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Chemistry

मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके एकल न्यूरॉन्स में आरएनए संशोधनों की विशेषता

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63940
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Chemistry, University of Illinois Urbana-Champaign

Summary

आरएनए के पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल संशोधन अनुवाद विनियमन की एक समझदार परत का प्रतिनिधित्व करते हैं जिसे हाल ही में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र प्लास्टिसिटी से जोड़ा गया है। यहां, नमूना तैयारी और तरल क्रोमैटोग्राफी-अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री दृष्टिकोण को एकल न्यूरॉन्स में कई आरएनए संशोधनों के एक साथ लक्षण वर्णन के लिए वर्णित किया गया है।

Abstract

आरएनए के पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल संशोधन (पीटीएम) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में अनुवाद के विनियमन में शामिल एक समझदार तंत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं। हाल के साक्ष्य ने विशिष्ट न्यूरोनल आरएनए संशोधनों को सीखने और स्मृति प्रतिमानों से जोड़ा है। दुर्भाग्य से, इन एपिट्रांसक्रिप्टोमिक विशेषताओं का पता लगाने के लिए पारंपरिक तरीके केवल थोक ऊतकों में अत्यधिक प्रचुर मात्रा में आरएनए संशोधनों की विशेषता में सक्षम हैं, जो अद्वितीय पीटीएम प्रोफाइल के मूल्यांकन को रोकते हैं जो सक्रिय व्यवहार सर्किट के भीतर व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के लिए मौजूद हो सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में, मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एसएनआरएमए-एमएस) द्वारा एकल-न्यूरॉन आरएनए संशोधन विश्लेषण का वर्णन किया गया है- एक साथ एकल न्यूरॉन्स में कई संशोधित राइबोन्यूक्लियोसाइड्स का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए। समुद्री मोलस्क, एप्लिसिया कैलिफोर्निका के व्यक्तिगत न्यूरॉन्स का उपयोग करके दृष्टिकोण को मान्य किया जाता है, जो न्यूरॉन सेल निकायों को उजागर करने के लिए प्रमुख सीएनएस गैन्ग्लिया के सर्जिकल अलगाव और एंजाइमेटिक उपचार से शुरू होता है, इसके बाद तेज सुइयों और माइक्रोपिपेट का उपयोग करके मैनुअल सिंगल-न्यूरॉन अलगाव होता है। अगला, बफर की एक छोटी मात्रा में नमूने का यांत्रिक और थर्मल उपचार बाद के आरएनए पाचन के लिए एक व्यक्तिगत सेल से आरएनए को मुक्त करने के लिए किया जाता है। संशोधित न्यूक्लियोसाइड को तब एक अनुकूलित तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधि का उपयोग करके पहचाना और मात्रा निर्धारित की जाती है। एसएनआरएमए-एमएस को एकल, पहचाने गए न्यूरॉन्स के लिए आरएनए संशोधन पैटर्न स्थापित करने के लिए नियोजित किया जाता है ए कैलिफोर्निका जो रूपात्मकता और कार्यों को जानते हैं। गुणात्मक और मात्रात्मक एसएनआरएमए-एमएस के उदाहरण प्रस्तुत किए जाते हैं जो न्यूरोनल नेटवर्क में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में आरएनए संशोधनों के विषम वितरण को उजागर करते हैं।

Introduction

आरएनए के विहित न्यूक्लियोसाइड में संशोधन प्रोटीन अनुवाद के नियमन में उनकी असंख्य भूमिकाओं के लिए तेजी से मान्यता प्राप्त है। आज तक 150 से अधिक अद्वितीय आरएनए संशोधनों की सूचना दी गई है कि मिथाइलेशन, हेटेरोएटम जोड़, सेलुलर मेटाबोलाइट्स 1,2 के साथ संयुग्मन तक जटिलता में सीमा है। यह विस्तारित आरएनए वर्णमाला, जिसे एपिट्रांसक्रिप्टोम के रूप में भी जाना जाता है, एंजाइमी लेखकों द्वारा उत्पन्न होता है और सेलुलर आरएनए की स्थिरता3, तह4 और अनुवाद दक्षता 5,6 को बदलने के लिए जिम्मेदार है। चुनिंदा आरएनए संशोधनों को एंजाइमेटिक इरेज़र 7,8 के माध्यम से भी उलट दिया जा सकता है, जबकि अन्य को आरएनए सबस्टोइकोमेट्रिक रूप से 9,10 में जोड़ा जाता है, जो जैविक प्रणालियों में संशोधित और असंशोधित आरएनए अनुक्रमों का एक जटिल परिदृश्य प्रदान करता है।

जैविक कार्य में आरएनए संशोधनों के महत्व को केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) 11 के उपक्षेत्रों सहित विभिन्न अंगों और ऊतकों में संशोधनों के असमान वितरण द्वारा इंगित किया जाता है। इस रासायनिक विषमता को सीएनएस विकास12, तनाव प्रतिक्रिया13 और गतिविधि-निर्भर प्लास्टिसिटी14 से जोड़ा गया है। सीएनएस उपक्षेत्रों में कोशिकाओं की विषम आबादी शामिल है जिसमें व्यक्तिगत कोशिकाएं अलग-अलग रासायनिक प्रोफाइल 15,16,17,18 प्रदर्शित करती हैं। यहां तक कि एक ही प्रकार की एकल कोशिकाएं ऊतक माइक्रोएनवायरनमेंट19 और स्टोकेस्टिक जीन अभिव्यक्ति20 के कारण भाग में अद्वितीय ट्रांसक्रिप्टोम प्रदर्शित कर सकती हैं। हालांकि, जबकि एकल-सेल ट्रांसक्रिप्टोम का लक्षण वर्णन कुछ हद तक नियमित है, कई आरएनए संशोधनों के लिए एकल-सेल एपिट्रांसक्रिप्टोम स्थापित करने के लिए कोई अनुरूप तरीके नहीं हैं। सीएनएस और अन्य जैविक प्रणालियों में पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल संशोधनों (पीटीएम) के सेलुलर विषमता और नियामक प्रभाव के व्यापक विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं में आरएनए संशोधनों के वितरण की रूपरेखा तैयार करने में सक्षम नए दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है।

ऊतकों में कई आरएनए संशोधनों का एक साथ माप तरल क्रोमैटोग्राफी-अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) तकनीकों का उपयोग करके आसानी से पूरा किया जाता है। संशोधित राइबोन्यूक्लियोसाइड्स के एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण के लिए, आरएनए कोशिकाओं (आमतौर पर 103-10 6 कोशिकाओं) से निकाला जाता है, वर्षा और पुन: निलंबन द्वारा शुद्ध किया जाता है, और बाद में न्यूक्लियोसाइड में पच जाता है। विहित और संशोधित न्यूक्लियोसाइड से युक्त नमूना मिश्रण को विश्लेषण पृथक्करण और पता लगाने के लिए एलसी-एमएस प्रणाली में इंजेक्ट किया जाता है, जिससे एक जीव 21,22,23 में आरएनए संशोधनों के पूर्ण पूरक का निर्धारण होता है। एमएस का उपयोग हाल ही में न्यूरोबायोलॉजिकल मॉडल, एप्लिसिया कैलिफोर्निका (ए कैलिफोर्निका) के सीएनएस में 26 आरएनए संशोधनों को निर्धारित करने के लिए किया गया था। इनमें से कुछ एपिट्रांसक्रिप्टोमिक चिह्नों की बहुतायत ने समय- और क्षेत्र-निर्भर गतिशीलता का प्रदर्शन किया जो जानवर24 में व्यवहार परिवर्तन के साथ सहसंबद्ध था। हालांकि, विधि की सीमित संवेदनशीलता के कारण >103 कोशिकाओं वाले थोक नमूनों में आरएनए संशोधनों का पता लगाना केवल संभव था। इन बड़े नमूनों ने जनसंख्या औसत के साथ व्यक्तिगत कोशिकाओं के अद्वितीय और कार्यात्मक रूप से महत्वपूर्ण आरएनए संशोधन प्रोफाइल को छिपाया। यद्यपि नमूना तैयारी की स्थिति के सावधानीपूर्वक नियंत्रण ने छोटी मात्रा के नमूनों 25,26,27,28 में आरएनए संशोधनों के लिए पता लगाने की सीमा में सुधार किया है, विश्लेषणात्मक तरीकों की आवश्यकता बनी हुई है जो एकल कोशिकाओं में कई संशोधित राइबोन्यूक्लियोसाइड्स का पता लगा सकते हैं और मात्रा निर्धारित कर सकते हैं।

यह प्रोटोकॉल मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एसएनआरएमए-एमएस) द्वारा एकल-न्यूरॉन आरएनए संशोधन विश्लेषण का परिचय देता है, जो ए कैलिफोर्निका29 के सीएनएस से एकल न्यूरॉन्स में एक दर्जन से अधिक आरएनए संशोधनों का पता लगाने की अनुमति देता है। दृष्टिकोण में प्रमुख सीएनएस गैन्ग्लिया से एकल, पहचानी गई कोशिकाओं के सर्जिकल अलगाव के बाद एक अनुकूलित नमूना तैयारी वर्कफ़्लो होता है जिसमें एमएस-संगत बफर में यांत्रिक सेल लाइसिस, आरएनए विकृतीकरण और एंजाइमी हाइड्रोलिसिस शामिल होता है। एमएस का उपयोग करके पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल रूप से संशोधित न्यूक्लियोसाइड्स की पहचान और मात्रा का ठहराव तब पूरा किया जाता है एसएनआरएमए-एमएस एकल न्यूरॉन्स के लिए पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल आरएनए संशोधन प्रोफाइल के अधिग्रहण की सुविधा प्रदान करके आरएनए संशोधन विश्लेषण के क्षेत्र में एक अपूर्ण आवश्यकता को पूरा करता है और अन्य सेल प्रकारों के लिए भविष्य के आवेदन की क्षमता रखता है।

Protocol

1. सामग्री और समाधान की तैयारी

  1. एक कड़े शुद्धिकरण प्रणाली से प्राप्त पानी में 460 एमएम एनएसीएल, 10 एमएम केसीएल, 10 एमएम सीएसीएल2, 22 एमएम एमजीसीएल 2,26 एमएम एमजीएसओ4, और 10 एमएम एचईपीईएस के साथ कृत्रिम समुद्री जल (एएसडब्ल्यू) तैयार करें। 1 एम एनएओएच या एचसीएल का उपयोग करके पीएच को 7.8 में समायोजित करें आमतौर पर, एएसडब्ल्यू के 1 एल तैयार करें और उपयोग होने तक 14 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. पेनिसिलिन जी के 10,000 यू / एमएल, स्ट्रेप्टोमाइसिन के 10 μg / μL, और जेंटामाइसिन के 10 μg / μL के साथ एक एएसडब्ल्यू-एंटीबायोटिक्स समाधान तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्रयोग से ठीक पहले, एएसडब्ल्यू के 20-40 एमएल में जमे हुए एंटीबायोटिक्स स्टॉक समाधान 1: 100 को पिघलाएं और पतला करें। काम कर रहे एएसडब्ल्यू समाधान में एंटीबायोटिक दवाओं की अंतिम एकाग्रता पेनिसिलिन जी के 100 यू / एमएल, स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 μg / एमएल, और जेंटामाइसिन के 100 μg / एमएल है।
  3. μL गोजातीय सीरम एल्बुमिन के 1 μL, 0.5 μg/μL पेंटोस्टैटिन के 0.5 μL, 2 U/μL क्षारीय फॉस्फेट के 0.495 μL, 0.1 U फॉस्फोडिएस्टरेज़ I (10 एमएम एमजीसीएल2 में), और 0.38 μL के संयोजन से एक आरएनए पाचन बफर तैयार करें यदि कई नमूनों का विश्लेषण करते हैं, तो विश्लेषण किए जाने वाले नमूनों की संख्या से गुणा किए गए प्रत्येक अभिकर्मक की मात्रा वाले एक अलग ट्यूब में एक मास्टर मिश्रण तैयार करें, साथ ही पिपेट ट्रांसफर चरणों से आकस्मिक अभिकर्मक हानि के लिए एक और।
  4. न्यूरॉन्स के मैनुअल अलगाव के लिए कई तेज सुइयों (या तो कांच या धातु) तैयार करें। टंगस्टन तार के इलेक्ट्रोकेमिकल नक़्क़ाशी द्वारा घर में धातु की सुइयों को30 के रूप में बनाएं या उन्हें खरीदें। माइक्रोपिपेट खींचने वाले का उपयोग करके मोटी या मानक दीवार बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं (1 मिमी बाहरी व्यास) से कांच की सुइयों को तैयार करें। वर्तमान विधि के लिए, सुई टिप व्यास 1-5 μm के बीच रखें, 100-150 μm की गर्दन की लंबाई के साथ।
    नोट: धातु और कांच की सुइयों दोनों के निर्माण को उन उपकरणों का उत्पादन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो शोधकर्ता की व्यक्तिगत आवश्यकताओं और विशिष्ट जैविक मॉडल की जांच की जा रही है।

2. एकल न्यूरॉन का अलगाव

  1. 14 डिग्री सेल्सियस के लिए एक 0.33 एम एमजीसीएल2 समाधान ठंडा करें। 50 एमएल सिरिंज का उपयोग करके, जानवर के शरीर की गुहा में एमजीसीएल 2 समाधान को इंजेक्ट करके ए कैलिफोर्निका (150-250 ग्राम) को संवेदनाहारी करें। पशु शरीर द्रव्यमान (जी) के लिए समाधान मात्रा (एमएल) के 1: 3 अनुपात के साथ सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त किए जाते हैं। जानवर को आराम करने के लिए लगभग 3 मिनट प्रतीक्षा करें, यह सुनिश्चित करना कि यह स्पर्श उत्तेजना के जवाब में शरीर के संकुचन को प्रदर्शित नहीं करता है।
  2. एक विदारक ट्रे में पशु उदर पक्ष (पैर की तरफ) रखें। जानवर की ओर तैनात एक कुंद टिप के साथ सर्जिकल कैंची का उपयोग करके जानवर को विच्छेदित करें, ध्यान से पैर के माध्यम से अनुदैर्ध्य कटौती करें।
  3. शरीर गुहा में स्थित आंतरिक अंगों और सीएनएस गैन्ग्लिया को उजागर करने के लिए पशु शरीर के रोस्ट्रल, पुच्छल और पार्श्व पक्षों को पिन करें। गैंग्लिया से उत्पन्न होने वाली नसों और कुछ संयोजी को शल्य चिकित्सा द्वारा जानवर से प्रमुख सीएनएस गैन्ग्लिया को अलग करें।
  4. स्ट्रेप्टोमाइसेस ग्रिसस (एएसडब्ल्यू-एंटीबायोटिक्स समाधान में 10 मिलीग्राम / एमएल) से प्रोटीज प्रकार XIV के समाधान में गैन्ग्लिया को विसर्जित करें और 30 मिनट या 1 घंटे (सेरेब्रल गैंग्लियन के लिए) के लिए 34 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    नोट: इनक्यूबेशन की अवधि मौसम, पशु आकार और स्थिति, साथ ही लक्षित न्यूरॉन्स पर निर्भर करती है। कुछ न्यूरॉन्स के अलगाव के लिए दूसरों की तुलना में अधिक इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है और प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए।
  5. एएसडब्ल्यू-एंटीबायोटिक्स समाधान के साथ गैन्ग्लिया 6 एक्स कुल्ला और सभी गैन्ग्लिया को एक पॉलीप्रोपाइलीन ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके एएसडब्ल्यू-एंटीबायोटिक दवाओं के समाधान से भरे सिलिकॉन बहुलक-लेपित पकवान में स्थानांतरित करें जिसे ~ 5 मिमी के उद्घाटन में काट दिया गया है। पिपेट (वैकल्पिक) में गैन्ग्लिया के चिपकने को कम करने के लिए एएसडब्ल्यू में गोजातीय सीरम एल्बुमिन के 1 मिलीग्राम / एमएल के साथ पिपेट का इलाज करें। गैन्ग्लिया को हर समय एएसडब्ल्यू में डूबे रखें।
    नोट: एंजाइमेटिक उपचार न्यूरॉन्स और आसपास के संयोजी ऊतक की यांत्रिक स्थिरता को कम करता है और परिणामस्वरूप, गैन्ग्लिया हस्तांतरण के दौरान हवा के संपर्क में आने के कारण न्यूरोनल झिल्ली क्षतिग्रस्त हो सकती है।
  6. गैन्ग्लिया को पिन करें और नाड़ीग्रन्थि म्यान को हटाने के लिए सूक्ष्म कैंची और ठीक संदंश का उपयोग करें। पर्याप्त रूप से मजबूत एंजाइमेटिक उपचार के साथ, डिसहीथिंग के लिए कांच या धातु की सुइयों का उपयोग करें।
  7. नेत्रहीन ब्याज के ए कैलिफोर्निका न्यूरॉन्स की पहचान करें। इस काम में, निम्नलिखित कोशिकाओं का अध्ययन किया गया था: पेट के नाड़ीग्रन्थि में आर 2, फुफ्फुस नाड़ीग्रन्थि में एलपीएल 1, सेरेब्रल गैंग्लियन में मेटासेरेब्रल कोशिकाएं (एमसीसी), और बुक्कल नाड़ीग्रन्थि में बी 2 कोशिकाएं। प्रत्येक सेल प्रकार के आकार और मात्रा निर्धारित करने के लिए 20x कुल आवर्धन पर एक कैलिब्रेटेड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सभी तंत्रिका और गैंग्लियोनिक तैयारी की ऑप्टिकल छवियां लें।
  8. एक खींचे गए ग्लास केशिका या तेज टंगस्टन सुइयों का उपयोग करके, थोक नाड़ीग्रन्थि से पहचाने गए सेल को सावधानीपूर्वक अलग करें।
  9. एक प्लास्टिक माइक्रोपिपेट में एएसडब्ल्यू की एक छोटी राशि (1 μL) ड्रा, और फिर 0.365 एम अमोनियम एसीटेट (पीएच 9.2) के 4 μL युक्त एक पीसीआर नमूना ट्यूब में पृथक सेल हस्तांतरण। रिक्त माप के लिए, नाड़ीग्रन्थि युक्त पकवान से एएसडब्ल्यू-एंटीबायोटिक्स समाधान के 5 μL विभाज्य एकत्र करें और पाचन बफर (नीचे वर्णित) के साथ मिश्रण करें।

3. एसएनआरएमए-एमएस के लिए सेल लिसिस और आरएनए पाचन

  1. 0.365 एम अमोनियम एसीटेट में एक माइक्रोपिपेट (~ 100 μm आंतरिक व्यास) के साथ दोहराया आकांक्षा और वितरण द्वारा पृथक न्यूरॉन्स लाइज़ करें। कुछ छोटी कोशिकाएं तुरंत टूट नहीं सकती हैं; उन्हें लाइज़ करने के लिए, एक खींचे गए ग्लास केशिका के साथ सेल के व्यास में दबाव लागू करें।
  2. निम्नलिखित तापमान कार्यक्रम के साथ नमूनों को गर्म करने के लिए एक थर्मल साइक्लर का उपयोग करें: 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 3 मिनट के लिए 10 डिग्री सेल्सियस, 10 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो। थर्मल साइक्लर से नमूना ट्यूब निकालें।
  3. प्रत्येक नमूने के लिए आरएनए पाचन बफर के 3.375 μL जोड़ें और कई बार समाधान को वापस लेने और वितरित करके एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके समाधान मिलाएं। पीसीआर ट्यूब की दीवारों से चिपकने वाली किसी भी तरल बूंदों को स्पिन करने के लिए 30 एस के लिए 2700 एक्स जी पर एक लघु बेंचटॉप अपकेंद्रित्र का उपयोग करें।
  4. 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थर्मल साइक्लर में नमूने सेते हैं, 10 डिग्री सेल्सियस (गर्म ढक्कन पर सेट) पर एक पकड़ के बाद। नमूना 10 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने के तुरंत बाद, ऑटोसैंपलर ट्यूब में बुलबुला गठन से बचने के लिए ध्यान रखते हुए, 250 μL डालने से लैस ऑटोसैंपलर शीशी में समाधान के 7 μL को स्थानांतरित करें।

4. तरल क्रोमैटोग्राफी-अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री

नोट: इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण स्रोत और छह-पोर्ट डायवर्टर वाल्व से लैस एलसी-एमएस / एमएस सिस्टम का उपयोग करके एकल-न्यूरॉन डाइजेस्ट और प्रामाणिक संशोधित न्यूक्लियोसाइड मानकों का विश्लेषण करें।

  1. विहित और संशोधित न्यूक्लियोसाइड के पृथक्करण के लिए एलसी प्रणाली तैयार करने के लिए, 99% मोबाइल चरण ए (5 एमएम अमोनियम एसीटेट, पीएच 5.6) और 1% मोबाइल चरण बी (60/40 मोबाइल चरण ए / एसीटोनिट्राइल (एसीएन)) के साथ एक सी 18 कॉलम (150 मिमी x 2.1 मिमी, 2.2 μm कण आकार, 120 ए छिद्र व्यास) को संतुलित करें। मोबाइल चरणों की तैयारी के लिए एलसी-एमएस ग्रेड सॉल्वैंट्स का उपयोग करें।
  2. जबकि एलसी संतुलन, 5 μL / मिनट की प्रवाह दर के साथ सिरिंज पंप के माध्यम से द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर के लिए 50/50 एसीएन / पानी में सोडियम एसीटेट के 1 एमएम समाधान को पेश करके द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर को कैलिब्रेट करें। अंशांकन के बाद, एलसी प्रवाह को द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर से फिर से कनेक्ट करें।
  3. निम्नलिखित रैखिक ढाल मापदंडों को प्रोग्राम करें: 0-5 मिनट के लिए 1% बी, 9 मिनट में 5% बी, 11 मिनट में 7% बी, 13 मिनट में 10% बी, 32 मिनट में 15% बी, 38 मिनट में 40% बी, 43 मिनट में 50% बी, 50 मिनट में 100% बी, 60 मिनट में 100% बी, 61 मिनट में 1% बी, और अगले इंजेक्शन से पहले 1% बी पर 12 मिनट का पुन: संतुलन।
  4. निम्नलिखित मापदंडों के साथ सकारात्मक मोड में एमएस उपकरण संचालित करें: केशिका वोल्टेज 4,500 वी पर सेट, सुखाने का तापमान275 डिग्री सेल्सियस, एन 2 सुखाने वाली गैस 5 एल / विश्लेषण के पहले 2 मिनट के लिए अपशिष्ट करने के लिए डायवर्टर वाल्व सेट करें और शेष रन के लिए स्रोत के लिए।
  5. 110-600 की एक मीटर / जेड रेंज पर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा ले लीजिए। डेटाबेस2 और ± 0.5 की एक अलगाव खिड़की का उपयोग करके निर्मित पसंदीदा द्रव्यमान सूची का उपयोग करके 3 एस चक्र समय पर 35-40 ईवी पर टकराव-प्रेरित पृथक्करण के लिए आयनों का चयन करें। तीन स्पेक्ट्रा के बाद विखंडन से आयनों को बाहर करने के लिए सक्रिय बहिष्करण का उपयोग करें।
  6. एमएस स्पेक्ट्रा अधिग्रहण क्रमशः 4 हर्ट्ज और 1 हर्ट्ज पर 50,000 मायने रखता है, और 1,990 गिनती पर आयन चयन के लिए एक न्यूनतम सीमा के ऊपर और नीचे तीव्रता के साथ आयनों के लिए सेट करें।
  7. मात्रात्मक एसएनआरएमए-एमएस के लिए, अज्ञात अंतर्जात विश्लेषण सांद्रता के प्रक्षेप की अनुमति देने के लिए कम से कम पांच सांद्रता पर संशोधित न्यूक्लियोसाइड मानकों के लिए प्राप्त निकाले गए आयन क्रोमैटोग्राम (ईआईसी) शिखर क्षेत्रों का उपयोग करके अंशांकन घटता का निर्माण करें।
    नोट: 150-250 ग्राम के शरीर के द्रव्यमान वाले जानवरों से प्राप्त न्यूरॉन्स को आमतौर पर 0.02 पीएमओएल से 2 पीएमओएल तक संशोधित न्यूक्लियोसाइड के लिए अंशांकन घटता की आवश्यकता होती है, लेकिन ये मान उपकरण की संवेदनशीलता के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।

5. डेटा विश्लेषण

  1. संशोधित न्यूक्लियोसाइड के लिए ईआईसी उत्पन्न करें (डेटाबेस मान2 से एम / डेटाबेस मानों के लिए उनके एमएस 2 स्पेक्ट्रा और एलसी प्रतिधारण विशेषताओं की तुलना करके पुटेटिव संशोधित न्यूक्लियोसाइडकी पहचान की पुष्टि करें। कैलिफोर्निका से एकल न्यूरॉन्स में पाए गए विशिष्ट आरएनए संशोधनों की एक सूची के लिए तालिका 1 देखें।
  2. मैन्युअल रूप से उन चोटियों को एकीकृत करें जो संशोधित और विहित न्यूक्लियोसाइड के अनुरूप हैं और इन मूल्यों को स्प्रेडशीट में रिकॉर्ड करते हैं। नमूने में पाए गए विहित साइटिडीन, यूरिडीन और गुआनोसिन के लिए चोटी क्षेत्रों के योग के साथ प्रत्येक संशोधित न्यूक्लियोसाइड के लिए शिखर क्षेत्र को सामान्य करें।
    नोट: एडेनोसिन एक गतिशील न्यूरोमोडुलेटर31 के रूप में सीएनएस में अपनी भूमिका के कारण सामान्यीकरण में शामिल नहीं है।
  3. प्रत्येक एकल-न्यूरॉन नमूने और संशोधित न्यूक्लियोसाइड के लिए संबंधित सामान्यीकृत शिखर क्षेत्रों से मिलकर एक डेटा मैट्रिक्स का निर्माण करें जो सिग्नल-टू-शोर अनुपात >10 का प्रदर्शन करता है। प्रिंसिपल घटक विश्लेषण (पीसीए) करें और स्कोर प्लॉट में पहले दो प्रमुख घटकों को प्रदर्शित करें। न्यूक्लियोसाइड मानकों के धारावाहिक कमजोर पड़ने से प्राप्त ईआईसी शिखर क्षेत्रों से रैखिक अंशांकन घटता का निर्माण करें और पता लगाए गए विश्लेषणों की सांद्रता की गणना करें।

Representative Results

एसएनआरएमए-एमएस में लाइसिस, पाचन और एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण (चित्रा 1 ए) के लिए छोटे नमूना संस्करणों में पहचाने गए न्यूरॉन्स का मैनुअल अलगाव शामिल है। इस वर्कफ़्लो ने नियमित रूप से ए कैलिफोर्निका (चित्रा 1 बी) के सीएनएस से एकल न्यूरॉन्स में एक दर्जन से अधिक आरएनए संशोधनों का पता लगाया, जो एक ही कोशिका में इस जानवर24 के ज्ञात एपिट्रांसक्रिप्टोम के लगभग आधे हिस्से के कवरेज का प्रतिनिधित्व करता है। उदाहरण के लिए, एलपीएल 1 न्यूरॉन (~ 500 μm व्यास) को एसएनआरएमए-एमएस के अधीन करने के परिणामस्वरूप 15 ± 1 आरएनए संशोधनों (एन = 3) का पता चला। संशोधित न्यूक्लियोसाइड को तीन विशेषताओं के आधार पर सकारात्मक रूप से पहचाना गया था: डेटाबेस 2 में प्रदान किए गए मूल्यों की तुलना में एलसी प्रतिधारण गुण, सटीक द्रव्यमान और एमएस2 विखंडन प्रोफाइल। तालिका 1 एलपीएल 1 न्यूरॉन में पाए गए सभी आरएनए संशोधनों की एक सूची दिखाती है। इन प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्वाड्रुपोल टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमीटर ने 4 पीपीएम की द्रव्यमान सटीकता के साथ-साथ संशोधित न्यूक्लियोसाइड एन 6, 6-डाइमिथाइलडेनोसिन (एम 66 ए, चित्रा 1 बी) के लिए एम / जेड164पर विशेषता एमएस 2 टुकड़ा आयन का पता लगाने में सक्षम बनाया। एलसी पृथक्करण डेटा के साथ संयुक्त, जो डेटाबेस में जमा निष्कर्षों से सहमत है (एन 6-मिथाइलडेनोसिन (एम6ए) के बाद एम66ए एल्यूट्स), एसएनआरएमए-एमएस दृष्टिकोण ने संशोधित न्यूक्लियोसाइड पहचान के सही असाइनमेंट का प्रदर्शन किया।

एसएनआरएमए-एमएस प्लेटफॉर्म को एकल न्यूरॉन्स के आरएनए संशोधन प्रोफाइल स्थापित करने और थोक ऊतकों के साथ उनके संबंधों की जांच के लिए लीवरेज किया जा सकता है। आर 2 न्यूरॉन्स बड़े (~ 500 μm व्यास) कोलीनर्जिक कोशिकाएं हैं जो पेट के नाड़ीग्रन्थि में रहती हैं। एसएनआरएमए-एमएस का उपयोग आर 2 न्यूरॉन्स के साथ-साथ आसपास के थोक पेट नाड़ीग्रन्थि (चित्रा 2 ए) में आरएनए संशोधनों का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। नाड़ीग्रन्थि नमूने (एन = 7) में आरएनए संशोधनों के लिए सामान्यीकृत चोटी क्षेत्रों का उपयोग पीसीए के लिए इनपुट के रूप में किया गया था, जिससे पता चलता है कि आर 2 न्यूरॉन्स गैन्ग्लिया की तुलना में अलग-अलग आरएनए संशोधन प्रोफाइल प्रदर्शित करते हैं जिसमें वे रहते हैं (चित्रा 2 बी)। यह पीसीए स्कोर प्लॉट के विभिन्न क्षेत्रों पर कब्जा करने वाले आर 2 न्यूरॉन्स और पेट गैन्ग्लिया के लिए डेटा बिंदुओं से स्पष्ट है। अद्वितीय संशोधित न्यूक्लियोसाइड पैटर्न के लिए आगे का समर्थन जानवरों के एक अलग समूह (एन = 7) से प्राप्त किया गया था जिसमें 13 आरएनए संशोधनों के लिए जोड़ीदार तुलना की गई थी जो आमतौर पर एकल न्यूरॉन्स और थोक ऊतक (चित्रा 2 सी) दोनों में पाए गए थे। दो संशोधित न्यूक्लियोसाइड, स्यूडोरिडीन (Ψ) और 2'-ओ-मिथाइलगुआनोसिन (जीएम), आर 2 न्यूरॉन्स की तुलना में पेट गैन्ग्लिया में काफी अधिक प्रचुरता पर थे। आर 2 न्यूरॉन-गैंग्लियन जोड़े के साथ आरएनए संशोधनों के सबसेट को देखते समय, सभी पेट गैन्ग्लिया ने Ψ और जीएम के उच्च स्तर का प्रदर्शन किया, और आर 2 न्यूरॉन्स में से एक को छोड़कर सभी में उनके संबंधित नाड़ीग्रन्थि (चित्रा 2 डी) की तुलना में 2'-ओ-मिथाइलडेनोसिन (एएम) की उच्च प्रचुरता थी। कुल मिलाकर, एसएनआरएमए-एमएस परिणाम पहली बार प्रकट करते हैं कि एकल कोशिकाओं के आरएनए संशोधन प्रोफाइल एक ही ऊतक में थोक कोशिकाओं से अलग हो सकते हैं।

कैलिफोर्निका मॉडल जानवर ए कैलिफोर्निका की जांच करने के लिए एसएनआरएमए-एमएस का उपयोग पहचान, कार्यात्मक रूप से अलग न्यूरॉन्स में आरएनए संशोधन प्रोफाइल को चिह्नित करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करता है। आरएनए संशोधनों का मूल्यांकन एसएनआरएमए-एमएस द्वारा चार पहचानी गई कोशिकाओं में किया गया था: आर 2 और एलपीएल 1 (सजातीय, रक्षात्मक श्लेष्म रिलीज में शामिल कोलीनर्जिक कोशिकाएं)32, एमसीसी (खिला में शामिल सेरोटोनर्जिक मॉड्यूलेटरी न्यूरॉन्स) 33, और बी 2 कोशिकाएं (पेट की गतिशीलता में शामिल पेप्टिडर्जिक न्यूरॉन्स) 34। इन पहचाने गए न्यूरॉन्स में छह आरएनए संशोधनों का पीसीए, या तो एंजाइमी उपचार के तुरंत बाद पृथक हो जाता है या 48 घंटे के लिए नाड़ीग्रन्थि तैयारी में सुसंस्कृत होता है, एकल कोशिका एपिट्रांसक्रिप्टोम की स्थिरता और गतिशीलता का प्रदर्शन करता है। कार्यात्मक रूप से विभिन्न कोशिकाओं में आरएनए संशोधनों ने स्कोर प्लॉट में अद्वितीय समूहों का गठन किया, जबकि सजातीय आर 2 / एलपीएल 1 न्यूरॉन्स सह-क्लस्टर (चित्रा 3 ए)। लोडिंग प्लॉट से पता चलता है कि मतभेद मुख्य रूप से मिथाइलडेनोसिन के स्थितीय आइसोमर्स की प्रचुरता से प्रेरित थे, जिसमें 2'-ओ-मिथाइलडेनोसिन (एएम) और एन 1-मिथाइलडेनोसिन (एम1ए) (चित्रा 3 बी) शामिल थे। उसी विश्लेषण में, 48 घंटे के लिए सीटू (यानी, उनके संबंधित गैन्ग्लिया में) में सुसंस्कृत ताजा पृथक कोशिकाओं और कोशिकाओं की तुलना की गई थी। जैसा कि पीसीए स्कोर प्लॉट में दिखाया गया है, कार्यात्मक रूप से अलग-अलग कोशिकाएं अपने आरएनए संशोधन प्रोफाइल द्वारा अलग-अलग बनी हुई हैं।

मात्रात्मक एसएनआरएमए-एमएस का उपयोग चुनिंदा आरएनए संशोधनों की पूर्ण मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है जिसके लिए प्रामाणिक मानक उपलब्ध हैं। बाहरी अंशांकन घटता एम1ए, Ψ, 2'-ओ-मिथाइलसाइटिडाइन (सेमी), एएम और एम6ए के लिए उत्पन्न किए गए थे, और एमसीसी और आर 2 / एलपीएल 1 सेल जोड़े में प्रत्येक संशोधित न्यूक्लियोसाइड की मात्रा प्रक्षेप (चित्रा 4 ए-ई) द्वारा निर्धारित की गई थी। सममित एमसीसी के दो जोड़े में एम1ए और Ψ की इंट्रासेल्युलर मात्रा समान दिखाई दी, जबकि इन संशोधनों की मात्रा में बड़े अंतर आर 2 / एलपीएल 1 कोशिकाओं के तीन जोड़े में देखे गए। अध्ययन की गई कोशिकाओं के भौतिक आकार के कारण मतभेदों के लिए खाते में, संशोधित न्यूक्लियोसाइड के इंट्रासेल्युलर सांद्रता उत्पन्न करने के लिए सेल व्यास के ऑप्टिकल माप से गणना की गई सेल वॉल्यूम द्वारा आरएनए संशोधन मात्रा को सामान्यीकृत किया गया था। सीएम और एएम के इंट्रासेल्युलर सांद्रता में महत्वपूर्ण अंतर एमसीसी और आर 2 / एलपीएल 1 न्यूरॉन्स के बीच देखा गया था। कुल मिलाकर, एसएनआरएमए-एमएस एकल न्यूरॉन्स में आरएनए संशोधनों के गुणात्मक और मात्रात्मक प्रोफाइलिंग दोनों को सक्षम बनाता है।

Figure 1
चित्रा 1: एसएनआरएमए-एमएस वर्कफ़्लो और एलसी-एमएस /एमएस द्वारा एकल न्यूरॉन्स में कई आरएनए संशोधनों का पता लगाना (ए) एक नमूना ट्यूब में डिसहीथेड बुकल गैंग्लियन और एकल न्यूरॉन अलगाव की तस्वीरें। स्केल बार = 200 μm, तीर पहचाने गए B1 सेल को इंगित करते हैं। एमएस विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी प्रक्रिया का एक आरेख भी दिखाया गया है। (बी) एक एकल एलपीएल 1 न्यूरॉन में आरएनए संशोधनों के लिए ओवरलैड ईआईसी, इनसेट के साथ एन 6, एन 6-डाइमेथिलडेनोसिन(एम66 ए) के लिए एमएस 1 और एमएस 2 स्पेक्ट्रा दिखा रहा है। संशोधित न्यूक्लियोसाइड के लिए ईआईसी उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एम /जेड मानों के लिए तालिका 1 देखें। इस आंकड़े को29 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एसएनआरएमए-एमएस एकल न्यूरॉन्स और थोक ऊतक के आरएनए संशोधन प्रोफाइल को अलग करता है( ए) आर 2 न्यूरॉन्स और आसपास के पेट के नाड़ीग्रन्थि का विश्लेषण करने के लिए ए कैलिफोर्निका सीएनएस और वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध। तस्वीर पेट नाड़ीग्रन्थि और आर 2 न्यूरॉन (दृश्यता के लिए फास्ट ग्रीन डाई के साथ इंजेक्शन) दिखाती है। (बी) पीसीए स्कोर (शीर्ष) और लोडिंग (नीचे) भूखंडों को उत्पन्न करने के लिए 13 आरएनए संशोधनों से सापेक्ष शिखर क्षेत्रों का उपयोग किया गया था। (सी) पेट नाड़ीग्रन्थि और आर 2 न्यूरॉन में आरएनए संशोधनों की जोड़ीवार तुलना। त्रुटि सलाखों ±1 मानक विचलन (एसडी), * पी < 0.05, *** पी < 5 x 10−4, बोनफेरोनी-होल्म सुधार के साथ युग्मित टी-टेस्ट का प्रतिनिधित्व करते हैं। (डी) पैनल सी से चुनिंदा आरएनए संशोधनों की तुलना जिसमें प्रत्येक जानवर के लिए आर 2-पेट नाड़ीग्रन्थि जोड़े ड्रॉपलाइन के साथ दिखाए जाते हैं। इस आंकड़े को29 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
(ए) एमसीसी के लिए पीसीए स्कोर प्लॉट, और बी 2, आर 2, और एलपीएल 1 कोशिकाएं जो 48 घंटे के लिए सीटू संस्कृति में या तो ताजा पृथक या पृथक थीं (सीएमसीसी, सीबी 2, सीआर 2, सीएलपीएल 1 द्वारा निरूपित), और (बी) आमतौर पर छह आरएनए संशोधनों के लिए भूखंडों को लोड करना इस आंकड़े को29 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: ए कैलिफोर्निका न्यूरॉन्स में मात्रात्मक एसएनआरएमए-एमएस। मात्रात्मक एसएनआरएमए-एमएस एकल में कई संशोधित न्यूक्लियोसाइड के लिए पूर्ण मात्रा और इंट्रासेल्युलर सांद्रता प्रदान करता है, पहचाने गए ए । सेरेब्रल गैंग्लियन में (ए) बाएं और दाएं एमसीसी (एलएमसीसी और आरएमसीसी, क्रमशः) और (बी) पेट के नाड़ीग्रन्थि में आर 2 और फुफ्फुस नाड़ीग्रन्थि में एलपीएल 1 की तस्वीरें। दृश्यता बढ़ाने के लिए कोशिकाओं को घेर लिया जाता है। एकल कोशिकाओं (रंगीन डॉट्स) में संशोधित न्यूक्लियोसाइड मात्राओं के प्रक्षेप के लिए उपयोग किए जाने वाले (सी) एम1ए और (डी) Ψ (त्रिकोण) के लिए रैखिक अंशांकन भूखंड। प्रत्येक जानवर से सेल जोड़े को 1-3 लेबल किया जाता है। (ई) एमसीसी और आर 2 / एलपीएल 1 सेल जोड़े में पांच संशोधित न्यूक्लियोसाइड की इंट्रासेल्युलर सांद्रता। मोटी रेखाएं सेल जोड़े को जोड़ती हैं। * पी < 0.05, ** पी < 0.005, बोनफेरोनी-होल्म सुधार के साथ टी-टेस्ट जोड़ा गया, एन = 2 जानवर (कुल चार कोशिकाएं) एमसीसी के लिए और एन = 3 जानवर (छह कोशिकाएं कुल) आर 2 / इस आंकड़े को29 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आरएनए संशोधन संक्षेपण क्षालन आदेश (सी 18) ईआईसी के लिए एम/जेड एमएस 2 के लिए एम /
डाइहाइड्रोरिडीन D 1 247.09 115
स्यूडोरिडीन Y 2 245.08 209/179/155
3-मिथाइलसाइटिडाइन एम 3 सी 3 258.11 126
एन 1-मिथाइलडेनोसिन एम 1 ए 4 282.12 150
5-मिथाइलसाइटिडाइन एम 5 सी 5 258.11 126
एन 7-मिथाइलगुआनोसिन एम 7 जी 6 298.12 166
2'-ओ-मिथाइलसाइटिडाइन सेंटीमीटर 7 258.11 112
इनोसिन आई6ए 8 269.09 137
2'-ओ-मिथाइलगुआनोसिन जीएम 9 298.12 152
एन 2-मिथाइलगुआनोसिन एम 2 जी 10 298.12 166
एन 2, एन 2, एन 7-ट्राइमेथिलगुआनोसिन एम 227 जी 11 326.15 194
एन 2, एन 2, -डाइमिथाइलगुआनोसिन एम 22 जी 12 312.13 180
2'-ओ-मिथाइलडेनोसिन हूँ 13 282.12 136
एन 6-मिथाइलडेनोसिन एम 6 ए 14 282.12 150
एन 6, एन 6-डाइमेथिलडेनोसिन एम 66 ए 15 296.14 164
एन 6-आइसोपेंटेनिलाडेनोसाइन आई6ए 16 336.17 204/136/148

तालिका 1: ए कैलिफोर्निका से एकल न्यूरॉन्स में आरएनए संशोधनों का पता चला। संशोधित न्यूक्लियोसाइड के लक्षण वर्णन के लिए विशेषताएं प्रदान की जाती हैं जिनमें एलसी प्रतिधारण आदेश, ईआईसी उत्पन्न करने के लिए एम / जेड और संबंधित सीआईडी टुकड़े शामिल हैं।

Discussion

एसएनआरएमए-एमएस एक अनुकूलित नमूना तैयारी दृष्टिकोण का लाभ उठाता है, जिसके परिणामस्वरूप एक छोटा, एमएस-संगत नमूना वॉल्यूम होता है जिसे एलसी-एमएस प्लेटफॉर्म पर पहुंचाया जा सकता है। सीएनएस गैन्ग्लिया का प्रारंभिक एंजाइमेटिक प्री-ट्रीटमेंट दोनों को उस आसानी से निर्धारित करता है जिसके साथ उन्हें अलग किया जा सकता है और अलगाव के दौरान एकल न्यूरॉन्स का स्थायित्व। सेरेब्रल गैंग्लियन को अक्सर बुक्कल, फुफ्फुस और पेट गैन्ग्लिया की तुलना में अपेक्षाकृत मोटी म्यान के कारण विस्तारित एंजाइमी उपचार की आवश्यकता होती है। एकल न्यूरॉन अलगाव करने वाले व्यक्तिगत शोधकर्ताओं की अलग-अलग प्राथमिकताएं हो सकती हैं कि माइक्रोसिसर और ठीक संदंश का उपयोग करते समय म्यान कितना टिकाऊ होना चाहिए। हालांकि, यह महत्वपूर्ण है कि गैन्ग्लिया अधिक पचा नहीं है, क्योंकि इससे उनकी संरचनात्मक अखंडता में नुकसान हो सकता है, स्थितीय जानकारी का नुकसान हो सकता है जो लक्ष्य कोशिकाओं की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है, और / नाड़ीग्रन्थि से अलगाव के बाद, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि न्यूरॉन को नमूना ट्यूब में स्थानांतरित करते समय अलगाव माध्यम की न्यूनतम मात्रा आकांक्षा की जाती है। एएसडब्ल्यू माध्यम में लवण की एक उच्च सांद्रता होती है जो आरएनए हाइड्रोलिसिस के दौरान पाचन एंजाइमों में हस्तक्षेप कर सकती है और नमूने को भी पतला कर देगी।

यांत्रिक लसीका चरण के दौरान, बड़े न्यूरॉन्स (>250 μm व्यास) के लिए बार-बार माइक्रोपिपेट से गुजरने पर टूटना आम है। छोटे न्यूरॉन्स को सेल लिसिस सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त ध्यान देने की आवश्यकता हो सकती है, जिसमें आमतौर पर सेल पर एक ग्लास केशिका दबाना शामिल होता है। इस उदाहरण में, यह संभव है कि नमूना बफर की आंशिक मात्रा केशिका बलों के कारण केशिका में खींची जाएगी। यह मात्रा ग्लास केशिका के अंत में दबाव लागू करके नमूना ट्यूब में वापस वितरित की जा सकती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोई नमूना खो न जाए।

आरएनए पाचन के लिए एंजाइमों को जोड़ने से पहले हीटिंग चरण को शामिल करके सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त किए जाते हैं। ऐसा इसलिए है क्योंकि 95 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग आरएनए माध्यमिक संरचनाओं को विकृत करती है जो आरएनए35 की गतिविधि को बाधित कर सकती है और आरएनए बायोपॉलिमर से जारी न्यूक्लियोसाइड की मात्रा को कम कर सकती है। स्थिर आइसोटोप-लेबल वाले मेथियोनीन के साथ नुकीले नमूनों का उपयोग करके नियंत्रण प्रयोगों को पहले यह जांचने के लिए किया गया था कि क्या गर्मी से प्रेरित आरएनए संशोधन कलाकृतियां नो-हीट एसएनआरएमए-एमएस प्रोटोकॉल29 के सापेक्ष आरएनए संशोधनों के लिए देखे गए बढ़े हुए शिखर क्षेत्रों का कारण थीं। ऐसी कोई लेबलिंग नहीं देखी गई, यह दर्शाता है कि अनुकूलित एसएनआरएमए-एमएस विधि का उपयोग करके आरएनए संशोधनों के लिए बेहतर संकेत आरएनए के बेहतर पाचन के कारण थे।

कोशिकाओं से कुल आरएनए को अलग करने के पारंपरिक तरीकों में फिनोल-क्लोरोफॉर्म और बाद में आरएनए वर्षा, धोने और पुन: निलंबन के साथ तरल-तरल निष्कर्षण (एलएलई) शामिल है। ये दृष्टिकोण रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन प्रयोगों के लिए उपयोगी साबित हुए हैं जहां चयनित जीनों की अभिव्यक्ति की पहचान ए कैलिफोर्निका न्यूरॉन्स36,37 में आसानी से निगरानी की जा सकती है। हालांकि, एलएलई विधियां एलसी-एमएस द्वारा संशोधित राइबोन्यूक्लियोसाइड्स का पता लगाने के लिए पर्याप्त आरएनए को पुनर्प्राप्त नहीं कर सकती हैं, जबकि यहां वर्णित एसएनआरएमए-एमएस विधि कई आरएनए संशोधनों का पता लगाने में सक्षम बनाती है। सेल नमूनों में विशिष्ट आरएनए प्रकारों (जैसे, आरआरएनए, टीआरएनए, एमआरएनए) के संशोधन प्रोफाइल का आकलन करने के लिए, आयनों-विनिमय ठोस चरण निष्कर्षण24, संकरण जांच-आधारित संवर्धन38, और क्रोमैटोग्राफिक विभाजन39 दृष्टिकोण लागू किए गए हैं, लेकिन एकल-कोशिका आरएनए शुद्धिकरण के लिए समान तरीके अभी तक उपलब्ध नहीं हैं। आरएनए विभाजन दृष्टिकोण का विकास जो एकल कोशिकाओं से विशिष्ट आरएनए प्रकारों को अलग करने में सक्षम हैं, आरएनए संशोधनों के कार्य की ओर अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा।

एसएनआरएमए-एमएस ने ए कैलिफोर्निका में एकल न्यूरॉन्स के आरएनए संशोधन परिदृश्य में पहले से अनिर्दिष्ट विषमता का खुलासा किया और यह कल्पनीय है कि स्तनधारी कोशिकाओं में इसी तरह के अलग-अलग पीटीएम प्रोफाइल मौजूद हैं। स्तनधारी कोशिकाओं इस प्रोटोकॉल में विश्लेषण बड़े ए कैलिफोर्निका न्यूरॉन्स की तुलना में अपेक्षाकृत छोटे हैं, क्योंकि छोटे नमूना संस्करणों की हैंडलिंग में सुधार कम पता लगाने की सीमा की सुविधा के लिए आवश्यक हैं। यद्यपि वर्तमान में एसएनआरएमए-एमएस ~ 5 μL की मात्रा तक सीमित है, यह उम्मीद की जाती है कि वर्कफ़्लो में माइक्रोफ्लुइडिक तरल हैंडलिंग उपकरणों को शामिल करके पर्याप्त सुधार प्राप्त किए जा सकते हैं। इसके अलावा, स्वचालित या अर्ध-स्वचालित सेल अलगाव के कार्यान्वयन से नमूना थ्रूपुट में वृद्धि होगी और बड़ी सेल आबादी के एकल-सेल आरएनए संशोधन विश्लेषण की अनुमति मिलेगी। नैनोफ्लो एलसी पृथक्करण27 के साथ इंटरफेसिंग करके, यहां तक कि छोटी कोशिकाओं में एपिट्रांसक्रिप्टोमिक चिह्नों का लक्षण वर्णन प्राप्त करने योग्य होगा।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस कार्य को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन ड्रग एब्यूज द्वारा अवार्ड नं. पी30डीए018310 और राष्ट्रीय मानव जीनोम अनुसंधान संस्थान पुरस्कार सं. आरएम 1 एचजी010023। केडीसी बेकमैन इंस्टीट्यूट पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप से समर्थन स्वीकार करता है। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि वित्त पोषण एजेंसियों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animals
Aplysia californica National Resource for Aplysia (Miami, FL) 150–250 g (adult)
Benchtop equipment
Glass capillary puller Sutter P-97
Milli-Q water purification system Millipore
Minicentrifuge for PCR tubes LW Scientific ZS-1
Optical Microscope Zeiss Stemi 2000C
Thermocycler Techne EW-93945-01
HPLC column and consumables
Acclaim RSLC 120 C18 column Thermo Scientific 71399
Autosampler vials Thermo Scientific C4011-13
LC and MS Instrumentation and Software
DataAnalysis 4.4 software Bruker
Dionex Ultimate 3000 nanoLC Thermo Scientific Equipped with online degasser, autosampler, and thermostatted column compartment
Impact HD UHR QqTOF mass spectrometer Bruker Equipped with ESI source
RStudio RStudio
Microdissection tools
Microscissors extra fine vannas 3.5” Roboz RS-5640
Tungsten needles Roboz RS-6065
Reagents/Materials
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane-sulfonic acid (HEPES) Fisher Scientific H3375
Alkaline phosphatase Worthington Biochemical Corp. LS004081
Ammonium acetate Honeywell 17836
Benzonase (endonuclease from S. marcescens) EMD Millipore 70746-4
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A2153
Calcium chloride Sigma-Aldrich C4901
Gentamycin sulfate Fisher Scientific G1264
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M9272
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 208094
Nucleosides test mix Sigma-Aldrich 47310-U
Penicillin G Sigma-Aldrich P7794
Pentostatin Sigma-Aldrich SML0508
Phosphodiesterase I Worthington Biochemical Corp. LS003926
Protease type XIV from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich P5147
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
Standard glass capillaries A-M Systems 626000 1 mm o.d., 0.5 mm i.d., 4 in
Streptomycin sulfate Sigma-Aldrich S9137

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रसायन विज्ञान अंक 182 आरएनए संशोधन एकल-कोशिका तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री न्यूक्लियोसाइड न्यूरॉन एप्लिसिया कैलिफोर्निका एपिट्रांसक्रिप्टोम
मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके एकल न्यूरॉन्स में आरएनए संशोधनों की विशेषता
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Clark, K. D., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (182), e63940, doi:10.3791/63940 (2022).

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