gjelder metodene som presenteres her for andre lepidopteran insekter og andre insekt taxa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Insektoppsamling og masseoppdrett
- Samle tortricid insekter fra felt etter tidligere publisert Referanser 8,12.
MERK: H. magnanima og A. honmai larver samles fra skadede teblader (figur 1A); voksne tiltrekkes ved hjelp av 4 W bærbart UV-lys (365 nm bølgelengde, se Materialtabell, figur 1B). - Bak de innsamlede larver (Figur 1C,D) individuelt på et stykke kunstig kosthold i en 1/2-oz kopp i 2-3 uker til voksen eklosjon (Figur 1E, F). Bekreft kjønn av pupper og voksne ved morfologiske egenskaper (Figur 1G, I).
- Mate hannene og hunnene i en plastboks (30 cm x 20 cm x 5 cm) til ovipositte eggmasser på et parafinpapir (figur 1J-L). Legg en kvinne og to menn i en 120 ml plastkopp med et stykke parafinpapir for å etablere en matrilin.
MERK: Det er viktig å lage bretter på parafinpapiret. For H. magnanima må parafinpapir være på bunnen av saken. I mellomtiden, for A. honmai, legg et papir på sakstaket for å samle egg (figur 1L) siden H. magnanima oviposit eggmasse på oversiden av tebladene, men A. honmai legger egg på undersiden av bladene8. Prosedyrene ble også verifisert i andre tortricidarter, og det er bedre å plassere papirer på begge sider hvis økologien og oppførselen til målartene er uavklart. - Klipp ut eggmassene (ca. 100-200 egg per eggmasse12, figur 1M) på parafinpapiret med saks. Legg eggene i en 1/2 oz kopp med dumpet papir i 5-7 dager.
MERK: Det modne embryoet viser en hudormkapsel (figur 1N). Periodene med embryogenese er mangfoldig tilskrevet tortricid arter, men generelt 5 dager etter oviposisjon (dpo) for H. magnanima og 4 dpo for A. honmai ved 25 °C med 60% relativ fuktighet, 16 h lys /8 t mørke sykluser7. - Oppbevar eggmassene som viser svarte hodekapsler ved 4-8 °C i 7 dager.
- Skive ~ 60 g kunstige dietter ved hjelp av en riper for masseoppdrett. Legg eggmassen fylt med modnet embryoer på det skiver kunstige kostholdet i en plastbeholder (23 cm x 16 cm x 8 cm). Legg parafinpapir på eggmassen med skiver dietter (figur 10).
MERK: Under 30% relativ fuktighet anses å være over tørr, mens over 70% er for fuktig. Å lage hull på plastbeholderens lokk er bedre for å muliggjøre bedre ventilasjon. Fyll hullene med bomull for å forhindre rømming av små larver. - For å eliminere overflateforurensninger fra eggene, suge eggmassen i 3% formalin og 0,2% Benzalkoniumkloridoppløsning i henholdsvis 5 min.12. For å utrydde tarm- eller intracellulære bakterier, bruk et kunstig kosthold supplert med 0,05% (w / w) Tetracyklinhydroklorid eller 0,06% (w / w) rifampicin i stedet for et normalt kunstig kosthold (se Materialfortegnelse).
MERK: Dette trinnet er valgfritt. Det er viktig å knead Silk Mate 2S og 0,05% (w / w) Tetracyklinhydroklorid eller 0,06% (m / w) rifampicin likeverdig for konsistens. - Samle puppene fra plastbeholderen og skille kjønn basert på morfologiske12 egenskaper (figur 1G-I).
MERK: Generelt presenterer tortricider 5-6 instars til pupering12. H. magnanima og A. honmai larver tar henholdsvis 3 uker og 2 uker etter klekking til pupering. - Legg 15 hanner og 10 kvinner i en plastboks (30 cm x 20 cm x 5 cm, figur 1K) for parring med 25 °C, 16 L/8 D. Samle egg per 5-7 dager og gjenta trinn 1,4-1,9. for hver generasjon.
MERK: Hvis det er behov for å samle nyoppussede eggmasser for etterfølgende analyse, angir du den mørke periodens start og slutt, for eksempel fra kl. 09.00 til 17.00. I denne tilstanden oviposit H. magnanima og A. honami vanligvis egg etter 5 timer (14:00).
2. Separasjon av egg og pharate larver fra eggmasser for fiksering, permeabilisering og farging
- Bløtlegg eggmassen i 1000 μL 1,2% natriumhypokloritt vandig løsning i 10 min eller i 1000 μL 5 M kaliumhydroksid vandig løsning i 30 minutter for å skille eggene.
- Vask de separerte eggene i 1000 μL PBSt (137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 0,05% av Polyoxyethylene (20) Sorbitan Monolaurate [Tween-20] pH 7.4, se Materialfortegnelser) etter den tidligere publiserte rapporten7.
- Bløtlegg egg i en blanding av 500 μL 100% heptan og 500 μL 4% paraformaldehyd-PBSt-løsning (m / v). Bland i 10 min ved 1500 o/min ved hjelp av en virvelblander.
- Bløtlegg eggene i en blanding av 500 μL 100% heptan og 500 μL 100% metanol. Bland i 10 min ved 1500 o/min.
- Vask eggene to ganger med 1000 μL 100% metanol og oppbevar ved 4 °C i 100 % metanol inntil videre eksperimenter (figur 2A).
MERK: Eggene kan oppbevares i minst 1 år ved 4 °C. - Bløtlegg eggene sekvensielt i 99%, 70%, 50% etanol og PBSt i 5 min hver for hydrofilisering etter den tidligere publiserte rapporten7.
- Vask eggene med PBSt, senk eggene i 1 μg / ml DAPI-løsning i 5 min, og vask deretter eggene med 1x PBS to ganger. Bløtlegg eggene i 20 μL 1,25% (m/w) melke-eddiksyre orceinoppløsning (se Materialtabell)11 for å visualisere heterokromatin til kjernene har en strålende rød farge (dette varierer fra 5-60 min) (figur 2B, C).
MERK: De melke-eddik-acetiske orceinfargingsperiodene avhenger av temperatur og fuktighet. Det er bedre å se etter riktig farging ved hjelp av et mikroskop med 4x-10x forstørrelse. - Overfør de fargede eggene ved hjelp av en pipette til en glasssklie. Legg de fargede eggene med antifadereagens (se Materialfortegnelser) og et dekkglass7.
- Trekk ut pharate H. magnanima og A. honmai larver (4-5 dager etter oviposisjon (dpo)) fra eggmassene ved hjelp av tang (figur 2D). Krysse larver på en glasssklie (figur 2E).
- Fest ethvert vev (f.eks. suboøsofageal ganglion, thoracic ganglia, malpighian tubule, etc.) med en blanding av 1:3 (v / v) 99,7% eddiksyre / 100% metanol i 5 min. Flekk de med 1,25% (w / w) melke-eddiksyre orceinoppløsning11 til kjernene er farget (dette kan ta 5-60 min, avhengig av temperatur og fuktighet).
- Bestem kjønn av hvert eksemplar ved å observere tilstedeværelsen (kvinne) eller fraværet (mann) av heterokromatin (W-kromosomet, figur 2F, G) under et mikroskop.
MERK: Kjønnet bestemmes ved å visualisere sexkromatin. Hver celle representerer kjønnskromatin som en prikk hos kvinner11,12, mens den resterende delen av pharate larval vev (ikke fast) bør umiddelbart nedsenkes i celle lysis buffer12 (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, og 1% SDS, pH 8.0) eller fenolholdige RNA ekstraksjon reagenser for enten DNA eller RNA ekstraksjon. Før disseksjonene må reagensene dispenseres 20 μL i 0,2 ml PCR-rør på forhånd (figur 3A). Senk og oppbevar prøver ved -80 °C inntil videre utvinning. Prøvene kan lagres i minst 3 måneder, men det er bedre å fortsette med nedstrømseksperimentene for å forhindre nedbrytning av nukleinsyrer.
3. DNA- og RNA-ekstraksjoner fra kjønnsbestemte pharate larver
- Basseng 12 sex-bestemte mannlige eller kvinnelige pharate larver (5 dpo embryo) og legg til enten celle lysis buffer eller RNA ekstraksjon reagenser (se trinn 2.11 og Tabell over materialer) i en 1,5 ml rør.
MERK: Følg trinn 3.2-3.7 for DNA-ekstraksjon og trinn 3.8-3.11 for RNA-ekstraksjon. - Homogeniser vev i 600 μL av cellelysebufferen (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA og 1% SDS, pH 8,0) og sentrifuger prøvene ved 10.000 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Samle supernatanten (500 μL) ved hjelp av en pipette og inkuber ved 50 °C med 1,5 μL Proteinase K (20 mg/ml, se Materialtabellen) i 5 timer på en varmeblokk.
- Behandle prøvene med 1,0 μL 10 mg/ml RNase-oppløsning (se materialtabellen) ved 37 °C i 30 minutter.
- Tilsett 200 μL proteinutfellingsløsning (se Materialtabell) i rørene7, etterfulgt av en sentrifuge ved 17 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Bland supernatanten (500 μL) med 500 μL 100% isopropanol, og sentrifuger deretter ved 20.400 x g i 10 min ved 4 °C.
- Vask det pelleterte DNA-et to ganger med 1000 μL 70% etanol. Deretter oppløses lufttørk (5-10 min ved romtemperatur), opp DNS i 30 μL 10 mM Tris-Cl buffer (pH 8,5).
- Homogeniser vevet i 600 μL RNA ekstraksjonsreagenser og tilsett 240 μL ultra-rent destillert vann til røret. Sentrifuger rørene ved 12 000 x g i 15 min ved 4 °C.
- Bland supernatanten (600 μL) med 600 μL 100% isopropanol og overfør blandingen til en silikaspinsøyle (se Materialtabell). Sentrifuger rørene ved 17 900 x g i 1 min ved 4 °C.
- Vask kolonnen med 750 μL 70% etanol, og sentrifuger kolonnen to ganger ved 17 900 x g i 1 min hver ved 4 °C.
- Last 15 μL ultra-rent destillert vann til kolonnen. Sentrifuger rørene ved 17 900 x g i 1 min ved 4 °C for å unngå RNA.
- Beregn og bekreft kvaliteten og mengden av DNA og RNA ved hjelp av et UV-basert spektrofotometer. Vurder renheten av nukleinsyrer ved hjelp av forholdet A260/A280 (Nukleinsyrer/protein) og A260/A230 (Nukleinsyrer/salter og andre forurensninger)13.
MERK: For RNA-ekstraksjon ble den tidligere publiserte prosedyren12 fulgt, noe som resulterte i fenolforurensning (tabell 1). Det ekstraherte DNA- og RNA-et fra et enkelt embryo eller pharate larver gir lav mengde og lavkvalitetsprøver. Vanligvis gir DNA-ekstraksjon fra 12 pharate larver 100-600 ng, mens RNA-ekstraksjon ved hjelp av den nåværende metoden genererer 900-1500 ng, som vist tabell 1.
MERK: Trinn 3.13-3.15 er valgfrie for ytterligere analyser av sekvenser med høy gjennomstrømning. - Beregn mengdene DNA og RNA ved hjelp av et fluorescensbasert spektrofotometer.
MERK: Forholdet mellom RNA-mengder (UV-basert konsentrasjon (ng/μL)/fluorescensbasert konsentrasjon (ng/μL)) ble beregnet for å vurdere kvaliteten for videre eksperimentell anvendelse. For eksempel, når UV- og fluorescensbaserte konsentrasjoner er henholdsvis 80 ng/uL og 60 ng/uL, vil forholdet være 1,5 (80/60). Vanligvis indikerer forhold under 1,5 tilstrekkelig renhet for nedstrømsapplikasjoner ved hjelp av høy gjennomstrømningssekvensering13. - Analyser kvaliteten på RNA ved hjelp av mikrochip elektroforese14.
- Bruk de kvalifiserte RNAene til å klargjøre RNA-biblioteket ved hjelp av et RNA-biblioteksforberedelsessett (se Materialfortegnelse). Sekvenser bibliotekene ved hjelp av en plattform som passer for de forberedte bibliotekene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etablering av vertslinjer og vedlikehold
Levedyktigheten til feltinnsamlede larver er forskjellig tilskrevet feltplassering, årstider og oppdrettsforhold (f.eks. 90% av levedyktigheten i Taiwan, Taoyuan, som vist i Arai et al.12). Omtrent 30%-50% av parene vil generere neste generasjon som vanlig. For H. magnanima og A. honmai har matriliner blitt opprettholdt ved innavl i over 100 generasjoner.
Morfologiske observasjoner og kjønnsbestemmelser
Behandlingen med enten kaliumhydroksid (3 eller 5 M KOH) eller natriumhypokloritt (1,2 % Cl2 eller NaClO) skiller egg fra sammenkoblede eggmasser (figur 2A). Den lavere konsentrasjonen av reagensene kunne ikke oppnå separasjon. Alle fikserings-, permeabiliserings- og fargingstrinnene gjorde det mulig å visualisere kjerner med DAPI-løsning. Eggene som ble behandlet med bare KOH eller NaClO (separert) uten fikserings- og permeabiliseringstrinn ble ikke farget med disse fargestoffene7. Ikke-behandlede H. magnanima eggmasser ble ikke farget. Den melke-eddiktiske orcein flekker heterochromatin (W kromosom) med en mørk rød farge og kjerner med en lys rød farge som vanlig (Figur 3A). Denne fargingen muliggjør enkel og rask kjønnsbestemmelse fra 4 dpo embryo til sjette instar larver. Selv om kjerner ble visualisert i 0-3 dpo embryoer, var det vanskelig å observere W-kromosomet med 400x forstørrelse.
DNA av høy kvalitet og RNA ble hentet fra kjønnsbestemte og samlede embryoer
Fra 12 pharate larver, høy kvalitet DNA (A260/A280 = 1,7-2,0; A260/A230 = 1,7-2,4) ble trukket ut med 100-600 ng totalt beløp (tabell 1). Selv om RNA utvunnet etter den tidligere publiserte metoden12 ga 500-1000 ng produkt med lav kvalitet: A260/A280 = 1,7-2,1; A260/A230 = 0,1-0,5 (tabell 1), de modifiserte protokollene ved hjelp av en spinnkolonne forbedret kvaliteten på RNA, og produserte 900-1500 ng-produkt med A260/A280 = 1,9-2,1 og A260/A230 = 1,9-2,3 (tabell 1). Videre var RNA-konsentrasjonsforholdet (UV-baserte / Qbit fluorescensbaserte verdier) for den modifiserte protokollen under 1,2, og oppfyller kvalitetskravene for neste generasjons sekvensering13. På den annen side var kvaliteten og mengden nukleinsyrer ekstrahert fra et enkelt embryo for lavt til å bli beregnet. Intaktheten til RNA hentet fra kjønnsbestemte pharate larver ved hjelp av den modifiserte protokollen ble også bekreftet ved hjelp av mikrochip elektroforese (figur 3B). De forberedte bibliotekene ble bekreftet å gi høy Q30-poengsum (tabell 2).
Figur 1: Oversikt over insektsamling og masseoppdrett av H. magnanima og A. honmai. (A) Teblader og reir skadet av en larve. (B) Lysfelle med UV-lys. (C,D) En kvinne (C) og en mann (D) 6th instar larve av H. magnanima. Den oransje trekanten angir attesten er. (E,F) Samlet larver ble oppdrettet individuelt i en 1/2 oz kopp med et stykke kunstig kosthold. (G,H) Pupae av H. magnanima (G) og A. honmai (H). Hunnen vises til venstre, mens hanen vises til høyre. (I) Voksne av H. magnanima (over) og A. honmai (nedenfor). Både menn og kvinner er vist henholdsvis til høyre og venstre. (J,K) En plastpose (J) eller plastkasse (K) for eggmasseoppsamling. (L) A. honmai oviposit egg på parafinpapir plassert på lokket, og H. magnanima legger egg på parafinpapir plassert på bunnen av saken. (M,N) Eggmasse av H. magnanima. De modne embryoene viser svarte hodekapsler indikert med hvite piler (N). (O) Skiver kunstige dietter med en riper for masseoppdrett. Larvene klekket ut av egg, plassert på skiver dietten, vil danne pupper 3-4 uker etter klekking ved 25 °C (under 16 t lys/8 t mørk syklus). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Observasjoner av embryoer. (A) Separerte, faste og permeabiliserte egg av H. magnanima ved hjelp av 5 N KOH, 4% PFA / heptan, metanol / heptan og metanol. Et separert egg er uthevet med ødelagte linjer. (B) Det 3 dpo embryoet ble farget med melke-eddiksyre orcein. Den svarte pilspissen indikerer embryoet. (C) 4 dpo-embryoet ble farget med DAPI. Den hvite pilspissen indikerer embryoet. (D,E) Disseksjon av pharate larver (5 dpo) ved hjelp av tang. Pharate larver er ekstrahert fra eggmasse (D), bisected på en glasssklie (E). (F,G) Melke-eddiktisk orcein farging ved hjelp av dissekerte pharate larver. Hunnene viser heterokromatin som en prikk (indikert med svart pilspiss, (F), men menn mangler heterochromatin (G). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Grafisk oppsummering av nukleinsyreutvinning ved hjelp av kjønnsbestemte pharate larver og RNA kvaliteter av H. magnanima og A. honmai. (A) Vev av dissekerte pharate larver på glass lysbilder ble farget med melke-eddik-orcein for å bestemme deres kjønn. De resterende vevene ble gjennomvåt i reagenser, samlet i ett rør sortert etter individets kjønn, og deretter utsatt for DNA / RNA-ekstraksjon. (B) Kvaliteten på RNA ekstrahert fra 12 mannlige H. magnanima eller A. honmai ble vurdert ved hjelp av et mikrochip elektroforesesystem. Forkortelser: [nt], nukleotidstørrelse; [FU], fluorescensenhet; M, molekylær markør; Hm, H. magnanima; Annonse, A. honmai. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Konsentrasjon og kvalitet på nukleinsyrer ekstrahert fra kjønnsbestemte pharate larver av H. magnanima. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Kvaliteter på RNA-sekvensering av rådata. 1 Q20 (%) angir sannsynligheten for å lese med 99 % lesenøyaktighet. 2 Q30 (%) angir sannsynligheten for å lese med 99,9 % lesenøyaktighet. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tortricid består av flere landbruks- og skogbruk skadedyr; Den nåværende studien presenterte metoder for å bake tortrix over generasjoner, observere embryogenese og kjønn av insekter, og gjennomføre molekylær analyse ved hjelp av modne embryoer.
En av hindringene for skadedyrsinsektstudie er å etablere oppdrettsmetoder. Spesielt påvirker innavl noen ganger artens kondisjon negativt. Kondisjonsreduksjonen ved innavl, kalt innavlsdepresjon, har blitt observert mye hos ulike planter og dyr, inkludert insekter 15,16,17,18. Som nevnt har både H. magnanima og A. honmai blitt opprettholdt i over 100 generasjoner (mer enn 10 år) uten tilsynelatende kondisjonskostnader. Selv om det ikke er nok å vurdere om andre tortricider også har høy toleranse for innavl generelt, kan de to artene ha utviklet egenskapene ved å tilpasse monotone miljøforhold (dvs. teplantasjer) og mot flere endosymbiotiske mikroorganismer (f.eks. Wolbachia 11,12 ). Eggene til de to artene er lett oppnådd, men deres oviposisjonsadferd er forskjellig tilskrevet deres økologi. Faktisk ser fuktighet og krøllretning ut til å påvirke antall oviposited egg direkte, noe som kan gjenspeile insektenes naturlige historier i felt. Det er viktig å justere oppdrettsmetoder til arter angående deres biologiske egenskaper i naturen.
Protokollene som ble etablert i denne studien gjorde det mulig å observere embryogenese og molekylære studier ved hjelp av kjønnsbestemte modne embryoer og larver. Insekteggene er generelt belagt med flere skalllag10,19. Videre er eggene til H. magnanima og A. honmai dekket med mors sekreter. Å flekke eggene med en slik kompleks struktur, separasjon, fiksering og permeabilisering ser ut til å være alt nødvendig. I Ostrinia furnacalis (Crambidae), som oviposits skala-lignende eggmasse som H. magnanima og A. honmai, PCR-baserte sexbestemmelse protokoller ved hjelp av enkelt embryoer har blitt foreslått, men lav kvalitet og mengde nukleinsyrer har vært et problem for etterfølgende analyse 6,20. I motsetning til dette foreslo den nåværende studien å trekke ut nukleinsyrer fra samlede kjønnsbestemte embryoer etter å ha observert kvinnespesifikk kjønnskromatin. RNAer er lett degradert, og utvinningsprosedyren vist her påvirket ikke kvaliteten på RNA, som også er bekreftet av transkripsjonsanalysen (RNA-seq). Teknikkene som vises her gjelder for studier av embryogenese av ulike insektarter. I tillegg har protokollene potensialer til å bli brukt til å vurdere effekten av kjemiske plantevernmidler eller intracellulære mikrober som Wolbachia, noe som forårsaker kjønnsspesifikke feil under embryogenese 6,11,12.
Den nåværende studien har flere begrensninger. For det første var kjønn av umodne embryoer (0-3 dpo) vanskelig å bestemme ved hjelp av melke-eddik-orcein farging i H. magnanima og A. honmai. Dette skyldes at antall og størrelse på kjernene generelt er små under tidlig embryogenese, noe som gjør det vanskelig å observere W-kromosomet. For å avklare tortricidenes kjønn under tidlig embryogenese, kan deteksjon og kvantifisering av markører på kjønnskromosomer 6,20 være en alternativ tilnærming. For det andre var det vanskelig å trekke ut nukleinsyrer med høy renhet fra et enkelt individ etter kjønnsbestemmelse, muligens på grunn av det lille antall celler. Imidlertid kan RNA eller DNA ekstrahert fra et enkelt embryo gjelde for etterfølgende analyser som PCR-analyser og encellede sekvenseringer.
Oppsummert beskriver den nåværende protokollen masseoppdrett, morfologiske observasjoner og genetiske analyser av eggene til to ikke-modell lepidopteran skadedyrsinsekter, H. magnanima og A. honmai. Disse enkle teknikkene forventes å være anvendelige for videre forskning på tortricid, andre lepidopterans insekter og andre taxa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne støtte fra Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Research Fellowships for Young Scientists [Grant Number 19J13123 og 21J00895].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 ounce cup | FP CHUPA | CP070009 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2 ounce cup lid | FP CHUPA | CP070011 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99.7% acetic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| benzalkonium chloride solution | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Cotton | AOUME | 8-1611-02 | insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| DAPI solution | Dojindo, Tokyo, Japan | 340-07971 | stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Disodium Hydrogenphosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS quantification kit | Invitrogen | Q33231 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II column | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Ethanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Glassine paper | HEIKO | 2100010 | insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw |
| heat block WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japan | 4002620 | incubation; https://www.attoeng.site/ |
| heptane | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Lactic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| methanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photometer NP 80 | Implen | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7770S | Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | not shown | Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Potassium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinase K Solution | Merck | 71049-4CN | DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| protein precipitation solution | Qiagen | 158912 | DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| rifampicin | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| RNA HS quantification kit | Invitrogen | Q32855 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase solution | Nippon Gene | 313-01461 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Sodium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Sodium Dodecyl Sulfate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| sodium hypochlorite aqueous solution | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Tetracycline Hydrochloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977023 | RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
References
- Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
- Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1 (2002).
- Matsuura, H., Naito, A. Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan. Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).
- Mita, K., et al. The construction of an EST database for Bombyx mori and its application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).
- Kawamoto, M., et al. High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).
- Fukui, T., et al. In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).
- Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis. Entomological Science. 25 (1), 12497 (2022).
- vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. Tortricid pests: their biology, natural enemies and control. , Elsevier Science Publishers. Amsterdam. (1991).
- Kiuchi, T., et al. A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm. Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).
- Kageyama, D., Traut, W. Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis. Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).
- Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima. Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).
- Schalamun, M., et al. Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora. Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).
- Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10 (1), 159 (2010).
- Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments. Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).
- Saccheri, I., et al. Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation. Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).
- Crnokrak, P., Roff, D. A.
- Keller, L. F., Waller, D. M.
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).
- Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host. Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).
