Modelli ortotopici traslazionali di glioblastoma multiforme

Il glioblastoma (GBM; glioma di grado IV) è il tumore cerebrale più comune e maligno e le terapie attuali sono inefficaci, con una sopravvivenza mediana di 15 mesi¹. Modelli preclinici affidabili e accurati che rappresentano le complesse vie di segnalazione coinvolte nella crescita e nella patogenesi del tumore cerebrale sono essenziali per accelerare i progressi nella valutazione di nuovi regimi terapeutici per GBM. I modelli murini in cui le linee cellulari di tumore cerebrale umano sono impiantate per via sottocutanea in topi immunocompromessi non riflettono l'ambiente immunitario nativo dei tumori cerebrali, né possono essere utilizzati per valutare la capacità delle terapie di attraversare la barriera emato-encefalica². Idealmente, i modelli murini preclinici dovrebbero anche riprodurre fedelmente l'istopatologia GBM umana, incluso l'alto livello di invasività nel parenchima circostante³. Sebbene i modelli murini geneticamente modificati (GEM) sviluppino tumori nel contesto di un sistema immunitario intatto, sono spesso necessari schemi di allevamento complicati e i tumori possono svilupparsi lentamente e in modo incoerente⁴. I modelli di allotrapianto derivati da GEM sono più adatti per studi terapeutici preclinici, in cui sono necessarie grandi coorti di topi portatori di tumore in un lasso di tempo più breve.

In un precedente rapporto, abbiamo descritto un modello murino ortotopico GBM derivato direttamente dai tumori GEM. La tumorigenesi nel GEM è iniziata da eventi genetici in popolazioni cellulari (principalmente astrociti) che esprimono la proteina acida fibrillare gliale (GFAP), che provocano la progressione verso GBM. Questi TRP GEM ospitano un transgene TgGZT121 (T), che esprime T121 dopo l'esposizione alla Cre ricombinasi guidata da GFAP. L'espressione della proteina T121 determina la soppressione dell'attività della proteina Rb (Rb1, p107 e p103). La co-espressione di un transgene Cre guidato da GFAP (GFAP-CreERT2) mira all'espressione degli astrociti adulti dopo induzione con tamoxifene. I topi TRP ospitano anche un Kras mutante Cre-dipendente (Kras^G12D; R) allele, per rappresentare l'attivazione della via del recettore tirosin-chinasi, e sono eterozigoti per la perdita di Pten (P)^5,6. Aberrazioni geniche concomitanti nelle reti del recettore tirosin-chinasi (RTK), PI3K e RB sono implicate nel 74% della patogenesi GBM⁷. Pertanto, le vie primarie di segnalazione alterate nel GBM umano sono rappresentate dalle mutazioni ingegnerizzate nei topi TRP, in particolare nei tumori GBM, in cui vengono attivati bersagli a valle condivisi di RTK⁵.

Il modello ortotopico singeneico derivato da GEM è stato convalidato come modello che riassume le caratteristiche dei tumori cerebrali umani, tra cui l'invasività e la presenza di biomarcatori di sottotipo, da utilizzare come piattaforma per valutare le terapie antitumorali mirate a percorsi aberranti nel GBM. Le cellule sono state coltivate da tumori raccolti dal cervello TRP e reimpiantate nel cervello di topi abbinati al ceppo, utilizzando apparecchiature stereotassiche per l'iniezione intracranica nella corteccia. Questo modello murino ortotopico preclinico ha sviluppato tumori GBM altamente cellulari, invasivi, pleomorfi con un alto tasso mitotico e mostravano focolai lineari di necrosi da parte di cellule neoplastiche e vascolarizzazione densa, come osservato per GBM umano. I volumi e la crescita del tumore sono stati misurati mediante risonanza magnetica (MRI) in vivo .

In questo rapporto, descriviamo la tecnica ottimale per l'iniezione intracranica di cellule GBM primarie o linee cellulari nel cervello di topo wild-type, usando i tumori TRP come esempio. Lo stesso protocollo può essere adattato per topi immunocompromessi e altre linee cellulari GBM. Vengono forniti suggerimenti cruciali per evitare insidie comuni, come la preparazione non ottimale delle cellule o la perdita di cellule nel sito di iniezione, e per utilizzare correttamente l'apparecchiatura stereotassica per garantire la riproducibilità e l'affidabilità del modello. Per scopi traslazionali, convalidiamo il modello mediante rilevamento MRI della crescita del tumore cerebrale in animali vivi, caratterizzazione istologica e presentiamo un esempio di trattamento nei topi portatori di tumore.

Il protocollo di studio qui descritto è stato approvato dal NCI presso il Frederick Animal Care and Use Committee. NCI-Frederick è accreditato da AAALAC International e segue la politica del servizio sanitario pubblico per la cura e l'uso di animali da laboratorio. La cura degli animali è stata fornita secondo le procedure delineate nella "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (Consiglio Nazionale delle Ricerche, 2011; The National Academies Press, Washington D.C.).

1. Preparazione delle cellule per l'iniezione

NOTA: Le cellule primarie del tumore cerebrale di topo (MBR) utilizzate per questo modello sono state originariamente isolate da topi TRP GEM indotti da tamoxifene, come descritto in El Meskini et ^al.5. I dettagli sulla preparazione delle cellule possono essere trovati in questo riferimento.

1. Eseguire i seguenti passaggi utilizzando la tecnica sterile in un armadio di biosicurezza.
2. Coltura di cellule tumorali cerebrali primarie in vitro fino a raggiungere la fase di crescita esponenziale.
3. Raccogliere le cellule in tripsina allo 0,25% e, una volta che si sono staccate, diluirle con terreno di crescita per inattivare la tripsina.
4. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 400 x g e lavare con mezzi senza siero. Ripeti una volta prima di contare.
5. Contare le celle manualmente o con un contatore automatico delle celle. Risospendere le cellule in metilcellulosa sterile al 5% in 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) alla concentrazione desiderata, sulla base di un volume di iniezione finale di 2 μL. La concentrazione cellulare desiderata può variare in base alla linea cellulare e al modello di tumore cerebrale. Per le celle GBM GEM TRP, iniettiamo 2 μL di una soluzione 25 x 10⁶ cellule/ml o 50.000 cellule.

2. Ceppo di topo

1. Allevare o acquistare un ceppo di topo appropriato che corrisponda allo sfondo del ceppo delle cellule tumorali cerebrali. Per le cellule TRP, utilizzare topi B6D2F1 / J di 9 settimane (da un incrocio tra femmine C57BL / 6J [B6] e maschi DBA / 2J [D2]) come destinatari di cellule tumorali.

3. Allestimento dell'area chirurgica

NOTA: Tutte le fasi chirurgiche sono condotte utilizzando la tecnica asettica in un ambiente pulito e igienizzato. Scrub e dispositivi di protezione individuale, compresa una maschera, devono essere indossati dal chirurgo. Gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati a caldo prima dell'uso.

1. Posizionare i protettori della superficie sotto l'apparecchio stereotassico e sul piano di lavoro.
2. Collegare il tubo in vinile dalla macchina per anestesia alla porta IN della piattaforma di anestesia gassosa dell'apparecchio stereotassico e un altro tubo alla porta OUT.
3. Collegare il display digitale a una fonte di alimentazione e all'apparecchio.
4. Collegare il controller della micropompa (Figura 1A) a una fonte di alimentazione e collegare la micropompa (Figura 1A) al braccio manipolatore dell'apparecchio (vedere anche le istruzioni del produttore).
5. Impostare la micropompa su 5,6 nL/s per l'iniezione di volume di 2.000 nL.
6. Accendere lo sterilizzatore a sfere calde.
7. Collegare il termoforo del mouse al regolatore di temperatura e collegarlo a una fonte di alimentazione. Posiziona il piatto sulla piattaforma del palcoscenico. Impostare la temperatura della piastra a 37 °C.
8. Caricare una siringa di precisione da 30 G, facendo attenzione a non introdurre bolle. Inserire lo stantuffo e inserire l'ago. Assicurarsi di afferrare l'ago solo dal mozzo. Premere lo stantuffo fino a quando una goccia della miscela di cellule di metilcellulosa eroga attraverso l'ago. Pulire l'ago con un tampone per la preparazione di alcol al 70% strofinando accuratamente i lati dell'ago o posizionando una garza sterile sul piano di lavoro e asciugandola. Fare attenzione a non piegare o rompere l'ago.
9. Collegare la siringa di precisione alla micropompa e ruotare il braccio del manipolatore lontano dal palco, per evitare lo spostamento dell'ago della siringa prima di posizionare il mouse sul palco.

4. Preparare il topo per la chirurgia

1. Anestetizzare il topo posizionandolo nella camera di induzione con il vaporizzatore isoflurano impostato al 2,5%, o secondo le linee guida istituzionali. Accendere il flusso di isoflurano al naso.
2. Trasferire il mouse sull'apparecchio stereotassico e fissarlo al nosecone, con i denti superiori posizionati sul supporto del nosecone (Figura 1B, 9). Stringere la manopola sul naso per fissare (Figura 1B). Garantire un livello appropriato di anestesia eseguendo un pizzico del dito del piede per verificare il riflesso.
   1. Monitorare le orecchie, i piedi e le mucose per il colore (rosa) per garantire un'adeguata ossigenazione. Inoltre, monitorare la frequenza respiratoria (un aumento o una diminuzione potrebbe indicare la necessità di regolare i livelli di isoflurano).
3. Inserire le barre auricolari (Figura 1B) in entrambe le orecchie e stringere la manopola per fissare la testa.
4. Applicare un unguento per gli occhi per lubrificare gli occhi mentre il topo è sotto anestesia.
5. Utilizzare una pinza curva per strappare i peli sulla testa del topo in un'area circa il 150% più grande dell'incisione pianificata, per garantire condizioni asettiche adeguate.
6. Iniettare 0,5-1 mg/kg di buprenorfina SR analgesia per via sottocutanea o utilizzare un altro analgesico approvato dal protocollo.
7. Posizionare la sonda rettale del topo per monitorare la temperatura interna e prevenire l'ipotermia dovuta all'anestesia. Mantenere la temperatura corporea del mouse tra 36,5 e 38,5 °C.
8. Sanificare il campo chirurgico utilizzando cerchi verso l'esterno, alternando uno scrub chirurgico e l'etanolo tre volte.
9. Usando una pinza per tirare la pelle tesa, praticare un'incisione di circa 1 cm con la lama di bisturi, iniziando tra gli occhi. Il bregma dovrebbe essere visibile attraverso l'incisione.
   NOTA: Per una corretta tecnica sterile, toccare il sito chirurgico solo con le punte degli strumenti sterilizzati e posizionare le punte degli strumenti solo su una superficie sterile (come l'interno di un pacco utensili in autoclave).
10. Utilizzare l'estremità in legno dell'applicatore con punta in cotone per raschiare via il tessuto connettivo in eccesso e quindi l'estremità in cotone di un altro applicatore per asciugare.

5. Iniezione cellulare

1. Riportare il braccio manipolatore con l'attacco della siringa sopra il mouse, serrando la manopola per fissarla. Utilizzare le manopole X e Y sul piano orizzontale per spostare il supporto della siringa sul bregma. Abbassare l'ago usando la manopola Z per confermare la posizione del bregma. Impostare la console di lettura digitale su zero.
2. Utilizzare le manopole X e Y e la corrispondente lettura digitale per spostare l'ago nella posizione desiderata. Per la posizione della corteccia corticale, le coordinate appropriate sono 3 mm posteriormente, 2 mm lateralmente a destra al bregma e 2 mm di profondità dalla dura madre. Utilizzare la manopola Z per spostare l'ago sulla superficie del cranio.
3. Forare un foro nel cranio usando una siringa da 1 mL con un ago da 25 G attaccato. Posizionare la smussatura dell'ago verso la siringa e l'ago di precisione da 30 G e ruotare con attenzione il braccio manipolatore verso il lato. Usando il pollice e il dito, far rotolare l'ago avanti e indietro lentamente con una leggera pressione fino a quando la punta dell'ago perfora appena il cappuccio cranico.
4. Utilizzare un applicatore con punta di cotone per tamponare il sangue lontano dal foro dell'ago. Riposizionare il braccio del manipolatore nella posizione appropriata con l'ago della siringa di precisione caricato sopra il foro. Allineare la punta dell'ago con il foro, utilizzando la manopola Z per abbassare l'ago fino alla durata del cervello e impostare la console di lettura digitale a zero.
5. Utilizzando la manopola Z, abbassare l'ago di 1 mm, quindi attendere 1 minuto. Ripetere l'operazione fino a raggiungere la profondità desiderata (2 mm come indicato).
   NOTA: L'ago viene abbassato lentamente per evitare ulteriori danni al tessuto cerebrale circostante e al riflusso della soluzione cellulare.
6. Avviare la micropompa, quindi monitorare per assicurarsi che la pompa si fermi quando sono stati iniettati 2 μL. Questo processo dovrebbe richiedere circa 6 minuti alla velocità indicata. Quindi, attendere 1 minuto prima di spostare l'ago.

6. Rimozione dell'ago e chiusura della ferita

1. Sollevare l'ago di 1 mm e attendere 1 minuto. Ripetere fino a quando l'ago è completamente libero dal cranio.
2. Se necessario, utilizzare un applicatore con punta di cotone per tamponare il sangue lontano dal sito di iniezione.
3. Utilizzando l'estremità in legno di un applicatore con punta di cotone, prendere un piccolo pezzo di cera ossea (~ 1 mm) e modellarlo in un cono. Mettilo nell'apertura del cranio, spingendo la cera nel foro.
4. Pinze termiche usando uno sterilizzatore di perline e usarle per sciogliere la cera rimanente sul cranio e levigarlo.
5. Posizionare circa due gocce di soluzione di bupivacaina (anestetico) nell'incisione e utilizzare una pinza per tirare insieme i bordi della pelle.
6. Tirare la pelle tesa e posizionare una o due clip per ferite per chiudere la pelle.
7. Posizionare il mouse in una gabbia di recupero pulita su una piastra riscaldante in un'area priva di correnti d'aria e osservare attentamente il mouse. Consentire al topo di svegliarsi completamente dall'anestesia, riprendendo la normale attività, prima di riportarlo all'alloggio normale.
8. Controllare quotidianamente il topo dopo la procedura chirurgica e somministrare la gestione del dolore, secondo le linee guida istituzionali.
   1. Se la buprenorfina SR (Fase 4.6) viene utilizzata per l'analgesia, la formula a rilascio prolungato dura 72 ore. Ripetere l'iniezione solo se è presente dolore o disagio visibile dopo 72 ore. Se eseguiti correttamente, i topi si riprendono bene dalle iniezioni intracraniche e non è necessaria un'ulteriore analgesia.
   2. Rimuovere le graffette 7-10 giorni dopo l'intervento.
9. Monitorare la crescita del tumore mediante imaging di animali vivi (MRI).
   1. Eutanasia dei topi quando vengono raggiunti endpoint umani (cioè, se l'animale perde il 20% del peso corporeo o diventa ipotermico).
   2. A causa della natura invasiva di questi tumori cerebrali, osservare i topi per sintomi neurologici, come andatura irregolare, paralisi parziale, rotazione o inclinazione della testa. Eutanasia di un topo se si osserva uno qualsiasi di questi segni clinici di crescita tumorale avanzata.

I topi iniettati con cellule tumorali cerebrali devono essere monitorati quotidianamente per segni di crescita tumorale come convulsioni, atassia o perdita di peso. La crescita del tumore cerebrale può anche essere monitorata mediante risonanza magnetica a intervalli regolari. Le scansioni MRI settimanali consentono la visualizzazione dell'aumento del carico tumorale all'interno del cervello e le misurazioni del volume del tumore (Figura 1C). In particolare, i tumori TRP mostrano una crescita aggressiva e i volumi tumorali 3D sono misurabili mediante risonanza magnetica entro 2 o 3 settimane dopo l'iniezione intracranica (con un volume medio da 30 a 40 mm3). In uno studio rappresentativo, una coorte di topi portatori di tumore cerebrale è stata divisa in due gruppi per il controllo rispetto alla radioterapia; La misurazione del volume tumorale MRI ha rivelato una mancanza di soppressione della crescita tumorale dopo il trattamento con radiazioni (Figura 2A), con conseguente nessun aumento della sopravvivenza per i topi trattati (Figura 2B).

All'autopsia, i tumori possono apparire come una macchia scura sul cervello all'interno di un emisfero destro gonfio (Figura 3A, pannello centrale), o nel caso di tumori più grandi, come una regione sollevata e oscurata. Per l'analisi istopatologica, il sezionamento sagittale attraverso la regione del sito di iniezione (Figura 3A) consente una valutazione ottimale della crescita tumorale e dell'entità dell'invasione nel tessuto cerebrale non maligno. I tumori GBM nei modelli singeneici possono crescere in modo aggressivo e violare il cranio dall'endpoint terminale, che può essere osservato all'autopsia. Al contrario, la crescita extracranica subito dopo l'impianto cellulare probabilmente indica una perdita di cellule durante l'iniezione, che può essere osservata sulle scansioni MRI (Figura 3B), o in un topo vivo da un'area a cupola sulla testa. L'ago potrebbe essere stato rimosso dal sito di iniezione troppo rapidamente (vedere paragrafo 6). La crescita extracranica è confermata come perdita nel sito di iniezione dalla valutazione istologica.

Nel modello ortotopico TRP, l'istopatologia ha confermato la presenza di astrocitoma/GBM di grado IV, inclusa la ricapitolazione delle caratteristiche distintive osservate nei tumori TRP GEM come pseudopalizzata e necrosi (Figura 4). Le cellule staminali neurali GBM e i marcatori progenitori descritti per la sottoclassificazione GBM umana sono stati valutati mediante immunoistochimica (Figura 5). L'espressione diffusa della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) indica un tumore proliferativo di origine progenitrice astrocitica, mentre Nestin e Sox-2 sono marcatori progenitori neuronali consolidati e l'espressione di Olig-2 conferma la presenza di cellule di origine oligodendrocitaria 5,7. Tutti e quattro i marcatori sono altamente espressi nei sottotipi diGBM 8 umano.

Figura 1: Configurazione dell'apparato implantare intracranico e crescita dei tumori TRP GBM visualizzati mediante risonanza magnetica seriale. (A) Configurazione dell'apparato con diversi elementi necessari per l'impianto intracranico (da 1 a 11 descritti); l'unità specifica di posizionamento della testa di topo e di anestesia per inalazione è ingrandita in (B). L'imaging settimanale è stato eseguito su uno scanner clinico MRI 3.0T con unabobina di superficie SENSE array 5,9 su misura. Sequenza Multi-slice T2-weighted turbo spin echo (T2w-TSE): (TR/TE (4437/100 ms), in risoluzione del piano (0,12 x 0,15 mm), spessore della fetta (0,5 mm), fattore di accelerazione SENSE (4) le immagini sono state acquisite nel piano assiale per coprire l'intero cervello del topo. Sono mostrate sezioni coronali da tumori a 3, 4 e 5 settimane dopo l'impianto. Una barra di scala rappresentativa per le immagini MRI è indicata in basso a destra (C). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Studio rappresentativo di efficacia di un modello ortotopico di GBM con radioterapia. (A) Volumi tumorali tridimensionali calcolati da scansioni MRI, corrispondenti alle settimane 2, 3 e 4 impianti post-tumorali. I volumi dei tumori cerebrali sono stati misurati attraverso l'analisi delle immagini MRI. Dopo aver caricato un'immagine MRI nel programma ITK_SNAP, il contrasto dell'immagine e il filtro della regione di intensità dell'immagine sono stati regolati. Dopo l'inizializzazione del contorno attivo e la segmentazione dell'immagine, il volume del tumore è stato misurato in milimieter cubici. Vengono tracciati topi di controllo individuali (non trattati) e topi trattati mediante irradiazione (3 Gy al giorno per 5 giorni per un totale di 15 Gy). (B) Sopravvivenza dei topi trattati con radiazioni rispetto al controllo. La percentuale di sopravvivenza è stata calcolata con un software grafico (vedi Tabella dei materiali) da un totale di n = 11 topi non trattati e n = 12 topi trattati con radiazioni. I topi dello studio sono stati eutanasizzati, in base alle nostre linee guida istituzionali. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Posizione del tumore nel cervello durante l'autopsia . (A) Corretta localizzazione della crescita tumorale nell'emisfero destro del topo. Il pannello di sinistra mostra un esempio di un tumore all'interno del cervello da una scansione MRI alla fine dello studio; La freccia rossa indica la posizione del tumore. Il cervello di topo sezionato viene mostrato all'interno del cranio (pannello centrale) e rimosso dalla cavità cranica (pannello di destra). Nel pannello centrale, le frecce blu indicano l'impatto dell'ago del sito di iniezione e le frecce a doppia punta indicano la posizione raccomandata del taglio sagittale cerebrale per l'istologia, dividendo l'emisfero destro in due parti. Entrambe le parti del cervello sono incorporate nella paraffina in modo "a libro aperto". La linea tratteggiata indica la fessura longitudinale mediana che separa i due emisferi cerebrali come riferimento. Nel pannello di destra, l'area racchiusa dalla linea tratteggiata rappresenta la regione tumorale visibile all'autopsia. (B) Un esempio di un tumore al cervello che cresce al di fuori del cranio del topo è mostrato nella scansione MRI. Una barra di scala rappresentativa per entrambe le immagini MRI è mostrata nella Figura 3A. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: L'istopatologia dei tumori ortotopici TRP GBM riassume le caratteristiche del GBM umano. Le sezioni sagittali dell'intero cervello colorate con ematossilina ed eosina (H & E) sono state valutate da un patologo veterinario certificato ACVP e i tumori sono stati classificati in base all'attuale classificazione dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) per gli astrocitomi umani10,11. I tumori ortotopici GBM sono altamente proliferativi, invasivi (I) e vascolarizzati (V) e presentano caratteristiche distintive dell'istopatologia GBM umana, tra cui necrosi (N) e pseudopalizzata (P) da parte delle cellule neoplastiche12. Le linee tratteggiate mostrano l'ingrandimento delle aree all'interno del tumore cerebrale e alla periferia, adiacenti al tessuto cerebrale normale (in alto e in basso a destra, rispettivamente). Gli anticorpi e i metodi per l'immunoistochimica sono descritti in El Meskini et al.5. Viene mostrata una barra di scala per le immagini H&E sia per gli ingrandimenti bassi che per quelli alti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Biomarcatori di GBM espressi nel modello ortotopico. L'espressione del marcatore progenitore multipotente SOX-2 (fattore di trascrizione SRY-Box 2), dei progenitori neurali Nestin e Olig-2 e del marcatore astrocitico della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) indica eterogeneità cellulare, una caratteristica comune del GBM umano 7,8. Una barra di scala rappresentativa per tutte le immagini IHC è mostrata in Olig2 (fattore di trascrizione degli oligodendrociti 2; in basso a destra). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.