Summary
Здесь мы описываем доклиническую ортотопическую модель мыши для GBM, созданную путем внутричерепной инъекции клеток, полученных из генетически модифицированных опухолей мыши. Эта модель отображает признаки заболевания ГБМ человека. Для трансляционных исследований опухоль головного мозга мыши отслеживается с помощью МРТ in vivo и гистопатологии.
Abstract
Генетически модифицированные мышиные модели (GEM) для мультиформной глиобластомы человека (GBM) имеют решающее значение для понимания развития и прогрессирования опухолей головного мозга. В отличие от опухолей ксенотрансплантата, в ГЭУ опухоли возникают в нативном микроокружении у иммунокомпетентной мыши. Тем не менее, использование GBM GEM в доклинических исследованиях лечения является сложной задачей из-за длительных латентных периодов опухоли, гетерогенности частоты новообразований и сроков развития опухоли поздней степени. Мыши, индуцированные с помощью внутричерепной ортотопической инъекции, более пригодны для доклинических исследований и сохраняют черты опухолей GEM. Мы создали ортотопическую модель опухоли головного мозга, полученную из модели GEM с аберрациями Rb, Kras и p53 (TRP), в которой развиваются опухоли GBM, демонстрирующие линейные очаги некроза опухолевыми клетками и плотную васкуляризацию, аналогичную GBM человека. Клетки, полученные из опухолей GEM GBM, вводят внутричерепно мышам-реципиентам дикого типа, соответствующим штамму, и воспроизводят опухоли IV степени, таким образом, обходя длительный латентный период опухоли у мышей GEM и позволяя создавать большие и воспроизводимые когорты для доклинических исследований. Высокопролиферативные, инвазивные и сосудистые особенности модели TRP GEM для GBM повторяются в ортотопических опухолях, а гистопатологические маркеры отражают подгруппы GBM человека. Рост опухоли контролируется серийными МРТ-сканированиями. Из-за инвазивного характера внутричерепных опухолей в иммунокомпетентных моделях тщательное следование описанной здесь процедуре инъекции имеет важное значение для предотвращения роста экстракраниальной опухоли.
Introduction
Глиобластома (GBM; глиома IV степени) является наиболее распространенной и злокачественной опухолью головного мозга, и современные методы лечения неэффективны, что приводит к средней выживаемости 15 месяцев1. Надежные и точные доклинические модели, представляющие сложные сигнальные пути, участвующие в росте и патогенезе опухоли головного мозга, необходимы для ускорения прогресса в оценке новых терапевтических схем для ГБМ. Мышиные модели, в которых линии опухолевых клеток головного мозга человека имплантируются подкожно мышам с ослабленным иммунитетом, не отражают нативную иммунную среду опухолей головного мозга и не могут быть использованы для оценки способности терапевтических средств пересекать гематоэнцефалический барьер2. В идеале доклинические мышиные модели должны также точно воспроизводить гистопатологию GBM человека, включая высокий уровень инвазивности в окружающей паренхиме3. Хотя генетически модифицированные модели мышей (GEM) развивают опухоли в контексте интактной иммунной системы, часто требуются сложные схемы разведения, и опухоли могут развиваться медленно и непоследовательно4. Модели аллотрансплантатов, полученные из GEM, лучше подходят для доклинических терапевтических исследований, где требуются большие когорты мышей с опухолями в более короткие сроки.
В предыдущем отчете мы описали ортотопическую модель мыши GBM, полученную непосредственно из опухолей GEM. Онкогенез в GEM инициируется генетическими событиями в клеточных популяциях (в первую очередь астроцитах), экспрессирующих глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), которые приводят к прогрессированию до GBM. Эти TRP GEM содержат трансген TgGZT121 (T), который экспрессирует T121 после воздействия рекомбиназы Cre, управляемой GFAP. Экспрессия белка T121 приводит к подавлению активности белка Rb (Rb1, p107 и p103). Совместная экспрессия трансгена Cre, управляемого GFAP (GFAP-CreERT2), нацелена на экспрессию во взрослые астроциты после индукции тамоксифеном. Мыши TRP также являются носителями Cre-зависимого мутанта Kras (KrasG12D; R) аллель, представляющий собой активацию рецепторного тирозинкиназного пути, и гетерозиготны по потере Pten (P) 5,6. Одновременные аберрации генов в цепях рецепторной тирозинкиназы (RTK), PI3K и RB участвуют в 74% патогенеза GBM7. Таким образом, первичные сигнальные пути, измененные в GBM человека, представлены сконструированными мутациями у мышей TRP, в частности опухолями GBM, в которых активируются общие последующие мишени RTK5.
Сингенная ортотопическая модель, полученная из GEM, была проверена как модель, которая повторяет особенности опухолей головного мозга человека, включая инвазивность и наличие биомаркеров подтипа, для использования в качестве платформы для оценки терапии рака, нацеленной на аберрантные пути в GBM. Клетки культивировали из опухолей, собранных из мозга TRP, и повторно имплантировали в мозг мышей, соответствующих штамму, с использованием стереотаксического оборудования для внутричерепной инъекции в кору. В этой доклинической ортотопической мышиной модели были разработаны опухоли GBM, которые были высококлеточными, инвазивными, плеоморфными с высокой частотой митоза и демонстрировали линейные очаги некроза опухолевыми клетками и плотной васкуляризацией, как это наблюдалось для GBM человека. Объемы и рост опухоли измеряли с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) in vivo .
В этом отчете мы описываем оптимальную технику внутричерепной инъекции первичных клеток GBM или клеточных линий в мозг мыши дикого типа, используя опухоли TRP в качестве примера. Тот же протокол может быть адаптирован для мышей с ослабленным иммунитетом и других клеточных линий GBM. Даны важные советы, позволяющие избежать распространенных ошибок, таких как неоптимальная подготовка клеток или утечка клеток в месте инъекции, а также правильное использование стереотаксического оборудования для обеспечения воспроизводимости и надежности модели. В трансляционных целях мы валидируем модель с помощью МРТ-обнаружения роста опухоли головного мозга у живых животных, гистологической характеристики и представляем пример лечения у мышей с опухолями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол исследования, описанный здесь, был одобрен NCI в Комитете по уходу за животными и их использованию Фредерика. NCI-Frederick аккредитован AAALAC International и следует Политике службы общественного здравоохранения по уходу за лабораторными животными и их использованию. Уход за животными осуществлялся в соответствии с процедурами, изложенными в «Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных» (Национальный исследовательский совет, 2011; Издательство Национальной академии, Вашингтон, округ Колумбия).
1. Подготовка клеток к инъекции
ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные клетки опухоли головного мозга мыши (MBR), используемые для этой модели, были первоначально выделены из мышей TRP GEM, индуцированных тамоксифеном, как описано в El Meskini et al.5. Подробную информацию о подготовке клеток можно найти в этом справочнике.
- Выполните следующие действия, используя стерильную технику в шкафу биобезопасности.
- Культивируйте первичные опухолевые клетки головного мозга in vitro до тех пор, пока они не достигнут экспоненциальной фазы роста.
- Соберите клетки в 0,25% трипсина, и после того, как они отсоединились, разбавьте их питательной средой, чтобы инактивировать трипсин.
- Гранулируйте ячейки центрифугированием в дозе 400 x g и промойте средой, не содержащей сыворотки. Повторите один раз перед подсчетом.
- Подсчитайте ячейки вручную или с помощью автоматического счетчика ячеек. Ресуспендируют клетки в 5% стерильной метилцеллюлозе в 1x фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS) в желаемой концентрации, исходя из конечного объема инъекции 2 мкл. Желаемая концентрация клеток может варьироваться в зависимости от клеточной линии и модели опухоли головного мозга. Для клеток GBM GEM TRP мы вводим 2 мкл раствора 25 x 106 клеток/мл или 50 000 клеток.
2. Напряжение мыши
- Разводите или покупайте подходящий штамм мыши, который соответствует фону штамма опухолевых клеток головного мозга. Для клеток TRP используйте 9-недельных мышей B6D2F1 / J (от скрещивания самок C57BL / 6J [B6] и самцов DBA / 2J [D2]) в качестве реципиентов опухолевых клеток.
3. Настройка хирургической зоны
ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические операции проводятся с использованием асептической техники в чистой, продезинфицированной среде. Хирург должен носить скрабы и средства индивидуальной защиты, включая маску. Хирургические инструменты должны быть подвергнуты термической стерилизации перед использованием.
- Поместите поверхностные протекторы под стереотаксический аппарат и на рабочую поверхность.
- Прикрепите виниловую трубку от наркозного аппарата к внутреннему порту платформы газовой анестезии стереотаксического аппарата, а другую трубку к выходному порту.
- Подключите цифровой дисплей к источнику питания и к устройству.
- Подключите контроллер микронасоса (рис. 1A) к источнику питания и прикрепите микронасос (рис. 1A) к манипулятору аппарата (см. также инструкцию производителя).
- Установите микронасос на 5.6 нл/с для впрыска объемом 2,000 нл.
- Включите стерилизатор горячих шариков.
- Подключите грелку мыши к регулятору температуры и подключите к источнику питания. Поставьте тарелку на сценическую платформу. Установите температуру пластины на 37 °C.
- Загрузите прецизионный шприц весом 30 г, стараясь не вводить пузырьки. Вставьте поршень и прикрепите иглу. Обязательно держите иглу только за ступицу. Нажимайте на поршень до тех пор, пока капля смеси метилцеллюлозных клеток не пройдет через иглу. Очистите иглу салфеткой с 70% спиртом, тщательно протерев стенки иглы или положив стерильную марлевую салфетку на рабочую поверхность и промокнув ее. Будьте осторожны, чтобы не согнуть и не сломать иглу.
- Прикрепите прецизионный шприц к микронасосу и поверните руку манипулятора в сторону от сцены, чтобы предотвратить смещение иглы шприца перед размещением мыши на сцене.
4. Подготовка мыши к операции
- Обезболите мышь, поместив ее в индукционную камеру с испарителем изофлурана, установленным на 2,5%, или в соответствии с руководящими принципами учреждения. Включите подачу изофлурана к носовому обтекателю.
- Перенесите мышь в стереотаксический аппарат и закрепите на носовом обтекателе, расположив верхние зубы на опоре носового обтекателя (рис. 1B, 9). Затяните ручку на носовом обтекателе, чтобы закрепить (рис. 1B). Обеспечьте надлежащий уровень анестезии, выполнив ущипывание пальца ноги, чтобы проверить рефлекс.
- Следите за цветом ушей, ног и слизистых оболочек, чтобы обеспечить адекватное насыщение кислородом. Кроме того, следите за частотой дыхания (увеличение или уменьшение может указывать на необходимость корректировки уровня изофлурана).
- Вставьте ушные вкладыши (рис. 1B) в оба уха и затяните ручку, чтобы зафиксировать голову.
- Нанесите глазную мазь для смазывания глаз, пока мышь находится под наркозом.
- Используйте изогнутые щипцы, чтобы выщипать волосы на голове мыши на площадь, примерно на 150% превышающую запланированный разрез, чтобы обеспечить адекватные асептические условия.
- Вводите 0,5-1 мг / кг бупренорфина SR анальгезии подкожно или используйте другой одобренный протоколом анальгетик.
- Расположите ректальный зонд мыши, чтобы контролировать внутреннюю температуру и предотвращать переохлаждение из-за анестезии. Поддерживайте температуру тела мыши от 36,5 до 38,5 °C.
- Продезинфицируйте операционное поле, используя наружные круги, чередуя хирургический скраб и этанол три раза.
- Используя щипцы, чтобы натянуть кожу, сделайте надрез примерно в 1 см лезвием скальпеля, начиная между глазами. Брегма должна быть видна через разрез.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для правильной стерильной техники прикасайтесь к месту операции только кончиками стерилизованных инструментов и кладите кончики инструментов только на стерильную поверхность (например, на внутреннюю часть автоклавного набора инструментов). - Используйте деревянный конец аппликатора с ватным наконечником, чтобы соскрести лишнюю соединительную ткань, а затем ватный конец другого аппликатора для высыхания.
5. Инъекция клеток
- Верните руку манипулятора с насадкой шприца на мышь, затянув ручку для фиксации. Используйте ручки X и Y в горизонтальной плоскости, чтобы переместить крепление шприца над брегмой. Опустите иглу с помощью Z-образной ручки, чтобы подтвердить положение брегмы. Установите консоль цифрового считывания на ноль.
- Используйте ручки X и Y и соответствующие цифровые показания, чтобы переместить стрелку в нужное положение. Для расположения корковой коры соответствующие координаты: 3 мм назад, 2 мм сбоку от брегмы и 2 мм вглубь твердой мозговой оболочки. Используйте Z-образную ручку, чтобы переместить иглу на поверхность черепа.
- Проколите отверстие в черепе с помощью шприца объемом 1 мл с прикрепленной иглой 25 G. Поместите скос иглы к прецизионному шприцу и игле 30 G и осторожно поверните руку манипулятора в сторону. Большим и указательным пальцами медленно катайте иглу вперед и назад с легким нажимом, пока кончик иглы не проткнет черепную крышку.
- Используйте аппликатор с ватным наконечником, чтобы смазать кровь с отверстия иглы. Установите рычаг манипулятора в соответствующее положение на нагруженную прецизионную иглу шприца над отверстием. Совместите кончик иглы с отверстием, используя Z-образную ручку, чтобы опустить иглу вниз к твердой мозговой оболочке, и установите цифровую консоль считывания на ноль.
- С помощью Z-образной ручки опустите иглу на 1 мм, а затем подождите 1 минуту. Повторяйте до тех пор, пока не будет достигнута желаемая глубина (2 мм, как указано).
ПРИМЕЧАНИЕ: Игла опускается медленно, чтобы предотвратить дополнительное повреждение окружающей ткани мозга и обратный поток клеточного раствора. - Запустите микронасос, а затем следите за тем, чтобы насос остановился после впрыска 2 мкл. Этот процесс должен занять около 6 минут при указанной скорости. Затем подождите 1 минуту, прежде чем перемещать иглу.
6. Удаление иглы и закрытие раны
- Поднимите иглу на 1 мм и подождите 1 мин. Повторяйте до тех пор, пока игла полностью не освободится от черепа.
- При необходимости используйте аппликатор с ватным наконечником, чтобы смазать кровь с места инъекции.
- Используя деревянный конец аппликатора с ватным наконечником, возьмите небольшой кусочек костного воска (~ 1 мм) и сформируйте из него конус. Поместите его в отверстие в черепе, проталкивая воск в отверстие.
- Нагрейте щипцы с помощью стерилизатора бисера и используйте их, чтобы растопить оставшийся воск на черепе и разгладить его.
- Поместите примерно две капли раствора бупивакаина (анестетика) в разрез и используйте щипцы, чтобы стянуть края кожи.
- Натяните кожу и поместите один или два зажима для раны, чтобы закрыть кожу.
- Поместите мышь в чистую клетку для восстановления на грелке в месте, свободном от сквозняков, и внимательно наблюдайте за мышью. Дайте мышке полностью проснуться от анестезии, возобновив нормальную активность, прежде чем вернуть ее в обычное жилье.
- Ежедневно проверяйте мышь после хирургической процедуры и управляйте обезболиванием в соответствии с руководящими принципами учреждения.
- Если бупренорфин SR (этап 4.6) используется для обезболивания, формула с замедленным высвобождением действует в течение 72 часов. Повторяйте инъекцию только в том случае, если через 72 ч присутствует видимая боль или дискомфорт. При правильном выполнении мыши хорошо восстанавливаются после внутричерепных инъекций, и дополнительная анальгезия не требуется.
- Снимают скобы через 7-10 дней после операции.
- Мониторинг роста опухоли с помощью визуализации живых животных (МРТ).
- Усыпляйте мышей, когда достигаются гуманные конечные точки (т.е. если животное теряет 20% массы тела или становится гипотермическим).
- Из-за инвазивной природы этих опухолей головного мозга наблюдайте за мышами на предмет неврологических симптомов, таких как неровная походка, частичный паралич, вращение или наклон головы. Усыпьте мышь, если наблюдаются какие-либо из этих клинических признаков прогрессирующего роста опухоли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мышей, которым вводили опухолевые клетки головного мозга, следует ежедневно контролировать на наличие признаков роста опухоли, таких как судороги, атаксия или потеря веса. Рост опухоли головного мозга также можно контролировать с помощью МРТ-сканирования через регулярные промежутки времени. Еженедельное МРТ-сканирование позволяет визуализировать увеличение опухолевой нагрузки в головном мозге и измерения объема опухоли (рис. 1C). В частности, опухоли TRP демонстрируют агрессивный рост, а 3D-объемы опухоли измеряются с помощью МРТ в течение 2-3 недель после внутричерепной инъекции (со средним объемом от 30 до 40мм3). В одном репрезентативном исследовании когорта мышей с опухолями головного мозга была разделена на две группы для контроля по сравнению с лучевой терапией; Измерение объема опухоли с помощью МРТ выявило отсутствие подавления роста опухоли после лучевой терапии (рис. 2A), что привело к отсутствию увеличения выживаемости обработанных мышей (рис. 2B).
При вскрытии опухоли могут выглядеть как темное пятно на головном мозге в опухшем правом полушарии (рис. 3A, средняя панель) или, в случае более крупных опухолей, как приподнятая, затемненная область. Для гистопатологического анализа сагиттальное сечение через область места инъекции (рис. 3А) позволяет оптимально оценить рост опухоли и степень инвазии в доброкачественную ткань головного мозга. Опухоли GBM в сингенных моделях могут агрессивно расти и пробивать череп к конечной точке, что можно наблюдать при вскрытии. Напротив, экстракраниальный рост вскоре после имплантации клеток, вероятно, указывает на утечку клеток во время инъекции, что можно наблюдать на МРТ-сканировании (рис. 3B) или у живой мыши по куполообразной области на голове. Возможно, игла была удалена из места инъекции слишком быстро (см. Раздел 6). Экстракраниальный рост подтверждается гистологической оценкой как утечка в месте инъекции.
В ортотопической модели TRP гистопатология подтвердила наличие астроцитомы IV степени/GBM, включая повторение отличительных особенностей, наблюдаемых в опухолях TRP GEM, таких как псевдопалисадирование и некроз (рис. 4). Нейронные стволовые клетки GBM и маркеры-предшественники, описанные для подклассификации GBM человека, оценивали с помощью иммуногистохимии (рис. 5). Широко распространенная экспрессия глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) указывает на пролиферативную опухоль астроцитарного происхождения-предшественника, тогда как Nestin и Sox-2 являются установленными нейрональными маркерами-предшественниками, а экспрессия Olig-2 подтверждает наличие клеток олигодендроцитарного происхождения 5,7. Все четыре маркера высоко экспрессируются в подтипах GBM8 человека.
Рисунок 1: Установка аппарата внутричерепной имплантации и рост опухолей TRP GBM, визуализированных с помощью серийной МРТ. (A) Установка аппарата с различными элементами, необходимыми для внутричерепного имплантата (от 1 до 11 описано); специфическое размещение головы мыши и аппарат ингаляционной анестезии увеличены в (B). Еженедельная визуализация проводилась на клиническом сканере MRI 3.0T с изготовленной по индивидуальному заказу матрицей SENSEс четырьмя мышами с поверхностной катушкой 5,9. Многосрезовая последовательность T2-взвешенного турбоспинового эха (T2w-TSE): (TR/TE (4437/100 мс), в плоском разрешении (0,12 x 0,15 мм), толщине среза (0,5 мм), коэффициенте ускорения SENSE (4) изображения были получены в осевой плоскости, чтобы покрыть весь мозг мыши. Показаны корональные срезы опухолей через 3, 4 и 5 недель после имплантации. Репрезентативная шкала для изображений МРТ указана в правом нижнем углу (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативное исследование эффективности ортотопической модели GBM с лучевой терапией . (A) Трехмерные объемы опухоли, рассчитанные на основе МРТ-сканирования, соответствующие неделям 2, 3 и 4 постопухолевых имплантатов. Объемы опухолей головного мозга были измерены путем анализа изображений МРТ. После загрузки МРТ-изображения в программу ITK_SNAP была отрегулирована контрастность изображения и фильтр областей интенсивности изображения. После активной инициализации контура и сегментации изображения объем опухоли измеряли в кубических миллимитерах. Нанесены индивидуальные контрольные (необработанные) мыши и мыши, обработанные облучением (3 Гр в день в течение 5 дней, всего 15 Гр). (B) Выживаемость мышей, подвергшихся радиационной обработке, по сравнению с контролем. Процент выживаемости был рассчитан с помощью графического программного обеспечения (см. Таблицу материалов) из общего числа n = 11 необработанных мышей и n = 12 мышей, обработанных радиацией. Исследуемые мыши были усыплены по мере достижения гуманных конечных точек на основе наших институциональных руководящих принципов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Расположение опухоли в головном мозге при вскрытии . (A) Правильное расположение опухолевого роста в правом полушарии мыши. На левой панели показан пример опухоли в головном мозге из МРТ-сканирования в конце исследования; Красная стрелка указывает на локализацию опухоли. Рассеченный мозг мыши показан внутри черепа (средняя панель) и удален из полости черепа (правая панель). На средней панели синими стрелками обозначено воздействие иглы на место инъекции, а двуглавыми стрелками указано рекомендуемое для гистологии расположение сагиттального разреза мозга, разделяющего правое полушарие на две части. Обе части мозга встроены в парафин в виде «открытой книги». Пунктирная линия указывает срединную продольную щель, разделяющую два полушария мозга в качестве ориентира. На правой панели область, заключенная пунктирной линией, представляет видимую область опухоли при вскрытии. (B) Пример опухоли головного мозга, растущей за пределами черепа мыши, показан на МРТ-сканировании. Репрезентативная шкала для обоих изображений МРТ показана на рисунке 3A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Гистопатология ортотопических опухолей TRP GBM повторяет признаки GBM человека. Окрашенные гематоксилином и эозином (H & E) сагиттальные срезы всего мозга оценивались сертифицированным ветеринарным патологоанатомом ACVP, а опухоли оценивались на основе действующей классификации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) для астроцитомы человека10,11. Ортотопические опухоли GBM являются высокопролиферативными, инвазивными (I) и васкуляризированными (V) и проявляют признаки гистопатологии GBM человека, включая некроз (N) и псевдопалисадирование (P) опухолевыми клетками12. Пунктирные линии показывают увеличение областей внутри опухоли головного мозга и на периферии, прилегающих к нормальной мозговой ткани (вверху и внизу справа соответственно). Антитела и методы иммуногистохимии описаны в El Meskini et al.5. Масштабная линейка для изображений H&E показана как для малого, так и для большого увеличения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Биомаркеры GBM, экспрессируемые в ортотопической модели. Экспрессия мультипотентного маркера-предшественника SOX-2 (транскрипционный фактор SRY-Box 2), нейронных предшественников Nestin и Olig-2 и астроцитарного маркера глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) указывает на клеточную гетерогенность, общую черту GBM 7,8 человека. Репрезентативная шкала для всех изображений IHC показана в Olig2 (фактор транскрипции олигодендроцитов 2; внизу справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Доклинические модели необходимы для оценки новых терапевтических мишеней и новых стратегий лечения при ГБМ. Генетически модифицированные мышиные модели для GBM имеют преимущество возникновения опухоли в автохтонном участке, но часто с длительной латентностью и непредсказуемым ростом опухоли13. Опухоли модели GEM демонстрируют латентность 4-5 месяцев, а идеальное временное окно для визуализации, набора и лечения варьируется среди отдельных мышей. Ортотопическая модель имеет хорошо зарекомендовавший себя и поддающийся лечению срок роста и лечения 4-5 недель, а опухоли надежно обнаруживаются с помощью МРТ после имплантации. Использование ортотопических моделей, полученных из GEM, позволяет размещать опухоль в точном месте у каждой мыши, а также контролировать время инициации роста опухоли, сохраняя при этом преимущество окружающего микроокружения мозга. В ортотопической модели TRP активированные пути RTK, PTEN и RB создают модель опухоли, которая повторяет гистологические особенности GBM человека. Аналогично человеческому GBM, ортотопические опухоли TRP GBM проявляют признаки агрессивного роста, такие как некротические очаги, окруженные псевдопализанизирующими опухолевыми клетками, и неоваскуляризация. Опухоли также инвазивны в окружающую паренхиму мозга. Таким образом, агенты, которые могут подавлять инфильтрацию и миграцию опухоли у пациентов, могут быть оценены доклинически при ортотопических опухолях TRP. Процесс инъекции клеток из инвазивных опухолей GEM сингенным мышам требует особой осторожности, чтобы избежать непреднамеренной утечки и роста клеток за пределами целевой области. Описанный здесь метод, при регулярной практике, может быть использован для создания больших когорт мышей с опухолями с последовательным ростом опухоли.
Критические шаги в протоколе, которые могут повлиять на успешную инъекцию опухоли, включают удаление иглы из мозга после инъекции клеток и использование костного воска. Игла должна быть введена и удалена на 1 мм за один раз (как описано на этапах 5 и 6), чтобы предотвратить дополнительное повреждение окружающей мозговой ткани и утечку остаточных клеток или обратный поток введенной суспензии14. Использование расплавленного костного воска для закупорки и герметизации отверстия иглы создает барьер для предотвращения утечки клеток, как и имплантация клеток в суспензию метилцеллюлозы. Важно отметить, что метилцеллюлозу необходимо смешивать в буферном растворе, таком как PBS (или, альтернативно, среда без сыворотки), прежде чем ресуспендировать клетки мозга. Кроме того, использование ингаляционной анестезии предпочтительнее инъекционной анестезии, чтобы сократить время восстановления.
Обратите внимание, что размер головы может незначительно отличаться в зависимости от штамма мышей, а также в зависимости от возраста и пола; Таким образом, стереотаксическое оборудование может нуждаться в повторной калибровке при переходе от одного типа когорты мышей к другому. Мы также рекомендуем оптимизировать количество клеток для инъекции для каждой интересующей клеточной линии у небольшого числа мышей, прежде чем приступать к большой когорте. По сравнению с ксенотрансплантатами человека, мышиные опухоли могут агрессивно расти при повторной имплантации мышам, соответствующим штамму, и требуют меньшего количества клеток для инъекций, как мы наблюдали с линиями TRP.
Ключевым преимуществом ортотопической инъекции в мозг по сравнению с инициацией и ростом глиобластомы в модели GEM является то, что ткань, окружающая введенную опухоль, является нормальной, и местная инвазивность может быть оценена по гистопатологии. Однако нельзя исключать изменения микроокружения из-за самой инъекционной раны, которые могут привести к местной воспалительной реакции или нарушению гематоэнцефалического барьера.
В заключение, ортотопические модели позволяют изучать GBM с разумными сроками лечения и в контексте нативного расположения опухоли. Наша модель повторяет особенности GBM человека, но у иммунокомпетентной мыши; Таким образом, иммунное микроокружение может быть проанализировано относительно роста опухоли или в ответ на иммунотерапию. Рост опухоли является агрессивным и инвазивным, в отличие от многих моделей ксенотрансплантата клеточной линии, в которых опухоль остается инкапсулированной и не проявляет гистологических особенностей GBMчеловека 13,15,16. При правильном выполнении описанная здесь процедура приводит к надежному росту опухоли без утечки клеток или экстракраниального распространения.
Наконец, хотя этот протокол был оптимизирован в контексте GBM в качестве ортотопической модели мыши, его точность и надежное применение в доклинической трансляции могут быть адаптированы к моделям других подклассов опухолей головного мозга. Методы и реагенты в этом протоколе могут быть использованы для имплантатов различных типов клеток, несущих мутации для интересующей модели опухоли головного мозга (например, диффузная глиомасредней линии 17), с корректировкой стереотаксических координат.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарны г-ну Алану Э. Кулаге за прекрасную техническую помощь и г-же Мишель Л. Гумпрехт за совершенствование хирургических методов. Мы благодарим доктора Филипа Л. Мартина за анализ патологии, а также г-жу Лилию Илеву и доктора Джозефа Калена из Программы визуализации мелких животных Национальной лаборатории Фредерика за МРТ-сканирование.
Этот проект был полностью или частично профинансирован за счет федеральных средств Национального института рака, Национальных институтов здравоохранения по контракту No HHSN261201500003I. Содержание этой публикации не обязательно отражает взгляды или политику Министерства здравоохранения и социальных служб, а упоминание торговых наименований, коммерческих продуктов или организаций не подразумевает одобрения со стороны правительства США.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
| Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
| B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
| Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
| CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
| Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
| Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
| Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
| Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
| Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
| KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
| Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 pipette | Gilson | F123600 | |
| Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |
References
- Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. Glioblastoma. , (2017).
- Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. Experimental models and tools to tackle glioblastoma. Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).
- Wen, P. Y., Kesari, S.
- Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- El Meskini, R., et al. A preclinical orthotopic model for glioblastoma recapitulates key features of human tumors and demonstrates sensitivity to a combination of MEK and PI3K pathway inhibitors. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 45-56 (2015).
- Song, Y., et al.
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103 (10), 1871-1879 (2012).
- Choyke, P. L., Dwyer, A. J., Knopp, M. V. Functional tumor imaging with dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 17 (5), 509-520 (2003).
- Raza, S. M., et al. Identification of necrosis-associated genes in glioblastoma by cDNA microarray analysis. Clinical Cancer Research. 10, 212-221 (2004).
- Raza, S. M., et al. Necrosis and glioblastoma: a friend or a foe? A review and a hypothesis. Neurosurgery. 51 (1), 2-12 (2002).
- Hambardzumyan, D., Bergers, G.
- Kijima, N., Kanemura, Y. Glioblastoma. Mouse Models of Glioblastoma. , Exon Publications. (2017).
- Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PloS One. 9 (4), 94919 (2014).
- Jin, F., Jin-Lee, H. J., Johnson, A. J.
- Zalles, M., Towner, R. A. Pre-Clinical Models and Potential Novel Therapies for Glioblastomas. Gliomas. , Exon Publications. 1-13 (2021).
- Wierzbicki, K., et al. Targeting and therapeutic monitoring of H3K27M-mutant glioma. Current Oncology Reports. 22 (2), 19 (2020).
