Summary
Post-transkriptionella modifieringar av RNA representerar ett understuderat lager av översättningsreglering som nyligen har kopplats till centrala nervsystemets plasticitet. Här beskrivs provberedning och vätskekromatografi-tandemmasspektrometrimetod för samtidig karakterisering av många RNA-modifieringar i enskilda neuroner.
Abstract
Post-transkriptionella modifieringar (PTM) av RNA representerar en understuderad mekanism som är involverad i reglering av översättning i centrala nervsystemet (CNS). Nya bevis har kopplat specifika neuronala RNA-modifieringar till inlärnings- och minnesparadigmer. Tyvärr kan konventionella metoder för detektering av dessa epitranskriptomiska egenskaper endast karakterisera mycket rikliga RNA-modifieringar i bulkvävnader, vilket utesluter bedömningen av unika PTM-profiler som kan existera för enskilda neuroner inom de aktiverade beteendekretsarna. I detta protokoll beskrivs ett tillvägagångssätt - en-neuron RNA-modifieringsanalys genom masspektrometri (SNRMA-MS) - för att samtidigt detektera och kvantifiera många modifierade ribonukleosider i enskilda neuroner. Tillvägagångssättet valideras med hjälp av enskilda neuroner i den marina blötdjuret, Aplysia californica, som börjar med kirurgisk isolering och enzymatisk behandling av stora CNS-ganglier för att exponera neuroncellkroppar, följt av manuell en-neuronisolering med skarpa nålar och en mikropipett. Därefter görs mekanisk och termisk behandling av provet i en liten volym buffert för att frigöra RNA från en enskild cell för efterföljande RNA-uppslutning. Modifierade nukleosider identifieras och kvantifieras sedan med hjälp av en optimerad vätskekromatografi-masspektrometrimetod. SNRMA-MS används för att fastställa RNA-modifieringsmönster för enstaka, identifierade nervceller från A. californica som har kända morfologier och funktioner. Exempel på kvalitativa och kvantitativa SNRMA-MS presenteras som belyser den heterogena fördelningen av RNA-modifieringar över enskilda nervceller i neuronala nätverk.
Introduction
Modifieringar i de kanoniska nukleosiderna av RNA har blivit alltmer erkända för sina otaliga roller i regleringen av proteinöversättning. Över 150 unika RNA-modifieringar har hittills rapporterats som sträcker sig i komplexitet från metylering, heteroatom addition, till konjugering med cellulära metaboliter 1,2. Detta expanderade RNA-alfabet, även känt som epitranskriptomet, genereras av enzymatiska författare och är ansvarigt för att ändra stabiliteten3, vikningen4 och översättningseffektiviteten 5,6 av cellulära RNA. Utvalda RNA-modifieringar kan också vändas via enzymatiska suddgummin 7,8, medan andra läggs till RNA substokiometriskt 9,10, vilket ger ett komplext landskap av modifierade och omodifierade RNA-sekvenser i biologiska system.
Betydelsen av RNA-modifieringar i biologisk funktion indikeras av den ojämna fördelningen av modifieringar över olika organ och vävnader, inklusive subregioner i centrala nervsystemet (CNS)11. Denna kemiska heterogenitet har kopplats till CNS-utveckling12, stressrespons13 och aktivitetsberoende plasticitet14. CNS-subregionerna omfattar vidare heterogena populationer av celler där enskilda celler uppvisar distinkta kemiska profiler 15,16,17,18. Även enstaka celler av samma typ kan uppvisa unika transkriptom, delvis på grund av vävnadsmikromiljöer19 och stokastiskt genuttryck20. Även om karakterisering av encells transkriptomet är något rutinmässigt, finns det inga analoga metoder för att upprätta encelliga epitranskriptomer för flera RNA-modifieringar. Nya metoder som kan profilera fördelningen av RNA-modifieringar i enskilda celler behövs för omfattande analys av den cellulära heterogeniteten och regleringspåverkan av post-transkriptionella modifieringar (PTM) i CNS och andra biologiska system.
Samtidig mätning av många RNA-modifieringar i bulkceller / vävnader utförs lätt med hjälp av vätskekromatografi-tandemmasspektrometri (LC-MS / MS) tekniker. För LC-MS/MS-analys av modifierade ribonukleosider extraheras RNA från celler (vanligtvis 10 3-10 6 celler), renas genom utfällning och resuspension och smälts därefter till nukleosider. Provblandningen bestående av kanoniska och modifierade nukleosider injiceras sedan i LC-MS-systemet för analyteseparation och detektion, vilket leder till bestämning av det fullständiga komplementet av RNA-modifieringar i en organism 21,22,23. LC-MS/MS användes nyligen för att bestämma 26 RNA-modifieringar i CNS i den neurobiologiska modellen, Aplysia californica (A. californica). Överflödet av några av dessa epitranskriptomiska märken uppvisade tids- och regionberoende dynamik som korrelerade med beteendeförändringar hos djuret24. Det var emellertid endast möjligt att detektera RNA-modifieringar i bulkprover innehållande >103 celler på grund av metodens begränsade känslighet. Dessa större prover dolde sannolikt unika och funktionellt viktiga RNA-modifieringsprofiler för enskilda celler med befolkningsmedelvärden. Även om noggrann kontroll av provberedningsförhållandena har förbättrat detektionsgränserna för RNA-modifieringar i småvolymprover 25,26,27,28, finns det fortfarande ett behov av analysmetoder som kan detektera och kvantifiera flera modifierade ribonukleosider i enskilda celler.
Detta protokoll introducerar en-neuron RNA-modifieringsanalys genom masspektrometri (SNRMA-MS), vilket möjliggör detektion av över ett dussin RNA-modifieringar i enskilda neuroner från CNS av A. californica29. Tillvägagångssättet består av kirurgisk isolering av enstaka, identifierade celler från stora CNS-ganglier följt av ett optimerat arbetsflöde för provberedning som involverar mekanisk celllys, RNA-denaturering och enzymatisk hydrolys i en MS-kompatibel buffert. Identifiering och kvantifiering av post-transkriptionellt modifierade nukleosider utförs sedan med hjälp av LC-MS / MS. SNRMA-MS uppfyller ett ouppfyllt behov inom RNA-modifieringsanalys genom att underlätta förvärvet av post-transkriptionella RNA-modifieringsprofiler för enskilda neuroner och har potential för framtida tillämpning på andra celltyper.
Protocol
1. Beredning av material och lösningar
- Förbered artificiellt havsvatten (ASW) med 460 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 22 mM MgCl2, 26 mM MgSO4 och 10 mM HEPES i vatten erhållet från ett strikt reningssystem. Justera pH till 7,8 med 1 M NaOH eller HCl. Förbered vanligtvis 1 L ASW och förvara vid 14 °C tills det används.
- Bered en ASW-antibiotikalösning med 10 000 U/ml penicillin G, 10 μg/μl streptomycin och 10 μg/μl gentamicin och förvara vid -20 °C. Omedelbart före experimentet, tina och späd den frysta antibiotikabuljonglösningen 1:100 i 20-40 ml ASW. Den slutliga koncentrationen av antibiotika i den fungerande ASW-lösningen är 100 U / ml penicillin G, 100 μg / ml streptomycin och 100 μg / ml gentamicin.
- Bered en RNA-matsmältningsbuffert genom att kombinera 1 μl 10 μg/μl bovint serumalbumin, 0,5 μl 0,5 μg/μl pentostatin, 0,495 μl alkaliskt fosfatas U/μL, 1 μl fosfodiesteras I (i 10 mM MgCl2) och 0,38 μl endonukleas från Serratia marcescens (25 U) per prov. Om du analyserar flera prover, förbered en masterblandning i ett separat rör som innehåller volymen av varje reagens multiplicerat med antalet prover som ska analyseras, plus ytterligare ett för att ta hänsyn till tillfällig reagensförlust från pipetöverföringssteg.
- Förbered flera skarpa nålar (antingen glas eller metall) för manuell isolering av neuroner. Gör metallnålar i huset genom elektrokemisk etsning av volframtråd som i30 eller köp dem. Förbered glasnålar från tjocka eller vanliga väggborosilikatglaskapillärer (1 mm ytterdiameter) med en mikropipettdragare. För den nuvarande metoden, håll nålspetsdiametern mellan 1-5 μm, med en halslängd på 100-150 μm.
OBS: Tillverkning av både metall- och glasnålar kan optimeras för att producera verktyg som passar forskarens individuella behov och den specifika biologiska modell som undersöks.
2. Isolering av enstaka neuron
- Kyl en 0,33 M MgCl2-lösning till 14 °C. Använd en 50 ml spruta, bedöva A. californica (150-250 g) genom att injicera MgCl2-lösningen i djurets kroppshålighet. Bästa resultat erhålls med förhållandet 1:3 mellan lösningsvolym (ml) och djurkroppsmassa (g). Vänta cirka 3 minuter tills djuret blir avslappnat och se till att det inte visar kroppssammandragningar som svar på taktil stimulering.
- Placera djurets ventrala sida (fotsida) uppåt i en dissekeringsbricka. Dissekera djuret med kirurgisk sax med en trubbig spets placerad mot djuret, försiktigt göra ett längsgående snitt genom foten.
- Fäst de rostrala, kaudala och laterala sidorna av djurkroppen för att exponera de inre organen och CNS-ganglierna i kroppshålan. Isolera stora CNS-ganglier från djuret genom att kirurgiskt skära nerver och några anslutningar som härrör från ganglierna.
- Sänk ner ganglierna i en lösning av proteas typ XIV från Streptomyces griseus (10 mg/ml i ASW-antibiotikalösning) och inkubera vid 34 °C i 30 minuter eller 1 timme (för cerebral ganglion).
OBS: Inkubationstiden beror på säsong, djurstorlek och tillstånd samt riktade neuroner. Isolering av vissa nervceller kräver längre inkubation än andra och bör bestämmas experimentellt. - Skölj ganglierna 6x med ASW-antibiotikalösning och överför alla ganglier till i en silikonpolymerbelagd skål fylld med ASW-antibiotikalösning med en polypropenöverföringspipett som har skurits till en öppning på ~ 5 mm. Behandla pipetten med 1 mg/ml bovint serumalbumin i ASW för att minimera att ganglierna fastnar i pipetten (tillval). Håll ganglier nedsänkta i ASW hela tiden.
OBS: Enzymatisk behandling minskar den mekaniska stabiliteten hos nervceller och omgivande bindväv och som ett resultat kan neuronala membran skadas på grund av exponering för luft under gangliöverföring. - Pinna ner ganglierna och använd mikrosax och fina pincett för att ta bort ganglionslidor. Med tillräckligt stark enzymatisk behandling, använd glas- eller metallnålar för desheathing.
- Visuellt identifiera A. californica neuroner av intresse. I detta arbete studerades följande celler: R2 i bukganglionen, LPl1 i pleural ganglion, metacerebrala celler (MCC) i cerebral ganglion och B2-celler i den buckala ganglionen. Ta optiska bilder av alla neurala och ganglioniska preparat med ett kalibrerat mikroskop med 20x total förstoring för att bestämma storlekarna och volymerna för varje celltyp.
- Använd en dragen glaskapillär eller skarpa volframnålar, isolera försiktigt den identifierade cellen från bulk ganglion.
- Dra en liten mängd (1 μl) ASW i en mikropipett av plast och överför sedan den isolerade cellen till ett PCR-provrör innehållande 4 μl 0,365 M ammoniumacetat (pH 9,2). För blankmätningar, samla upp 5 μL alikvoter av ASW-antibiotikalösningen från skålen som innehåller ganglion och blanda med matsmältningsbufferten (beskrivs nedan).
3. Celllys och RNA-matsmältning för SNRMA-MS
- Lysa de isolerade neuronerna genom upprepad aspiration och dispensering med en mikropipett (~ 100 μm innerdiameter) i 0,365 M ammoniumacetat. Vissa mindre celler kanske inte omedelbart brister; för att lysera dem, applicera tryck över cellens diameter med en dragen glaskapillär.
- Använd en termisk cykler för att värma proverna med följande temperaturprogram: 95 °C i 3 min, 10 °C i 3 min, håll vid 10 °C. Ta bort provröret från värmecykeln.
- Tillsätt 3,375 μl RNA-uppslutningsbuffert för varje prov och blanda lösningen med en mikropipett genom att dra upp och dosera lösningen flera gånger. Använd en miniatyrbänkcentrifug vid 2700 x g i 30 s för att snurra ner eventuella vätskedroppar som klamrar sig fast vid PCR-rörets väggar.
- Inkubera proverna i värmecykeln vid 37 °C i 3 timmar, följt av ett stopp vid 10 °C (uppvärmt lock inställt på ON). Omedelbart efter det att provet har svalnat till 10 °C, överför 7 μL av lösningen till en autosamplerflaska utrustad med en 250 μL insats, varvid man ska se till att bubbelbildning i autosamplerröret undviks.
4. Vätskekromatografi-tandem masspektrometri
OBS: Analysera en-neuron-smältningar och autentiska modifierade nukleosidstandarder med hjälp av ett LC-MS / MS-system utrustat med en elektrosprayjoniseringskälla och sexports avledningsventil.
- För att förbereda LC-systemet för separation av kanoniska och modifierade nukleosider, likrikta en C18-kolonn (150 mm x 2,1 mm, 2,2 μm partikelstorlek, 120 Å pordiameter) med 99% mobil fas A (5 mM ammoniumacetat, pH 5,6) och 1% mobil fas B (60/40 mobil fas A / acetonitril (ACN)) vid en flödeshastighet av 0,2 ml / min i 12 minuter vid 36 ° C. Använd lösningsmedel av LC-MS-kvalitet för beredning av mobila faser.
- Medan LC balanserar, kalibrera masspektrometern genom att införa en 1 mM lösning av natriumacetat i 50/50 ACN/vatten till masspektrometern via sprutpump med en flödeshastighet på 5 μL/min. Efter kalibrering, anslut LC-flödet till masspektrometern igen.
- Programmera följande linjära gradientparametrar: 1% B i 0-5 min, 5% B vid 9 min, 7% B vid 11 min, 10% B vid 13 min, 15% B vid 32 min, 40% B vid 38 min, 50% B vid 43 min, 100% B vid 50 min, 100% B vid 60 min, 1% B vid 61 min, och en 12 min re-equilibration vid 1% B före nästa injektion.
- Använd MS-instrumentet i positivt läge med följande parametrar: kapillärspänning inställd på 4 500 V, torktemperatur 275 °C,N2-torkgas 5 l/min och nebuliserande gas 1 bar. Ställ in avledningsventilen på avfall under de första 2 minuterna av analysen och till källan under resten av körningen.
- Samla masspektra över ett m/z-intervall på 110-600. Välj joner för kollisionsinducerad dissociation vid 35-40 eV under en 3 s cykeltid med hjälp av en föredragen masslista konstruerad med hjälp av databasen2 och ett isoleringsfönster på ± 0,5. Använd aktiv exkludering för att utesluta joner från fragmentering efter tre spektra.
- Ställ in dynamisk MS/MS-spektraförvärv för joner med intensiteter över och under 50 000 räkningar vid 4 Hz respektive 1 Hz, och en minimitröskel för jonval vid 1 990 räkningar.
- För kvantitativ SNRMA-MS, konstruera kalibreringskurvor med hjälp av extraherade jonkromatogram (EIC) toppareor erhållna för modifierade nukleosidstandarder vid minst fem koncentrationer för att möjliggöra interpolering av okända endogena analytkoncentrationer.
OBS: Neuroner erhållna från djur med kroppsmassor på 150-250 g kräver vanligtvis kalibreringskurvor för modifierade nukleosider från 0,02 pmol till 2 pmol, men dessa värden kan variera beroende på instrumentets känslighet.
5. Analys av data
- Generera EIC för modifierade nukleosider (m/z från databasvärden2). Verifiera identiteten hos förmodade modifierade nukleosider genom att jämföra deras MS2-spektra och LC-retentionsegenskaper med databasvärden2. Se tabell 1 för en lista över typiska RNA-modifieringar som detekterats i enstaka neuroner från A. californica.
- Integrera toppar manuellt som motsvarar modifierade och kanoniska nukleosider och registrera dessa värden i ett kalkylblad. Normalisera toppområdet för varje modifierad nukleosid med summan av toppområdena för kanonisk cytidin, uridin och guanosin detekterad i provet.
OBS: Adenosin ingår inte i normaliseringen på grund av dess roll i CNS som en dynamisk neuromodulator31. - Konstruera en datamatris bestående av varje enskilt neuronprov och motsvarande normaliserade toppområden för modifierade nukleosider som uppvisade signal-brusförhållanden >10. Utför huvudkomponentanalys (PCA) och visa de två första huvudkomponenterna i poängdiagrammet. Konstruera linjära kalibreringskurvor från de EIC-toppareor som erhållits från den seriella utspädningen av nukleosidstandarder och beräkna koncentrationerna av detekterade analyter.
Representative Results
SNRMA-MS innebär manuell isolering av identifierade nervceller i små provvolymer för lys, matsmältning och LC-MS / MS-analys (Figur 1A). Detta arbetsflöde upptäckte rutinmässigt över ett dussin RNA-modifieringar i enstaka neuroner från CNS av A. californica (Figur 1B), vilket representerar en täckning av nästan hälften av det kända epitranskriptomet för detta djur24 i en enda cell. Till exempel resulterade det i detektion av 15 ± 1 RNA-modifieringar (n = 3) att LPl1-neuronen (~ 500 μm diameter) utsattes för SNRMA-MS. Modifierade nukleosider identifierades positivt på grundval av tre attribut: LC-retentionsegenskaper, exakt massa och MS2-fragmenteringsprofiler jämfört med värden som anges i databasen2. Tabell 1 visar en lista över alla RNA-modifieringar som detekterats i LPl1-neuronen. Den högupplösta fyrdubbla flygtidsmasspektrometern som användes för dessa experiment möjliggjorde en massnoggrannhet på 4 ppm samt detektion av den karakteristiska MS2-fragmentjonen vid m/z 164 för den modifierade nukleosiden N6,6-dimetyladenosin (m66A, figur 1B). I kombination med LC-separationsdata, som överensstämmer med fynd som deponerats i databasen (m66A eluerar efter N6-metyladenosin (m6A)), visade SNRMA-MS-metoden korrekt tilldelning av modifierade nukleosididentiteter.
SNRMA-MS-plattformen kan utnyttjas för att upprätta RNA-modifieringsprofiler för enskilda neuroner och undersöka deras förhållande till bulkvävnader. R2-neuroner är stora (~ 500 μm i diameter) kolinerga celler som finns i buk ganglion. SNRMA-MS användes för att analysera RNA-modifieringar i R2-neuroner såväl som den omgivande bulk buken ganglion (Figur 2A). Normaliserade toppområden för RNA-modifieringar i varje neuron/ ganglionprov (n = 7) användes som ingångar för PCA, vilket avslöjade att R2-neuroner uppvisar distinkta RNA-modifieringsprofiler jämfört med de ganglier där de bor (Figur 2B). Detta framgår av datapunkter för R2-neuroner och bukganglier som upptar olika regioner i PCA-poängdiagrammet. Ytterligare stöd för unika modifierade nukleosidmönster erhölls från en separat kohort av djur (n = 7) där parvisa jämförelser utfördes för 13 RNA-modifieringar som vanligtvis detekterades i både de enskilda neuronerna och bulkvävnaden (Figur 2C). Två modifierade nukleosider, pseudouridin (Ψ) och 2'-O-metylguanosin (Gm), hade signifikant högre förekomst i bukganglierna jämfört med R2-neuroner. När man tittade på en delmängd av RNA-modifieringarna med R2-neuron-ganglionpar indikerade, uppvisade alla bukganglier högre nivåer av Ψ och Gm, och alla utom en av R2-neuronerna hade högre överflöd av 2'-O-metyladenosin (Am) än deras motsvarande ganglion (figur 2D). Sammantaget avslöjar SNRMA-MS-resultaten för första gången att RNA-modifieringsprofiler för enskilda celler kan avvika från bulkceller i samma vävnad.
Att använda SNRMA-MS för att undersöka modelldjuret A. californica ger en unik möjlighet att karakterisera RNA-modifieringsprofiler i identifierade, funktionellt distinkta nervceller. RNA-modifieringar utvärderades av SNRMA-MS i fyra identifierade celler: R2 och LPl1 (homologa, kolinerga celler involverade i defensiv slemfrisättning)32, MCC (serotonerga modulerande neuroner involverade i utfodring)33 och B2-celler (peptiderga neuroner involverade i tarmmotilitet)34. PCA av sex RNA-modifieringar i dessa identifierade neuroner, antingen isolerade omedelbart efter enzymatisk behandling eller odlade i ett ganglionpreparat i 48 timmar, visade stabiliteten och dynamiken hos encelliga epitranskriptomer. RNA-modifieringar i funktionellt olika celler bildade unika kluster i poängdiagrammet medan homologa R2 / LPl1-neuroner samklustrades (figur 3A). Belastningsdiagrammet visar att skillnaderna främst drevs av förekomsten av positionsisomerer av metyladenosin, inklusive 2'-O-metyladenosin (Am) och N1-metyladenosin (m1A) (figur 3B). I samma analys utfördes en jämförelse av nyligen isolerade celler och celler odlade in situ (dvs i sina respektive ganglier) i 48 timmar. Som visas i PCA-poängdiagrammet förblev funktionellt olika celler urskiljbara genom sina RNA-modifieringsprofiler.
Kvantitativ SNRMA-MS kan användas för att bestämma absoluta mängder av utvalda RNA-modifieringar för vilka autentiska standarder finns tillgängliga. Externa kalibreringskurvor genererades för m1A, Ψ, 2'-O-metylcytidin (Cm), Am och m6A, och mängden av varje modifierad nukleosid i MCC- och R2 / LPl1-cellparen bestämdes genom interpolering (figur 4A-E). De intracellulära kvantiteterna av m1A och Ψ i två par symmetriska MCC tycktes vara likartade, medan större skillnader i mängderna av dessa modifieringar observerades i tre par R2 / LPl1-celler. För att ta hänsyn till skillnader på grund av den fysiska storleken på de studerade cellerna normaliserades RNA-modifieringsmängder av cellvolymer beräknade från optisk mätning av celldiametrar för att ge intracellulära koncentrationer av modifierade nukleosider. Signifikanta skillnader i intracellulära koncentrationer av Cm och Am observerades mellan MCC och R2/LPl1 nervceller. Sammantaget möjliggör SNRMA-MS både kvalitativ och kvantitativ profilering av RNA-modifieringar i enskilda nervceller.
Figur 1: SNRMA-MS-arbetsflöde och detektion av flera RNA-modifieringar i enskilda neuroner av LC-MS / MS. (A) Fotografier av avvärmd buckal ganglion och enkel neuronisolering i ett provrör. Skalstreck = 200 μm, pilar indikerar identifierad B1-cell. Ett diagram över provberedningsförfarandet för LC-MS / MS-analys visas också. (B) Överlagrade EIC för RNA-modifieringar i en enda LPl1-neuron, med infällning som visar MS1- och MS2-spektra för N6, N6-dimetyladenosin (m66A). Se tabell 1 för m/z-värden som används för att generera EIC för modifierade nukleosider. Denna siffra har ändrats från29. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: SNRMA-MS skiljer RNA-modifieringsprofiler för enskilda neuroner och bulkvävnad. Fotografiet visar buk ganglion och R2 neuron (injicerad med Fast Green färgämne för synlighet). (B) Relativa toppområden från 13 RNA-modifieringar användes för att generera PCA-poängen (överst) och laddningen (botten) diagram. (C) Parvis jämförelse av RNA-modifieringar i bukganglionen och R2-neuronen. Felstaplar representerar ±1 standardavvikelse (SD), *p < 0,05, ***p < 5 x 10−4, parat t-test med Bonferroni−Holm-korrigering. (D) Jämförelse av utvalda RNA-modifieringar från panel C där R2-abdominala ganglionpar för varje djur visas med dropplinjer. Denna siffra har ändrats från29. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Profilering av RNA-modifieringar i identifierade, funktionellt olika neuroner från A. californica CNS. (A) PCA-poängdiagram för MCC och B2-, R2- och LPl1-celler som antingen nyligen isolerades eller isolerades efter in situ-odling i 48 timmar (betecknat med cMCC, cB2, cR2, cLPl1) och (B) laddningsdiagram för sex RNA-modifieringar som vanligtvis detekteras i dessa celler. Denna siffra har ändrats från29. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Kvantitativ SNRMA-MS i A. californica-neuroner . Kvantitativ SNRMA-MS ger absoluta mängder och intracellulära koncentrationer för flera modifierade nukleosider i enstaka, identifierade A. californica-neuroner . Fotografier av (A) vänster och höger MCC (LMCC respektive RMCC) i cerebral ganglion och (B) R2 i buk ganglion och LPl1 i pleural ganglion. Cellerna är inringade för att förbättra synligheten. Linjära kalibreringsdiagram för (C) m1A och (D) Ψ (trianglar) som används för interpolering av modifierade nukleosidmängder i enstaka celler (färgade prickar). Cellpar från varje djur är märkta 1-3. (E) Intracellulära koncentrationer av fem modifierade nukleosider i MCC- och R2/ LPl1-cellpar. Tjocka linjer förbinder cellpar. *p < 0,05, **p < 0,005, parat t-test med Bonferroni−Holm-korrigering, n = 2 djur (totalt fyra celler) för MCC och n = 3 djur (totalt sex celler) för R2/LPl1. Denna siffra har ändrats från29. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| RNA-modifiering | Förkortning | Elueringsordning (C18) | m/z för EIC | m/z för MS2 |
| dihydrouridin | D | 1 | 247.09 | 115 |
| pseudouridin | Y | 2 | 245.08 | 209/179/155 |
| 3-metylcytidin | m3C | 3 | 258.11 | 126 |
| N1-metyladenosin | m1A | 4 | 282.12 | 150 |
| 5-metylcytidin | m5C | 5 | 258.11 | 126 |
| N7-metylguanosin | m7G | 6 | 298.12 | 166 |
| 2'-O-metylcytidin | Centimeter | 7 | 258.11 | 112 |
| inosin | I6A | 8 | 269.09 | 137 |
| 2'-O-metylguanosin | Gm | 9 | 298.12 | 152 |
| N2-metylguanosin | m2G | 10 | 298.12 | 166 |
| N2,N2,N7-trimetylguanosin | m227G | 11 | 326.15 | 194 |
| N2,N2,-dimetylguanosin | m22G | 12 | 312.13 | 180 |
| 2'-O-metyladenosin | Vara | 13 | 282.12 | 136 |
| N6-metyladenosin | m6A | 14 | 282.12 | 150 |
| N6,N6-dimetyladenosin | m66A | 15 | 296.14 | 164 |
| N6-isopentenyladenosin | i6A | 16 | 336.17 | 204/136/148 |
Tabell 1: RNA-modifieringar detekterade i enstaka neuroner från A. californica. Attribut för karakterisering av modifierade nukleosider tillhandahålls inklusive LC-retentionsordning, m / z för att generera EIC och motsvarande CID-fragment.
Discussion
SNRMA-MS utnyttjar en optimerad provberedningsmetod, vilket resulterar i en liten, MS-kompatibel provvolym som kan levereras till LC-MS-plattformen. Den initiala enzymatiska förbehandlingen av CNS-ganglier dikterar både hur lätt de kan värmas upp och hållbarheten hos enskilda neuroner under isolering. Den cerebrala ganglionen kräver ofta förlängd enzymatisk behandling på grund av dess relativt tjocka mantel jämfört med de buckala, pleurala och bukganglierna. Enskilda forskare som utför de enskilda neuronisoleringarna kan ha olika preferenser för hur hållbar manteln ska vara när man använder mikroscissorer och fina pincett. Det är dock viktigt att ganglierna inte översmälts, eftersom detta kan leda till förlust av deras strukturella integritet, förlust av positionsinformation som är avgörande för att identifiera målceller och / eller celllys. Efter isolering från ganglion är det viktigt att säkerställa att en minimal volym isoleringsmedium aspireras vid överföring av neuronen till provröret. ASW-mediet innehåller en hög koncentration av salter som kan störa matsmältningsenzymer under RNA-hydrolys och kommer också att späda ut provet.
Under det mekaniska lyssteget är det vanligt att stora nervceller (>250 μm diameter) brister när de upprepade gånger passerar genom en mikropipett. Mindre nervceller kan kräva ytterligare uppmärksamhet för att säkerställa celllys, vilket vanligtvis innebär att man pressar en glaskapillär på cellen. I detta fall är det möjligt att en partiell volym av provbufferten dras in i kapillären på grund av kapillärkrafter. Denna volym kan levereras tillbaka till provröret genom att applicera tryck på slutet av glaskapillären för att säkerställa att inget prov går förlorat.
De bästa resultaten erhålls genom att inkludera ett uppvärmningssteg innan enzymer tillsätts för RNA-matsmältning. Detta beror sannolikt på att uppvärmning vid 95 ° C denaturerar RNA-sekundära strukturer som kan hindra aktiviteten hos RNas35 och minska mängden nukleosider som frigörs från RNA-biopolymerer. Kontrollexperiment med prover spetsade med stabilt isotopmärkt metionin utfördes tidigare för att undersöka om värmeinducerade RNA-modifieringsartefakter var orsaken till de ökade toppområdena som observerades för RNA-modifieringar i förhållande till ett SNRMA-MS-protokoll29 utan värme. Ingen sådan märkning observerades, vilket indikerar att de förbättrade signalerna för RNA-modifieringar med den optimerade SNRMA-MS-metoden berodde på överlägsen matsmältning av RNA.
Konventionella metoder för att isolera totalt RNA från celler involverar vätske-vätskeextraktion (LLE) med fenol-kloroform och efterföljande RNA-utfällning, tvättning och resuspension. Dessa metoder har visat sig användbara för omvänd transkription av polymeraskedjereaktionsexperiment där uttrycket av utvalda gener lätt kan övervakas i identifierade A. californica-neuroner 36,37. LLE-metoder kan emellertid inte återvinna tillräckligt med RNA för detektion av modifierade ribonukleosider med LC-MS, medan SNRMA-MS-metoden som beskrivs häri möjliggör detektion av många RNA-modifieringar29. För att bedöma modifieringsprofiler för specifika RNA-typer (t.ex. rRNA, tRNA, mRNA) i bulkvävnads- / cellprover har anjonbyte fastfasextraktion24, hybridiseringssondbaserad anrikning38 och kromatografisk fraktionering39 metoder tillämpats, men liknande metoder är ännu inte tillgängliga för encells RNA-rening. Utvecklingen av RNA-fraktioneringsmetoder som kan isolera specifika RNA-typer från enskilda celler skulle ge ytterligare insikt om funktionen av RNA-modifieringar.
SNRMA-MS avslöjade tidigare okarakteriserad heterogenitet i RNA-modifieringslandskapet hos enskilda neuroner i A. californica och det är tänkbart att liknande distinkta PTM-profiler finns över däggdjursceller. Eftersom däggdjursceller är relativt små jämfört med de stora A. californica-neuronerna som analyseras i detta protokoll behövs förbättringar i hanteringen av små provvolymer för att underlätta lägre detektionsgränser. Även om SNRMA-MS för närvarande är begränsat till volymer på ~ 5 μL, förväntas det att betydande förbättringar kan uppnås genom att integrera mikrofluidiska vätskehanteringsenheter i arbetsflödet. Dessutom skulle implementeringen av automatiserade eller halvautomatiserade cellisoleringar öka provgenomströmningen och möjliggöra encells RNA-modifieringsanalys av större cellpopulationer. Genom att samverka med nanoflöde LC-separationer27 kommer karakteriseringen av epitranskriptomiska märken i ännu mindre celler att kunna uppnås.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av National Institute on Drug Abuse under Award no. P30DA018310 och National Human Genome Research Institute under Award nr. RM1HG010023. K.D.C. erkänner stöd från ett Beckman Institute Postdoctoral Fellowship. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis finansiärernas officiella åsikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Aplysia californica | National Resource for Aplysia (Miami, FL) | 150–250 g (adult) | |
| Benchtop equipment | |||
| Glass capillary puller | Sutter | P-97 | |
| Milli-Q water purification system | Millipore | ||
| Minicentrifuge for PCR tubes | LW Scientific | ZS-1 | |
| Optical Microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Thermocycler | Techne | EW-93945-01 | |
| HPLC column and consumables | |||
| Acclaim RSLC 120 C18 column | Thermo Scientific | 71399 | |
| Autosampler vials | Thermo Scientific | C4011-13 | |
| LC and MS Instrumentation and Software | |||
| DataAnalysis 4.4 software | Bruker | ||
| Dionex Ultimate 3000 nanoLC | Thermo Scientific | Equipped with online degasser, autosampler, and thermostatted column compartment | |
| Impact HD UHR QqTOF mass spectrometer | Bruker | Equipped with ESI source | |
| RStudio | RStudio | ||
| Microdissection tools | |||
| Microscissors extra fine vannas 3.5” | Roboz | RS-5640 | |
| Tungsten needles | Roboz | RS-6065 | |
| Reagents/Materials | |||
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane-sulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | H3375 | |
| Alkaline phosphatase | Worthington Biochemical Corp. | LS004081 | |
| Ammonium acetate | Honeywell | 17836 | |
| Benzonase (endonuclease from S. marcescens) | EMD Millipore | 70746-4 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Gentamycin sulfate | Fisher Scientific | G1264 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| Nucleosides test mix | Sigma-Aldrich | 47310-U | |
| Penicillin G | Sigma-Aldrich | P7794 | |
| Pentostatin | Sigma-Aldrich | SML0508 | |
| Phosphodiesterase I | Worthington Biochemical Corp. | LS003926 | |
| Protease type XIV from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Standard glass capillaries | A-M Systems | 626000 | 1 mm o.d., 0.5 mm i.d., 4 in |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 |
References
- Cantara, W. A., et al. The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update. Nucleic Acids Research. 39, suppl_1 195-201 (2011).
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46, 303-307 (2017).
- Kimura, S., Waldor, M. K. The RNA degradosome promotes tRNA quality control through clearance of hypomodified tRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (4), 1394-1403 (2019).
- Helm, M. Post-transcriptional nucleotide modification and alternative folding of RNA. Nucleic Acids Research. 34 (2), 721-733 (2006).
- Rezgui, V. A. N., et al. tRNA tKUUU, tQUUG, and tEUUC wobble position modifications fine-tune protein translation by promoting ribosome A-site binding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12289-12294 (2013).
- Shanmugam, R., et al. Cytosine methylation of tRNA-Asp by DNMT2 has a role in translation of proteins containing poly-Asp sequences. Cell Discovery. 1 (1), 1-10 (2015).
- Jia, G., et al. N 6-Methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nature Chemical Biology. 7 (12), 885-887 (2011).
- Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N 1 -methyladenosine methylome. Nature Chemical Biology. 12 (5), 311-316 (2016).
- Krogh, N., et al. Profiling of 2′-O-Me in human rRNA reveals a subset of fractionally modified positions and provides evidence for ribosome heterogeneity. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7884-7895 (2016).
- Babaian, A., et al. Loss of m1acp3Ψ Ribosomal RNA Modification Is a Major Feature of Cancer. Cell Reports. 31 (5), 107611 (2020).
- Chang, M., et al. Region-specific RNA m6A methylation represents a new layer of control in the gene regulatory network in the mouse brain. Open Biology. 7 (9), 170166 (2017).
- Wang, C. -X., et al. METTL3-mediated m6A modification is required for cerebellar development. PLOS Biology. 16 (6), 2004880 (2018).
- Engel, M., et al. The role of m6A/m-RNA methylation in stress response regulation. Neuron. 99 (2), 389-403 (2018).
- Widagdo, J., et al. Experience-dependent accumulation of N6-Methyladenosine in the prefrontal cortex is associated with memory processes in mice. Journal of Neuroscience. 36 (25), 6771-6777 (2016).
- Eberwine, J., et al. Analysis of gene expression in single live neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).
- Cong, Y., et al. Ultrasensitive single-cell proteomics workflow identifies >1000 protein groups per mammalian cell. Chemical Science. 12 (3), 1001-1006 (2021).
- Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nature Methods. 8 (4), 20-29 (2011).
- Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Metabolic differentiation of neuronal phenotypes by single-cell capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (17), 6810-6817 (2011).
- Lovatt, D., et al. Transcriptome in vivo analysis (TIVA) of spatially defined single cells in live tissue. Nature Methods. 11 (2), 190-196 (2014).
- Kærn, M., Elston, T. C., Blake, W. J., Collins, J. J. Stochasticity in gene expression: from theories to phenotypes. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 451-464 (2005).
- Chan, C. T. Y., et al. A quantitative systems approach reveals dynamic control of tRNA modifications during cellular stress. PLOS Genetics. 6 (12), 1001247 (2010).
- Sun, C., Jora, M., Solivio, B., Limbach, P. A., Addepalli, B. The effects of ultraviolet radiation on nucleoside modifications in RNA. ACS Chemical Biology. 13 (3), 567-572 (2018).
- Heiss, M., Hagelskamp, F., Marchand, V., Motorin, Y., Kellner, S. Cell culture NAIL-MS allows insight into human tRNA and rRNA modification dynamics in vivo. Nature Communications. 12 (1), 389 (2021).
- Clark, K. D., Lee, C., Gillette, R., Sweedler, J. V. Characterization of neuronal RNA modifications during non-associative learning in aplysia reveals key roles for tRNAs in behavioral sensitization. ACS Central Science. 7 (7), 1183-1190 (2021).
- Basanta-Sanchez, M., Temple, S., Ansari, S. A., D'Amico, A., Agris, P. F. Attomole quantification and global profile of RNA modifications: Epitranscriptome of human neural stem cells. Nucleic Acids Research. 44 (3), 26 (2016).
- Huang, W., et al. Determination of DNA and RNA methylation in circulating tumor cells by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (2), 1378-1384 (2016).
- Sarin, L. P., et al. Nano LC-MS using capillary columns enables accurate quantification of modified ribonucleosides at low femtomol levels. RNA. 24 (10), 1403-1417 (2018).
- Clark, K. D., Philip, M. C., Tan, Y., Sweedler, J. V. Biphasic liquid microjunction extraction for profiling neuronal RNA modifications by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (18), 12647-12655 (2020).
- Clark, K. D., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry: Characterizing RNA modification patterns and dynamics with single-cell resolution. Analytical Chemistry. 93 (43), 14537-14544 (2021).
- Guise, O. L., Ahner, J. W., Jung, M. -C., Goughnour, P. C., Yates, J. T. Reproducible electrochemical etching of tungsten probe tips. Nano Letters. 2 (3), 191-193 (2002).
- Peng, W., Wu, Z., Song, K., Zhang, S., Li, Y., Xu, M. Regulation of sleep homeostasis mediator adenosine by basal forebrain glutamatergic neurons. Science. 369 (6508), (2020).
- Rayport, S. G., Ambron, R. T., Babiarz, J. Identified cholinergic neurons R2 and LPl1 control mucus release in Aplysia. Journal of Neurophysiology. 49 (4), 864-876 (1983).
- Rosen, S. C., Weiss, K. R., Goldstein, R. S., Kupfermann, I. The role of a modulatory neuron in feeding and satiation in Aplysia: effects of lesioning of the serotonergic metacerebral cells. Journal of Neuroscience. 9 (5), 1562-1578 (1989).
- Lloyd, P. E., Kupfermann, I., Weiss, K. R. Central peptidergic neurons regulate gut motility in Aplysia. Journal of Neurophysiology. 59 (5), 1613-1626 (1988).
- Crain, P. F. Preparation and enzymatic hydrolysis of DNA and RNA for mass spectrometry. Methods in Enzymology. 193, 782-790 (1990).
- Kadakkuzha, B. M., et al. Age-associated bidirectional modulation of gene expression in single identified R15 neuron of Aplysia. BMC Genomics. 14 (1), 880 (2013).
- Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (83), e51075 (2014).
- Tardu, M., Jones, J. D., Kennedy, R. T., Lin, Q., Koutmou, K. S. Identification and quantification of modified nucleosides in saccharomyces cerevisiae mRNAs. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1403-1409 (2019).
- Heiss, M., Reichle, V. F., Kellner, S. Observing the fate of tRNA and its modifications by nucleic acid isotope labeling mass spectrometry: NAIL-MS. RNA Biology. 14 (9), 1260-1268 (2017).
