Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Aufzuchtmethode von tortriciden Schädlingsinsekten in den Laboratorien. Die Verfahren zur Unterscheidung des Geschlechts von Insekten und zum Extrahieren von Nukleinsäuren für die Hochdurchsatzsequenzierung werden unter Verwendung von zwei Tortricid-Schädlingen festgelegt.
Abstract
Tortricidae (Lepidoptera), allgemein bekannt als Tortrix oder Blattwickler, umfassen viele land- und forstwirtschaftliche Schädlinge, die schwere landwirtschaftliche Verluste verursachen. Um die Biologie solcher Schädlingsmotten zu verstehen, waren grundlegende Techniken sehr gefragt. Hier werden Methoden zur Massenaufzucht, Beobachtungen und molekulare Studien mit zwei Teetortrix, Homona magnanima und Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae), entwickelt. Insekten wurden mit in Scheiben geschnittener künstlicher Nahrung massenhaft gezüchtet und durch Inzucht über 100 Generationen unter Berücksichtigung ihrer biologischen Eigenschaften aufrechterhalten. Insekten haben verschiedene Geschlechtsdimorphismen; Daher ist es schwierig, das Geschlecht während der Entwicklungsstadien zu unterscheiden, die nachfolgende Assays verhindert haben. Die vorliegende Arbeit hob hervor, dass das Geschlecht von Tortricidenlarven durch die Beobachtung von Hoden oder Milch-Essigsäure-Orcein-Färbung bestimmt werden konnte, um das frauenspezifische W-Chromosom zu visualisieren. Darüber hinaus ermöglichte die vorliegende Studie unter Verwendung der Geschlechtsbestimmungsmethoden Nukleinsäureextraktionen aus geschlechtsbestimmten Embryonen und die Anwendung auf Hochdurchsatzsequenzierung. Diese Tipps sind für andere Schadinsekten anwendbar und erleichtern weitere morphologische und genetische Studien.
Introduction
Lepidoptera-Insekten machen mehr als 10% aller beschriebenen lebenden Artenaus 1, und bestimmte Taxaarten verursachen schwere Schäden an Pflanzen und schwere landwirtschaftliche Verluste 2,3. Obwohl molekulare und genetische Studien mit Modellinsekten wie der Seidenraupe Bombyx mori4,5 entwickelt wurden, bleiben Schädlingsinsekten unerforscht, teilweise wegen der Schwierigkeiten bei der Aufzucht und Handhabung 6,7. Daher sind grundlegende Studien und Techniken notwendig, um die Biologie solcher Nicht-Modell-Schädlingsinsekten zu verstehen.
Die Tortricidae (Lepidoptera), allgemein bekannt als Tortrix oder Blattwickler, umfassen viele land- und forstwirtschaftliche Schädlinge8. Von den Insektentaxa sind die orientalische Teetortrix Homona magnanima Diakonoff und die Sommerfruchttortrix Adoxophyes honmai Yasuda schwere polyphage Schädlinge, von denen bekannt ist, dass sie Teebäume in Ostasien schädigen7. Die beiden Arten legen flache und ovale schuppenartige Eierhaufen (oder Eiermassen), die aus dünnen, weichen und zerbrechlichen Eiern bestehen, die von mütterlichen Sekreten bedeckt sind. Obwohl Embryogenesestadien für die Insektenentwicklung und die Geschlechtsbestimmung entscheidend sind9, verhindern Strukturen der Eier, dass weitere Analysen die Biologie der Insekten verstehen. Es ist wichtig, die Schwierigkeiten für weitere Studien über Schädlinge, die eine solche komplexe Eimasse ovipositieren, zu überwinden.
Um die Biologie der Tortricide zu verstehen, wurden Methoden zur Massenaufzucht, Beobachtungen und molekularen Studien mit A. honmai und H. magnanima entwickelt. Erstens erhalten Massenaufzuchtmethoden beide Tortrizide über 100 Generationen nach Inzucht. Die Trennung der Eier von der verketteten, schuppenartigen Eimasse erleichterte die embryonale Beobachtung der Tortricide mit alkalischen und organischen Lösungsmitteln, die zuvor aus Techniken entwickelt wurden, die bei Fliegen10 verwendet wurden. Darüber hinaus stellte die vorliegende Studie die geschlechtsspezifische Diskriminierung kleiner Embryonen fest, indem sie Färbemethoden für das Geschlechtschromatin von Lepidoptera-Weibchen unter Verwendung von Milch-Essig-Orcein11 entwickelte. Durch die Kombination dieser Methoden wurden qualitativ hochwertige und quantitative Nukleinsäuren aus geschlechtsbestimmten Embryonen extrahiert, was ansonsten schwer zu etablieren war6. Die extrahierte RNA wurde für die Sequenzierung der nächsten Generation verwendet. Insgesamt gelten die hier vorgestellten Methoden für andere Lepidoptera-Insekten und andere Insektentaxa.
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Protocol
1. Insektensammlung und Massenaufzucht
- Sammeln Sie tortricide Insekten von Feldern nach zuvor veröffentlichten Referenzen 8,12.
HINWEIS: H. magnanima und A. honmai Larven werden aus beschädigten Teeblättern gesammelt (Abbildung 1A); Erwachsene werden mit tragbarem 4-W-UV-Licht (365 nm Wellenlänge, siehe Materialtabelle, Abbildung 1B) angezogen. - Züchten Sie die gesammelten Larven (Abbildung 1C, D) einzeln mit einem Stück künstlicher Diät in einer 1/2-Unzen-Tasse für 2-3 Wochen bis zur Eklosion des Erwachsenen (Abbildung 1E, F). Bestätigen Sie das Geschlecht von Puppen und Erwachsenen durch morphologische Merkmale (Abbildung 1G, I).
- Verbinden Sie die Männchen und Weibchen in einer Plastikbox (30 cm x 20 cm x 5 cm) mit Eiablage-Eimassen auf einem Paraffinpapier (Abbildung 1J-L). Legen Sie ein Weibchen und zwei Männer in einen 120 ml Plastikbecher mit einem Stück Paraffinpapier, um eine Matriline zu etablieren.
HINWEIS: Es ist wichtig, Falten auf dem Paraffinpapier zu machen. Für H. magnanima muss Paraffinpapier auf der Unterseite des Gehäuses sein. In der Zwischenzeit, für A. honmai, legen Sie ein Papier auf die Gehäuseobergrenze, um Eier zu sammeln (Abbildung 1L), da H. magnanima Eizellmasse auf der Oberseite von Teeblättern ist, aber A. honmai legt Eier auf die Unterseite der Blätter8. Die Verfahren wurden auch bei anderen Tortricid-Arten verifiziert, und es ist besser, Papiere auf beiden Seiten zu platzieren, wenn die Ökologie und das Verhalten der Zielarten ungeklärt sind. - Die Eiermassen (ca. 100-200 Eier pro Eimasse12, Abbildung 1M) auf dem Paraffinpapier mit einer Schere ausschneiden. Legen Sie die Eier für 5-7 Tage in eine 1/2 Unze Tasse mit abgekipptem Papier.
HINWEIS: Der gereifte Embryo weist eine Mitesserkapsel auf (Abbildung 1N). Die Perioden der Embryogenese werden unterschiedlich den Tortricid-Spezies zugeschrieben, aber im Allgemeinen 5 Tage nach der Eiablage (dpo) für H. magnanima und 4 dpo für A. honmai bei 25 ° C mit 60% relativer Luftfeuchtigkeit, 16 h hell / 8 h dunkle Zyklen7. - Lagern Sie die Eiermassen, die Schwarzkopfkapseln zeigen, 7 Tage lang bei 4-8 ° C.
- Schneiden Sie ~ 60 g künstliche Diäten mit einer Reibe für die Massenaufzucht. Legen Sie die mit reifen Embryonen gefüllte Eimasse auf die in Scheiben geschnittene künstliche Diät in einen Plastikbehälter (23 cm x 16 cm x 8 cm). Legen Sie Paraffinpapiere mit den geschnittenen Diäten auf die Eimasse (Abbildung 10).
HINWEIS: Unter 30% relative Luftfeuchtigkeit gilt als zu trocken, während über 70% zu feucht ist. Das Erzeugen von Löchern auf dem Deckel des Kunststoffbehälters ist besser, um eine bessere Belüftung zu ermöglichen. Füllen Sie die Löcher mit Baumwolle, um das Entweichen kleiner Larven zu verhindern. - Um Oberflächenverunreinigungen aus den Eiern zu entfernen, tränken Sie die Eiermasse für 5 min bzw.12 Minuten in 3% Formalin und 0,2% ige Benzalkoniumchloridlösung. Um Darm- oder intrazelluläre Bakterien auszurotten, verwenden Sie eine künstliche Diät, die mit 0,05% (w / w) Tetracyclinhydrochlorid oder 0,06% (w / w) Rifampicin anstelle einer normalen künstlichen Diät ergänzt wird (siehe Tabelle der Materialien).
HINWEIS: Dieser Schritt ist optional. Es ist wichtig, Silk Mate 2S und 0,05% (w/w) Tetracyclinhydrochlorid oder 0,06% (w/w) Rifampicin gleichmäßig für Konsistenz zu kneten. - Sammeln Sie die Puppen aus dem Plastikbehälter und unterscheiden Sie das Geschlecht anhand vonmorphologischen 12 Merkmalen (Abbildung 1G-I).
HINWEIS: Im Allgemeinen präsentieren Tortricide 5-6 Stadien bis zur Verpuppung12. Die Larven H. magnanima und A. honmai brauchen 3 Wochen bzw. 2 Wochen, nach dem Schlüpfen bis zur Verpuppung. - Legen Sie 15 Männchen und 10 Weibchen in eine Plastikbox (30 cm x 20 cm x 5 cm, Abbildung 1K) zur Paarung mit 25 °C, 16 L/8 D. Sammeln Sie Eier pro 5-7 Tage und wiederholen Sie die Schritte 1.4-1.9. für jede Generation.
HINWEIS: Wenn das Sammeln neu eiabgelegter Eimasse für die nachfolgende Analyse erforderlich ist, legen Sie den Beginn und das Ende der dunklen Periode fest, z. B. von 9 bis 17 Uhr. In diesem Zustand nehmen H. magnanima und A. honami normalerweise Eier nach 5 h (14 Uhr) oviposit auf.
2. Trennung von Eiern und Pharatenlarven aus Eiermassen zur Fixierung, Permeabilisierung und Färbung
- Die Eimasse in 1.000 μL 1,2% wässriger Natriumhypochloritlösung für 10 min oder in 1.000 μL 5 M Kaliumhydroxid-wässriger Lösung für 30 min einweichen, um die Eier zu trennen.
- Waschen Sie die getrennten Eier in 1.000 μL PBSt (137 mM NaCl, 8,1 mMNa2HPO 4, 2,68 mM KCl, 1,47 mMKH2PO 4, 0,05% Polyoxyethylen (20) Sorbitanmonolaurat [Tween-20] pH7,4, siehe Materialtabelle) nach dem zuvor veröffentlichten Bericht7.
- Eier in einer Mischung aus 500 μL 100% Heptan und 500 μL 4% Paraformaldehyd-PBSt-Lösung (w/v) einweichen. Mischen Sie für 10 Minuten bei 1.500 U / min mit einem Wirbelmischer.
- Die Eier in eine Mischung aus 500 μL 100% Heptan und 500 μL 100% Methanol einweichen. Mischen Sie für 10 min bei 1.500 U / min.
- Waschen Sie die Eier zweimal mit 1.000 μL 100% Methanol und lagern Sie sie bei 4 °C in 100% Methanol bis zu weiteren Experimenten (Abbildung 2A).
HINWEIS: Die Eier können mindestens 1 Jahr bei 4 °C gelagert werden. - Weichen Sie die Eier nacheinander in 99%, 70%, 50% Ethanol und PBSt für jeweils 5 Minuten zur Hydrophilisierung nach dem zuvor veröffentlichten Bericht7 ein.
- Waschen Sie die Eier mit PBSt, tauchen Sie die Eier für 5 min in 1 μg / ml DAPI-Lösung und waschen Sie die Eier dann zweimal mit 1x PBS. Die Eier in 20 μL 1,25% (w/w) Milch-Essigsäure-Orceinlösung (siehe Materialtabelle)11 einweichen, um Heterochromatin zu visualisieren, bis die Kerne eine leuchtend rote Farbe aufweisen (dies variiert von 5-60 min) (Abbildung 2B,C).
HINWEIS: Die Milch-Essigsäure-Orcein-Färbeperioden hängen von Temperatur und Luftfeuchtigkeit ab. Es ist besser, die richtige Färbung mit einem Mikroskop mit 4x-10-facher Vergrößerung zu überprüfen. - Die gefärbten Eier mit einer Pipette auf einen Glasschieber geben. Umschließen Sie die gefärbten Eier mit Antifade-Reagenz (siehe Materialtabelle) und einem Deckglas7.
- Extrahieren Sie die Larven von Pharat H. magnanima und A. honmai (4-5 Tage nach der Eiablage (dpo)) aus den Eiermassen mit einer Pinzette (Abbildung 2D). Bisect Larven auf einem Glasobjektträger (Abbildung 2E).
- Fixieren Sie alle Gewebe (z. B. Ganglion subösophageales, Thoraxganglien, Malpich-Tubuli usw.) mit einer Mischung aus 1:3 (v/v) 99,7% Essigsäure/100% Methanol für 5 min. Färben Sie diejenigen mit 1,25% (w/w) Milch-Essigsäure-Orceinlösung11 , bis die Kerne gefärbt sind (dies kann 5-60 Minuten dauern, abhängig von der Temperatur und Luftfeuchtigkeit).
- Bestimmen Sie das Geschlecht jeder Probe, indem Sie das Vorhandensein (weiblich) oder Fehlen (männlich) von Heterochromatin (das W-Chromosom, Abbildung 2F, G) unter einem Mikroskop beobachten.
HINWEIS: Das Geschlecht wird durch die Visualisierung des Geschlechtschromatins bestimmt. Jede Zelle stellt das Geschlechtschromatin als Punkt bei Frauen 11,12 dar, während der verbleibende Teil des Pharatenlarvengewebes (nicht fixiert) sofort in Zelllysepuffer 12 (10 mM Tris-HCl,100 mM EDTA und 1% SDS, pH 8,0) oder phenolhaltige RNA-Extraktionsreagenzien für die DNA- oder RNA-Extraktion eingetaucht werden sollte. Vor den Dissektionen 20 μL der Reagenzien im Voraus in 0,2 ml PCR-Röhrchen dosieren (Abbildung 3A). Tauchen und lagern Sie die Proben bei -80 °C bis zur weiteren Extraktion. Die Proben können mindestens 3 Monate gelagert werden, aber es ist besser, mit den nachgeschalteten Experimenten fortzufahren, um den Abbau von Nukleinsäuren zu verhindern.
3. DNA- und RNA-Extraktionen aus geschlechtsspezifischen Pharatenlarven
- Pool 12 geschlechtsspezifische männliche oder weibliche Pharatenlarven (5 dpo Embryo) und entweder Zelllysepuffer oder RNA-Extraktionsreagenzien (siehe Schritt 2.11 und Tabelle der Materialien) in ein 1,5 ml Röhrchen geben.
HINWEIS: Befolgen Sie die Schritte 3.2-3.7 für die DNA-Extraktion und die Schritte 3.8-3.11 für die RNA-Extraktion. - Homogenisieren Sie das Gewebe in 600 μL des Zelllysepuffers (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA und 1% SDS, pH 8,0) und zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 x g für 5 min bei 4 °C.
- Sammeln Sie den Überstand (500 μL) mit einer Pipette und inkubieren Sie bei 50 °C mit 1,5 μL Proteinase K (20 mg/ml, siehe Materialtabelle) für 5 h auf einem Heizblock.
- Behandeln Sie die Proben mit 1,0 μL 10 mg/ml RNase-Lösung (siehe Materialtabelle) bei 37 °C für 30 min.
- 200 μL Proteinfällungslösung (siehe Materialtabelle) in die Röhrchen7 geben, gefolgt von einer Zentrifuge bei 17.000 x g für 10 min bei 4 °C.
- Mischen Sie den Überstand (500 μL) mit 500 μL 100% Isopropanol und zentrifugieren Sie dann bei 20.400 x g für 10 min bei 4 °C.
- Waschen Sie die pelletierte DNA zweimal mit 1.000 μL 70% Ethanol. Dann an der Luft trocknen (5-10 min bei Raumtemperatur), lösen Sie die DNA in 30 μL 10 mM Tris-Cl-Puffer (pH 8,5) auf.
- Homogenisieren Sie das Gewebe in 600 μL RNA-Extraktionsreagenzien und fügen Sie 240 μL ultrareines destilliertes Wasser in die Tube hinzu. Zentrieren Sie die Röhrchen bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C.
- Mischen Sie den Überstand (600 μL) mit 600 μL 100% Isopropanol und übertragen Sie das Gemisch auf eine Silica-Spinsäule (siehe Materialtabelle). Die Röhrchen bei 17.900 x g für 1 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Waschen Sie die Säule mit 750 μL 70% Ethanol und zentrifugieren Sie die Säule zweimal bei 17.900 x g für jeweils 1 min bei 4 °C.
- Laden Sie 15 μL ultrareines destilliertes Wasser in die Säule. Zentrieren Sie die Röhrchen bei 17.900 x g für 1 min bei 4 °C, um die RNA zu eluieren.
- Berechnen und verifizieren Sie die Qualität und Quantität von DNA und RNA mit einem UV-basierten Spektralphotometer. Beurteilen Sie die Reinheit von Nukleinsäuren unter Verwendung der Verhältnisse A260/A280 (Nukleinsäuren/Protein) und A260/A230 (Nukleinsäuren/Salze und andere Verunreinigungen)13.
HINWEIS: Für die RNA-Extraktion wurde das zuvor veröffentlichte Verfahren12 befolgt, das zu einer Phenolkontamination führte (Tabelle 1). Die extrahierte DNA und RNA aus einem einzelnen Embryo oder einer Rastratlarve liefert Proben mit geringer Menge und geringer Qualität. Typischerweise ergibt die DNA-Extraktion aus 12 Pharatarven 100-600 ng, während die RNA-Extraktion mit der aktuellen Methode 900-1.500 ng erzeugt, wie in Tabelle 1 gezeigt.
HINWEIS: Die Schritte 3.13-3.15 sind für weitere Assays von Hochdurchsatz-Sequenzierungen optional. - Berechnen Sie die Mengen an DNA und RNA mit einem fluoreszenzbasierten Spektralphotometer.
HINWEIS: Das Verhältnis der RNA-Mengen (UV-basierte Konzentration (ng/μL)/fluoreszenzbasierte Konzentration (ng/μL)) wurde berechnet, um die Qualität für die weitere experimentelle Anwendung zu beurteilen. Wenn beispielsweise UV- und fluoreszenzbasierte Konzentrationen 80 ng / uL bzw. 60 ng / uL betragen, beträgt das Verhältnis 1,5 (80/60). In der Regel weisen Verhältnisse unter 1,5 auf eine ausreichende Reinheit für nachgelagerte Anwendungen mit Hochdurchsatzsequenzierung13 hin. - Analysieren Sie die Qualität der RNA mit Hilfe der Mikrochip-Elektrophorese14.
- Verwenden Sie die qualifizierten RNAs, um die RNA-Bibliothek mit einem RNA-Bibliotheksvorbereitungskit vorzubereiten (siehe Materialtabelle). Sequenzieren Sie die Bibliotheken mit einer Plattform, die für die vorbereiteten Bibliotheken geeignet ist.
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Representative Results
Einrichtung von Wirtsstrecken und deren Instandhaltung
Die Lebensfähigkeit von Feldsammellarven wird unterschiedlich dem Standort des Feldes, den Jahreszeiten und den Aufzuchtbedingungen zugeschrieben (z. B. 90% der Lebensfähigkeit in Taiwan, Taoyuan, wie in Arai et al.12 gezeigt). Ungefähr 30% -50% der Paare werden wie gewohnt die nächste Generation erzeugen. Für H. magnanima und A. honmai werden Matriline seit über 100 Generationen durch Inzucht aufrechterhalten.
Morphologische Beobachtungen und Geschlechtsbestimmungen
Die Behandlung mit Kaliumhydroxid (3 oder 5 M KOH) oder Natriumhypochlorit (1,2%Cl2 oder NaClO) trennt Eier von ihren verketteten Eimassen (Abbildung 2A). Die geringere Konzentration der Reagenzien konnte keine Trennung erreichen. Alle Fixierungs-, Permeabilisierungs- und Färbeschritte ermöglichten die Visualisierung von Kernen mit DAPI-Lösung. Die Eier, die nur mit KOH oder NaClO (getrennt) ohne die Fixations- und Permeabilisierungsschritte behandelt wurden, wurden mit diesen Farbstoffennicht angefärbt 7. Unbehandelte H. magnanima Eiermassen wurden nicht gefärbt. Das Milch-Essigsäure-Orcein färbt Heterochromatin (W-Chromosom) mit einer dunkelroten Farbe und Kerne mit einer leuchtend roten Farbe wie üblich (Abbildung 3A). Diese Färbung ermöglicht eine einfache und schnelle Geschlechtsbestimmung von 4 dpo-Embryonen bis zu Larven im sechsten Stadium. Obwohl Kerne in 0-3 dpo-Embryonen sichtbar gemacht wurden, war es schwierig, das W-Chromosom mit 400-facher Vergrößerung zu beobachten.
Hochwertige DNA und RNA wurden aus geschlechtsspezifischen und gepoolten Embryonen gewonnen
Aus 12 Pharatenlarven, hochwertige DNA (A260/A280 = 1,7-2,0; A260/A230 = 1,7-2,4) wurden mit einer Gesamtmenge von 100-600 ng extrahiert (Tabelle 1). Obwohl die nach der zuvor veröffentlichten Methode12 extrahierte RNA 500-1.000 ng Produkt mit geringer Qualität ergab: A260/A280 = 1,7-2,1; A260/A230 = 0,1-0,5 (Tabelle 1), die modifizierten Protokolle unter Verwendung einer Spinsäule verbesserten die Qualität der RNA und erzeugten 900-1.500 ng Produkt mit A260/A280 = 1,9-2,1 und A260/A230 = 1,9-2,3 (Tabelle 1). Darüber hinaus lag das RNA-Konzentrationsverhältnis (UV-basierte/Qbit-fluoreszenzbasierte Werte) für das modifizierte Protokoll unter1,2 und erfüllte damit die Qualitätsanforderungen für die Next-Generation-Sequenzierung 13. Umgekehrt waren die Qualität und Quantität der Nukleinsäuren, die aus einem einzigen Embryo extrahiert wurden, zu gering, um berechnet zu werden. Die Unversehrtheit der RNA, die aus geschlechtsspezifischen Pharatarven unter Verwendung des modifizierten Protokolls extrahiert wurde, wurde ebenfalls mittels Mikrochip-Elektrophorese bestätigt (Abbildung 3B). Es wurde bestätigt, dass die vorbereiteten Bibliotheken hohe Q30-Score-Lesewerte lieferten (Tabelle 2).
Abbildung 1: Übersicht über die Insektensammlung und Massenaufzucht von H. magnanima und A. honmai. (A) Teeblätter und Nester, die durch eine Larve beschädigt wurden. (B) Lichtfalle mit UV-Licht. (C,D) Eine weibliche (C) und einmännliches (D) 6. Stadium Larve von H. magnanima. Das orangefarbene Dreieck zeigt den Hoden an. (E,F) Die gesammelten Larven wurden einzeln in einer 1/2 Unze Tasse mit einem Stück künstlicher Diät aufgezogen. (G,H) Puppen von H. magnanima (G) und A. honmai (H). Das Weibchen ist auf der linken Seite dargestellt, während das Männchen auf der rechten Seite gezeigt wird. (I) Erwachsene von H. magnanima (oben) und A. honmai (unten). Sowohl Männchen als auch Weibchen sind rechts bzw. links dargestellt. (J,K) Eine Plastiktüte (J) oder ein Plastiketui (K) für die Massensammlung von Eiern. (L) A. honmai Eiablageeier auf Paraffinpapier auf dem Deckel und H. magnanima legen Eier auf Paraffinpapier, das auf den Boden des Gehäuses gelegt wird. (M,N) Eiermasse von H. magnanima. Die reifen Embryonen weisen schwarze Kopfkapseln auf, die mit weißen Pfeilen (N) gekennzeichnet sind. (O) In Scheiben geschnittene künstliche Diäten mit einer Reibe für die Massenaufzucht. Die aus Eiern geschlüpften Larven, die auf die geschnittene Diät gelegt wurden, bilden 3-4 Wochen nach dem Schlüpfen bei 25 ° C (unter 16 h hell / 8 h dunkler Zyklus) Puppen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Beobachtungen von Embryonen . (A) Die getrennten, fixierten und permeabilisierten Eier von H. magnanima unter Verwendung von 5 N KOH, 4% PFA / Heptan, Methanol / Heptan und Methanol. Ein getrenntes Ei wird mit unterbrochenen Linien hervorgehoben. (B) Der 3-dpo-Embryo wurde mit Milch-Essigsäure-Orcein gefärbt. Die schwarze Pfeilspitze zeigt den Embryo an. (C) Der 4-dpo-Embryo wurde mit DAPI gefärbt. Die weiße Pfeilspitze zeigt den Embryo an. (D,E) Dissektion von Pharatenlarven (5 dpo) mit Pinzetten. Die Pharatenlarven werden aus Eimasse (D) extrahiert und auf einem Glasobjektträger (E) halbiert. (F,G) Milch-Essigsäure-Orcein-Färbung mit den sezierten Pharatenlarven. Weibchen zeigen Heterochromatin als Punkt (angezeigt mit schwarzer Pfeilspitze, (F), aber Männern fehlt das Heterochromatin (G). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Grafische Zusammenfassung der Nukleinsäureextraktion unter Verwendung geschlechtsspezifischer Pharatenlarven und RNA-Qualitäten von H. magnanima und A. honmai. (A) Gewebe von sezierten Pharatenlarven auf Glasobjektträgern wurden mit Milch-Essigsäure-Orcein gefärbt, um ihr Geschlecht zu bestimmen. Das verbleibende Gewebe wurde in Reagenzien eingeweicht, in einer Röhre gepoolt, die nach dem Geschlecht der Individuen sortiert war, und dann einer DNA/RNA-Extraktion unterzogen. (B) Die Qualität der aus 12 männlichen H. magnanima oder A. honmai extrahierten RNA wurde mit einem Mikrochip-Elektrophoresesystem bewertet. Abkürzungen: [nt], Nukleotidgröße; [FU], Fluoreszenzeinheit; M, molekularer Marker; Hm, H. magnanima; Anzeige, A. honmai. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: Konzentration und Qualität von Nukleinsäuren, die aus geschlechtsbestimmten Pharatarven von H. magnanima extrahiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Qualitäten von RNA-sequenzierenden Rohdaten. 1 Q20 (%) gibt die Wahrscheinlichkeit von Lesevorgängen mit einer Lesegenauigkeit von 99 % an. arabische Ziffer Q30 (%) gibt die Wahrscheinlichkeit von Lesevorgängen mit einer Lesegenauigkeit von 99,9 % an. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Tortricid umfasst mehrere land- und forstwirtschaftliche Schädlinge; Die vorliegende Studie präsentierte Methoden zur Aufzucht von Tortrix über Generationen, zur Beobachtung der Embryogenese und des Geschlechts der Insekten und zur Durchführung molekularer Analysen mit reifen Embryonen.
Eines der Hindernisse für die Schädlingsinsektenforschung ist die Etablierung von Aufzuchtmethoden. Vor allem Inzucht wirkt sich manchmal negativ auf die Fitness der Art aus. Die Fitnessverringerung durch die Inzucht, Inzuchtdepression genannt, wurde bei verschiedenen Pflanzen und Tieren, einschließlich Insekten15,16,17,18, weithin beobachtet. Wie bereits erwähnt, werden sowohl H. magnanima als auch A. honmai seit über 100 Generationen (mehr als 10 Jahre) ohne offensichtliche Fitnesskosten gepflegt. Obwohl es nicht ausreicht zu beurteilen, ob auch andere Tortrizide generell eine hohe Toleranz gegenüber Inzucht aufweisen, könnten die beiden Arten die Eigenschaften durch Anpassung monotoner Umweltbedingungen (z.B. Teeplantagen) und gegen mehrere endosymbiotische Mikroorganismen (z.B. Wolbachia11,12 ). Die Eier der beiden Arten sind leicht zu erhalten, aber ihr Eiablageverhalten wird unterschiedlich ihrer Ökologie zugeschrieben. Tatsächlich scheinen Feuchtigkeit und Faltenrichtung die Anzahl der eiförmigen Eier direkt zu beeinflussen, was die natürliche Geschichte der Insekten auf den Feldern widerspiegeln könnte. Es ist wichtig, die Aufzuchtmethoden an die Arten hinsichtlich ihrer biologischen Eigenschaften in der Natur anzupassen.
Die in dieser Studie erstellten Protokolle ermöglichten die Beobachtung der Embryogenese und molekularer Studien mit geschlechtsspezifischen reifen Embryonen und Larven. Die Insekteneier sind in der Regel mit mehreren Schalenschichtenüberzogen 10,19. Darüber hinaus sind die Eier von H. magnanima und A. honmai mit mütterlichen Sekreten bedeckt. Um die Eier mit einer solchen komplexen Struktur zu färben, scheint eine Trennung, Fixierung und Permeabilisierung notwendig zu sein. In Ostrinia furnacalis (Crambidae), das skalenartige Eimasse wie H. magnanima und A. honmai ovipositiert, wurden PCR-basierte Geschlechtsbestimmungsprotokolle mit einzelnen Embryonen vorgeschlagen, aber die geringe Qualität und Quantität von Nukleinsäuren war ein Problem für die nachfolgende Analyse 6,20. Im Gegensatz dazu schlug die vorliegende Studie vor, Nukleinsäuren aus gepoolten geschlechtsspezifischen Embryonen zu extrahieren, nachdem weiblich-spezifisches Geschlechtschromatin beobachtet wurde. RNAs werden leicht abgebaut, und das hier gezeigte Extraktionsverfahren hat die Qualität der RNA nicht beeinflusst, was auch durch die Transkriptomanalyse (RNA-seq) bestätigt wurde. Die hier gezeigten Techniken sind für Studien der Embryogenese verschiedener Insektenarten anwendbar. Darüber hinaus haben die Protokolle das Potenzial, die Auswirkungen von chemischen Pestiziden oder intrazellulären Mikroben wie Wolbachia zu bewerten, die während der Embryogenesegeschlechtsspezifische Defekte verursachen 6,11,12.
Die vorliegende Studie weist mehrere Einschränkungen auf. Erstens war das Geschlecht unreifer Embryonen (0-3 dpo) mit Milch-Essigsäure-Orcein-Färbung bei H. magnanima und A. honmai schwer zu bestimmen. Dies liegt daran, dass die Anzahl und Größe der Kerne während der frühen Embryogenese im Allgemeinen klein sind, was es schwierig macht, das W-Chromosom zu beobachten. Um das Geschlecht der Tortricide während der frühen Embryogenese zu klären, könnte der Nachweis und die Quantifizierung von Markern auf Geschlechtschromosomen 6,20 ein alternativer Ansatz sein. Zweitens war es schwierig, Nukleinsäuren mit hoher Reinheit von einem einzelnen Individuum nach der Geschlechtsbestimmung zu extrahieren, möglicherweise aufgrund der geringen Anzahl von Zellen. Die aus einem einzelnen Embryo extrahierte RNA oder DNA kann jedoch für nachfolgende Analysen wie PCR-Assays und Einzelzellsequenzierungen gelten.
Zusammenfassend beschreibt das vorliegende Protokoll Massenaufzucht, morphologische Beobachtungen und genetische Analysen der Eier von zwei nicht modellhaften Lepidoptera-Schädlingen, H. magnanima und A. honmai. Es wird erwartet, dass diese einfachen Techniken für die weitere Erforschung von Tortricid, anderen Lepidopterans-Insekten und anderen Taxa anwendbar sind.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken der Unterstützung durch die Forschungsstipendien der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) für junge Wissenschaftler [Fördernummer 19J13123 und 21J00895].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 ounce cup | FP CHUPA | CP070009 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2 ounce cup lid | FP CHUPA | CP070011 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99.7% acetic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| benzalkonium chloride solution | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Cotton | AOUME | 8-1611-02 | insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| DAPI solution | Dojindo, Tokyo, Japan | 340-07971 | stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Disodium Hydrogenphosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS quantification kit | Invitrogen | Q33231 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II column | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Ethanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Glassine paper | HEIKO | 2100010 | insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw |
| heat block WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japan | 4002620 | incubation; https://www.attoeng.site/ |
| heptane | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Lactic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| methanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photometer NP 80 | Implen | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7770S | Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | not shown | Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Potassium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinase K Solution | Merck | 71049-4CN | DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| protein precipitation solution | Qiagen | 158912 | DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| rifampicin | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| RNA HS quantification kit | Invitrogen | Q32855 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase solution | Nippon Gene | 313-01461 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Sodium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Sodium Dodecyl Sulfate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| sodium hypochlorite aqueous solution | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Tetracycline Hydrochloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977023 | RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
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