Summary
Den foreliggende protokol beskriver opdrætsmetoden for tortricid skadedyrsinsekter i laboratorierne. Procedurerne til skelnen mellem insekters køn og ekstraktion af nukleinsyrer til sekventering med høj gennemstrømning etableres ved anvendelse af to tortricid skadedyr.
Abstract
Tortricidae (Lepidoptera), almindeligvis kendt som tortrix eller leafroller moths, omfatter mange landbrugs- og skovbrug skadedyr, som forårsager alvorlige landbrugstab. For at forstå biologien af sådanne skadedyrsmøller har grundlæggende teknikker været i høj efterspørgsel. Her udvikles metoder til masseopdræt, observationer og molekylære undersøgelser ved hjælp af to te tortrix, Homona magnanima og Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Insekter blev masseopdrættet med skiveskåret kunstig kost og opretholdt ved indavl i over 100 generationer ved at overveje deres biologiske egenskaber. Insekter har forskellige kønsdimorfier; derfor er det vanskeligt at skelne kønnet i udviklingsstadierne, som har forhindret efterfølgende assays. Det foreliggende arbejde fremhævede, at tortricidlarvernes køn kunne bestemmes ved at observere testikler eller mælke-eddikesyre orceinfarvning for at visualisere det kvindespecifikke W-kromosom. Desuden muliggjorde den foreliggende undersøgelse ved hjælp af kønsbestemmelsesmetoderne nukleinsyreekstraktioner fra kønsbestemte embryoner og anvendelse mod sekventering med høj gennemstrømning. Disse tips gælder for andre skadedyrsinsekter og vil lette yderligere morfologiske og genetiske undersøgelser.
Introduction
Lepidopteranske insekter udgør mere end 10 % af alle beskrevne levende arter1, og visse taxaarter forårsager alvorlig skade på planter og alvorlige tab i landbruget 2,3. Selvom der er udviklet molekylære og genetiske undersøgelser ved hjælp af modelinsekter som silkeormen Bombyx mori 4,5, forbliver skadedyrsinsekter uundersøgte, dels på grund af vanskelighederne med opdræt og håndtering 6,7. Derfor er grundlæggende undersøgelser og teknikker nødvendige for at forstå biologien hos sådanne ikke-model skadedyrsinsekter.
Tortricidae (Lepidoptera), almindeligvis kendt som tortrix eller bladrullemøller, omfatter mange landbrugs- og skovbrugsskadedyr8. Af insekttaxa er den orientalske te tortrix Homona magnanima Diakonoff og sommerfrugt tortrix Adoxophyes honmai Yasuda alvorlige polyfagiske skadedyr, der vides at skade tetræer i Østasien7. De to arter lå flade og ovale skalalignende ægklynger (eller ægmasser) bestående af tynde, bløde og skrøbelige æg dækket af moderens sekreter. Selvom embryogenesestadier er afgørende for insektudvikling og kønsbestemmelse9, forhindrer æggenes strukturer yderligere analyser i at forstå insekternes biologi. Det er vigtigt at overvinde vanskelighederne for yderligere undersøgelse af skadedyr, der ovipositerer en sådan kompleks ægmasse.
Her, for at forstå tortricidernes biologi, er der udviklet metoder til masseopdræt, observationer og molekylære undersøgelser ved hjælp af A. honmai og H. magnanima. For det første opretholder masseopdrætsmetoder begge tortricider over 100 generationer ved indavl. Adskillelsen af æg fra den sammenkædede skalalignende ægmasse lettede embryogeneseobservationen af tortriciderne ved hjælp af alkaliske og organiske opløsningsmidler, der tidligere var udviklet fra teknikker, der blev anvendt i fluer10. Derudover fastslog den foreliggende undersøgelse kønsdiskrimination af små embryoner ved at udvikle farvningsmetoder til kønskromatin hos lepidopteranske hunner ved hjælp af mælkesyre-eddikesyre orcein11. Ved at kombinere disse metoder blev nukleinsyrer af høj kvalitet og mængde ekstraheret fra kønsbestemte embryoner, som ellers var vanskelige at fastslå6. Det ekstraherede RNA blev anvendt til næste generations sekventering. Samlet set gælder de metoder, der præsenteres her, for andre lepidopteranske insekter og andre insekttaxa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Insektopsamling og masseopdræt
- Saml tortricidinsekter fra marker efter tidligere offentliggjorte referencer 8,12.
BEMÆRK: H. magnanima og A. honmai larver opsamles fra beskadigede teblade (figur 1A); voksne tiltrækkes ved hjælp af 4 W bærbart UV-lys (365 nm bølgelængde, se tabel over materialer, figur 1B). - Bag de indsamlede larver (figur 1C,D) individuelt på et stykke kunstig kost i en 1/2 oz kop i 2-3 uger indtil vokseneklosion (figur 1E,F). Bekræft køn af pupper og voksne ved morfologiske træk (figur 1G,I).
- Par hannerne og hunnerne i en plastikkasse (30 cm x 20 cm x 5 cm) til oviposit ægmasser på et paraffinpapir (figur 1J-L). Læg en hun og to hanner i en 120 ml plastikkop med et stykke paraffinpapir for at etablere en matrilin.
BEMÆRK: Det er vigtigt at lave folder på paraffinpapiret. For H. magnanima skal paraffinpapir være på bunden af sagen. I mellemtiden skal du for A. honmai lægge et papir på kasseloftet for at samle æg (figur 1L), da H. magnanima oviposit ægmasse på oversiden af teblade, men A. honmai lægger æg på undersiden af bladene8. Procedurerne blev også verificeret i andre tortricidarter, og det er bedre at placere papirer på begge sider, hvis målarternes økologi og adfærd er uafklaret. - Skær ægmasserne (ca. 100-200 æg pr. ægmasse12, figur 1M) ud på paraffinpapiret med en saks. Læg æggene i en 1/2 oz kop med dumpet papir i 5-7 dage.
BEMÆRK: Det modne embryo udviser en hudormekapsel (figur 1N). Perioderne med embryogenese tilskrives forskelligt tortricidarter, men generelt 5 dage efter oviposition (dpo) for H. magnanima og 4 dpo for A. honmai ved 25 °C med 60 % relativ luftfugtighed, 16 timer lys/8 timer mørke cyklusser7. - Opbevar ægmasserne, der viser kapsler med sort hoved ved 4-8 °C, i 7 dage.
- Skær ~ 60 g kunstige kostvaner ved hjælp af et rivejern til masseopdræt. Placer ægmassen fyldt med modne embryoner på den skivede kunstige diæt i en plastikbeholder (23 cm x 16 cm x 8 cm). Læg paraffinpapir på ægmassen med de skivede kostvaner (figur 10).
BEMÆRK: Under 30% relativ luftfugtighed betragtes som over tør, mens over 70% er for fugtig. Oprettelse af huller på plastbeholderens låg er bedre for at muliggøre bedre ventilation. Fyld hullerne med bomuld for at forhindre flugt fra små larver. - For at fjerne overfladeforurenende stoffer fra æggene suges ægmassen i 3% formalin og 0,2% Benzalkoniumchloridopløsning i henholdsvis 5 minutter12. For at udrydde tarm eller intracellulære bakterier skal du bruge en kunstig kost suppleret med 0,05% (w/w) tetracyclinhydrochlorid eller 0,06% (w/w) rifampicin i stedet for en normal kunstig kost (se tabel over materialer).
BEMÆRK: Dette trin er valgfrit. Det er vigtigt at ælte Silk Mate 2S og 0,05% (w/w) tetracyclinhydrochlorid eller 0,06% (w/w) rifampicin ligeligt for konsistens. - Saml pupperne fra plastbeholderen og skelne kønnet baseret på morfologiske12 egenskaber (figur 1G-I).
BEMÆRK: Generelt præsenterer tortricider 5-6 instars indtil hvalp12. H. magnanima og A. honmai larverne tager henholdsvis 3 uger og 2 uger efter udklækning indtil hvalp. - Placer 15 hanner og 10 hunner i en plastikkasse (30 cm x 20 cm x 5 cm, figur 1K) til parring med 25 °C, 16 L/8 D. Saml æg pr. 5-7 dage og gentag trin 1,4-1,9. for hver generation.
BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt at indsamle ny ovipositerede ægmasser til efterfølgende analyse, skal du indstille den mørke periodes start og slutning, f.eks. fra kl. 9 til 17. I denne tilstand oviposit æg H. magnanima og A. honami normalt efter 5 timer (14:00).
2. Adskillelse af æg og pharate larver fra ægmasser til fiksering, permeabilisering og farvning
- Æggemassen lægges i blød i 1.000 μL 1,2% natriumhypochlorit vandig opløsning i 10 minutter eller i 1.000 μL 5 M vandig kaliumhydroxidvandig opløsning i 30 minutter for at adskille æggene.
- De adskilte æg vaskes i 1.000 μL PBSt (137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 0,05 % polyoxyethylen (20) sorbitanmonolaurat [Tween-20] pH 7,4, se materialetabel) efter den tidligere offentliggjorte rapport7.
- Æggene lægges i blød i en blanding af 500 μL 100 % heptan og 500 μL 4 % paraformaldehyd-PBSt-opløsning (w/v). Bland i 10 minutter ved 1.500 o / min ved hjælp af en hvirvelblander.
- Sug æggene i blød i en blanding af 500 μL 100% heptan og 500 μL 100% methanol. Bland i 10 minutter ved 1.500 omdr./min.
- Æggene vaskes to gange med 1.000 μL 100 % methanol og opbevares ved 4 °C i 100 % methanol indtil yderligere forsøg (figur 2A).
BEMÆRK: Æggene kan opbevares i mindst 1 år ved 4 °C. - Sug æggene sekventielt i 99%, 70%, 50% ethanol og PBSt i 5 minutter hver til hydrofilisering efter den tidligere offentliggjorte rapport7.
- Vask æggene med PBSt, nedsænk æggene i 1 μg/ml DAPI-opløsning i 5 min,og vask derefter æggene med 1x PBS to gange. Blødgør æggene i 20 μL af 1,25% (w/w) mælke-eddikesyre orceinopløsning (se tabel over materialer)11 for at visualisere heterochromatin, indtil kernerne udviser en strålende rød farve (dette varierer fra 5-60 min) (figur 2B,C).
BEMÆRK: De mælke-eddikesyre orcein farvningsperioder afhænger af temperatur og fugtighed. Det er bedre at kontrollere for korrekt farvning ved hjælp af et mikroskop med 4x-10x forstørrelse. - Overfør de farvede æg ved hjælp af en pipette til et glasglas. Vedlæg de farvede æg med antifadereagens (se Materialetabel) og et dækglas7.
- Uddrag pharate H. magnanima og A. honmai larver (4-5 dage efter oviposition (dpo)) fra ægmasserne ved hjælp af tang (figur 2D). Bisect larver på et glas dias (figur 2E).
- Fastgør væv (f.eks. Suboesophageal ganglion, thoraxganglier, malpighisk tubuli osv.) med en blanding af 1: 3 (v / v) 99,7% eddikesyre / 100% methanol i 5 minutter. Plet dem med 1,25% (w/w) mælke-eddikesyre orceinopløsning11 , indtil kernerne er farvede (dette kan tage 5-60 minutter, afhængigt af temperatur og fugtighed).
- Bestem kønnet af hver prøve ved at observere tilstedeværelsen (kvindelig) eller fraværet (mandlig) af heterochromatin (W-kromosomet, figur 2F,G) under et mikroskop.
BEMÆRK: Kønnet bestemmes ved at visualisere kønskromatnet. Hver celle repræsenterer kønskromatinen som en prik hos kvinder11,12, mens den resterende del af pharate larvevæv (ikke fast) straks skal nedsænkes i cellelysebuffer12 (10 mM Tris-HCI, 100 mM EDTA og 1% SDS, pH 8,0) eller phenolholdige RNA-ekstraktionsreagenser til enten DNA- eller RNA-ekstraktion. Før dissektionerne udleveres 20 μL af reagenserne i 0,2 ml PCR-rør på forhånd (figur 3A). Prøverne nedsænkes og opbevares ved -80 °C, indtil yderligere ekstraktion. Prøverne kan opbevares i mindst 3 måneder, men det er bedre at fortsætte med nedstrømsforsøgene for at forhindre nedbrydning af nukleinsyrer.
3. DNA- og RNA-ekstraktioner fra kønsbestemte pharatlarver
- Pool 12 kønsbestemte mandlige eller kvindelige pharat larver (5 dpo embryo) og tilsæt enten cellelysebuffer eller RNA-ekstraktionsreagenser (se trin 2.11 og Table of Materials) i et 1,5 ml rør.
BEMÆRK: Følg trin 3.2-3.7 for DNA-ekstraktion og trin 3.8-3.11 for RNA-ekstraktion. - Homogeniser væv i 600 μL af cellelysebufferen (10 mM Tris-HCI, 100 mM EDTA og 1% SDS, pH 8,0), og centrifuger prøverne ved 10.000 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten opsamles (500 μL) ved hjælp af en pipette og inkuberes ved 50 °C med 1,5 μL proteinase K (20 mg/ml, se materialetabellen) i 5 timer på en varmeblok.
- Prøverne behandles med 1,0 μL 10 mg/ml RNase-opløsning (se materialetabellen) ved 37 °C i 30 minutter.
- Der tilsættes 200 μL proteinudfældningsopløsning (se materialetabellen) til rørene7 efterfulgt af en centrifuge ved 17 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten (500 μL) blandes med 500 μL 100 % isopropanol og centrifugeres derefter ved 20.400 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Vask det pelleterede DNA to gange med 1.000 μL 70% ethanol. Derefter lufttørres (5-10 minutter ved stuetemperatur) DNA'et opløses i 30 μL 10 mM Tris-Cl-buffer (pH 8,5).
- Homogeniser vævene i 600 μL RNA-ekstraktionsreagenser og tilsæt 240 μL ultrarent destilleret vand til røret. Centrifugering af rørene ved 12.000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten (600 μL) blandes med 600 μL 100 % isopropanol, og blandingen overføres til en silicaspinsøjle (se materialetabellen). Centrifugering af rørene ved 17.900 x g i 1 min ved 4 °C.
- Kolonnen vaskes med 750 μL 70 % ethanol, og kolonnen centrifugeres to gange ved 17 900 x g i 1 min. hver ved 4 °C.
- Læg 15 μL ultrarent destilleret vand i kolonnen. Centrifuger rørene ved 17.900 x g i 1 min ved 4 °C for at eluere RNA'et.
- Beregn og verificer kvaliteten og mængden af DNA og RNA ved hjælp af et UV-baseret spektrofotometer. Renheden af nukleinsyrer vurderes ved hjælp af forholdet A260/A280 (nukleinsyrer/protein) og A260/A230 (nukleinsyrer/salte og andre forurenende stoffer)13.
BEMÆRK: Til RNA-ekstraktion blev den tidligere offentliggjorte procedure12 fulgt, hvilket resulterede i phenolkontaminering (tabel 1). Det ekstraherede DNA og RNA fra et enkelt embryo eller pharate larver giver lav mængde og lav kvalitet prøver. Typisk giver DNA-ekstraktion fra 12 pharat larver 100-600 ng, mens RNA-ekstraktion ved hjælp af den nuværende metode genererer 900-1.500 ng, som vist tabel 1.
BEMÆRK: Trin 3.13-3.15 er valgfri til yderligere analyser af sekventeringer med høj kapacitet. - Beregn mængderne af DNA og RNA ved hjælp af et fluorescensbaseret spektrofotometer.
BEMÆRK: Forholdet mellem RNA-mængder (UV-baseret koncentration (ng/μL)/fluorescensbaseret koncentration (ng/μL)) blev beregnet for at vurdere kvaliteten til yderligere eksperimentel anvendelse. For eksempel, når UV- og fluorescensbaserede koncentrationer er henholdsvis 80 ng / uL og 60 ng / uL, vil forholdet være 1,5 (80/60). Normalt indikerer forhold under 1,5 tilstrækkelig renhed til downstream-applikationer ved hjælp af høj gennemstrømningssekventering13. - Analyser kvaliteten af RNA ved hjælp af mikrochipelektroforese14.
- Brug de kvalificerede RNA'er til at forberede RNA-biblioteket ved hjælp af et RNA-biblioteksforberedelsessæt (se Tabel over materialer). Sekvenser bibliotekerne ved hjælp af en platform, der passer til de forberedte biblioteker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etablering af værtslinjer og vedligeholdelse heraf
Levedygtigheden af feltopsamlede larver tilskrives forskelligt markplacering, årstider og opdrætsforhold (f.eks. 90% af levedygtigheden i Taiwan, Taoyuan, som vist i Arai et al.12). Cirka 30% -50% af parrene vil generere den næste generation som normalt. For H. magnanima og A. honmai er matriliner blevet opretholdt ved indavl i over 100 generationer.
Morfologiske observationer og kønsbestemmelse
Behandlingen med enten kaliumhydroxid (3 eller 5 M KOH) eller natriumhypochlorit (1,2%Cl2 eller NaClO) adskiller æg fra deres sammenkædede ægmasser (figur 2A). Den lavere koncentration af reagenserne kunne ikke opnå adskillelse. Alle fikserings-, permeabiliserings- og farvningstrin muliggjorde visualisering af kerner med DAPI-opløsning. Æggene, der kun blev behandlet med KOH eller NaClO (adskilt) uden fikserings- og permeabiliseringstrinnene, blev ikke farvet med disse farvestoffer7. Ikke-behandlede H. magnanima ægmasser blev ikke farvet. Den mælke-eddikesyre orcein pletter heterochromatin (W-kromosom) med en mørk rød farve og kerner med en lys rød farve som sædvanlig (figur 3A). Denne farvning muliggør nem og hurtig kønsbestemmelse fra 4 dpo embryo til sjette instar larver. Selvom kerner blev visualiseret i 0-3 dpo embryoner, var det svært at observere W-kromosomet med 400x forstørrelse.
DNA og RNA af høj kvalitet blev opnået fra kønsbestemte og poolede embryoner
Fra 12 pharate larver, høj kvalitet DNA (A260 / A280 = 1,7-2,0; A260/A230 = 1,7-2,4) blev ekstraheret med 100-600 ng i samlet mængde (tabel 1). Selvom RNA'et ekstraheret efter den tidligere offentliggjorte metode12 gav 500-1.000 ng produkt med lav kvalitet: A260 / A280 = 1,7-2,1; A260/A230 = 0,1-0,5 (tabel 1), de modificerede protokoller ved hjælp af en spinkolonne forbedrede kvaliteten af RNA'et og producerede 900-1.500 ng produkt med A260/A280 = 1,9-2,1 og A260/A230 = 1,9-2,3 (tabel 1). Desuden var RNA-koncentrationsforholdet (UV-baserede/Qbit-fluorescensbaserede værdier) for den modificerede protokol under 1,2, hvilket opfyldte kvalitetskravene til næste generations sekventering13. Omvendt var kvaliteten og mængden af nukleinsyrer ekstraheret fra et enkelt embryo for lav til at blive beregnet. Intaktheden af RNA'et ekstraheret fra kønsbestemte pharatlarver ved anvendelse af den modificerede protokol blev også bekræftet ved anvendelse af mikrochipelektroforese (figur 3B). De forberedte biblioteker blev bekræftet at give høje Q30-scorelæsninger (tabel 2).
Figur 1: Oversigt over insektopsamling og masseopdræt af H. magnanima og A. honmai. (A) Teblade og reder beskadiget af en larve. (B) Lysfælde med UV-lys. (C,D) En hun (C) og en han (D) 6. instar larve af H. magnanima. Den orange trekant angiver testiklerne. (E,F) Indsamlede larver blev opdrættet individuelt i en 1/2 oz kop med et stykke kunstig kost. (G,H) Pupper af H. magnanima (G) og A. honmai (H). Hunnen er vist til venstre, mens hanen er vist til højre. (I) Voksne af H. magnanima (ovenfor) og A. honmai (nedenfor). Både mænd og kvinder vises henholdsvis til højre og venstre. (Jørgensen,K) En plastikpose (J) eller plastikkasse (K) til opsamling af ægmasse. (L) A. honmai oviposit æg på paraffinpapir anbragt på låget, og H. magnanima lægger æg på paraffinpapir anbragt på bunden af sagen. (M,N) Æggemasse af H. magnanima. De modne embryoner udviser sorte hovedkapsler angivet med hvide pile (N). (O) Skiveskåret kunstig kost med rivejern til masseopdræt. Larverne, der klækkes fra æg, placeret på skiveskåret kost, vil danne pupper 3-4 uger efter udklækning ved 25 ° C (under 16 timer lys / 8 timers mørk cyklus). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Observationer af embryoner. (A) De adskilte, faste og permeabiliserede æg af H. magnanima ved anvendelse af 5 N KOH, 4% PFA / heptan, methanol / heptan og methanol. Et adskilt æg fremhæves med brudte linjer. (B) Embryoet på 3 dpo blev farvet med mælkesyre-eddikesyre ellercein. Den sorte pilespids angiver embryoet. (C) Embryoet på 4 dpo blev farvet med DAPI. Den hvide pilespids angiver embryoet. (D,E) Dissektion af pharate larver (5 dpo) ved hjælp af tang. Pharate larverne ekstraheres fra ægmasse (D), gennemskåret på et glasglas (E). (F,G) Laktisk-eddikesyre orceinfarvning ved hjælp af de dissekerede pharate larver. Kvinder udviser heterochromatin som en pric (angivet med sort pilespids, (F), men mænd mangler heterochromatin (G). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Grafisk resumé af nukleinsyreekstraktion ved anvendelse af kønsbestemte pharatlarver og RNA-kvaliteter af H. magnanima og A. honmai. (A) Væv af dissekerede pharate larver på glas dias blev farvet med mælkesyre-eddikesyre orcein for at bestemme deres køn. De resterende væv blev gennemblødt i reagenser, samlet i et rør sorteret efter individernes køn og derefter udsat for DNA / RNA-ekstraktion. (B) Kvaliteten af RNA ekstraheret fra 12 mandlige H. magnanima eller A. honmai blev vurderet ved hjælp af et mikrochipelektroforesesystem. Forkortelser: [nt], nukleotidstørrelse; [FU], fluorescensenhed; M, molekylær markør; Hm, H. magnanima; Annonce, A. honmai. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Koncentration og kvalitet af nukleinsyrer ekstraheret fra kønsbestemte pharatlarver af H. magnanima. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Kvaliteter af RNA-sekventering af rådata. 1 Q20 (%) angiver sandsynligheden for læsninger med 99% læsenøjagtighed. 2 Q30 (%) angiver sandsynligheden for læsninger med 99,9% læsenøjagtighed. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tortricid omfatter flere landbrugs- og skovbrugsskadegørere; den foreliggende undersøgelse præsenterede metoder til at bage tortrix gennem generationer, observere embryogenese og køn af insekterne og udføre molekylær analyse ved hjælp af modne embryoner.
En af hindringerne for skadedyrsinsektundersøgelse er at etablere opdrætsmetoder. Især indavl påvirker undertiden artens egnethed negativt. Konditionsreduktionen af den indavlede, kaldet indavlsdepression, er i vid udstrækning blevet observeret i forskellige planter og dyr, herunder insekter 15,16,17,18. Som nævnt er både H. magnanima og A. honmai blevet opretholdt i over 100 generationer (mere end 10 år) uden tilsyneladende fitnessomkostninger. Selv om det ikke er nok at vurdere, om andre tortricider også har en høj tolerance over for indavl generelt, kan de to arter have udviklet egenskaberne ved at tilpasse monotone miljøforhold (dvs. teplantager) og mod flere endosymbiotiske mikroorganismer (f.eks. Wolbachia 11,12 ). Æggene fra de to arter opnås let, men deres ovipositionsadfærd tilskrives forskelligt deres økologi. Faktisk synes fugtighed og krølleretning direkte at påvirke antallet af ovipositerede æg, hvilket kan afspejle insekternes naturlige historie på marker. Det er vigtigt at tilpasse opdrætsmetoderne til arterne med hensyn til deres biologiske egenskaber i naturen.
De protokoller, der blev etableret i denne undersøgelse, muliggjorde observation af embryogenese og molekylære undersøgelser ved hjælp af kønsbestemte modne embryoner og larver. Insektæggene er generelt belagt med flere skallag10,19. Desuden er æggene af H. magnanima og A. honmai dækket af moderens sekretioner. For at plette æggene med en sådan kompleks struktur synes adskillelse, fiksering og permeabilisering at være alt nødvendigt. I Ostrinia furnacalis (Crambidae), som oviposits skalalignende ægmasse som H. magnanima og A. honmai, er PCR-baserede kønsbestemmelsesprotokoller ved hjælp af enkelte embryoner blevet foreslået, men den lave kvalitet og mængde nukleinsyrer har været et problem for efterfølgende analyse 6,20. I modsætning hertil foreslog den foreliggende undersøgelse at ekstrahere nukleinsyrer fra poolede kønsbestemte embryoner efter at have observeret kvindespecifikt kønskromatin. RNA'er nedbrydes let, og ekstraktionsproceduren vist her påvirkede ikke kvaliteten af RNA, hvilket også er blevet bekræftet af transkriptomanalysen (RNA-seq). De teknikker, der er vist her, kan anvendes til undersøgelser af embryogenese af forskellige insektarter. Derudover har protokollerne potentiale til at blive brugt til at vurdere virkningerne af kemiske pesticider eller intracellulære mikrober som Wolbachia, som forårsager kønsspecifikke defekter under embryogenese 6,11,12.
Den foreliggende undersøgelse har flere begrænsninger. For det første var køn af umodne embryoner (0-3 dpo) vanskeligt at bestemme ved hjælp af mælke-eddikesyre orceinfarvning i H. magnanima og A. honmai. Dette skyldes, at antallet og størrelsen af kernerne generelt er lille under tidlig embryogenese, hvilket gør det vanskeligt at observere W-kromosomet. For at klarlægge tortricidernes køn under tidlig embryogenese kan påvisning og kvantificering af markører på kønskromosomer 6,20 være en alternativ tilgang. For det andet var det vanskeligt at udtrække nukleinsyrer med høj renhed fra et enkelt individ efter kønsbestemmelse, muligvis på grund af det lille antal celler. RNA'et eller DNA'et, der ekstraheres fra et enkelt embryo, kan dog finde anvendelse på efterfølgende analyser såsom PCR-assays og enkeltcellesekventeringer.
Sammenfattende beskriver denne protokol masseopdræt, morfologiske observationer og genetiske analyser af æg fra to ikke-model lepidopteranske skadedyrsinsekter, H. magnanima og A. honmai. Disse enkle teknikker forventes at være anvendelige til yderligere forskning i tortricid, andre lepidopteraner insekter og andre taxa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at anerkende støtte fra Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Research Fellowships for Young Scientists [Grant Number 19J13123 and 21J00895].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 ounce cup | FP CHUPA | CP070009 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2 ounce cup lid | FP CHUPA | CP070011 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99.7% acetic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| benzalkonium chloride solution | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Cotton | AOUME | 8-1611-02 | insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| DAPI solution | Dojindo, Tokyo, Japan | 340-07971 | stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Disodium Hydrogenphosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS quantification kit | Invitrogen | Q33231 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II column | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Ethanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Glassine paper | HEIKO | 2100010 | insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw |
| heat block WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japan | 4002620 | incubation; https://www.attoeng.site/ |
| heptane | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Lactic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| methanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photometer NP 80 | Implen | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7770S | Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | not shown | Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Potassium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinase K Solution | Merck | 71049-4CN | DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| protein precipitation solution | Qiagen | 158912 | DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| rifampicin | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| RNA HS quantification kit | Invitrogen | Q32855 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase solution | Nippon Gene | 313-01461 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Sodium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Sodium Dodecyl Sulfate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| sodium hypochlorite aqueous solution | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Tetracycline Hydrochloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977023 | RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
References
- Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
- Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1 (2002).
- Matsuura, H., Naito, A. Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan. Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).
- Mita, K., et al. The construction of an EST database for Bombyx mori and its application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).
- Kawamoto, M., et al. High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).
- Fukui, T., et al. In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).
- Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis. Entomological Science. 25 (1), 12497 (2022).
- vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. Tortricid pests: their biology, natural enemies and control. , Elsevier Science Publishers. Amsterdam. (1991).
- Kiuchi, T., et al. A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm. Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).
- Kageyama, D., Traut, W. Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis. Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).
- Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima. Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).
- Schalamun, M., et al. Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora. Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).
- Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10 (1), 159 (2010).
- Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments. Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).
- Saccheri, I., et al. Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation. Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).
- Crnokrak, P., Roff, D. A.
- Keller, L. F., Waller, D. M.
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).
- Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host. Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).
