Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

استخدام الملقط البصري المزدوج والموائع الدقيقة للدراسات أحادية الجزيء

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64023
Automatic Translation
1
1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Nebraska Medical Center

Summary

يتم تسهيل الكيمياء الحيوية البصرية أحادية الجزيء التي تمت دراستها من خلال غرف الموائع الدقيقة بشكل كبير باستخدام برميل زجاجي ، ومحاقن مانعة لتسرب الغاز ، ووصلات مستقرة للأنابيب بخلايا التدفق ، والقضاء على الفقاعات عن طريق وضع صمامات التبديل بين المحاقن والأنابيب. يصف البروتوكول الفخاخ البصرية المزدوجة التي تمكن من تصور معاملات الحمض النووي والتفاعلات بين الجزيئات.

Abstract

الكيمياء الحيوية البصرية هي تقنية قوية لمراقبة الخصائص العشوائية للإنزيمات المفردة أو مجمعات الإنزيم التي يتم حجبها في المتوسط الذي يحدث في دراسات المرحلة السائبة. لتحقيق التصور ، يتم تركيز الملقط البصري المزدوج ، حيث يتم تثبيت أحد المصيدة والآخر متحرك ، في قناة واحدة لغرفة الموائع الدقيقة متعددة التيارات الموضوعة على مرحلة مجهر مضان مقلوب. تحبس الملقط البصري جزيئات مفردة من الحمض النووي المسمى بالفلورسنت وتدفق السوائل عبر الغرفة وتتجاوز الخرز المحبوس ، وتمتد الحمض النووي إلى شكل B (تحت الحد الأدنى من القوة ، أي 0 pN) مع ملاحظة الحمض النووي كخيط أبيض على خلفية سوداء. يتم نقل جزيئات الحمض النووي من تيار إلى آخر ، عن طريق ترجمة المرحلة المتعامدة مع التدفق لتمكين بدء التفاعلات بطريقة خاضعة للرقابة. لتحقيق النجاح ، يتم تزاوج أجهزة الموائع الدقيقة ذات القنوات الواضحة بصريا مع المحاقن الزجاجية المثبتة في مكانها في مضخة حقنة. تستخدم النتائج المثلى الموصلات المرتبطة بشكل دائم بخلية التدفق ، وهي أنابيب صلبة ميكانيكيا ومقاومة كيميائيا ، ومتصلة بصمامات التبديل التي تقضي على الفقاعات التي تمنع التدفق الصفحي.

Introduction

قدمت القدرة على تصور تفاعلات البروتين والحمض النووي على مستوى الجزيء الواحد وفي الوقت الفعلي نظرة ثاقبة مهمة لاستقرار الجينوم 1,2. بالإضافة إلى العمل مع جزيئات مفردة من الحمض النووي واحدا تلو الآخر ، فإن القدرة على عرض المعاملات بين الجزيئات الفردية القريبة توفر رؤية إضافية3،4،5. يتطلب التلاعب بجزيئات الحمض النووي الإضافية كلا من الفخاخ البصرية الإضافية بالإضافة إلى خلايا تدفق الموائع الدقيقة عالية الجودة ومتعددة القنوات6.

هناك العديد من الطرق المتاحة لإنشاء أكثر من مصيدة بصرية واحدة. وتشمل هذه مرايا مسح الجلفانومتر ، ومعدلات البصريات الصوتية ، والبصريات الحيود ، والتي تولد ملاقط بصرية ثلاثية الأبعاد4،7،8،9. في كثير من الأحيان ، تنتج مرايا المسح الضوئي والمعدلات البصرية الصوتية مصائد تشارك بالوقت. في الإعداد الموضح هنا ، يتم تقسيم شعاع ليزر Nd: YAG واحد على الاستقطاب ، ثم تتحكم مرايا المسح الضوئي بالليزر الجلفانومتر في موضع ما يسمى بالمصيدة المتنقلة (الشكل 1) 4. لتسهيل وضع المرايا والمرشحات لتوجيه شعاع الاصطياد إلى الفتحة الخلفية لهدف المجهر ، يتم استخدام ليزر HeNe. هذا يجعل المحاذاة الكلية أسهل لأن شعاع HeNe مرئي للعين المجردة ، في حين أن أشعة الأشعة تحت الحمراء ليست كذلك. يعد شعاع HeNe أيضا أكثر أمانا للعمل مع جعل وضع المرايا والمكونات الأخرى أقل إرهاقا. في البداية ، يكون مسار شعاع هذا الليزر منفصلا عن شعاع 1064 نانومتر ، ولكن يتم إدخاله في نفس مسار الحزمة ، ثم في هدف المجهر. بمجرد تحقيق المحاذاة المادية ، يتم وضع شعاع 1064 نانومتر أعلى شعاع HeNe ويتم تسهيل ذلك من خلال استخدام عارض الأشعة تحت الحمراء وأدوات تصوير الحزمة المختلفة لتصور موضع الحزمة وجودتها. بعد ذلك ، يتم إدخال موسع الحزمة ، ويتم محاذاة شعاع الأشعة تحت الحمراء الموسع الناتج على الفتحة الخلفية للهدف. أخيرا ، تتم إزالة الهدف ويتم قياس القدرة في كل حزمة مستقطبة وتعديلها باستخدام ألواح موجية λ / 2 لتكون متساوية (الشكل 1C). يتم إجراء قياسات الطاقة أيضا بمجرد إرجاع الهدف وعادة ما يكون هناك فقدان للطاقة بنسبة 53٪. ومع ذلك ، هناك طاقة كافية لتشكيل مصائد بصرية ثابتة ومتحركة مستقرة في المستوى البؤري (الشكل 1D).

لتصوير معاملات الحمض النووي ، تلعب خلايا تدفق الموائع الدقيقة دورا رئيسيا لأنها تسمح بالقياسات الخاضعة للرقابة على مستوى الجزيء الواحد بدقة مكانية وزمانية عالية (الشكل 2). يشير مصطلح الموائع الدقيقة إلى القدرة على معالجة السوائل في قناة واحدة أو أكثر بأبعاد تتراوح من 5-500 ميكرومتر10,11. يشير مصطلح التيار إلى السائل الفعلي داخل القناة وتشير القناة إلى القناة المادية التي يتحرك فيها تيار أو تيارات مائعة. يحتوي تصميم خلية التدفق أحادية القناة على قناة مادية مشتركة حيث يتم ملاحظة التفاعلات وعادة ما يكون هناك تيار سائل واحد فقط. وبالتالي ، تعرف هذه التصميمات باسم خلايا التدفق أحادية الدفق. في المقابل ، يتم تعريف خلايا التدفق متعددة الدفق على أنها جهاز موائع دقيقة تتلاقى فيه قناتان أو أكثر من قنوات الدخول في قناة مادية واحدة مشتركة (الشكل 2 أ). داخل القناة المشتركة ، تتدفق تيارات السوائل التي تنشأ من القنوات الفردية بالتوازي مع بعضها البعض ، وتظل منفصلة مع حدوث الحد الأدنى من الاختلاط بينها بسبب الانتشار (الشكل 2 ب). في معظم الإعدادات التجريبية ، تدفع مضخة واحدة السوائل إلى كل قناة بنفس السرعة. في المقابل ، عند استخدام التوجيه الحدودي ، تقوم ثلاث مضخات أو أكثر يتم التحكم فيها بشكل مستقل بدفع السوائل عبر القنوات. ومع ذلك ، تعمل كل مضخة بسرعة مختلفة ولكن معدل التدفق الصافي في القناة المشتركة ثابت12. هذا يسمح بالتبادل السريع لمكونات القناة الرئيسية ببساطة عن طريق تغيير سرعة المضخة.

بالإضافة إلى التدفق الصفحي ، هناك عامل حاسم آخر هو ملف تعريف سرعة القطع المكافئ داخل تيار السائل الرقائقي. تحدث أعلى سرعة تدفق في منتصف التيار ويحدث الأبطأ بجوار الأسطح (الشكل 2C)13. يجب اعتبار هذا المظهر الجانبي لتمديد جزيء الحمض النووي المرتبط بخرزة مثبتة في التيار بالكامل من أجل التصور الدقيق للحمض النووي الفلوري والتحليلات الدقيقة لجزيء واحد. هنا ، يمتد الحمض النووي إلى الشكل B ويتم تثبيته في مكانه تحت 0 pN من القوة. لتحقيق ذلك ، يجب أن يكون تركيز موضع المصيدة الضوئية على موضع 10-20 ميكرومتر من سطح الغطاء السفلي (الشكل 2D). يجب توخي الحذر حتى لا يمتد جزيء الحمض النووي إلى ما بعد الشكل B لأن هذا يمكن أن يمنع تفاعلات الإنزيم. في ظل ظروف المخزن المؤقت النموذجية ، 1 ميكرومتر = 3000 نقطة أساس من الحمض النووي14. علاوة على ذلك ، من خلال محاصرة 10-20 ميكرومتر من الغطاء ، يتم وضع مركب الحمض النووي بعيدا عن السطح وبالتالي تقليل التفاعلات السطحية.

تم استخدام العديد من الطرق لإنشاء قنوات جهاز الموائع الدقيقة ويمكن القيام بذلك في المختبر أو يمكن شراء خلايا التدفق من المصادر التجارية6،15،16،17. يجب أن تكون المواد المثلى المستخدمة لبناء خلايا التدفق صلبة ميكانيكيا ، وشفافة بصريا مع مضان منخفض ، وغير منفذة للمذيبات العضوية6. في كثير من الأحيان ، يتم استخدام الزجاج المصقول البورسليكات ، أو السيليكا المنصهرة لتوفير بيئة تدفق مستقرة لفترة طويلة مناسبة للاصطياد البصري والتصور واكتشاف القوة. تسمح هذه المواد أيضا باستخدام المذيبات غير المائية (على سبيل المثال ، الميثانول من الدرجة الطيفية) لتبسيط ترطيب السطح وإزالة فقاعات الهواء ، والمواد المسخة (على سبيل المثال ، 6M guanidinium hydrochloride) أو المنظفات لتنظيف خلية التدفق. أخيرا ، تختلف الطرق المستخدمة لإدخال السوائل في خلايا التدفق من أنظمة مضخات التفريغ المعقدة إلى مضخات المحاقن المفردة 14،18،19،20،21،22،23،24،25،26،27. في النهج الموضح هنا ، يتم استخدام مضخة حقنة يمكنها استيعاب ما يصل إلى 10 محاقن (الشكل 3 أ). يوفر هذا المرونة لاستخدام خلايا التدفق أحادية القناة أو خلايا التدفق ذات قنوات مدخل متعددة. هنا ، يتم استخدام خلية تدفق ثلاثية القنوات ويتم تزاوجها مع المحاقن المثبتة في مكانها على مضخة المحقنة باستخدام أنابيب poly-ether-ether-ketone (PEEK) (الشكل 3A-C). يتم التحكم في تدفق السوائل بواسطة صمامات تبديل رباعية الاتجاهات وبالتالي تعمل على تقليل إدخال الفقاعات في خلية التدفق (الشكل 3 أ ، د). بالإضافة إلى ذلك ، يوصى باستخدام محاقن هاملتون محكمة الغاز التي لها جدران زجاجية صلبة وغطاسات مطلية بالبولي تترافلوروإيثيلين (PTFE) ، لأنها توفر حركة مكبس سلسة بشكل استثنائي ضرورية للحصول على تدفق سلس14,27.

في النظام التجريبي الموصوف ، تم استخدام خلايا التدفق مع قناتين إلى خمس قنات. يتم تحديد عدد قنوات المدخل من خلال التجربة التي يتم إجراؤها. لدراسة RecBCD و Hop2-Mnd1 ، كانت قناتان دفق كافية14,28. بالنسبة إلى اللولب ، كان الإنزيم مرتبطا بالطرف الحر من الحمض النووي وترجم إلى تيار يحتوي على المغنيسيوم و ATP لبدء النقل والتفكيك. بالنسبة إلى Hop2-Mnd1 ، تمت ترجمة الحمض النووي المحاصر بصريا إلى تيار السائل المجاور الذي يحتوي على البروتينات والمخزن المؤقت ± أيونات المعادن ثنائية التكافؤ. يتيح استخدام خلايا التدفق ثلاثية القنوات للمرء حبس الحمض النووي في التيار 1 ، وترجمة الحمض النووي إلى التيار 2 للسماح بحدوث ارتباط البروتين ، ثم التدفق 3 حيث يوجد ATP ، على سبيل المثال ، لبدء التفاعلات. الاختلاف في ما سبق هو استخدام البروتين الموسوم بالفلورسنت في القناة 2 ، مما يؤدي إلى أن يكون تيار السائل أبيض تماما ويمنع تصور الحمض النووي. عندما يترجم هذا الجزيء إلى تيار 3 ، يكون كل من البروتينات والحمض النووي مرئيا الآن عند بدء التفاعلات.

يعد استخدام صمامات التبديل رباعية الاتجاهات للتحكم في تدفق السوائل مكونا مهما في النظام للقضاء على الفقاعات في خلايا التدفق. الفقاعات ضارة بتدفق السوائل المستقر لأنها تتقلص وتتوسع بطرق غير متوقعة مما يؤدي إلى تغيرات سريعة في سرعة التدفق وإدخال الاضطراب. عندما يتم وضع الصمامات بين المحاقن وأنابيب المدخل ، يتم فصل مسار التدفق عن طريق تبديل موضع الصمام عند تغيير المحاقن. عندما يتم وضع المحقنة الجديدة في مكانها ، يمكن الضغط على المكبس يدويا بحيث يتم إخراج >6 ميكرولتر (الحجم الميت للصمام) وهذا يزيل الفقاعات بالكامل تقريبا.

غالبا ما يكون ربط الموصلات بخلايا التدفق هو خطوة تحديد المعدل في استخدام خلايا التدفق. وصفنا استخدام نوعين من الموصلات: قابلة للإزالة تعرف باسم press-fit وأخرى دائمة (تجميعات nanoport). الموصلات القابلة للإزالة سهلة الالتصاق بخلية التدفق ويمكن اختبار أنواع مختلفة من الأنابيب المرنة بالإضافة إلى PTFE الموصى بها باستخدام هذه الموصلات. هذه طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لاختبار الأنابيب والموصلات دون التضحية بخلايا تدفق الزجاج الأكثر تكلفة. في المقابل ، يتم إرفاق مجموعات المنافذ النانوية بشكل دائم ، وتتحمل ضغوطا تصل إلى 1000 رطل / بوصة مربعة ، وفي أيدينا ، يقتصر استخدامها على أنابيب PEEK بأقطار مختلفة. هذا ليس عيبا حيث يفضل استخدام أنابيب PEEK. يمكن إعادة استخدام خلية تدفق زجاجية واحدة مع تجميعات دائمة مرفقة لأكثر من 1 سنة مع الاستخدام الدقيق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. محاذاة مصيدة الليزر واختبارها باستخدام حبات البوليسترين

ملاحظة: للإعداد ، راجع الشكل 1 أ ، ب.

تنبيه: يجب على القائم بالتجربة ارتداء نظارات واقية مناسبة أو نظارات أمان بالليزر أثناء محاذاة شعاع الليزر. نظرا لأن نظام الملقط البصري الموصوف هنا يستخدم كلا من حزم HeNe و IR ، يلزم وجود مجموعتين منفصلتين من الأواني الزجاجية الآمنة بالليزر.

  1. محاذاة شعاع HeNe
    1. ضع جميع المكونات البصرية على اللوح. قم بمحاذاة اللوح بحيث يكون قريبا من زاوية 90 درجة قدر الإمكان بالنسبة إلى المجهر.
    2. قم بتوصيل أنبوب التزاوج الذي يحتوي على الهدف وعدسة telan بالمجهر (الشكل 1A-11،12).
      ملاحظة: عدسة telan هي نظام عدسة يستخدم لتركيز الصورة على مستوى الصورة المتوسط في العدسات.
    3. قم بتشغيل ليزر HeNe وافتح الغالق (الشكل 1A-18). يجب أن يضرب الشعاع المرشح (الشكل 1A-3) على ارتفاع 54 مم يعكس 50٪ من الضوء على المرآة 5 (الشكل 1A-5). تصطدم نسبة 50٪ المتبقية من الحزمة بالمرآة 4 (الشكل 1A-4) بنفس ارتفاع المرآة 3.
    4. اضبط المرآة 4 (الشكل 1A-4) بحيث تصطدم الحزمة بالمرآة 6 (الشكل 1A-6) على ارتفاع 51 مم.
    5. اضبط المرآة 6 (الشكل 1A-6) بحيث يتم توجيه الحزمة إلى المرآة الجلفانية السفلية على ارتفاع 51 مم. سيكون الشعاع الذي يخرج من المرآة الجلفانية العلوية عند 57.5 مم.
    6. اضبط المرآة 3 (الشكل 1A-3) بحيث يضرب هذا الشعاع المرآة 5 (الشكل 1A-5) على ارتفاع 57.5 مم. بمجرد انعكاس المرآة 5 ، يجب أن تضرب الحزمة المرآة 9 (الشكل 1A-9) بنفس الارتفاع. يتم إعادة تجميع الحزمة بشكل فعال في المرآة 9 ، ويمر عبر الهدف ، ونظام عدسة telan على المرآة 21 (الشكل 1A-21) ، مما يعكسه في الهدف.
    7. ضع شريحة مجهر نظيفة على مرحلة المجهر. قم بتشغيل الكاميرا وتصوير حزم الحزم الثابتة والمسح الضوئي بشكل فردي على الشاشة. بدءا من المرآة 3 ، ثم 5 و 9 ، وأخيرا 21 ، قم بإجراء تعديلات صغيرة لوضع الحزمة الثابتة في وسط الشاشة.
    8. للتأكد من أن زاوية خروج الشعاع من المرآة 21 هي 90 درجة ، قم بتغيير ارتفاع Z للمجهر وضع الحزمة المصورة على الأسطح العلوية والسفلية للشريحة. عندما تكون متطابقة ، تكون الحزمة في الموضع الصحيح ، وهو عمودي على المرحلة. قم بإغلاق هذا الشعاع باستخدام الغالق 19 (الشكل 1A-19).
    9. بدءا من المرايا 4 و 6 ، قم بإجراء تعديلات صغيرة لوضع الشعاع الثابت في وسط الشاشة. مصراع هذا الشعاع.
  2. محاذاة شعاع الأشعة تحت الحمراء (IR)
    تنبيه: نفذ جميع الخطوات بطاقة ليزر منخفضة لأسباب تتعلق بالسلامة.
    1. اضبط لوحة الموجة 14 (الشكل 1A-14) لضبط نسبة الحزم المرسلة والمنعكسة التي يتم تقسيمها عند مقسم الحزمة 2 (الشكل 1A-2). يعكس مقسم الشعاع 2 المكون s لشعاع الليزر وينقل المكون p.
    2. تصطدم الحزمة التي تمر عبر 2 بالمرآة 7 (الشكل 1A-7) ، والتي تنحرف الحزمة إلى المرآة الجلفانية السفلية. يجب أن يتبع مسار شعاع HeNe على المرآة 21. أداء حركات صغيرة من مرآة 7 لتحقيق هذا الوضع.
    3. اضبط المرآة 2 بحيث يضرب الشعاع الذي تنعكس بواسطة المرآة 2 المرآة 10 (الشكل 1A-10) على ارتفاع 57.5 مم.
    4. ينعكس الشعاع من المرآة 10 إلى المرآة 8 (الشكل 1A-8) على ارتفاع 57.5 مم. يجب أن يضرب الشعاع اللاحق المرآة 9 بنفس الارتفاع. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بإجراء تعديلات صغيرة على المرايا 10 و 8 حسب الحاجة.
    5. قم بإزالة الهدف ووضع رأس عداد الطاقة فوق المنفذ في برج الهدف.
    6. استخدم اللوحات 14 و 15 و 16 (الشكل 1A-14،15،16) لضبط قوة كل شعاع ليزر بحيث تكون متساوية كما هو موضح في الشكل 1C.
    7. ضع موسع الشعاع 1 (الشكل 1A-1) في مكانه. اضبط شعاع الليزر الموسع ليكون دائريا دون أي غيبوبة أو استجماتيزم.
    8. لاختبار الفخاخ البصرية ، اصنع محلولا من حبات البوليسترين 1 ميكرومتر معلقة في الماء. بعد ذلك ، ضع 10 ميكرولتر من هذا المحلول على شريحة مجهر ، ضع غطاء في الأعلى وأغلقه بطلاء الأظافر. ضع الشريحة على مرحلة المجهر واختبر الفخاخ الضوئية عن طريق محاصرة هذه الخرز 1 ميكرومتر. تأكد من امتصاص الخرز في الفخاخ وتثبيته بثبات عند تحريك المسرح. يجب أن يحدث الاصطياد بكفاءة متساوية من جميع جوانب المصيدة.

2. إعداد غرفة الموائع الدقيقة

  1. إذا كانت خلية التدفق عبارة عن جهاز تم إنشاؤه تجاريا مصنوع من polydimethylsiloxane (PDMS) على قسيمة غطاء ، فانتقل إلى الخطوة 3. إذا كان جهازا زجاجيا به موصلات متصلة ، فانتقل إلى الخطوة 4.
  2. إذا لم تكن خلية التدفق تحتوي على موصلات متصلة ، فقم بربطها بفتحات الدخول الموجودة على شريحة المجهر أولا. راجع الخطوة 3 لمعرفة خطوات توصيل الموصلات.

3. اتصالات خلية التدفق باستخدام خلية تدفق PDMS

ملاحظة: للإعداد ، راجع الشكل 2D.

  1. ضع خلية التدفق على سطح مستو نظيف. امسك أنبوب PTFE 3 مم من الطرف الحر بالملقط. ادفع الأنبوب إلى المنفذ المشكل مسبقا (يمكن أن يدعم المنفذ ضغط خط 2 بار).
  2. كرر هذا الإجراء لكل منفذ من المنافذ المتبقية. قم بتوصيل منافذ المدخل بمضخة المحقنة والمخرج بزجاجة نفايات (الشكل 4 أ ، ب).
  3. املأ كل حقنة زجاجية ب 1 مل من الميثانول من الدرجة الطيفية. قم بتوصيل كل حقنة بصمام التبديل. تأكد من أن الصمام يحتوي على مخرج موجه للنفايات وتطهير كل خط ب 50 ميكرولتر من الميثانول (الشكل 4C ، الوضع المغلق).
  4. قم بتبديل موضع المخرج إلى خلية التدفق (الشكل 4C ، الوضع المفتوح). ضخ 800 ميكرولتر من الميثانول عبر خلية التدفق بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / ساعة لتبليل الأسطح والقضاء على الفقاعات.
  5. في اليوم التالي ، كرر هذه العملية باستخدام 800 ميكرولتر من الماء عالي النقاء. خلية التدفق جاهزة الآن للاستخدام.

4. إرفاق موصلات أنابيب الصحافة المناسبة

ملاحظة: للإعداد ، راجع الشكل 2F.

  1. إذا كان سيتم استخدام موصلات أنابيب مناسبة للضغط ، فقم بإزالة الشريط اللاصق بعناية من جانب واحد من الموصل وضعه فوق الفتحة الموجودة في شريحة المجهر. اضغط لأسفل لبضع ثوان. كرر العملية للموصلات المتبقية.
  2. ضع خلية التدفق على سطح مستو نظيف. امسك أنبوب PTFE 3 مم من الطرف الحر بالملقط. ادفع الأنبوب إلى الفتحة المشكلة مسبقا في المنفذ وكرر هذا الإجراء لكل منفذ من المنافذ المتبقية.
  3. قم بتوصيل الأنابيب من المداخل بصمامات التبديل. انتقل إلى الخطوة 7.

5. إرفاق الجمعيات الدائمة

ملاحظة: للإعداد ، راجع الشكل 2A-C.

  1. قم بإجراء المرفق إما على سطح نظيف ومسطح أو على مشعب مصمم خصيصا لتثبيت خلية التدفق والموصلات في مكانها أثناء حدوث الترابط.
  2. ضع خلية التدفق على سطح مستو نظيف أو في القسم الغائر من المشعب (الشكل 2 ب). ضع كمية صغيرة من الغراء الزجاجي في الجزء السفلي من المجموعة وأدخل الختم.
  3. ضع المنفذ النانوي فوق أحد فتحات الدخول على شريحة المجهر. ادفع برفق لأسفل وثبت في مكانه بدون حركة جانبية. كرر العملية للمنافذ المتبقية.
  4. السماح ليجف أو المشبك في مكانه في المشعب. قم بإزالة خلية التدفق برفق من المشعب وتأكد من محاذاة التجميعات جيدا مع منافذ الدخول في خلية التدفق. انتقل إلى الخطوة 7 عندما تكون جاهزا.

6. اتصالات خلية التدفق والتحضير

ملاحظة: للإعداد ، راجع الشكل 4 أ ، ب.

  1. ضع خلية تدفق على مرحلة المجهر. قم بتوصيل الأنبوب باستخدام الموصلات الضيقة للإصبع.
  2. املأ كل حقنة زجاجية ب 1 مل من الميثانول من الدرجة الطيفية. قم بتوصيل كل حقنة بصمام التبديل. تأكد من أن الصمام يحتوي على مخرج موجه للنفايات وتطهير كل خط ب 50 ميكرولتر من الميثانول (الشكل 4C ، الوضع المغلق).
  3. قم بتبديل موضع المخرج إلى خلية التدفق (الشكل 4C ، الوضع المفتوح). ضخ 800 ميكرولتر من الميثانول عبر خلية التدفق بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / ساعة لتبليل الأسطح والقضاء على الفقاعات.
  4. في اليوم التالي ، كرر هذه العملية باستخدام 800 ميكرولتر من الماء عالي النقاء. خلية التدفق جاهزة الآن للاستخدام.

7. التحكم في تدفق السوائل

  1. أدر صمامات التبديل إلى الوضع المغلق (الشكل 4 ج). إزالة المحاقن ، والتخلص من المياه المتبقية ، وملء المحاقن مع حلول تجريبية ، على سبيل المثال ، حبات الحمض النووي ؛ انزيم; و ATP. أعد المحاقن إلى المضخة وقم بتوصيلها بصمامات التبديل.
  2. في هذا الوضع ، قم بإجبار الغطاسات يدويا على خفض 5-10 ميكرولتر لإزالة أي فقاعات. قم بتغيير موضع صمام التبديل إلى فتح.
  3. استخدم مخطط معدل التدفق لتحقيق سرعة تدفق السوائل المثلى للملائمة والتصور كما هو موضح في الجدول 1. يجب أن يتيح التدفق الأمثل للسوائل للاصطياد البصري الاصطياد المستقر للخرز وبمجرد تمدد الحمض النووي ، يجب أن يكون على شكل B (~ 3000 bp / μm).

8. محاصرة حبات البوليسترين مع جزيئات الحمض النووي المفردة المرفقة

  1. عند التكبير 10x ، حدد موقع الحد الفاصل بين تيارات السوائل بالقرب من نقاط دخول القناة. أضف الزيت إلى هدف 100x وانتقل إلى التكبير الأعلى.
  2. افتح مصاريع الفخاخ الضوئية (إما كلاهما أو واحد في كل مرة). يجب أن تحبس أشعة الليزر المركزة الخرز ويجب أن يمتد الحمض النووي على الفور.
  3. بمجرد محاصرة المجمع ، قم بترجمة المرحلة بشكل عمودي على التدفق (الشكل 3A ، C ، أقحم). سيؤدي ذلك إلى نقل المركب المحاصر من محلول حبة الحمض النووي إلى التيار 2. مزيد من الترجمة ستنقل المجمع إلى تيار 3.

9. تنظيف خلايا التدفق

ملاحظة: نفذ هذا يوميا.

  1. قم بإيقاف تشغيل المضخة عند اكتمال التجربة. أدر صمامات التبديل إلى الوضع المغلق (الشكل 4 ج).
  2. إزالة المحاقن وتفريغها. شطف ثلاث مرات بالماء المقطر المصفى.
  3. املأ المحاقن بمحلول التنظيف. ضع المحاقن في المضخة وقم بتوصيلها بصمامات التبديل.
  4. تطهير صمامات التبديل وتغيير الموقف لفتح. ضخ 800 ميكرولتر من محلول التنظيف بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / ساعة عادة بين عشية وضحاها.
  5. في اليوم التالي ، أغلق صمامات التبديل ، ثم قم بإزالة المحاقن وشطفها بالماء. شطف خلية التدفق والخطوط مع 4-800 ميكرولتر من الماء بمعدل تدفق 400-800 ميكرولتر / ساعة. إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من التنظيف الشاق لخلايا التدفق ، فاستبدل محلول التنظيف ب 6 M guanidium hydrochloride.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم إجراء الاختبار الأولي لمحاذاة المصيدة وقوتها باستخدام حبات البوليسترين غير الفلورية 1 ميكرومتر. نظرا لأن معظم الأبحاث التي أجريت في المختبر تستخدم مضان ، فإننا نختبر قوة المصيدة باستخدام 1 ميكرومتر ، حبات البوليسترين الخضراء التنين (الشكل 1D ، E). بعد ذلك يتغير العمل إلى الاصطياد البصري لمجمعات خرزة الحمض النووي حيث يتم تلطيخ الحمض النووي بصبغة ثنائية الإقحام YOYO-114,29. عندما يتم احتجاز هذه المجمعات 10-15 ميكرومتر فوق سطح الغطاء في خلية تدفق الموائع الدقيقة ، فإن تدفق السوائل عبر الخرزة يمتد الحمض النووي (الأشكال 3B ، C). من المهم قياس طول الحمض النووي الممتد بالسائل للتأكد من شده إلى طوله على شكل B ، وهو الطول المتوقع. على سبيل المثال ، بالنسبة للبكتيريا لامدا الحمض النووي ، يكون الطول الكامل أطول قليلا من 16 ميكرومتر ، وهو ما يعادل 48504 نقطة أساس14.

لتوصيف تدفق السوائل ، تم إدخال حبات الفلورسنت في خلايا التدفق بارتفاع تركيز يبلغ 15 ميكرومتر فوق سطح انزلاق الغطاء باستخدام سرعات مضخة مختلفة وفي محاليل ذات لزوجة مختلفة. تم التقاط أفلام موضع الخرزة ، وتم تتبع موضع الخرزة باستخدام برنامج تحليل الصور. أظهرت النتائج أنه بالنسبة للخرزات التي يبلغ قطرها 1 ميكرومتر ، يمكن تتبع السرعة الخطية بدقة بمعدل تدفق مضخة يبلغ 100 ميكرولتر / ساعة في محاليل السكروز التي تتراوح من 10٪ إلى 50٪ (الشكل 5 أ). في ظل ظروف مماثلة ، يمكن حساب القوة على الخرزة ووجد أنها تتراوح من 10 إلى 400 pN ، اعتمادا على معدل تدفق المضخة ولزوجة المحلول (الشكل 5B). أخيرا ، تم تقييم تأثير قطر حبة يتراوح من 120 إلى 970 نانومتر على القوة في تركيزات مختلفة من السكروز. تكشف البيانات أن القوى التي تتراوح من 1-27 pN يمكن قياسها عن طريق ربط حبات ذات قطر مختلف ببروتين المحرك ومطالبة المحرك بسحب تلك الخرزة ضد تدفق السوائل (الشكل 5C).

Figure 1
الشكل 1: التخطيط البصري وعرض نشاط الملائمة. (أ) رسم تخطيطي للتخطيط البصري مع شعاع الأشعة تحت الحمراء باللون الأحمر وشعاع HeNe باللون الأسود. (ب) صورة فوتوغرافية لمكونات بصرية مثبتة على لوح تجارب. الأرقام المكونة في اللوحتين A و B هي كما يلي: 1) ، موسع الشعاع ؛ 2) ، مرآة التداخل (Rsmax = 1064 nm ؛ Tpmax = 1064 نانومتر) ؛ 3) ، مرايا التداخل (633 نانومتر ؛ R = 50٪ ؛ ر = 50٪) ؛ 4-6) ، مرايا التداخل (Rmax = 633 نانومتر) ؛ 7) ، مرآة التداخل (Rmax = 1064 نانومتر ؛ Tmax = 633 نانومتر) ؛ 8) ، مرآة التداخل (Rsmax = 1064 nm ؛ Tp max = 1064 نانومتر ، Tmax = 633 نانومتر) ؛ 9) ، مرآة التداخل (Rmax = 1064 نانومتر ، 633 نانومتر ؛ Tmax = 1064 نانومتر ، 633 نانومتر) ؛ 10) ، مرآة التداخل (Rmax = 1064 نانومتر) ؛ 11) ، عدسة موضوعية ، f = 110 نانومتر ؛ 12) ، عدسة تيلان ؛ 13) ، المرايا الكلفانية. 14-16) ، الدوارات (/ 2) ؛ 17) ، مصراع قناة المسح الضوئي بالأشعة تحت الحمراء ؛ 18) ، مصراع القناة المرئية ؛ 19) ، مصراع قناة IR الثابتة ؛ 20) ، توقف الشعاع و 21) ، مرآة التداخل (Rmax = 1064 نانومتر ؛ Tكحد أقصى = 633 نانومتر). (ج) قياس خرج الطاقة. يتم قياس خرج الطاقة من الليزر قبل تثبيت رأس الليزر في التخطيط البصري. بمجرد الانتهاء من محاذاة المصيدة، يتم قياس قدرة الحزمة بعد هدف 100x لكل مصيدة. (د) و(ه) صور توضح الاصطياد البصري المستقر لخرزات فلورية مقدارها 1 ميكرومتر. F ، المصيدة الثابتة و M ، المصيدة المتنقلة مع المصيدة المتنقلة في وضع المسح تتحرك عبر دائرة صغيرة (D) أو كبيرة (E) عند 30 ميجاهرتز. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: خلايا تدفق الموائع الدقيقة. أ: تجميع خلية تدفق ثلاثية القنوات مصنوعة من زجاج البورسليكات. (ب) مشعب لوضع خلايا التدفق بثبات أثناء ربط الموصل. أعلى ، قاعدة مشعب الألومنيوم مع قسم غائر 1 مم لوضع خلية التدفق بشكل جانبي. توجه الأعمدة الأربعة (واحدة في كل زاوية) غطاء المشعب إلى موضعه ، بينما يتم استخدام البراغي الملولبة الموضوعة بشكل مركزي لتثبيت الغطاء في مكانه. غطاء سفلي مشعب مع ثقوب محفورة لتتناسب مع الأعمدة والمسامير الموجودة على قاعدة المشعب. (1) ، الصواميل التي تعلق على مسامير القاعدة المتشعبة ؛ (2) نوابض توضع بين الصواميل والغطاء المشعب لتوفير توتر خفيف أثناء عملية الترابط. (ج) منظر عن قرب لتقارب قنوات المدخل في تيار سائل واحد مشترك في خلية تدفق زجاجية مع موصلات متصلة بالفعل. يتم وضع ربع بجوار خلية التدفق كمرجع. د: صورة لخلية تدفق PDMS. يبلغ سمك طبقات PDMS 3 مم. (ه) خلية تدفق السيليكا المنصهرة مع موصلات luer. (F) خلية تدفق زجاجية من البورسليكات مع موصلات ملائمة للضغط في مكانها. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: خصائص سريان السوائل عبر خلية تدفق زجاجية. (أ) تدفق السائل داخل خلية السريان رقائقي. يوضح الرسم التخطيطي خلية التدفق من الأعلى لإثبات أن الانتشار بين القنوات هو المصدر الرئيسي للخلط بين تيارات السوائل المجاورة. يشار إلى اتجاه التدفق بأسهم زرقاء والتدفقات الفردية ملونة باللون الأبيض والرمادي الفاتح والأبيض. يشار إلى المناطق المتسعة للانتشار العرضي بين القنوات باللون الأحمر. يظهر الجزء الداخلي صورة مضان لتيارات السوائل المجاورة عند تكبير 10x مع مجمعات خرزة الحمض النووي الموسومة بالفلورسنت في التيار السفلي والمخزن المؤقت فقط في التيار العلوي. البقع البيضاء في التيار العلوي هي ضوضاء لقطة من كاميرا CCD. (ب) نمط السريان (أرجواني فاتح) في خلايا السريان الصفحي مكافئ. يتم عرض خلية التدفق من الجانب ويشار إلى اتجاه التدفق فوق كل خلية. تحدث أسرع سرعات السوائل في خلية التدفق الموجودة في المركز بينما تحدث أبطأ سرعات السوائل بجوار أسطح خلايا التدفق. وبالتالي ، بالنسبة لمجمع حبة الحمض النووي المحاصر بصريا الموجود في مركز خلية التدفق ، فإن تدفق السائل يمد جزيء الحمض النووي للبكتيريا λ (48,504 bp) إلى 16 ميكرومتر (شكل B) بحيث يمكن عمل تصور واضح (الصورة اليسرى). في المقابل ، فإن نفس الجزيء الموجود بالقرب من سطح خلية التدفق يعاني من معدلات تدفق منخفضة ولا يمكن تمديده. (ج) يوضع مركب حبة DNA واحد داخل خلية السريان. يمكن استخدام خلايا تدفق عمق مختلفة ، ولكن في كل حالة ، يمكن ضبط محاذاة الحزمة بحيث يحدث الاصطياد الأمثل 10-20 ميكرومتر فوق سطح الغطاء ، مما يلغي التأثيرات السطحية وله تدفق مستقر بحيث يمكن تمديد جزيئات الحمض النووي إلى شكل B. كما هو موضح في الصورة اليسرى في (ج) ، يتم تمديد الحمض النووي لتمكين التصور الواضح. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: التحكم في التدفق والتفاعل للحمض النووي المحبوس بصريا داخل خلية السريان في مرحلة المجهر. أ: تزاوج خلية السريان مع مضخة حقنة. يتم تقديم صورة لخلية تدفق ثلاثية القنوات متصلة بمضخة حقنة عبر صمامات تبديل ثلاثية الاتجاهات. يتم تثبيت خلية التدفق في مكانها على مرحلة آلية في مجهر مقلوب. يتم توصيل خلية التدفق بخط نفايات (يسار) وصمامات تبديل (دائرة سماوية متقطعة) عبر أنبوب برتقالي 500 ميكرومتر (يشار إليه بشريط أخضر). يتم تثبيت الصمامات بثبات على مشعب مصمم خصيصا يتكيف مع جهاز مضخة المحاقن ، والذي يضم محاقن محكمة الغلق سعة 1 مل (الأسهم الصفراء تحدد الغطاسات). تستخدم خطوط النفايات لإزالة فقاعات الهواء التي يمكن أن تكون محاصرة في صمام التبديل أثناء تغيير الحقن. (ب) منظر عن قرب لخلية السريان ثلاثية القنوات. لتسهيل تصور تيارات السوائل ، تم تلوين الأجزاء الخارجية بألوان الطعام مع احتواء التيار المركزي على الماء فقط. تشير المنطقة المكبرة إلى كيفية ترجمة مركب جزيء bead-DNA المحاصر بصريا من تيار سائل إلى آخر (السهم الأزرق) عن طريق ترجمة المرحلة بشكل عمودي على التدفق (السهم الأسود). (ج) مخططات صمامات التبديل ثلاثية الاتجاهات التي تشير إلى مواقعها التشغيلية. تتوافق تسميات الحروف F و S و W مع مائع الاتجاه ويمكن أن تتدفق إلى خلية التدفق والمحقنة والنفايات ، على التوالي. يتم إغلاق منفذ واحد بشكل دائم كما هو موضح بواسطة القابس الأسود أعلى كل مخطط. في الوضع المفتوح أو التشغيلي (اللوحة اليسرى) ، يمر تدفق السوائل مباشرة عبر صمام التبديل من المحقنة (S) إلى خلية التدفق (F). في الوضع المغلق (اللوحة اليمنى) ، يتم تشغيل القرص بحيث يتم إغلاق خلية التدفق من البيئة. في هذا الوضع ، يتم توجيه التدفق إلى النفايات ويمكن تبديل المحاقن دون إدخال فقاعات هواء في خلية التدفق. نظرا لأن الصمامات لها حجم ميت يبلغ 6 ميكرولتر ، يتم إهدار القليل جدا من المحلول عند تطهير الخطوط قبل العودة إلى التكوين المفتوح. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: تتأثر حركة الخرزة والقوة المعاكسة بتدفق السوائل. (أ) تتأثر سرعة الخرزة الخطية بسرعة المضخة وتركيز السكروز. (ب) تتأثر القوة المعارضة المؤثرة على الخرزة بلزوجة المحلول. (ج) يؤثر قطر الخرزة على القوة المؤثرة على الخرز تحت السريان. في جميع التجارب ، تم استخدام حبات الفلورسنت (التنين الأخضر). في (A) و (B) ، تم استخدام حبات قطرها 0.97 ميكرومتر وفي (C) ، تم استخدام حبات ذات أقطار مختلفة. صنعت محاليل السكروز في ماء فائق النقاء، وتمت تصفيتها من خلال مرشحات 0.2 ميكرومتر وقياس معامل الانكسار باستخدام مقياس إنكسار محمول باليد، مع تحديد اللزوجة بالسنتيبواز باستخدام جداول ISCO وأخيرا تحويلها إلى وحدات SI في mPa.s. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

معدل التدفق (ميكرولتر / ساعة) ب الوقت لكل خطوة (دقيقة) الحجم الموزع (ميكرولتر)
800 5 67
400 5 33
200 5 17
100 5 8
50 5 4
25 5 2
15 5 أو أكثر 1 أو أكثر
a. هذه هي معدلات تدفق السوائل المحسوبة بواسطة برنامج مضخة المحاقن وهي فريدة لكل قطر حقنة مستخدم. تتيح معدلات التدفق الملء السريع للخطوط وغرفة التدفق (800 ميكرولتر / ساعة) ، يليها انخفاض تدريجي في معدل التدفق المثالي للمحاصرة والتصور
b. يمكن التحكم في مضخة المحقنة من لوحة المفاتيح أو باستخدام برنامج يوفره البائع.

الجدول 1: معدلات تدفق السوائل لتقليل الفقاعات وتحقيق محاصرة مستقرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعد التجميع الدقيق لنظام التدفق أمرا بالغ الأهمية لنجاح نتائج التجارب 4,6. أحد أكثر جوانب البروتوكول تحديا هو ربط الموصلات بالسطح الزجاجي. لهذا ، نستخدم النهجين التاليين: موصلات الأنابيب المناسبة للضغط وتجميعات المنافذ النانوية. تلتصق الموصلات المناسبة للضغط بسهولة بالزجاج متبوعة بدفع أنابيب PTFE إلى الثقوب المشكلة مسبقا باستخدام الملقط. عندما تكون هناك حاجة إلى مرفق أكثر استقرارا ، يفضل ربط تجميعات المنافذ النانوية. مع الاستخدام الدقيق والتنظيف ، يمكن استخدام خلية تدفق زجاجية واحدة مع تجميعات دائمة لأكثر من 1 سنة. إذا كانت خلايا التدفق بحاجة إلى التبديل بشكل متكرر ، فيمكن استخدام خلايا تدفق PDMS لأنها بديل ممتاز وأرخص. يمكن إعادة استخدامها ولكن PDMS عرضة للتورم ، مما قد يغير سلوك تدفق السوائل بمرور الوقت.

كل من خلايا التدفق الزجاجية و PDMS ليست غير قابلة للتدمير. في المختبر ، الحد الأقصى لمعدل التدفق المستخدم هو 800 ميكرولتر / ساعة. إذا تم تجاوز هذا يوميا و / أو لفترات طويلة من الوقت ، يمكن أن يحدث تزييف خلايا التدفق (خلايا التدفق الزجاجي) وتشويه PDMS. في حين أن إجراء الترطيب الأولي بالميثانول والماء يستغرق وقتا ، إلا أنه يستحق ذلك حيث يتم التخلص من جميع الفقاعات ، ويمكن أيضا اكتشاف التسريبات في الموصلات. توفر خلايا التدفق الموصوفة هنا المرونة للتجارب التي يتم إجراؤها. باستخدام هذه الأساليب لخلايا التدفق المختلفة والأنابيب وربط الموصلات المختلفة ، يمكن تكييف الظروف التجريبية بسهولة وتحسينها بسرعة لضمان الحصول على البيانات المثلى. يتم تقديم خلايا تدفق القناة على شكل حرف Y ولكن تتوفر مجموعة كبيرة من تصميمات أجهزة الموائع الدقيقة من شركات متعددة بدون موصلات متصلة بها. وهذا يوفر للباحث مرونة أكبر في التصميم التجريبي.

يعد استخدام صمامات التبديل رباعية الاتجاهات طريقة بسيطة وفعالة تضمن أنه بمجرد تجميع نظام التدفق واختباره ، يصبح بيئة مغلقة بشكل فعال ، حيث يكون التلوث ضئيلا ، ويتم التخلص من الفقاعات. هذا الأخير مهم لأن الفقاعات تميل إلى الضغط وفك الضغط بشكل عشوائي أثناء التجربة وهذا يزعج تدفق السوائل مما يتسبب في تحرك جزيئات الحمض النووي المحاصرة بطرق غير متوقعة وحتى كسرها. يجب توخي الحذر الشديد لضمان منعها من التكون في النظام.

أخيرا ، تم تحسين النظام الموصوف هنا للكيمياء الحيوية المرئية حيث يمكن إجراء تحليل دقيق للحمض النووي أو الخرز المرتبط بالبروتينات أو البروتينات الموسومة بالفلورسنت. على الرغم من أن النظام غير مصمم لإجراء قياسات القوة باستخدام الفخاخ المزدوجة وإضافة أجهزة الكشف الضوئي الرباعية ، يمكن قياس القوى عن طريق ربط حبات ذات أقطار مختلفة ببروتينات محرك الحمض النووي ، على سبيل المثال ، ومطالبة المحرك بسحب هذه الخرزة ضد تدفق السوائل. من خلال تغيير لزوجة المحلول وتدفق السوائل وقطر الخرزة ، يمكن تطبيق مجموعة كبيرة من القوى المتعارضة لتوفير رؤية مفصلة لوظيفة البروتين الحركي (الشكل 5). هذه طريقة بسيطة وغير مكلفة لقياس القوى المرتبطة بالمعاملات البيولوجية ، لكنها تفتقر إلى الدقة المرتبطة بالنهج الأكثر حساسية. عندما يتم الجمع بين النهج البيوكيميائي البصري وطرق الكشف عن القوة الحساسة ، يمكن توفير صور أكثر اكتمالا للتفاعلات الكيميائية الحيوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلف عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يتم دعم البحث في مختبر بيانكو من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة GM100156 و GM144414 إلى PRB

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x objective Leica 506318 or 506038 Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging
10X Objective Leica 506263 Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell
1 mm fluorescent beads Bangs Labs FSDG004 Used for tap performance, focal position determination
1 mm polystyrene beads Bangs Labs CPO1004 Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules
63x objective Leica 506081 Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens
Alignment laser Lumentum 1100 series 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics
Beam alignment camera Amscope MU303 A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position
Camera control and Image capture software Hamamatsu HCImage Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching
Camera; Orca flash 4 Hamamatsu c13440-20cu CCD camera for imaging of single-molecule experiments
C-mount for the beam alignment camera Spot imaging solutions DE50CMT Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment
C-mount for the Orca Flash 4 camera Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.
Cy5  fluorescence filter cube Semrock cy5-404a-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only
Fitc-Txred  fluorescence filter cube Semrock fitc/txred-2x-b-000 Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed
Fluidics tubing Grace Bio 46004 PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used
GFP fluorescence filter cube Semrock gfp-3035b-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only
Glass flow cells Translume Custom Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)
Glass glue Loctite 233841 Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells
Glass/PDMS sandwich flow cells CIDRA Precision services Custom design Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)
Hamilton Cleaning solution Hamilton 18311 Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully
Illumination system Sutter Instrument Lamda DG4 Discontinued so recommend Lambda 721
Illumination system Sutter Instrument Lamda DG4 Discontinued so recommend Lambda 721
Image analysis software Media cybernetics Image Pro Premiere Analysis of images and single molecule tracking
Image analysis software Fiji/NIH Image/Image J Shareware Analysis of images and single molecule tracking
Image display card Melles Griot 06 DLA 001 Alternate product from Thorlabs: VRC5
Immersion oil Zeiss 444960 Immersol 518 F fluorescence free
Laser beam alignment tools Thor labs FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1  Used to ensure beams are horizontal and at the correct height
Laser beam viewer Canadian Photonics labs IR 3150 Used to image IR beam spots on mirrors and  targets
Laser power meter Thor labs Measurement of laser output as well as trap strength
Laser safety glasses (HeNe) Thor labs LG7 or 8 Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm
Laser safety glasses (IR) Thor labs LG11 Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm
Mcherry  fluorescence filter cube Semrock mcherry-a-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only
Microscope Leica DMIRE2 DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror
Microscope control software  UCSF/shareware uManager Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control
Nanoport assembly IDEX N333 Connectors that are bonded to flow cells
Optical table support Thor Labs PA52502 Active isolation table support
Optics and lenses Solar TII Various Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system
PDMS flow cells ufluidix Custom Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)
PEEK tubing IDEX 1532 Provides excellent connection to flow cells and switching valves
Pinkel fluorescence filter cube Semrock lf488/543/635-3x-a-000 Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly
Press fit tubing connectors GraceBio 46003 Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass
Scanning mirrors GSI Lumonics VM500 Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific
Stage Leica
Stage micrometer Electron Microscopy Sciences 68042-08 Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration
Switching valves IDEX V-101T Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells
Syringe and valve manifold Machine shop None Custom built
Syringe pump Harvard Apparatus PHD 2000 Controls fluid flow through flow cells
Syringe pump software Harvard Apparatus 70-6000 Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow
Syringes Hamilton 81320 Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers
Table top Thor Labs T36H Optical table top or breadboard
Trapping laser Newport/Spectra Physics J-series; BL106C Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bianco, P. R., Lu, Y. Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).
  2. Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. 491 (2019).
  3. Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation. Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).
  4. Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
  5. Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. Watching individual proteins acting on single molecules of DNA. Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).
  6. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
  7. Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope. Cytometry. 14, 105-114 (1993).
  8. Vermeulen, K. C., Mameren, J. v Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors. Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704 (2006).
  9. Dufresne, E. R. Computer-generated holographic optical tweezers arrays. Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810 (2001).
  10. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).
  11. Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Applications of microfluidics in chemical biology. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (6), 584-591 (2006).
  12. Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).
  13. Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles. Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).
  14. Bianco, P. R., et al. Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules. Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).
  15. Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy. Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).
  16. Streets, A. M., Huang, Y. Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution. Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).
  17. Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies. Scientific Reports. 10 (1), 18069 (2020).
  18. Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).
  19. Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).
  20. Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
  21. Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).
  22. Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA. Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).
  23. Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament. Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).
  24. Merenda, F., et al. Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics. Proceeding of SPIE. Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G. , 6483 (2007).
  25. Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule. Science. 286 (5437), 120-123 (1999).
  26. Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions. Science Progress. 84, 267-290 (2001).
  27. Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
  28. Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange. Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).
  29. Rye, H. S., et al. Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 189 ،
استخدام الملقط البصري المزدوج والموائع الدقيقة للدراسات أحادية الجزيء
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bianco, P. R. Use of Dual Optical… More

Bianco, P. R. Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies. J. Vis. Exp. (189), e64023, doi:10.3791/64023 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter