Summary
Burada, genetiği değiştirilmiş fare modeli tümörlerinden türetilen hücrelerin intrakraniyal enjeksiyonu ile kurulan GBM için klinik öncesi bir ortotopik fare modelini tarif ediyoruz. Bu model, insan GBM'sinin hastalık özelliklerini gösterir. Translasyonel çalışmalar için, fare beyin tümörü in vivo MRG ve histopatoloji ile izlenir.
Abstract
İnsan glioblastoma multiforme (GBM) için genetik olarak tasarlanmış fare (GEM) modelleri, beyin tümörlerinin gelişimini ve ilerlemesini anlamak için kritik öneme sahiptir. Ksenogreft tümörlerinden farklı olarak, GEM'lerde, tümörler immünokompetan bir farede doğal mikro ortamda ortaya çıkar. Bununla birlikte, GBM GEM'lerin preklinik tedavi çalışmalarında kullanımı, uzun tümör gecikmeleri, neoplazm frekansındaki heterojenite ve ileri dereceli tümör gelişiminin zamanlaması nedeniyle zordur. İntrakraniyal ortotopik enjeksiyon yoluyla indüklenen fareler, preklinik çalışmalar için daha kolay izlenebilirdir ve GEM tümörlerinin özelliklerini korur. Neoplastik hücreler tarafından doğrusal nekroz odakları ve insan GBM'sine benzer yoğun vaskülarizasyon gösteren GBM tümörleri geliştiren Rb, Kras ve p53 anormallikleri (TRP) içeren bir GEM modelinden türetilen ortotopik bir beyin tümörü modeli oluşturduk. GEM GBM tümörlerinden türetilen hücreler, vahşi tip, suşla eşleşen alıcı farelere intrakraniyal olarak enjekte edilir ve derece IV tümörleri çoğaltır, bu nedenle GEM farelerinde uzun tümör gecikme süresini atlar ve klinik öncesi çalışmalar için büyük ve tekrarlanabilir kohortların oluşturulmasına izin verir. GBM için TRP GEM modelinin yüksek proliferatif, invaziv ve vasküler özellikleri ortotopik tümörlerde özetlenmiştir ve histopatoloji belirteçleri insan GBM alt gruplarını yansıtmaktadır. Tümör büyümesi seri MRG taramaları ile izlenir. İmmünkompetan modellerde intrakraniyal tümörlerin invaziv doğası nedeniyle, burada özetlenen enjeksiyon prosedürünü dikkatli bir şekilde takip etmek, ekstrakraniyal tümör büyümesini önlemek için esastır.
Introduction
Glioblastoma (GBM; grade IV glioma) en sık görülen ve malign beyin tümörüdür ve mevcut tedaviler etkisizdir ve medyan sağkalım 15 ay1 ile sonuçlanır. Beyin tümörü büyümesi ve patogenezinde rol oynayan karmaşık sinyal yollarını temsil eden güvenilir ve doğru preklinik modeller, GBM için yeni terapötik rejimlerin değerlendirilmesindeki ilerlemeyi hızlandırmak için gereklidir. İnsan beyni tümörü hücre hatlarının bağışıklık sistemi baskılanmış farelerde deri altından implante edildiği fare modelleri, beyin tümörlerinin doğal bağışıklık ortamını yansıtmaz ve terapötiklerin kan-beyin bariyerini geçme yeteneğini değerlendirmek için kullanılamaz2. İdeal olarak, klinik öncesi fare modelleri, çevredeki parankim3'e yüksek düzeyde invazivlik de dahil olmak üzere insan GBM histopatolojisini de yakından yeniden üretmelidir. Genetiği değiştirilmiş fare (GEM) modelleri, sağlam bir bağışıklık sistemi bağlamında tümörler geliştirse de, karmaşık üreme şemaları sıklıkla gereklidir ve tümörler yavaş ve tutarsız bir şekilde gelişebilir4. GEM kaynaklı allogreft modelleri, tümör taşıyan farelerin büyük kohortlarının daha kısa sürede ihtiyaç duyulduğu klinik öncesi terapötik çalışmalar için daha uygundur.
Önceki bir raporda, doğrudan GEM tümörlerinden türetilen ortotopik bir GBM fare modelini tanımladık. GEM'deki tümörigenez, glial fibriler asidik proteini (GFAP) eksprese eden hücre popülasyonlarındaki (öncelikle astrositler) genetik olaylarla başlatılır ve GBM'ye ilerlemeyle sonuçlanır. Bu TRP GEM'ler, GFAP güdümlü Cre rekombinazına maruz kaldıktan sonra T121'i eksprese eden bir TgGZT121 transgeni (T) barındırır. T121 protein ekspresyonu, Rb (Rb1, p107 ve p103) protein aktivitesinin baskılanmasına neden olur. GFAP güdümlü Cre transgeninin (GFAP-CreERT2) birlikte ekspresyonu, tamoksifen ile indüksiyondan sonra yetişkin astrositlere ekspresyonu hedefler. TRP fareleri ayrıca Cre'ye bağımlı bir mutant Kras (KrasG12D; R) alel, reseptör tirozin kinaz yolunun aktivasyonunu temsil eder ve Pten (P)5,6 kaybı için heterozigottur. Reseptör tirozin kinaz (RTK), PI3K ve RB ağlarındaki eş zamanlı gen anormallikleri GBM patogenezinin %74'ünde rol oynar7. Bu nedenle, insan GBM'sinde değiştirilen birincil sinyal yolakları, TRP farelerindeki, özellikle de RTK'ların paylaşılan aşağı akış hedeflerinin aktive edildiği GBM tümörlerindeki mühendislik mutasyonları ile temsil edilir5.
GEM kaynaklı sinjenik ortotopik model, GBM'de anormal yolları hedefleyen kanser terapötiklerini değerlendirmek için bir platform olarak kullanılmak üzere, invazivlik ve alt tip biyobelirteçlerin varlığı da dahil olmak üzere insan beyin tümörlerinin özelliklerini özetleyen bir model olarak doğrulanmıştır. Hücreler, TRP beyinlerinden toplanan tümörlerden kültürlendi ve kortekste intrakraniyal enjeksiyon için stereotaktik ekipman kullanılarak, suşla eşleşen farelerin beynine yeniden implante edildi. Bu preklinik ortotopik fare modeli, yüksek mitotik orana sahip, yüksek hücresel, invaziv, pleomorfik GBM tümörleri geliştirdi ve insan GBM'sinde gözlendiği gibi, neoplastik hücreler ve yoğun vaskülarizasyon ile doğrusal nekroz odakları sergiledi. Tümör hacimleri ve büyümesi in vivo manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ile ölçüldü.
Bu yazıda, TRP tümörlerini örnek olarak kullanarak, birincil GBM hücrelerinin veya hücre hatlarının vahşi tip fare beynine intrakraniyal enjeksiyonu için en uygun tekniği tanımladık. Aynı protokol, bağışıklık sistemi baskılanmış fareler ve diğer GBM hücre hatları için uyarlanabilir. Enjeksiyon bölgesinde yetersiz hücre hazırlığı veya hücre sızıntısı gibi yaygın tuzaklardan kaçınmak ve modelin tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini sağlamak için stereotaktik ekipmanı doğru kullanmak için çok önemli ipuçları verilmiştir. Translasyonel amaçlar için, modeli canlı hayvanlarda beyin tümörü büyümesinin MRG tespiti, histolojik karakterizasyon ile doğruluyoruz ve tümör taşıyan farelerde bir tedavi örneği sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan çalışma protokolü, Frederick Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ndeki NCI tarafından onaylanmıştır. NCI-Frederick, AAALAC International tarafından akredite edilmiştir ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Halk Sağlığı Hizmeti Politikasını izlemektedir. Hayvan bakımı, "Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu"nda özetlenen prosedürlere uygun olarak sağlanmıştır (Ulusal Araştırma Konseyi, 2011; Ulusal Akademiler Yayınları, Washington D.C.)
1. Enjeksiyon için hücrelerin hazırlanması
NOT: Bu model için kullanılan fare beyin tümörü primer hücreleri (MBR'ler), El Meskini ve ark.5'te açıklandığı gibi, başlangıçta tamoksifen kaynaklı TRP GEM farelerinden izole edilmiştir. Hücre preparasyonu ile ilgili detaylar bu referansta bulunabilir.
- Bir biyogüvenlik kabininde steril teknik kullanarak aşağıdaki adımları uygulayın.
- Kültür primer beyin tümörü hücreleri üstel büyüme fazına ulaşana kadar in vitro .
- Hücreleri% 0.25 tripsin içinde toplayın ve ayrıldıktan sonra, tripsini etkisiz hale getirmek için onları büyüme ortamı ile seyreltin.
- Hücreleri 400 x g'da santrifüjleme ile pelet haline getirin ve serumsuz ortamlarla yıkayın. Saymadan önce bir kez tekrarlayın.
- Hücreleri el ile veya otomatik bir hücre sayacıyla sayın. Hücreleri, 2 μL'lik son enjeksiyon hacmine dayanarak, istenen konsantrasyonda, 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 5 steril metilselüloz içinde yeniden askıya alın. İstenilen hücre konsantrasyonu, hücre hattına ve beyin tümörü modeline bağlı olarak değişebilir. GBM GEM TRP hücreleri için, 25 x 106 hücre/ml'lik bir çözeltinin 2 μL'sini veya 50.000 hücreyi enjekte ediyoruz.
2. Fare gerginliği
- Beyin tümörü hücrelerinin suş arka planına uyan uygun bir fare suşu yetiştirin veya satın alın. TRP hücreleri için, tümör hücresi alıcıları olarak 9 haftalık B6D2F1 / J fareleri (C57BL / 6J [B6] dişileri ve DBA / 2J [D2] erkekleri arasındaki bir haçtan) kullanın.
3. Ameliyat alanının ayarlanması
NOT: Tüm cerrahi adımlar temiz, sterilize edilmiş bir ortamda aseptik teknik kullanılarak gerçekleştirilir. Keseler ve maske de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipmanlar cerrah tarafından giyilmelidir. Cerrahi aletler kullanımdan önce ısıl sterilize edilmelidir.
- Yüzey koruyucuları stereotaksik aparatın altına ve çalışma yüzeyine yerleştirin.
- Vinil boruyu anestezi makinesinden stereotaksik cihazın gaz anestezi platformunun IN portuna ve başka bir tüpü OUT portuna takın.
- Dijital ekranı bir güç kaynağına ve cihaza bağlayın.
- Mikro pompa kontrolörünü (Şekil 1A) bir güç kaynağına bağlayın ve mikro pompayı (Şekil 1A) cihazın manipülatör koluna takın (ayrıca üretici talimatlarına bakın).
- 2.000 nL hacim enjeksiyonu için mikro pompayı 5,6 nL/sn'ye ayarlayın.
- Sıcak boncuk sterilizatörünü açın.
- Fare ısıtma yastığını sıcaklık kontrol cihazına takın ve bir güç kaynağına bağlayın. Plakayı sahne platformuna yerleştirin. Plaka sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın.
- 30 G hassasiyetli bir şırıngayı geri yükleyin, kabarcıklara karışmamaya dikkat edin. Pistonu takın ve iğneyi takın. İğneyi yalnızca göbeğinden tuttuğunuzdan emin olun. Metilselüloz hücre karışımının bir damlası iğneden geçene kadar pistonu bastırın. İğnenin kenarlarını dikkatlice silerek veya çalışma yüzeyine steril bir gazlı bez pedi yerleştirip lekeleyerek iğneyi% 70'lik bir alkol hazırlama pedi ile temizleyin. İğneyi bükmemeye veya kırmamaya dikkat edin.
- Hassas şırıngayı mikro pompaya takın ve fareyi sahneye yerleştirmeden önce şırınga iğnesinin yer değiştirmesini önlemek için manipülatör kolunu sahneden uzağa döndürün.
4. Fareyi ameliyat için hazırlama
- Fareyi, izofluran buharlaştırıcı% 2,5'e ayarlanmış olarak veya kurumsal yönergelere göre indüksiyon odasına yerleştirerek uyuşturun. Burun konisine izofluran akışını açın.
- Fareyi stereotaksik aparatlara aktarın ve üst dişler burun konisi desteğine yerleştirilerek burun konisine sabitleyin (Şekil 1B, 9). Sabitlemek için burun konisi üzerindeki düğmeyi sıkın (Şekil 1B). Refleksi kontrol etmek için bir parmak sıkışması yaparak uygun bir anestezi seviyesi sağlayın.
- Yeterli oksijenlenmeyi sağlamak için kulakları, ayakları ve mukoza zarlarını renk (pembe) açısından izleyin. Ayrıca, solunum hızını izleyin (bir artış veya azalma, izofluran seviyelerini ayarlama ihtiyacını gösterebilir).
- Kulak çubuklarını (Şekil 1B) her iki kulağa da takın ve kafayı sabitlemek için düğmeyi sıkın.
- Fare anestezi altındayken gözleri yağlamak için göz merhemi uygulayın.
- Yeterli aseptik koşulları sağlamak için farenin kafasındaki kılları planlanan insizyondan yaklaşık% 150 daha büyük bir alana çıkarmak için kavisli forseps kullanın.
- Deri altından 0.5-1 mg/kg buprenorfin SR analjezi enjekte edin veya protokol onaylı başka bir analjezik kullanın.
- İç sıcaklığı izlemek ve anesteziye bağlı hipotermiyi önlemek için fare rektal probunu konumlandırın. Farenin vücut sıcaklığını 36,5 ila 38,5 °C arasında tutun.
- Cerrahi alanı, cerrahi bir ovma ve etanol arasında üç kez dönüşümlü olarak, dışa doğru daireler kullanarak sterilize edin.
- Cildi gergin çekmek için forseps kullanarak, neşter bıçağı ile gözlerin arasından başlayarak yaklaşık 1 cm'lik bir kesi yapın. Bregma insizyondan görülebilmelidir.
NOT: Uygun steril teknik için, cerrahi bölgeye yalnızca sterilize edilmiş aletlerin uçlarıyla dokunun ve alet uçlarını yalnızca steril bir yüzeye (otoklavlanmış bir alet paketinin içi gibi) yerleştirin. - Fazla bağ dokusunu kazımak için pamuk uçlu aplikatörün ahşap ucunu ve ardından kuruması için başka bir aplikatörün pamuk ucunu kullanın.
5. Hücre enjeksiyonu
- Manipülatör kolunu şırınga ataşmanı ile farenin üzerine geri döndürün ve sabitlemek için düğmeyi sıkın. Şırınga montajını bregma üzerinde hareket ettirmek için yatay düzlemdeki X ve Y düğmelerini kullanın. Bregma pozisyonunu onaylamak için Z düğmesini kullanarak iğneyi indirin. Dijital okuma konsolunu sıfıra ayarlayın.
- İğneyi istenen konuma taşımak için X ve Y düğmelerini ve ilgili dijital okumayı kullanın. Kortikal korteks lokalizasyonu için uygun koordinatlar 3 mm posterior, bregmaya 2 mm lateral sağ ve dura mater 2 mm derinliğindedir. İğneyi kafatasının yüzeyine taşımak için Z düğmesini kullanın.
- Ekli 25 G iğneli 1 mL'lik bir şırınga kullanarak kafatasındaki bir deliği delin. İğnenin eğimini 30 G hassasiyetli şırınga ve iğneye doğru yerleştirin ve manipülatör kolunu dikkatlice yana doğru döndürün. Başparmağınızı ve parmağınızı kullanarak, iğne ucu kafatası kapağını delene kadar iğneyi hafifçe basınçla yavaşça ileri geri yuvarlayın.
- İğne deliğinden herhangi bir kanı uzaklaştırmak için pamuk uçlu bir aplikatör kullanın. Manipülatör kolunu, deliğin üzerindeki yüklü hassas şırınga iğnesi ile uygun konuma getirin. İğneyi beyin durasına indirmek için Z düğmesini kullanarak iğnenin ucunu delikle hizalayın ve dijital okuma konsolunu sıfıra ayarlayın.
- Z düğmesini kullanarak iğneyi 1 mm indirin ve 1 dakika bekleyin. İstenilen derinliğe ulaşılana kadar tekrarlayın (belirtildiği gibi 2 mm).
NOT: İğne, çevredeki beyin dokusuna ek hasarı ve hücre çözeltisinin geri akışını önlemek için yavaşça indirilir. - Mikro pompayı çalıştırın ve ardından 2 μL enjekte edildiğinde pompanın durduğundan emin olmak için izleyin. Bu işlem belirtilen hızda yaklaşık 6 dakika sürmelidir. Ardından, iğneyi hareket ettirmeden önce 1 dakika bekleyin.
6. İğnenin çıkarılması ve yaranın kapatılması
- İğneyi 1 mm kaldırın ve 1 dakika bekleyin. İğne kafatasından tamamen kurtulana kadar tekrarlayın.
- Gerekirse, enjeksiyon bölgesinden herhangi bir kanı uzaklaştırmak için pamuk uçlu bir aplikatör kullanın.
- Pamuk uçlu bir aplikatörün ahşap ucunu kullanarak, küçük bir parça kemik mumu (~ 1 mm) alın ve bir koni haline getirin. Balmumu deliğe iterek kafatasındaki açıklığa yerleştirin.
- Bir boncuk sterilizatörü kullanarak forsepsleri ısıtın ve kafatasında kalan balmumu eritmek ve pürüzsüzleştirmek için kullanın.
- Kesinin içine kabaca iki damla bupivakain (anestezik) çözeltisi yerleştirin ve cildin kenarlarını bir araya getirmek için forseps kullanın.
- Cildi gergin bir şekilde çekin ve cildi kapatmak için bir veya iki yara klipsi yerleştirin.
- Fareyi temiz bir kurtarma kafesine, taslaksız bir alandaki bir ısıtma yastığına yerleştirin ve fareyi yakından gözlemleyin. Farenin normal muhafazaya dönmeden önce normal aktiviteye devam ederek anesteziden tamamen uyanmasına izin verin.
- Cerrahi prosedürü takiben fareyi günlük olarak kontrol edin ve kurumsal yönergelere göre ağrı yönetimini uygulayın.
- Analjezi için buprenorfin SR (Adım 4.6) kullanılırsa, sürekli salınımlı formül 72 saat sürer. Enjeksiyonu sadece 72 saat sonra görünür ağrı veya rahatsızlık varsa tekrarlayın. Doğru yapıldığında, fareler intrakraniyal enjeksiyonlardan iyi iyileşir ve ek analjeziye gerek yoktur.
- Zımbaları ameliyattan 7-10 gün sonra çıkarın.
- Canlı hayvan görüntüleme (MRG) ile tümör büyümesini izleyin.
- İnsancıl uç noktalara ulaşıldığında fareleri ötenazi yapın (yani, hayvan vücut ağırlığını% 20 kaybederse veya hipotermik hale gelirse).
- Bu beyin tümörlerinin invaziv doğası nedeniyle, fareleri düzensiz yürüyüş, kısmi felç, eğirme veya baş eğme gibi nörolojik semptomlar için gözlemleyin. İleri tümör büyümesinin bu klinik belirtilerinden herhangi biri gözlenirse bir fareyi ötenazi yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beyin tümörü hücreleri ile enjekte edilen fareler, nöbetler, ataksi veya kilo kaybı gibi tümör büyüme belirtileri için günlük olarak izlenmelidir. Beyin tümörü büyümesi düzenli aralıklarla MRI taraması ile de izlenebilir. Haftalık MRG taramaları, beyinde artan tümör yükünün ve tümör hacim ölçümlerinin görselleştirilmesini sağlar (Şekil 1C). Özellikle, TRP tümörleri agresif büyüme gösterir ve 3D tümör hacimleri, intrakraniyal enjeksiyondan sonraki 2 ila 3 hafta içinde MRG ile ölçülebilir (ortalama hacim 30 ila 40mm3). Temsili bir çalışmada, beyin tümörü taşıyan farelerin bir kohortu, radyasyon tedavisine karşı kontrol için iki gruba ayrıldı; MRG tümör hacmi ölçümü, radyasyon tedavisinden sonra tümör büyümesinin baskılanma eksikliğini ortaya koydu (Şekil 2A), tedavi edilen fareler için sağkalımda bir artışa neden olmadı (Şekil 2B).
Nekropside, tümörler şişmiş bir sağ yarımküre içinde beyinde karanlık bir nokta olarak (Şekil 3A, orta panel) veya daha büyük tümörlerde yükselmiş, koyulaşmış bir bölge olarak görünebilir. Histopatoloji analizi için, enjeksiyon bölgesi bölgesinden sagital kesitleme (Şekil 3A), tümör büyümesinin optimal olarak değerlendirilmesini ve malign olmayan beyin dokusuna invazyon derecesini sağlar. Sinjenik modellerdeki GBM tümörleri agresif bir şekilde büyüyebilir ve kafatasını nekropside gözlenebilen terminal bitiş noktası tarafından kırabilir. Buna karşılık, hücre implantasyonundan hemen sonra ekstrakraniyal büyüme muhtemelen enjeksiyon sırasında MRI taramalarında (Şekil 3B) veya canlı bir farede kafadaki kubbeli bir alandan gözlemlenebilen bir hücre sızıntısını gösterir. İğne enjeksiyon bölgesinden çok hızlı bir şekilde çıkarılmış olabilir (bakınız Bölüm 6). Ekstrakraniyal büyüme, histolojik değerlendirme ile enjeksiyon bölgesinde kaçak olarak doğrulanır.
TRP ortotopik modelinde, histopatoloji, psödopalizading ve nekroz gibi TRP GEM tümörlerinde gözlenen ayırt edici özelliklerin özetlenmesi de dahil olmak üzere derece IV astrositom/GBM varlığını doğrulamıştır (Şekil 4). İnsan GBM alt sınıflaması için tanımlanan GBM nöral kök hücre ve progenitör belirteçleri immünohistokimya ile değerlendirildi (Şekil 5). Glial fibriler asidik proteinin (GFAP) yaygın ekspresyonu, astrositik progenitör kökenli proliferatif bir tümörü gösterirken, Nestin ve Sox-2 nöronal progenitör belirteçleridir ve Olig-2 ekspresyonu, oligodendrositik kökenli hücrelerin varlığını doğrular 5,7. Dört belirtecin tümü, insan GBM8'in alt tiplerinde yüksek oranda ifade edilir.
Şekil 1: Seri MRG ile görselleştirilen TRP GBM tümörlerinin intrakraniyal implant aparatı kurulumu ve büyümesi. (A) İntrakraniyal implant için gerekli farklı elemanlarla aparat kurulumu (1 ila 11 tanımlanmıştır); spesifik fare kafası yerleştirme ve inhalasyon anestezi ünitesi (B)'de büyütülür. Haftalık görüntüleme, özel yapım dört fare SENSE dizisi yüzey bobini 5,9 ile bir MRI 3.0T klinik tarayıcısında gerçekleştirildi. Çok kesitli T2 ağırlıklı turbo spin ekosu (T2w-TSE) dizisi: (TR/TE (4437/100 ms), düzlem çözünürlüğünde (0,12 x 0,15 mm), dilim kalınlığında (0,5 mm), eksenel düzlemde fare beyninin tamamını kaplayacak şekilde SENSE ivme faktörü (4) görüntüleri elde edilmiştir. İmplant sonrası 3, 4 ve 5. haftalarda tümörlerden koronal kesitler gösterilmiştir. MRG görüntüleri için temsili bir ölçek çubuğu sağ altta (C) belirtilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Radyasyon tedavisi ile ortotopik bir GBM modelinin temsili etkinlik çalışması. (A) MRI taramalarından hesaplanan, tümör sonrası implantların 2, 3 ve 4. haftalarına karşılık gelen üç boyutlu tümör hacimleri. Beyin tümörlerinin hacimleri, MRG görüntülerinin analizi ile ölçüldü. ITK_SNAP programına bir MRI görüntüsü yüklendikten sonra, görüntü kontrastı ve görüntü yoğunluğu bölge filtresi ayarlandı. Aktif kontur başlatma ve görüntü segmentasyonunu takiben, tümör hacmi kübik milimieterlerde ölçüldü. Bireysel kontrol (tedavi edilmemiş) fareler ve ışınlama ile tedavi edilen fareler (toplam 15 Gy için 5 gün boyunca günde 3 Gy) çizilir. (B) Radyasyonla tedavi edilen farelerin kontrole kıyasla hayatta kalmaları. Hayatta kalma yüzdesi, toplam n = 11 işlenmemiş fareden ve n = 12 radyasyonla tedavi edilmiş fareden grafik yazılımı (Malzeme Tablosuna bakınız) ile hesaplanmıştır. Çalışma fareleri, kurumsal yönergelerimize dayanarak insancıl son noktalara ulaşıldıkça ötenazi yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Nekropside beyindeki tümör lokalizasyonu . (A) Sağ fare yarımküresinde tümör büyümesinin doğru yeri. Sol panel, çalışma sonlandırmada bir MRI taramasından beyindeki bir tümörün bir örneğini gösterir; Kırmızı ok, tümörün yerini gösterir. Disseke edilmiş fare beyni kafatası içinde (orta panel) gösterilir ve kafatası boşluğundan (sağ panel) çıkarılır. Orta panelde, mavi oklar enjeksiyon bölgesinin iğne etkisini gösterir ve çift başlı oklar, sağ yarımküreyi iki parçaya bölerek histoloji için beyin sagital kesiminin önerilen yerini gösterir. Her iki beyin parçası da "açık kitap" tarzında parafine gömülüdür. Kesikli çizgi, iki beyin yarımküresini referans olarak ayıran medyan uzunlamasına çatlağı gösterir. Sağ panelde, kesikli çizginin çevrelediği alan, nekropside görünür tümör bölgesini temsil eder. (B) MRI taramasında fare kafatasının dışında büyüyen bir beyin tümörü örneği gösterilmektedir. Her iki MRG görüntüsü için temsili bir ölçek çubuğu Şekil 3A'da gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Ortotopik TRP GBM tümörlerinin histopatolojisi, insan GBM'sinin ayırt edici özelliklerini özetlemektedir. Hematoksilin ve eozin (H&E) boyalı, tüm beynin sagital bölümleri ACVP kurulu sertifikalı bir veteriner patolog tarafından değerlendirildi ve tümörler, insan astrositomları için mevcut Dünya Sağlık Örgütü (WHO) sınıflandırmasına göre derecelendirildi10,11. Ortotopik GBM tümörleri oldukça çoğaltıcı, invaziv (I) ve vaskülarize (V) olup, neoplastik hücreler tarafından nekroz (N) ve psödopalizading (P) dahil olmak üzere insan GBM histopatolojisinin ayırt edici özelliklerini gösterir12. Kesikli çizgiler, beyin tümörü içindeki ve çevresindeki, normal beyin dokusuna bitişik alanların büyütülmesini gösterir (sırasıyla sağ üst ve alt). İmmünohistokimya için antikorlar ve yöntemler El Meskini ve ark.5'te tanımlanmıştır. Hem düşük hem de yüksek büyütmeler için H&E görüntüleri için bir ölçek çubuğu gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Ortotopik modelde ifade edilen GBM'nin biyobelirteçleri. Multipotent progenitör belirteç SOX-2 (SRY-Box transkripsiyon faktörü 2), nöral progenitörler Nestin ve Olig-2 ve glial fibriler asidik protein (GFAP) astrositik belirtecinin ekspresyonu, insan GBM 7,8'in ortak bir özelliği olan hücresel heterojeniteyi gösterir. Tüm IHC görüntüleri için temsili bir ölçek çubuğu Olig2'de gösterilmiştir (Oligodendrosit transkripsiyon faktörü 2; sağ altta). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GBM'de yeni terapötik hedeflerin ve yeni tedavi stratejilerinin değerlendirilmesi için preklinik modeller gereklidir. GBM için genetiği değiştirilmiş fare modelleri, otokton bölgede tümör oluşumu avantajına sahiptir, ancak genellikle uzun bir gecikme süresi ve öngörülemeyen tümör büyümesi ile13. GEM modeli tümörler 4-5 aylık bir gecikme gösterir ve görüntüleme, işe alım ve tedavi için ideal zaman aralığı bireysel fareler arasında değişkendir. Ortotopik model, 4-5 haftalık iyi kurulmuş ve izlenebilir bir büyüme ve tedavi zaman çizelgesine sahiptir ve tümörler implant sonrası MRG ile güvenilir bir şekilde tespit edilir. GEM kaynaklı ortotopik modellerin kullanılması, tümörün her farede tam olarak yerine yerleştirilmesine ve ayrıca çevredeki beyin mikro ortamının avantajını korurken, tümör büyümesinin başlatılmasının zamansal kontrolüne izin verir. TRP ortotopik modelinde, aktive RTK, PTEN ve RB yolakları, insan GBM'sinin histolojik özelliklerini özetleyen bir tümör modeli üretir. İnsan GBM'sine benzer şekilde, ortotopik TRP GBM tümörleri, psödopalizading neoplastik hücrelerle çevrili nekrotik odaklar ve neovaskülarizasyon gibi agresif büyüme özellikleri gösterir. Tümörler ayrıca çevredeki beyin parankimine invazivdir. Bu nedenle TRP ortotopik tümörlerde hastalarda tümör infiltrasyonunu ve migrasyonunu baskılayabilecek ajanlar preklinik olarak değerlendirilebilir. İnvaziv GEM tümörlerinden sinjenik farelere hücre enjekte etme işlemi, hedeflenen bölgenin dışındaki hücrelerin istenmeyen sızıntısını ve büyümesini önlemek için özel dikkat gerektirir. Burada açıklanan yöntem, rutin olarak uygulandığında, tutarlı tümör büyümesine sahip büyük tümör taşıyan fare kohortları oluşturmak için kullanılabilir.
Başarılı tümör enjeksiyonunu etkileyebilecek protokoldeki kritik adımlar, iğnenin beyinden hücre sonrası enjeksiyondan çıkarılmasını ve kemik mumu kullanımını içerir. İğne, çevreleyen beyin dokusuna ek hasar gelmesini ve artık hücrelerin sızmasını veya enjekte edilen süspansiyonun geri akışını önlemek için bir seferde 1 mm (adım 5 ve 6'da açıklandığı gibi) yerleştirilmeli ve çıkarılmalıdır14. İğne deliğini tıkamak ve kapatmak için erimiş kemik balmumu kullanımı, hücrelerin bir metilselüloz süspansiyonuna implante edilmesi gibi, hücre sızıntısını önlemek için bir bariyer oluşturur. Önemli olarak, metilselüloz, beyin hücrelerini yeniden askıya almadan önce PBS (veya alternatif olarak serumsuz ortam) gibi tamponlanmış bir çözelti içinde karıştırılmalıdır. Ek olarak, iyileşme süresini kısaltmak için enjekte edilebilir anestezi yerine inhalasyon anestezisi kullanımı tercih edilir.
Kafa boyutunun fare suşları arasında veya yaşa ve cinsiyete göre biraz farklı olabileceğini unutmayın; Bu nedenle, bir fare kohort türünden diğerine geçerken stereotaktik ekipmanın yeniden kalibre edilmesi gerekebilir. Ayrıca, büyük bir kohortla devam etmeden önce az sayıda farede ilgilenilen her hücre hattı için enjeksiyon için hücre sayısının optimizasyonunu öneririz. İnsan ksenogreftleriyle karşılaştırıldığında, murin tümörleri, suşla eşleşen farelere yeniden implante edildiğinde agresif bir şekilde büyüyebilir ve TRP çizgilerinde gözlemlediğimiz gibi, enjeksiyon için daha az hücre gerektirir.
Ortotopik beyin enjeksiyonunun bir GEM modelinde glioblastomun başlaması ve büyümesine kıyasla önemli bir avantajı, enjekte edilen tümörü çevreleyen dokunun normal olması ve lokal invazivliğin histopatoloji ile değerlendirilebilmesidir. Bununla birlikte, enjeksiyon yarasının kendisinden dolayı mikro ortamdaki değişiklikleri göz ardı edemeyiz, bu da muhtemelen lokal bir enflamatuar yanıt veya kan-beyin bariyerinin bozulmasına neden olur.
Sonuç olarak, ortotopik modeller, tedavi için makul bir zaman çizelgesi ile ve doğal tümör lokalizasyonu bağlamında GBM'nin incelenmesine izin vermektedir. Modelimiz, insan GBM özelliklerini özetler, ancak immünokompetan bir farede; Bu nedenle, immün mikro çevre tümör büyümesine göre veya immünoterapiye yanıt olarak analiz edilebilir. Tümör büyümesi, tümörün kapsüllenmiş kaldığı ve insan GBM13,15,16'nın histolojik özelliklerini göstermediği birçok hücre hattı ksenogreft GBM modelinin aksine agresif ve invazivdir. Doğru uygulandığında, burada açıklanan prosedür, hücre sızıntısı veya ekstrakraniyal yayılma olmadan güvenilir tümör büyümesi ile sonuçlanır.
Son olarak, bu protokol GBM bağlamında ortotopik bir fare modeli olarak optimize edilmiş olmasına rağmen, klinik öncesi çeviride doğruluğu ve güvenilir uygulaması diğer beyin tümörü alt sınıflarının modellerine uyarlanabilir. Bu protokoldeki yöntemler ve reaktifler, stereotaksik koordinatların ayarlanması ile ilgilenilen beyin tümörü modeli (örneğin, diffüz orta hat glioma17) için mutasyonlar taşıyan farklı hücre tipi implantlar için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Mükemmel teknik yardım için Sayın Alan E. Kolaga'ya ve cerrahi teknikleri geliştirdiği için Sayın Michelle L. Gumprecht'e minnettarız. Patoloji analizi için Dr. Philip L. Martin'e ve MRI taramaları için Frederick Ulusal Laboratuvarı Küçük Hayvan Görüntüleme Programı'ndan Bayan Lilia Ileva ve Dr. Joseph Kalen'e teşekkür ederiz.
Bu proje tamamen veya kısmen, HHSN261201500003I sayılı Sözleşme kapsamında Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden Federal fonlarla finanse edilmiştir. Bu yayının içeriği, Sağlık ve İnsani Hizmetler Bakanlığı'nın görüşlerini veya politikalarını yansıtmak zorunda değildir ve ticari isimlerin, ticari ürünlerin veya kuruluşların belirtilmesi ABD Hükümeti tarafından onaylandığı anlamına gelmez.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
| Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
| B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
| Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
| CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
| Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
| Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
| Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
| Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
| Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
| KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
| Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 pipette | Gilson | F123600 | |
| Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |
References
- Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. Glioblastoma. , (2017).
- Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. Experimental models and tools to tackle glioblastoma. Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).
- Wen, P. Y., Kesari, S.
- Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- El Meskini, R., et al. A preclinical orthotopic model for glioblastoma recapitulates key features of human tumors and demonstrates sensitivity to a combination of MEK and PI3K pathway inhibitors. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 45-56 (2015).
- Song, Y., et al.
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103 (10), 1871-1879 (2012).
- Choyke, P. L., Dwyer, A. J., Knopp, M. V. Functional tumor imaging with dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 17 (5), 509-520 (2003).
- Raza, S. M., et al. Identification of necrosis-associated genes in glioblastoma by cDNA microarray analysis. Clinical Cancer Research. 10, 212-221 (2004).
- Raza, S. M., et al. Necrosis and glioblastoma: a friend or a foe? A review and a hypothesis. Neurosurgery. 51 (1), 2-12 (2002).
- Hambardzumyan, D., Bergers, G.
- Kijima, N., Kanemura, Y. Glioblastoma. Mouse Models of Glioblastoma. , Exon Publications. (2017).
- Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PloS One. 9 (4), 94919 (2014).
- Jin, F., Jin-Lee, H. J., Johnson, A. J.
- Zalles, M., Towner, R. A. Pre-Clinical Models and Potential Novel Therapies for Glioblastomas. Gliomas. , Exon Publications. 1-13 (2021).
- Wierzbicki, K., et al. Targeting and therapeutic monitoring of H3K27M-mutant glioma. Current Oncology Reports. 22 (2), 19 (2020).
