Summary
Il presente protocollo descrive il metodo di allevamento degli insetti nocivi tortricidi nei laboratori. Le procedure per distinguere il sesso degli insetti ed estrarre gli acidi nucleici per il sequenziamento ad alto rendimento sono stabilite utilizzando due parassiti tortricidi.
Abstract
Tortricidae (Lepidoptera), comunemente noti come tortrix o falene leafroller, comprende molti parassiti agricoli e forestali, che causano gravi perdite agricole. Per comprendere la biologia di tali falene nocive, le tecniche fondamentali sono state molto richieste. Qui, i metodi per l'allevamento di massa, le osservazioni e gli studi molecolari sono sviluppati utilizzando due tortrix del tè, Homona magnanima e Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Gli insetti sono stati allevati in massa con una dieta artificiale affettata e mantenuti dalla consanguineità per oltre 100 generazioni considerando le loro caratteristiche biologiche. Gli insetti hanno vari dimorfismi sessuali; quindi è difficile distinguere il sesso durante le fasi di sviluppo, che hanno impedito i test successivi. Il presente lavoro ha evidenziato che il sesso delle larve di tortricidi potrebbe essere determinato osservando testicoli o colorazione di orceina lattico-acetica per visualizzare il cromosoma W specifico della femmina. Inoltre, utilizzando i metodi di determinazione del sesso, il presente studio ha permesso l'estrazione di acido nucleico da embrioni determinati dal sesso e l'applicazione verso il sequenziamento ad alto rendimento. Questi suggerimenti sono applicabili ad altri insetti parassiti e faciliteranno ulteriori studi morfologici e genetici.
Introduction
Gli insetti lepidotteri rappresentano oltre il 10% di tutte le specie viventi descritte1 e alcune specie di taxa causano gravi danni alle piante e gravi perdite agricole 2,3. Sebbene siano stati sviluppati studi molecolari e genetici utilizzando insetti modello come il baco da seta Bombyx mori 4,5, gli insetti parassiti rimangono non indagati, in parte a causa delle difficoltà di allevamento e manipolazione 6,7. Pertanto, sono necessari studi e tecniche fondamentali per comprendere la biologia di tali insetti parassiti non modello.
I Tortricidae (Lepidoptera), comunemente noti come tortrix o falene leafroller, comprendono molti parassiti agricoli e forestali8. Dei taxa degli insetti, il tortrix orientale del tè Homona magnanima Diakonoff e il tortrix di frutta estiva Adoxophyes honmai Yasuda sono gravi parassiti polifagi noti per danneggiare gli alberi del tè in Asia orientale7. Le due specie depongono grappoli di uova piatte e ovali simili a squame (o masse d'uovo) costituiti da uova sottili, morbide e fragili coperte da secrezioni materne. Sebbene le fasi di embriogenesi siano cruciali per lo sviluppo degli insetti e le determinazioni del sesso9, le strutture delle uova impediscono a ulteriori analisi di comprendere la biologia degli insetti. È importante superare le difficoltà per ulteriori studi sui parassiti che ovopongono una massa di uova così complessa.
Qui, per comprendere la biologia dei tortricidi, sono stati sviluppati metodi per l'allevamento di massa, osservazioni e studi molecolari utilizzando A. honmai e H. magnanima. In primo luogo, i metodi di allevamento di massa mantengono entrambi i tortricidi per oltre 100 generazioni da inbred. La separazione delle uova dalla massa uovo concatenata simile a una scala ha facilitato l'osservazione dell'embriogenesi dei tortricidi utilizzando solventi alcalini e organici precedentemente sviluppati da tecniche utilizzate nelle mosche10. Inoltre, il presente studio ha stabilito la discriminazione sessuale di piccoli embrioni sviluppando metodi di colorazione della cromatina sessuale di femmine di lepidotteri utilizzando orceina lattico-acetica11. Combinando questi metodi, gli acidi nucleici di alta qualità e quantità sono stati estratti da embrioni determinati dal sesso, che era altrimenti difficile da stabilire6. L'RNA estratto è stato utilizzato per il sequenziamento di prossima generazione. Collettivamente, i metodi qui presentati si applicano ad altri insetti lepidotteri e altri taxa di insetti.
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Protocol
1. Raccolta e allevamento di massa degli insetti
- Raccogli gli insetti tortricidi dai campi seguendo i riferimenti 8,12 precedentemente pubblicati.
NOTA: le larve di H. magnanima e A. honmai sono raccolte da foglie di tè danneggiate (Figura 1A); gli adulti sono attratti utilizzando la luce UV portatile da 4 W (lunghezza d'onda di 365 nm, vedi Tabella dei materiali, Figura 1B). - Allevare le larve raccolte (Figura 1C, D) individualmente su un pezzo di dieta artificiale in una tazza da 1/2 oz per 2-3 settimane fino all'eclosione adulta (Figura 1E, F). Confermare il sesso delle pupe e degli adulti per tratti morfologici (Figura 1G,I).
- Accoppiare i maschi e le femmine in una scatola di plastica (30 cm x 20 cm x 5 cm) alle masse di uova di ovoposito su una carta di paraffina (Figura 1J-L). Metti una femmina e due maschi in un bicchiere di plastica da 120 ml con un pezzo di carta di paraffina per stabilire una matrilina.
NOTA: È importante fare pieghe sulla carta di paraffina. Per H. magnanima, la carta di paraffina deve essere sul fondo del caso. Nel frattempo, per A. honmai, metti un foglio sul soffitto della cassa per raccogliere le uova (Figura 1L) poiché H. magnanima oviposit massa di uova sul lato superiore delle foglie di tè, ma A. honmai depone le uova sul lato inferiore delle foglie8. Le procedure sono state verificate anche in altre specie tortricidi, ed è meglio posizionare documenti su entrambi i lati se l'ecologia e il comportamento delle specie bersaglio non sono chiariti. - Ritagliare le masse di uova (circa 100-200 uova per massa d'uovo12, Figura 1M) sulla carta di paraffina con le forbici. Metti le uova in una tazza da 1/2 oz con carta scaricata per 5-7 giorni.
NOTA: L'embrione maturo presenta una capsula di punti neri (Figura 1N). I periodi di embriogenesi sono attribuiti in modo diverso alle specie totricidi, ma generalmente 5 giorni dopo l'ovodeposizione (dpo) per H. magnanima e 4 dpo per A. honmai a 25 °C con il 60% di umidità relativa, 16 ore di luce / 8 ore di cicli scuri7. - Conservare le masse di uova che mostrano capsule di testa nera a 4-8 °C per 7 giorni.
- Affettare ~ 60 g di diete artificiali usando una grattugia per l'allevamento di massa. Metti la massa d'uovo piena di embrioni maturi sulla dieta artificiale affettata in un contenitore di plastica (23 cm x 16 cm x 8 cm). Posizionare le carte di paraffina sulla massa d'uovo con le diete a fette (Figura 10).
NOTA: al di sotto del 30% l'umidità relativa è considerata troppo secca, mentre oltre il 70% è troppo umida. Creare fori sul coperchio del contenitore di plastica è meglio per consentire una migliore ventilazione. Riempire i fori con il cotone per evitare le fughe di piccole larve. - Per eliminare i contaminanti superficiali dalle uova, immergere la massa dell'uovo in una soluzione di cloruro di benzalconio al 3% e allo 0,2% per 5 minuti, rispettivamente12. Per sradicare i batteri intestinali o intracellulari, utilizzare una dieta artificiale integrata con 0,05% (p / p) tetraciclina cloridrato o 0,06% (p / p) rifampicina invece di una normale dieta artificiale (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: questo passaggio è facoltativo. È importante impastare Silk Mate 2S e 0,05% (p / p) tetraciclina cloridrato o 0,06% (p / p) rifampicina equamente per coerenza. - Raccogliere le pupe dal contenitore di plastica e distinguere il sesso in base alle12 caratteristiche morfologiche (Figura 1G-I).
NOTA: Generalmente, i tortricidi presentano 5-6 stelle fino alla pupa12. Le larve di H. magnanima e A. honmai impiegano rispettivamente 3 settimane e 2 settimane dopo la schiusa fino alla pupa. - Metti 15 maschi e 10 femmine in una scatola di plastica (30 cm x 20 cm x 5 cm, Figura 1K) per l'accoppiamento con 25 °C, 16 L/8 D. Raccogli le uova per 5-7 giorni e ripeti i passaggi 1,4-1,9. per ogni generazione.
NOTA: se è necessaria la raccolta di masse di uova appena ovopositate per un'analisi successiva, impostare l'inizio e la fine del periodo buio, ad esempio dalle 9:00 alle 17:00. In questa condizione, H. magnanima e A. honami di solito ovoposito uova dopo 5 h (2 PM).
2. Separazione delle uova e delle larve di farato dalle masse delle uova per la fissazione, la permeabilizzazione e la colorazione
- Immergere la massa dell'uovo in 1.000 μL di soluzione acquosa di ipoclorito di sodio all'1,2% per 10 minuti o in 1.000 μL di soluzione acquosa di idrossido di potassio 5 M per 30 minuti per separare le uova.
- Lavare le uova separate in 1.000 μL di PBSt (137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 0,05% di poliossietilene (20) sorbitano monolaurato [Tween-20] pH 7,4, vedere Tabella dei materiali) seguendo il rapportoprecedentemente pubblicato 7.
- Immergere le uova in una miscela di 500 μL di eptano al 100% e 500 μL di soluzione di paraformaldeide-PBSt al 4% (p/v). Mescolare per 10 minuti a 1.500 giri / min utilizzando un miscelatore a vortice.
- Immergere le uova in una miscela di 500 μL di 100% eptano e 500 μL di metanolo al 100%. Miscelare per 10 min a 1.500 giri/min.
- Lavare le uova due volte con 1.000 μL di metanolo al 100% e conservare a 4 °C in metanolo al 100% fino a ulteriori esperimenti (Figura 2A).
NOTA: Le uova possono essere conservate per almeno 1 anno a 4 °C. - Immergere le uova in sequenza in etanolo al 99%, 70%, 50% e PBSt per 5 minuti ciascuno per l'idrofilizzazione seguendo il rapporto7 precedentemente pubblicato.
- Lavare le uova con PBSt, immergere le uova in 1 μg/mL di soluzione DAPI per 5 minuti, quindi lavare le uova con 1x PBS due volte. Immergere le uova in 20 μL di soluzione di orceina lattico-acetica all'1,25% (p/p) (vedi Tabella dei materiali)11 per visualizzare l'eterocromatina fino a quando i nuclei non presentano un colore rosso brillante (questo varia da 5-60 min) (Figura 2B,C).
NOTA: I periodi di colorazione della orceina lattico-acetica dipendono dalla temperatura e dall'umidità. È meglio verificare la corretta colorazione usando un microscopio con ingrandimento 4x-10x. - Trasferire le uova colorate usando una pipetta su un vetrino. Racchiudere le uova colorate con un reagente antideflagrante (vedi Tabella dei materiali) e un vetro di copertura7.
- Estrarre le larve di pharate H. magnanima e A. honmai (4-5 giorni dopo l'ovodeposizione (dpo)) dalle masse uovo usando una pinza (Figura 2D). Larve tagliate in due su un vetrino (Figura 2E).
- Fissare eventuali tessuti (ad esempio, ganglio subesofageo, gangli toracici, tubulo malpighiano, ecc.) con una miscela di 1:3 (v/v) 99,7% acido acetico/100% metanolo per 5 minuti. Macchiare quelli con 1,25% (p/p) di soluzione di orceina lattico-acetica11 fino a quando i nuclei non sono macchiati (questo può richiedere 5-60 minuti, a seconda della temperatura e dell'umidità).
- Determinare il sesso di ciascun campione osservando la presenza (femmina) o l'assenza (maschio) di eterocromatina (il cromosoma W, Figura 2F,G) al microscopio.
NOTA: Il sesso è determinato visualizzando la cromatina sessuale. Ogni cellula rappresenta la cromatina sessuale come un punto nelle femmine11,12, mentre la restante porzione di tessuti larvali di farato (non fissa) deve essere immediatamente immersa nel tampone di lisi cellulare12 (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA e 1% SDS, pH 8,0) o reagenti di estrazione dell'RNA contenenti fenolo per l'estrazione di DNA o RNA. Prima delle dissezioni, erogare in anticipo 20 μL dei reagenti in tubi PCR da 0,2 mL (Figura 3A). Immergere e conservare i campioni a -80 °C fino a un'ulteriore estrazione. I campioni possono essere conservati per almeno 3 mesi, ma è meglio procedere con gli esperimenti a valle per prevenire la degradazione degli acidi nucleici.
3. Estrazioni di DNA e RNA da larve di farato determinate per sesso
- Raggruppare 12 larve di farato maschili o femminili determinate per sesso (embrione da 5 dpo) e aggiungere tampone di lisi cellulare o reagenti di estrazione dell'RNA (vedere il passaggio 2.11 e la tabella dei materiali) in un tubo da 1,5 ml.
NOTA: seguire i passaggi 3.2-3.7 per l'estrazione del DNA e i passaggi 3.8-3.11 per l'estrazione dell'RNA. - Omogeneizzare i tessuti in 600 μL del tampone di lisi cellulare (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA e 1% SDS, pH 8,0) e centrifugare i campioni a 10.000 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Raccogliere il surnatante (500 μL) usando una pipetta e incubare a 50 °C con 1,5 μL di proteinasi K (20 mg/mL, vedere Tabella dei materiali) per 5 ore su un blocco termico.
- Trattare i campioni con 1,0 μL di 10 mg/mL di soluzione di RNasi (vedere Tabella dei materiali) a 37 °C per 30 min.
- Aggiungere 200 μL di soluzione di precipitazione proteica (vedere Tabella dei materiali) ai tubi7, quindi una centrifuga a 17.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Mescolare il surnatante (500 μL) con 500 μL di isopropanolo al 100% e quindi centrifugare a 20.400 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Lavare il DNA pellettato due volte con 1.000 μL di etanolo al 70%. Quindi, asciugare all'aria (5-10 minuti a temperatura ambiente), sciogliere il DNA in 30 μL di tampone Tris-Cl da 10 mM (pH 8,5).
- Omogeneizzare i tessuti in 600 μL di reagenti per l'estrazione dell'RNA e aggiungere 240 μL di acqua distillata ultrapura al tubo. Centrifugare i tubi a 12.000 x g per 15 min a 4 °C.
- Mescolare il surnatante (600 μL) con 600 μL di isopropanolo al 100% e trasferire la miscela in una colonna di spin di silice (vedere Tabella dei materiali). Centrifugare i tubi a 17.900 x g per 1 min a 4 °C.
- Lavare la colonna con 750 μL di etanolo al 70% e centrifugare la colonna due volte a 17.900 x g per 1 minuto ciascuno a 4 °C.
- Caricare 15 μL di acqua distillata ultrapura sulla colonna. Centrifugare i tubi a 17.900 x g per 1 min a 4 °C per eluire l'RNA.
- Calcola e verifica la qualità e la quantità di DNA e RNA utilizzando uno spettrofotometro basato su UV. Valutare la purezza degli acidi nucleici utilizzando i rapporti A260/A280 (Acidi nucleici/proteine) e A260/A230 (Acidi nucleici/sali e altri contaminanti)13.
NOTA: Per l'estrazione dell'RNA, è stata seguita la procedura12 precedentemente pubblicata, che ha provocato la contaminazione da fenoli (Tabella 1). Il DNA e l'RNA estratti da un singolo embrione o larve di farato producono campioni di bassa quantità e di bassa qualità. Tipicamente, l'estrazione del DNA da 12 larve di farato produce 100-600 ng, mentre l'estrazione dell'RNA utilizzando il metodo corrente genera 900-1.500 ng, come mostrato nella Tabella 1.
NOTA: i passaggi 3.13-3.15 sono facoltativi per ulteriori saggi di sequenziamenti ad alto rendimento. - Calcola le quantità di DNA e RNA utilizzando uno spettrofotometro basato sulla fluorescenza.
NOTA: Il rapporto tra le quantità di RNA (concentrazione basata su UV (ng/μL)/concentrazione basata sulla fluorescenza (ng/μL)) è stato calcolato per valutare la qualità per ulteriori applicazioni sperimentali. Ad esempio, quando le concentrazioni basate su UV e fluorescenza sono rispettivamente 80 ng / uL e 60 ng / uL, il rapporto sarà 1,5 (80/60). Di solito, rapporti inferiori a 1,5 indicano una purezza sufficiente per le applicazioni a valle che utilizzano il sequenziamento ad alta produttività13. - Analizzare la qualità dell'RNA utilizzando l'elettroforesi a microchip14.
- Utilizzare gli RNA qualificati per preparare la libreria di RNA utilizzando un kit di preparazione della libreria di RNA (vedere Tabella dei materiali). Sequenziare le librerie utilizzando una piattaforma adatta alle librerie preparate.
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Representative Results
Creazione di linee host e loro manutenzione
La vitalità delle larve raccolte sul campo è attribuita in modo diverso alla posizione del campo, alle stagioni e alle condizioni di allevamento (ad esempio, il 90% della vitalità a Taiwan, Taoyuan, come mostrato in Arai et al.12). Circa il 30%-50% delle coppie genererà la prossima generazione come al solito. Per H. magnanima e A. honmai, le matriline sono state mantenute dalla consanguineità per oltre 100 generazioni.
Osservazioni morfologiche e determinazioni del sesso
Il trattamento con idrossido di potassio (3 o 5 M KOH) o ipoclorito di sodio (1,2 % Cl 2 o NaClO) separa le uova dalle loro masse di uova concatenate (Figura 2A). La concentrazione inferiore dei reagenti non poteva ottenere la separazione. Tutte le fasi di fissazione, permeabilizzazione e colorazione hanno permesso la visualizzazione dei nuclei con la soluzione DAPI. Le uova trattate solo con KOH o NaClO (separate) senza le fasi di fissazione e permeabilizzazione non sono state macchiate con questi coloranti7. Le masse di uova di H. magnanima non trattate non sono state macchiate. L'orceina lattico-acetica colora eterocromatina (cromosoma W) con un colore rosso scuro e nuclei con un colore rosso vivo come al solito (Figura 3A). Questa colorazione consente una facile e veloce determinazione del sesso da 4 embrioni dpo a sesta larva instar. Sebbene i nuclei fossero visualizzati in embrioni 0-3 dpo, era difficile osservare il cromosoma W con ingrandimento 400x.
DNA e RNA di alta qualità sono stati ottenuti da embrioni determinati per sesso e raggruppati
Da 12 larve di farato, DNA di alta qualità (A260/A280 = 1,7-2,0; A260/A230 = 1,7-2,4) sono stati estratti con 100-600 ng in quantità totale (tabella 1). Sebbene l'RNA estratto seguendo il metodo12 precedentemente pubblicato abbia prodotto 500-1.000 ng di prodotto con bassa qualità: A260 / A280 = 1,7-2,1; A260/A230 = 0,1-0,5 (Tabella 1), i protocolli modificati che utilizzano una colonna di spin hanno migliorato la qualità dell'RNA, producendo 900-1.500 ng prodotto con A260/A280 = 1,9-2,1 e A260/A230 = 1,9-2,3 (Tabella 1). Inoltre, il rapporto di concentrazione dell'RNA (valori basati su UV/Qbit fluorescenza) per il protocollo modificato era inferiore a 1,2, soddisfacendo i requisiti di qualità per il sequenziamento di prossima generazione13. Al contrario, la qualità e la quantità degli acidi nucleici estratti da un singolo embrione erano troppo basse per essere calcolate. L'integrità dell'RNA estratto da larve di farato determinate per sesso utilizzando il protocollo modificato è stata confermata anche utilizzando l'elettroforesi a microchip (Figura 3B). È stato confermato che le librerie preparate producono letture di punteggi Q30 elevate (Tabella 2).
Figura 1: Panoramica della raccolta di insetti e dell'allevamento di massa di H. magnanima e A. honmai. (A) Foglie di tè e nidi danneggiati da una larva. (B) Trappola luminosa con luce UV. (C,D) Una femmina (C) e un maschio (D) 6° instar larva di H. magnanima. Il triangolo arancione indica il testicolo. (E,F) Le larve raccolte sono state allevate individualmente in una tazza da 1/2 oz con un pezzo di dieta artificiale. (G,H) Pupe di H. magnanima (G) e A. honmai (H). La femmina è mostrata a sinistra, mentre il maschio è mostrato a destra. (I) Adulti di H. magnanima (sopra) e A. honmai (sotto). Sia i maschi che le femmine sono mostrati rispettivamente a destra e a sinistra. (J,K) Un sacchetto di plastica (J) o una custodia di plastica (K) per la raccolta della massa delle uova. (L) A. honmai uova di ovoposit su carta di paraffina posta sul coperchio e H. magnanima depongono le uova su carta di paraffina posta sul fondo della custodia. (M,N) Massa d'uovo di H. magnanima. Gli embrioni maturi presentano capsule di testa nera indicate con frecce bianche (N). (O) Diete artificiali affettate con grattugia per l'allevamento di massa. Le larve schiuse dalle uova, poste sulla dieta affettata, formeranno pupe 3-4 settimane dopo la schiusa a 25 °C (sotto 16 ore luce/8 h ciclo buio). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Osservazioni di embrioni. (A) Le uova separate, fisse e permeabilizzate di H. magnanima utilizzando 5 N KOH, 4% PFA / eptano, metanolo / eptano e metanolo. Un uovo separato è evidenziato con linee spezzate. (B) L'embrione 3 dpo è stato colorato con orceina lattico-acetica. La punta di freccia nera indica l'embrione. (C) L'embrione 4 dpo è stato colorato con DAPI. La punta di freccia bianca indica l'embrione. (D,E) Dissezione di larve di pharate (5 dpo) usando una pinza. Le larve di farato vengono estratte dalla massa dell'uovo (D), tagliate in due su un vetrino (E). (F,G) Colorazione dell'orceina lattico-acetica usando le larve di farato sezionate. Le femmine mostrano eterocromatina come punto (indicato con punta di freccia nera, (F), ma i maschi mancano dell'eterocromatina (G). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Riepilogo grafico dell'estrazione di acidi nucleici utilizzando larve di farato determinate dal sesso e qualità di RNA di H. magnanima e A. honmai. (A) I tessuti delle larve di farato sezionate su vetrini sono stati colorati con orceina lattico-acetica per determinare il loro sesso. I tessuti rimanenti sono stati immersi in reagenti, raggruppati in un tubo ordinato in base al sesso degli individui e quindi sottoposti all'estrazione di DNA / RNA. (B) La qualità dell'RNA estratto da 12 maschi H. magnanima o A. honmai è stata valutata utilizzando un sistema di elettroforesi a microchip. Abbreviazioni: [nt], dimensione nucleotidica; [FU], unità di fluorescenza; M, marcatore molecolare; Hm, H. magnanima; Ad, A. honmai. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Concentrazione e qualità degli acidi nucleici estratti da larve di pharate determinate per sesso di H. magnanima. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Qualità dei dati grezzi di sequenziamento dell'RNA. 1 Q20 (%) indica la probabilità di letture con una precisione di lettura del 99%. numero arabo Q30 (%) indica la probabilità di letture con una precisione di lettura del 99,9%. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Tortricid comprende diversi parassiti agricoli e forestali; il presente studio ha presentato metodi per allevare tortrix nel corso delle generazioni, osservare l'embriogenesi e il sesso degli insetti e condurre analisi molecolari utilizzando embrioni maturi.
Uno degli ostacoli per lo studio degli insetti nocivi è quello di stabilire metodi di allevamento. Soprattutto, la consanguineità a volte influisce negativamente sulla forma fisica della specie. La riduzione della forma fisica da parte degli inbred, chiamata depressione da consanguineità, è stata ampiamente osservata in varie piante e animali, compresi gli insetti 15,16,17,18. Come notato, sia H. magnanima che A. honmai sono stati mantenuti per oltre 100 generazioni (più di 10 anni) senza costi di fitness apparenti. Sebbene non sia sufficiente valutare se anche altri tortricidi abbiano un'elevata tolleranza alla consanguineità in generale, le due specie potrebbero aver sviluppato le caratteristiche adattando condizioni ambientali monotone (ad esempio, piantagioni di tè) e contro diversi microrganismi endosimbiotici (ad esempio, Wolbachia 11,12 ). Le uova delle due specie sono facilmente ottenibili, ma i loro comportamenti di ovodeposizione sono attribuiti in modo diverso alla loro ecologia. In effetti, l'umidità e la direzione della piega sembrano influenzare direttamente il numero di uova ovopositate, che potrebbero riflettere le storie naturali degli insetti nei campi. È importante adattare i metodi di allevamento alle specie per quanto riguarda le loro caratteristiche biologiche in natura.
I protocolli stabiliti in questo studio hanno permesso l'osservazione dell'embriogenesi e studi molecolari utilizzando embrioni e larve maturi determinati dal sesso. Le uova di insetto sono generalmente rivestite con diversi strati di guscio10,19. Inoltre, le uova di H. magnanima e A. honmai sono coperte di secrezioni materne. Per macchiare le uova con una struttura così complessa, la separazione, la fissazione e la permeabilizzazione sembrano essere tutte necessarie. In Ostrinia furnacalis (Crambidae), che ovoposita massa uovo simile a una scala come H. magnanima e A. honmai, sono stati proposti protocolli di determinazione del sesso basati sulla PCR utilizzando singoli embrioni, ma la bassa qualità e quantità di acidi nucleici sono stati un problema per le successive analisi 6,20. Al contrario, il presente studio ha suggerito di estrarre acidi nucleici da embrioni raggruppati determinati dal sesso dopo aver osservato la cromatina sessuale specifica per le donne. Gli RNA sono facilmente degradabili e la procedura di estrazione mostrata qui non ha influenzato la qualità dell'RNA, che è stata confermata anche dall'analisi del trascrittoma (RNA-seq). Le tecniche qui mostrate sono applicabili per gli studi di embriogenesi di varie specie di insetti. Inoltre, i protocolli hanno il potenziale per essere utilizzati per valutare gli effetti di pesticidi chimici o microbi intracellulari come Wolbachia, che causa difetti specifici del sesso durante l'embriogenesi 6,11,12.
Il presente studio ha diverse limitazioni. In primo luogo, il sesso degli embrioni immaturi (0-3 dpo) era difficile da determinare usando la colorazione di orceina lattico-acetica in H. magnanima e A. honmai. Questo perché il numero e le dimensioni dei nuclei sono generalmente piccoli durante l'embriogenesi precoce, rendendo difficile l'osservazione del cromosoma W. Per chiarire il sesso dei tortrici durante l'embriogenesi precoce, l'individuazione e la quantificazione dei marcatori sui cromosomi sessuali 6,20 potrebbe essere un approccio alternativo. In secondo luogo, era difficile estrarre acidi nucleici con elevata purezza da un singolo individuo dopo la determinazione del sesso, probabilmente a causa del piccolo numero di cellule. Tuttavia, l'RNA o il DNA estratto da un singolo embrione può essere applicato ad analisi successive come saggi PCR e sequenziamenti monocellulari.
In sintesi, il presente protocollo descrive l'allevamento di massa, le osservazioni morfologiche e le analisi genetiche delle uova di due insetti parassiti lepidotteri non modello, H. magnanima e A. honmai. Queste semplici tecniche dovrebbero essere applicabili per ulteriori ricerche su tortricidi, altri insetti lepidotteri e altri taxa.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano riconoscere il sostegno della Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Research Fellowships for Young Scientists [Numero di sovvenzione 19J13123 e 21J00895].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 ounce cup | FP CHUPA | CP070009 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2 ounce cup lid | FP CHUPA | CP070011 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99.7% acetic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| benzalkonium chloride solution | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Cotton | AOUME | 8-1611-02 | insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| DAPI solution | Dojindo, Tokyo, Japan | 340-07971 | stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Disodium Hydrogenphosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS quantification kit | Invitrogen | Q33231 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II column | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Ethanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Glassine paper | HEIKO | 2100010 | insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw |
| heat block WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japan | 4002620 | incubation; https://www.attoeng.site/ |
| heptane | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Lactic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| methanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photometer NP 80 | Implen | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7770S | Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | not shown | Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Potassium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinase K Solution | Merck | 71049-4CN | DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| protein precipitation solution | Qiagen | 158912 | DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| rifampicin | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| RNA HS quantification kit | Invitrogen | Q32855 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase solution | Nippon Gene | 313-01461 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Sodium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Sodium Dodecyl Sulfate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| sodium hypochlorite aqueous solution | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Tetracycline Hydrochloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977023 | RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
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