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Genetics

Nachweis eines horizontalen Gentransfers, der durch natürliche konjugative Plasmide in E. coli vermittelt wird

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64523
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1, 2
1School of Biological Sciences, University of California Irvine, 2Department of Microbiology & Environmental Toxicology, University of California Santa Cruz

Summary

Die Konjugation vermittelt den horizontalen Gentransfer, indem sie Plasmid-DNA über zwei verschiedene Zellen mobilisiert und so die Verbreitung nützlicher Gene erleichtert. Diese Arbeit beschreibt eine weit verbreitete Methode zur effizienten Detektion des konjugativen Plasmidtransfers, die auf der Verwendung von Differentialmarkern im konjugativen Plasmid, Spender und Empfänger basiert, um die Transkonjugation zu erkennen.

Abstract

Die Konjugation stellt einen der Hauptmechanismen dar, die den horizontalen Gentransfer in gramnegativen Bakterien erleichtern. Diese Arbeit beschreibt Methoden zur Untersuchung der Mobilisierung von natürlich vorkommenden konjugativen Plasmiden am Beispiel zweier natürlich vorkommender Plasmide. Diese Protokolle beruhen auf dem differentiellen Vorhandensein von selektierbaren Markern in Spender-, Empfänger- und konjugativem Plasmid. Konkret umfassen die beschriebenen Methoden 1) die Identifizierung natürlicher konjugativer Plasmide, 2) die Quantifizierung der Konjugationsraten in Festkultur und 3) den diagnostischen Nachweis der Antibiotikaresistenzgene und Plasmidreplicon-Typen in transkonjuganten Empfängern durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Die hier beschriebenen Protokolle wurden im Zusammenhang mit der Untersuchung der Evolutionsökologie des horizontalen Gentransfers entwickelt, um das Vorhandensein von konjugativen Plasmiden, die Antibiotikaresistenzgene tragen, in Bakterien in der Umwelt zu untersuchen. Der in diesen Kulturexperimenten beobachtete effiziente Transfer von konjugativen Plasmiden unterstreicht die biologische Relevanz der Konjugation als Mechanismus, der den horizontalen Gentransfer im Allgemeinen und die Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen im Besonderen fördert.

Introduction

Im Jahr 1946 beschrieben Lederberg und Tatum1 einen sexuellen Prozess in Escherichia coli K-12, der heute als Konjugation bekannt ist. Bakterielle Konjugation ist der Prozess, bei dem eine Bakterienzelle (der Spender) unidirektional genetisches Material durch direkten Zell-zu-Zell-Kontakt auf eine andere Zelle (den Empfänger) überträgt. Die Konjugation ist in Bakterien2,3 weit verbreitet, obwohl der Anteil der Spenderzellen, die die Konjugationsmaschinerie exprimieren, typischerweise sehr klein ist4.

Plasmide sind autonom replizierende extrachromosomale DNA-Elemente. Zusätzlich zu den Genen, die an der Replikation und Aufrechterhaltung von Plasmiden beteiligt sind, tragen Plasmide häufig eine Vielzahl von Genen, die an der Anpassung an Umweltprobleme wie Schwermetalle oder die Exposition gegenüber Antibiotika beteiligt sind5. Konjugative Plasmide sind eine Klasse von Plasmiden mit einer Reihe spezialisierter Gene, die ihre Übertragung auf Empfängerzellen ermöglichen und ihre Persistenz nach der Übertragung unterstützen6. Konjugative Plasmide variieren in der Größe von 21,8 kb bis 1,35 Mb in Bakterien im Stamm Pseudomonadota (gleichbedeutend mit Proteobakterien), wobei der Median um 100 kb 5,7 liegt. Sie haben in der Regel auch eine niedrige Kopienzahl, möglicherweise um die metabolische Belastung des Wirts niedrig zu halten 8,9.

Der typische konjugative Apparat besteht aus vier Komponenten: einem Transferursprung (oriT), einer Relaxase, einem Typ-IV-Kopplungsprotein und einem Typ-IV-Sekretionssystem (eine röhrenartige Struktur namens Pilus, die es den Spendern ermöglicht, mit den Empfängern in Kontakt zu treten)6. Nur ein sehr kleiner Teil der Zellen, die konjugative Plasmide tragen, exprimieren die Konjugationsmaschinerie4, aber wenn die Plasmide einen Fitnessvorteil bieten, können sich die Transkonjuganten schnell in der Population ausbreiten. Zwischen 35% und über 80% der E. coli-Isolate, die aus verschiedenen Lebensräumen gesammelt wurden, haben konjugative Plasmide mit Genen, die Resistenz gegen mindestens ein Antibiotikum verleihen10,11; Daher ist der horizontale Gentransfer, der durch konjugative Plasmide vermittelt wird, ein wichtiger Mechanismus, der die globale Ausbreitung von Antibiotikaresistenzgenen antreibt12.

In Laborkultur durchgeführte Paarungsexperimente haben gezeigt, dass die Konjugationshäufigkeit von mehreren Faktoren beeinflusst wird, einschließlich der Art der Empfängerzellen, der Wachstumsphase, der Zelldichte, des Spender-Empfänger-Verhältnisses, ob die Konjugation in flüssigen oder festen Medien durchgeführt wird, Kohlenstoff, Sauerstoff, Gallensalzen, Metallkonzentrationen, Vorhandensein von Säugetierzellen, Temperatur, pH-Wert und Paarungszeit13,14, 15. Sonstiges

Diese Arbeit beschreibt Protokolle zum Nachweis des Vorhandenseins von konjugativen Plasmiden in einem bestimmten Wirtsstamm, zur Quantifizierung der Konjugationsraten in fester Kultur und zur Überprüfung ihrer Übertragung auf Empfängerzellen. Diese Protokolle können als erster Schritt zur Identifizierung natürlicher konjugativer Plasmide verwendet werden, die für die Forschung geeignet sind. Sie verwenden eine minimale Anzahl vereinfachter Schritte, da sie darauf ausgelegt sind, das Vorhandensein konjugativer Plasmide in Bakterien zu untersuchen, die aus mehreren Quellen (Umwelt, kommensal und pathogen) in großem Maßstab (Dutzende bis Hunderte von Spendern) stammen.

Darüber hinaus werden Tests gezeigt, um nachzuweisen, ob die Mobilisierung eines bestimmten konjugativen Plasmids unabhängig von dem für den Nachweis verwendeten Antibiotikum ist (d.h. die Relevanz des Antibiotikaresistenzgens unter Selektion) und um die Konjugationsraten zweier konjugativer Plasmide in verschiedenen Umweltisolaten zu vergleichen.

Basierend auf der genetischen Zusammensetzung der relevanten konjugativen Plasmide (Plasmidreplikon und Antibiotikaresistenzgen-Make-up) kann jeder Schritt des Protokolls modifiziert werden, um die Auswirkungen einer Vielzahl von Faktoren zu untersuchen, die die Konjugationsrate beeinflussen können.

Allgemeines Versuchsdesign:
Die wesentlichen Komponenten, die für den Aufbau eines Paarungsexperiments benötigt werden, sind Spenderzellen, ein Empfängerstamm und feste Medien zur Auswahl von Spendern (Antibiotikum A), Empfängern (Antibiotikum B) und Transkonjuganten (Antibiotikum A und B). Transkonjuganten sind Empfängerzellen, die das konjugative Plasmid des Spenders stabil halten.

Spenderzellen sind resistent gegen ein Antibiotikum (Antibiotikum A) und anfällig für den Marker oder die Marker, die zur Auswahl der Empfängerzellen verwendet werden (Antibiotikum B). Die genomische Lokalisation des Antibiotikaresistenzgens (d.h. ob es sich im Chromosom oder in einem Plasmid der Spenderzelle befindet) muss nicht a priori bekannt sein, da die Mobilisierung von Antibiotikaresistenzmarkern für den Empfänger (nach einem direkten Spender-Empfänger-Kontakt) impliziert, dass sich die vom Spender bereitgestellten Marker in einem Plasmid befanden.

Ein Empfängerstamm (von dem bekannt ist, dass er konjugative Plasmide einnimmt) muss einen stabilen selektierbaren Marker haben, der im Spender nicht vorhanden ist. Dieser wählbare Marker ist im Allgemeinen resistent gegen ein Antibiotikum oder Biozid, das sich im Chromosom befindet. Die Auswahl des Empfängers, der in Paarungsexperimenten verwendet werden soll, ist von entscheidender Bedeutung, da einige E. coli-Stämme in ihrer Fähigkeit, konjugative Plasmide aufzunehmen, variieren16.

Sobald diese Komponenten etabliert sind, ist jede Kolonie, die nach einem Spender-Empfänger-Paarkontakt auf Medien mit beiden Antibiotika (A und B) wächst, ein mutmaßlicher Transkonjugant (Abbildung 1). Dies setzt voraus, dass Spender in Medien mit Antibiotikum A wachsen können, aber nicht in Medien mit Antibiotikum B, und dass Empfänger in der Lage sind, in Medien mit Antibiotikum B zu wachsen, aber nicht in der Lage, mit Antibiotikum A zu wachsen. Der erste Test besteht aus dem Nachweis (durch Polymerase-Kettenreaktion [PCR], Amplifikation von Genen oder anderen Methoden) von Genen, die im konjugativen Plasmid in transkonjuganten Kolonien gefunden wurden. Der zweite Test beinhaltet die Verwendung von differentiellen Koloniefarbmarkern basierend auf dem Laktosestoffwechsel. Die unterschiedliche Koloniefarbe wird durch die Verwendung von MacConkey-Agar aufgedeckt; Die Laktose im Agar kann von Laktose-fermentierenden (LAC+) Mikroorganismen als Fermentationsquelle genutzt werden. Diese Mikroorganismen produzieren organische Säuren, insbesondere Milchsäure, die den pH-Wert senken. Neutrales Rot ist ein im Medium enthaltener pH-Indikator, der sich von cremefarben zu leuchtend rot/rosa verfärbt, wenn der pH-Wert unter 6,817 fällt. So produzieren E . coli-Laktose-positive Stämme größere rosa Kolonien auf MacConkey-Agar, während Laktose-negative Stämme blassgelbe und kleinere Kolonien auf MacConkey-Agar produzieren.

Figure 1
Abbildung 1: Experimentelles Design zum Nachweis des Vorhandenseins konjugativer Plasmide in Spenderstämmen. In diesem Beispiel trägt der Spender ein konjugatives Plasmid mit einem Antibiotikaresistenzgen, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum A verleiht, aber er ist anfällig für das Antibiotikum B. Umgekehrt hat der Empfänger eine chromosomale Resistenzdeterminante, die Schutz vor dem Antibiotikum B bietet, aber es ist anfällig für das Antibiotikum A. Transkonjuganten sind gegen beide Antibiotika (A und B) resistent. weil sie das konjugative Plasmid des Spenders haben, das Resistenz gegen das Antibiotikum A verleiht, und das Chromosom des Empfängers, das Schutz vor dem Antibiotikum B bietet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Konjugationsrate für ein Spender-Empfänger-Paar (unter gegebenen experimentellen Bedingungen) kann berechnet werden, indem die Anzahl der Transkonjuganten durch die Anzahl der Spender oder durch die Anzahl der Empfänger dividiert wird. Die erste Rate gibt den Anteil der Spenderzellen an, die eine funktionelle Expression der Konjugationsmaschinerie durch den Spender aufweisen16,18, während die zweite Rate die Fähigkeit des Empfängers angibt, konjugative Plasmide 19,20 zu nehmen. In dieser Studie stellt die Konjugationsrate, sofern nicht anders angegeben, den Anteil der Empfängerzellen dar, die transkonjugant werden (d.h. Rate pro Empfänger).

Hier werden zwei unabhängige Paarungsexperimente berichtet, an denen ein E. coli-Empfänger und zwei E. coli-Spender beteiligt waren. Darüber hinaus wurden verschiedene Antibiotika verwendet, um Transkonjuganten für einen der Spender auszuwählen, um zu bestätigen, dass ein einzelnes multiresistentes Plasmid mit jedem der im konjugativen Plasmid gefundenen Antibiotikaresistenzgene ausgewählt werden kann.

Die in dieser Arbeit verwendeten Spender- und Empfängerstämme wurden vollständig sequenziert, um alle Komponenten dieses experimentellen Systems zu verstehen. Diese Protokolle wurden jedoch entwickelt, um nach dem Vorhandensein von konjugativen Plasmiden in Wirten unbekannter Sequenz zu suchen, und können auch in diesem experimentellen Kontext verwendet werden. In diesem Fall werden jedoch zuerst die relevanten Gene sequenziert.

Die im Protokoll verwendeten Spender- und Empfängerstämme sind die folgenden:

Spender 1. E. coli SW4955 wurde in einem See in Baton Rouge (LA, USA) gesammelt. Es hat ein konjugatives Plasmid mit 134.797 bp (p134797) mit IncFIC(FII) und IncFIB (AP001918) Replikons. Dieses konjugative Plasmid verfügt über Gene, die Resistenz gegen Cephalosporine der dritten Generation (blaCTX-M-55), Aminoglykoside (aac(3)-IIa und aadA1), Phänicole (catA2), Tetracycline (tet(A)), Trimethoprim (dfrA14) und Sulfonamide (sul3) verleihen. Eine vollständige Karte von p134797 finden Sie in Abbildung 2A. E. coli SW4955 ist Laktose-positiv und produziert rosa Kolonien auf MacConkey-Agar.

Spender 2. E. coli SW7037 wurde im Eriesee (Ottawa County, OH, USA) gesammelt. Es trägt ein konjugatives Plasmid (p101718) mit 101.718 bp und einem IncI1-I(Alpha)-Replikon. Dieses konjugative Plasmid hat ein Gen, das Resistenz gegen Beta-Lactame verleiht (blaCMY-2). Eine vollständige Karte von p101718 finden Sie in Abbildung 2B. E. coli SW7037 ist auch Laktose-positiv und produziert rosa Kolonien auf MacConkey-Agar.

Figure 2
Abbildung 2: Genetische Karte der in dieser Studie verwendeten konjugativen Plasmide . (A) Plasmid p134797, das konjugative Plasmid, das im E. coli-Stamm SW4955 gefunden wurde. (B) Plasmid p101718, das konjugative Plasmid, das im E. coli-Stamm SW7037 gefunden wird. Antibiotikaresistenzgene sind blau und Gene, die zum Konjugationsapparat gehören, rot hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Empfänger. E. coli Als Empfänger wird LMB100 verwendet. Dies ist ein plasmidloser Stamm, der gegen Rifampicin (100 mg/L) und Streptomycin (100 mg/L) resistent ist. Eine Resistenz gegen zwei Antibiotika verringert die Wahrscheinlichkeit, dass beim Spender Resistenzmutationen auftreten, die die Interpretation der Ergebnisse beeinträchtigen würden. Darüber hinaus ist E. coli LMB100 laktosenegativ und kann von den beiden Spenderstämmen unterschieden werden, da es hellgelbe und kleine Kolonien (im Gegensatz zu größeren, rosa Kolonien) auf MacConkey-Agar produziert.

Wenn der Spender laktosenegativ ist, empfehlen wir die Verwendung eines laktosepositiven Empfängers (z. B . E. coli J53). Die LMB100- und J53-Stämme stehen anderen Laboren zur Verwendung zur Verfügung. Bitte senden Sie eine Anfrage an Dr. Gerardo Cortés-Cortés mit einer Adresse und einer FedEx-Nummer.

Das feste Medium, das zur Auswahl und Zählung von Spendern, Empfängern und Transkonjuganten benötigt wird, ist MacConkey-Agar in Petrischalen mit einem Durchmesser von 100 mm. Die Zugabe der folgenden Antibiotika ist erforderlich: (i) Medium A: Carbenicillin (100 mg/l), um die Spender zu zählen und sicherzustellen, dass die Empfänger mit diesem Antibiotikum nicht wachsen können. (ii) Medien B: Rifampicin (100 mg/l) + Streptomycin (100 mg/l), um die Empfänger zu zählen und sicherzustellen, dass die Spender diese beiden Antibiotika nicht züchten können. iii) Medien AB: Carbenicillin (100 mg/l) + Rifampicin (100 mg/l) + Streptomycin (100 mg/l) zur Gewinnung und Zählung von Transkonjutanten. (iv) Medium C: keine Antibiotika, um alle untersuchten Isolate zu streifen.

Die Konjugationsraten von konjugativen Plasmiden von E. coli SW4955 und E. coli SW7037 bis E. coli LMB100 werden verglichen. Darüber hinaus wird im Fall des konjugativen Plasmids p134797 (SW4955-Stamm) das Antibiotikum Carbenicillin (100 mg/l) in nachfolgenden Experimenten durch Gentamicin (2 mg/l), Chloramphenicol (25 mg/l), Tetracyclin (10 mg/l), Trimethoprim (20 mg/l) oder Sulfamethoxazol (100 mg/l) ersetzt, um festzustellen, ob der für die Selektion verwendete Antibiotikaresistenzmarker einen Einfluss auf die Ergebnisse hat.

Protocol

1. Methode 1: Konjugation

  1. Tag 1: Streifen Sie die Spender und Empfänger. Streifen Sie getrennt von den Glycerinvorräten auf Medium C (MacConkey-Agar ohne Antibiotika) und inkubieren Sie es über Nacht bei 37 °C.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist notwendig, um sicherzustellen, dass das Experiment mit reinen Isolaten durchgeführt wird, und um den Laktose-Phänotyp durch die Farbe der Kolonien zu bestätigen.
  2. Tag 2: Beschriften Sie ein 14,0-ml-Kulturröhrchen für jeden Spender und Empfänger. Wählen Sie eine einzelne Kolonie von jedem Spender und Empfänger aus und züchten Sie sie über Nacht (18 h) in separaten 14,0-ml-Kulturröhrchen, die 2 ml Mueller-Hinton-Brühe bei 37 °C und Schütteln bei 200 U/min enthalten.
    HINWEIS: Bei den verwendeten Stämmen wird die stationäre Phase nach einer Nachtkultur von 18 h erreicht.
  3. Tag 3: Messen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600) der Nachtkultur jedes Spenders und Empfängers (kein Vortexing) mit einer 1:10-Verdünnung von 900 μl Kochsalzlösung und 100 μl der Nachtkultur.
  4. Stellen Sie die optische Dichte jedes Spenders und Empfängers mit sterilisierter Kochsalzlösung (0,85% NaCl in Wasser) auf 2,0 (OD600 = 2,0) ein.
    HINWEIS: Eine Übernachtkultur von E. coli mit einem OD600 = 2,0 hat 1,6 x 109 KBE/ml.
  5. Beschriften Sie ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen als "Gegenröhrchen" und geben Sie die Spender- und Empfängerstämme an. Übertragen Sie 500 μl der angepassten (OD600 = 2,0) Suspension jedes Spenders und Empfängers und legen Sie sie in das Gegenröhrchen (dieses Gegenröhrchen hätte 0,8 x 109 KBE/ml von jedem Spender und Empfänger). Mischen Sie das Gegenrohr vorsichtig durch Inversion.
  6. Zentrifugieren Sie das Gegenröhrchen für 10 min bei 500 x g bei Raumtemperatur.
  7. Pipettieren Sie, ohne das Pellet zu stören, 800 μl des Konjugationsröhrchens aus. Im Konjugationsröhrchen sollten noch 200 μl vorhanden sein.
    HINWEIS: Entsorgen Sie den Überstand in einen 10%igen Bleichbehälter, um Bakterien in der Suspension zu inaktivieren.
  8. Inkubieren Sie das Gegenröhrchen für 18 h (über Nacht) bei 37 °C in einem Inkubator. Die Paarung erfolgt während der Inkubationszeit.
    HINWEIS: Dieser Schritt muss ohne Schütteln durchgeführt werden, um den konjugativen Pili nicht zu brechen.
  9. Als Negativkontrolle streifen Sie die Nachtkultur von Spendern auf Medium B und Empfängern auf Medium A. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C
  10. Tag 4: Geben Sie 800 μl Kochsalzlösung in das Gegenrohr und den Wirbel, um sie zu resuspendieren (dies rekonstituiert die Gegenmischung auf 1 ml).
    HINWEIS: Durch das Vortexen werden die Paarungsbakterien auseinander gebrochen und die Kultur homogenisiert, um die KBE/ml zu quantifizieren.
  11. Bereiten Sie 1:10-Verdünnungen (von 1 x 100 bis 1 x 10-7) der Gegenmischung vor. Platte 100 μl der Verdünnungen 10-5 bis 10-7 auf den Medien A und B sowie alle Verdünnungen auf den Medien AB.
    HINWEIS: Dlution 100 bezieht sich auf das saubere Röhrchen.
  12. Lassen Sie die Teller trocknen, bevor Sie sie kopfüber in den Inkubator stellen. Die Platten werden 18 h (über Nacht) bei 37 °C inkubiert.
  13. Tag 5: Überprüfen Sie die Negativkontrollen, um sicherzustellen, dass die Streifen der reinen Übernachtkulturen der Spender auf dem Medium B nicht gewachsen sind und die reine Übernachtkultur der Empfänger auf dem Medium A nicht gewachsen ist.
  14. Notieren Sie die Anzahl der Kolonien und Verdünnungen, die gezählt werden können:
    1. Zählen Sie die Kolonien in Medium A; Das sind die Spender. Die Kolonien sollten rosa sein (Abbildung 3A,B).
    2. Zählen Sie die Kolonien in Medium B; Dies sind die Empfänger und Transkonjuganten. Die Kolonien sollten blassgelb sein (Abbildung 3C).
    3. Zählen Sie die Kolonien in media AB; Dies sind die Transkonjumanten. Die Kolonien sollten hellgelb sein.
      HINWEIS: Wählen Sie eine zählbare Platte aus. Eine zählbare Platte hat zwischen 30 und 300 Kolonien (mehr als 300 Kolonien wären schwer zu zählen, und weniger als 30 Kolonien werden als zu kleine Stichprobengröße angesehen, um eine genaue Darstellung der ursprünglichen Probe darzustellen).
  15. Berechnen Sie die Häufigkeit der Konjugation pro Spender oder pro Empfänger
    Häufigkeit der Konjugation pro Spender = (KBE/ml des Transkonjuganten [Medien AB])/ (KBE/ml der Spender [Medien A]) x 100
    Häufigkeit der Konjugation pro Empfänger = (KBE/ml des Transkonjuganten [Medium AB])/ (KBE/ml der Empfänger und Transkonjuganten [Medium B]) x 100
    HINWEIS: Die Konjugationshäufigkeit für dieses Protokoll wurde berechnet als Transkonjuganten dividiert durch die Anzahl des Empfängers, multipliziert mit 100. Gemäß der Literatur könnte die resultierende Menge der Konjugation als exkonjugante Frequenz, Gentransferfrequenz, Konjugationshäufigkeit, rekombinante Ausbeute, Plasmidtransfereffizienz, Konjugationshäufigkeit basierend auf der Gesamtkeimzahl, Anteil der Transkonjumanten, Anteil der Transkonjutanten in der Empfängerpopulation, transkonjugierte Frequenz, Konjugationshäufigkeit, Logarithmus der Konjugationsrate, Transferratenkonstante, Konjugationsrate pro Paarungspaar, Konjugationskoeffizient oder Konjugationseffizienz20. Dieses Protokoll bezieht sich auf den Begriff Konjugationseffizienz.
  16. Lagern Sie die Transkonjuganten in Glycerinvorräten bei -80 °C. Befolgen Sie die Teilschritte zur Herstellung von Glycerinvorräten.
    1. Wählen Sie eine einzelne Kolonie von Transkonjuganten aus und züchten Sie sie über Nacht (18 h) in 5,0-ml-Kulturröhrchen mit 2 ml Mueller-Hinton-Brühe, ergänzt mit Carbenicillin (100 mg/l), bei 37 °C und Schütteln bei 200 U/min.
    2. Beschriften Sie kryogene Durchstechflaschen unter Angabe des Namens des Transkonjuganten wie folgt: Tc + Name des Spenders + Antibiotikum der Selektion in Medium A (da es sich um Transkonjudenten handelt, ist bekannt, dass ihr Hintergrund der Empfängerstamm ist, der bereits gegen Streptomycin und Rifampicin resistent ist, aber zusätzlich das Plasmid mit einem Beta-Lactam-Resistenzgen enthält); zum Beispiel TcU1Carb. Fügen Sie fortlaufende Zahlen hinzu, falls mehr als ein Transkonjugant desselben Spenders gespeichert werden muss (z. B. TcU1Carb1, TcU1Carb2 usw.).
    3. Übertragen Sie 1 ml der Übernachtkultur auf 1 ml 50%iges Glycerin (v/v; die endgültige Glycerinkonzentration sollte 25% betragen) und mischen Sie vorsichtig durch Inversion. Legen Sie die kryogenen Fläschchen für 15 Minuten auf Trockeneis und lagern Sie die Kryoflaschen bei -80 °C für zukünftige Experimente.
  17. Für die DNA-Extraktion werden die Trasnkonjuganten aus Glycerinvorräten auf Mueller-Hinton-Agar gestreift, der mit Carbenicillin (100 mg/l) ergänzt ist, und über Nacht bei 37 °C inkubiert; Befolgen Sie dann die Empfehlungen aus Schritt 2.1.

2. Methode 2: Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Amplifikation von Antibiotikaresistenzgenen und Plasmid-Replikons in E. coli-Transkonjuganten

HINWEIS: Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde 1983 von Dr. Kary Mullis entwickelt. Die PCR hängt von spezifischen Primern ab (ein kurzes Stück DNA, das zu einer bestimmten DNA-Sequenz komplementär ist und als Punkt fungiert, an dem die Replikation fortgesetzt werden kann, im Allgemeinen 20-40 Nukleotide lang und idealerweise mit einem Guanin-Cytosin-Gehalt von 40%-60%), die zu gegenüberliegenden Strängen einer denaturierten, doppelsträngigen DNA-Matrize geglüht und durch eine thermostabile DNA-Polymerase verlängert werden, Dadurch wird eine zusätzliche Vorlage für den nächsten Reaktionszyklus erzeugt, was zu einer exponentiellen Verstärkung der ursprünglichen Vorlage21 führt. In diesem Protokoll wurden die in den konjugativen Plasmiden vorhandenen Replikons und Resistenzgene amplifiziert, um den Transfer in transkonjuganten Empfängerzellen zu bestätigen.

  1. DNA-Extraktion
    1. Um die Übertragung von Resistenzgenen nachzuweisen, die von konjugativen Plasmiden getragen werden, verwenden Sie transkonjugante DNA als Vorlage. Verwenden Sie eine einfache Kochvorbereitungsextraktion, um die bakteriellen Zellwände zu lysieren.
      HINWEIS: Die einfache Extraktion von Kochpräparaten ist ein einfacher Ansatz zur Lyse der bakteriellen Zellwände. Diese Extraktion enthält Plasmid-DNA, die mit genomischer DNA gemischt ist, aber da Primer nach spezifischen DNA-Sequenzen von Interesse entworfen werden, ist diese Vorlage auch für die PCR nützlich. Plasmide können auch spezifisch gereinigt werden, obwohl die Ausbeuten mit zunehmender Plasmidgrößetendenziell abnehmen 22. Dies ist ein bequemer Haltepunkt. DNA kann mehrere Monate bei -20 °C gelagert werden.
  2. PCR (PCR)
    1. Da das Experiment eine negative und eine positive Kontrolle hat, ist es vorteilhaft, einen Pool für alle Reaktionen in einem 1,5-ml-Röhrchen einzurichten. Beschriften Sie ein 1,5-ml-Röhrchen als "Pool" und die erforderlichen PCR-Röhrchen mit dem Namen des Gens und der Probe (z. B. OXA-U1).
    2. Pipettieren Sie die PCR-Reagenzien in der folgenden Reihenfolge in ein 1,5-ml-Röhrchen: steriles Wasser, 2x Master Mix, Primer und Polymerase (außer der Template-DNA) (siehe Tabelle 1). Vorsichtig mischen, indem Sie mindestens 10 Mal auf und ab pipettieren. Bleiben Sie die ganze Zeit auf Eis.
      HINWEIS: Tragen Sie Handschuhe, um eine Kontamination des Reaktionsgemisches oder der Reagenzien zu vermeiden. Vermeiden Sie es, Reagenzien zu öffnen und zu mischen und Proben im selben Bereich zu handhaben, um eine Kontamination der Reagenzien zu vermeiden. Geben Sie die Reagenzien in den Eiskübel, um die Nukleaseaktivität und das unspezifische Priming zu unterdrücken. Lassen Sie sie vollständig auftauen, bevor Sie eine Reaktion auslösen. Halten Sie die Reagenzien während des gesamten Experiments auf Eis. Taq-Polymerase wird am Ende hinzugefügt, da sie empfindlich auf pH-Änderungen reagiert. Es muss gepuffert werden, um eine Verschlechterung oder Fehlfaltung zu vermeiden. Die Sequenz der Primer ist in Tabelle 2 - Antibiotikaresistenzgene - und Tabelle 3 - Replikons 23,24,25,26,27,28 aufgeführt.
    3. Fügen Sie die Matrizen-DNA in das entsprechende Röhrchen hinzu. Vermeiden Sie das Einbringen von Blasen und sichern Sie die Kappen auf den PCR-Röhrchen.
    4. Setzen Sie die PCR-Röhrchen in den Thermocycler ein.
    5. Starten Sie das Programm. Beziehen Sie sich auf die Programmeinstellungen, die für jedes Gen in Tabelle 2 (Resistenzgene) und Tabelle 3 (Replikons) aufgeführt sind.
      HINWEIS: Stellen Sie die PCR-Programme so ein, dass die Proben nach dem Lauf bei 4 °C gehalten werden.
      1. PCR-Bedingungen für Replikons: ein Denaturierungszyklus bei 94 °C für 5 min, gefolgt von 30 Denaturierungszyklen bei 94 °C für 1 min, Glühen bei 60 °C für 30 s, Elongation bei 72 °C für 1 min und eine abschließende Verlängerung eines Zyklus bei 72 °C für 5 min.
        HINWEIS: Dies sind die von Carattoli et al.29 standardisierten Bedingungen.
    6. Wenn das Programm beendet ist, lagern Sie die PCR-Röhrchen bei 4 °C.
      HINWEIS: Dies ist ein bequemer Haltepunkt. PCR-Produkte können mehrere Monate bei -20 °C gelagert werden
    7. Bereiten Sie ein 1%iges Agarosegel vor, indem Sie 0,6 g Agarose in einem 250-ml-Kolben wiegen und 60 ml 1x Tris-acetat-EDTA (TAE)-Puffer hinzufügen (Reagenzien anpassen, wenn eine andere Gelgröße benötigt wird). Die Agarose vorsichtig und langsam in der Mikrowelle schmelzen, damit keine Agarose über den Kolben läuft, und auf ca. 55 °C (10-15 min) abkühlen lassen.
      1. Bereiten Sie alle Reagenzien mit hochreinem deionisiertem Wasser und Reagenzien in analytischer Qualität vor:
      2. TAE 50x Puffer (Tris-Base, Essigsäure und EDTA) (1 l): Mischen Sie 121,1 g Tris-Base + 372,24 g EDTA und fügen Sie 500 ml destilliertes Wasser hinzu. Mit einem Magnetrührer auflösen. Fügen Sie 57,1 ml Essigsäure hinzu und fügen Sie destilliertes Wasser zu einem Gesamtvolumen von 1.000 ml hinzu.
      3. Autoklavieren Sie bei 15 psi, 121 °C für 15 Minuten und halten Sie es bei Raumtemperatur, bis es bis zu 6 Monate bereit ist.
      4. TAE 1x Puffer (1 l): Kombinieren Sie 20 ml TAE 50x Puffer mit 980 ml destilliertem Wasser und mischen Sie.
    8. Unter einem Abzug 6 μl SYBR Green in die geschmolzene Agarose geben, mischen und in die Schale (und den Kamm) gießen, die zuvor mit Klebeband verschlossen wurde, um ein Verschütten zu vermeiden. Lassen Sie das Gel 15-25 Minuten einwirken, bis eine Trübung auftritt.
      HINWEIS: Andere alternative Farbstoffe sind ebenfalls erhältlich30,31,32,33.
    9. Entfernen Sie das Klebeband und legen Sie das Gel in die Elektrophoresekammer, wobei Sie genügend 1x TAE-Puffer hinzufügen, um das Gel zu bedecken.
    10. Mischen Sie 5 μl 6x DNA-Gelbeladungsfarbstoff mit 25 μl jeder Reaktion. Vorsichtig mischen, indem Sie mindestens 10 Mal auf und ab pipettieren.
      HINWEIS: Nicht das gesamte PCR-Produkt muss in das Gel geladen werden, um das erwartete Produkt zu visualisieren (passen Sie die Farbstoffmenge entsprechend an). Die verbleibende PCR-Probe konnte gelagert und mehrere Monate bei -20 °C gelagert werden.
    11. Füllen Sie die Mischung in Vertiefungen (vermeiden Sie das Einbringen von Blasen) und setzen Sie den Kammerdeckel ab.
      HINWEIS: Laden Sie die erste Probe in die zweite Vertiefung (reservieren Sie die erste auf der Leiter), beginnend mit der Negativkontrolle.
    12. Laden Sie 4 μl der 1 kb DNA-Leiter in die erste Vertiefung.
    13. Führen Sie die Elektrophorese mit 120 V, 400 mA und 60 min durch.
    14. Visualisieren Sie das Gel unter UV-Licht (mit einem UV-Strahler) und nehmen Sie das Bild auf.
      HINWEIS: Wenn ein PCR-Produkt vorhanden ist, können gefärbte DNA-Banden mit einem Standard-UV-Transilluminator, einem Transilluminator für sichtbares Licht oder einem laserbasierten Scanner nachgewiesen werden.
Reagenz Lagerlösung Volumen addiert zu 50 μL Reaktion (1x) Finale Beispiel: Lautstärke Beispiel: Lautstärke Beispiel: Volumen, das zu jedem Röhrchen hinzugefügt wird Final Vol. 50 μL Lautstärke zur Positivkontrolle hinzugefügt Lautstärke zur Negativkontrolle hinzugefügt
Konzentration zu 1x hinzugefügt hinzugefügt zu 3x (Pool)
Steriles Wasser - 21,5 μl (q.s. bis 50 μl) - 21,5 μL 64,5 μL 49 μL/Röhrchen 49 μL/Röhrchen 49 μL/Röhrchen
Master-Mix 2x 25 μL 1x 25 μL 75 μL
Vorwärts Primer 25 μM 1 μL 0,5 μM 1 μL 3 μL
Umgekehrte Grundierung 25 μM 1 μL 0,5 μM 1 μL 3 μL
Template-DNA Variabel (100–200 ng/μL) Variabel (1 μL) Variable 0,5 μL 1,5 μL
Polymerase 5 Einheiten/μL 0,5 μL 2,5 Einheiten - - 1 μL (transkonjugant) 1 μL (Spender) 1 μL (Empfänger)
HINWEIS: q.s. ist eine lateinische Abkürzung für quantum satis, was die Menge bedeutet, die benötigt wird.

Tabelle 1: PCR-Reagenzien und Pool für drei Reaktionen (ein Beispiel). 

Primer (Sequenz in der 5' - 3' Ausrichtung) PCR-Programm Erwartete Größe
(bp) Schiri.
blaCTX-M Gruppe 1 94 oC 7 min (864) Nr. 23
CTX-M: GGTTAAAAAATCACTGCGYC 94 oC 50 s (35 Zyklen)
CTX-M: TTGGTGACGATTTTAGCCGC 50 oC 40 s
68 oC 1 min
68 oC 5 min
blaCMY-2 95 oC 3 min (1855) Nr. 24
CMY-2-F: GATTCCTTGGACTCTTCAG 95 oC 30 s (30 Zyklen)
CMY-2-R: TAAAACCAGGTTCCCAGATAGC 53 oC 30 s
72 oC 30 s
72 oC 3 min
aac(3')-II 94 oC 5 min (237) 25
AAC(3')-II-F: ACTGTGATGGGATACGCGTC 94 oC 30 s (32 Zyklen)
aac(3')-II-R: CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA 60 oC 45 s
72 oC 2 min
72 oC 8 min
aadA 94 oC 5 min (283) Nr. 26
aadA1: GCAGCGCAATGACATTCTTG 94 oC 1 min (35 Zyklen)
aadA2: ATCCTTCGGCGCGATTTTG 60 oC 1 min
72 oC 1 min
72 oC 8 min
sul-3 94 oC 5 min (799) Nr. 27
sul-3-F: GAGCAAGATTTTTGGAATCG 94 °C 1 min (30 Zyklen)
sul-3-R: CATCTGCAGCTAACCTAGGGCTTTGGA 51 oC 1 min
72 oC 1 min
72 oC 5 min
tet(A) 95 oC 5 min (957) Nr. 28
TETA-1: GTAATTCTGAGCACTGTCGC 95 oC 30 s (23 Zyklen)
TETA-2: CTGCCTGGACAACAACATTGCTT 62 oC 30 s
72 oC 45 s
72 oC 7 min
DFR Ein 95 oC 5 min (302) Dieses Werk
DFRA-F: CATACCCTGGTCCGCGAAAG 95 oC 1 min (30 Zyklen)
55 oC 1 min
DFRA-R: CGATGTCGATCGTCGATAAGTG 72 oC 1 min
72 oC 7 min
catA2 95 oC 5 min
catA2-F: GACCCGGTCTTTACTGTCTCTC 95 °C 1 min (25 Zyklen) (225) Dieses Werk
catA2-R: TCCGGTGATATTCAGATTAAAT 60 oC 1 min
72 oC 1 min
72 oC 7 min

Tabelle 2: Primer und PCR-Programme zur Amplifikation diagnostischer Resistenzgene. 

Replicon Primer (Sequenz in der 5' - 3' Ausrichtung aufgeführt) Ziel PCR-Programm Erwartete Größe (bp)
IncFIB F: TCTGTTTATTCTTTTTACTGTCCAC repA 94 oC 5 min 683
R: CTCCCGTCGCTTCAGGGCATT 94 °C 1 min (30 Zyklen)
60 oC 30 s
IncFIC F: GTGAACTGGCAGATGAGGAAGG repA2 72 oC 1 min 262
R: TTCTCCTCGTCGCCAAACTAGAT 72 oC 5 min
IncI1 F: CGAAAGCCGGACGGCAGAA RNAI (Hrsg.) 139
R: TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGT

Tabelle 3: Primer und PCR-Programm zur Klassifizierung der Plasmide p134797 und p101718 durch PCR-basierte Replicon-Typisierung29. 

Representative Results

Angesichts der Tatsache, dass die Spender SW4955 und SW7037 sequenziert wurden, wird erwartet, dass diese beiden Spenderstämme die Resistenzphänotypen aufweisen, die dem in ihrer Genomsequenz identifizierten Resistenzgenprofil entsprechen. Das Plasmid p134797 (aus SW4955) verfügt über Gene, die Resistenz gegen Cephalosporine der dritten Generation (blaCTX-M-55) und Resistenz gegen Aminoglykoside (aac(3)-IIa und aadA1), Phenicole (catA2), Tetracycline (tet(A)), Trimethoprim (dfrA14) und Sulfonamide (sul3) verleihen; Es wurden keine Antibiotikaresistenzgene im SW4955-Chromosom gefunden. Das Plasmid p101718 (aus SW7037) trägt nur ein Antibiotikaresistenzgen (bla CMY-2), von dem erwartet wird, dass es eine Resistenz gegen Cephalosporine der dritten Generation (blaCTX-M-55) verleiht. Auch hier wurden keine Antibiotikaresistenzgene im SW7037-Chromosom gefunden.

Nach der Paarung wurde der Nachweis des Transfers der beiden konjugativen Plasmide erwartet, die alle oben genannten Resistenzgene tragen. Der Nachweis positiver Konjugationen impliziert, dass die als Transkonjuganten identifizierten Empfänger die konjugativen Plasmide erworben haben sollten. Das Vorhandensein der diagnostischen Resistenzgene für die konjugativen Plasmide in den Transkonjuganten (wie durch PCR nachgewiesen) wurde ebenfalls erwartet.

Um die hier beschriebenen Methoden zu veranschaulichen, wurde die Fähigkeit von zwei E. coli-Umweltisolaten getestet, Plasmid-DNA durch Konjugation zu übertragen. Eine schematische Darstellung der Versuchsumgebung ist in Abbildung 1 dargestellt. Zwei Spender (E. coli SW4955 und SW7037) und ein Empfänger (E. coli LMB100) wurden unabhängig voneinander verpaart. Die Genkarte der konjugativen Plasmide, die in E. coli SW4955 (p134797) und SW7037 (p101718) gefunden wurden, ist in Abbildung 2 dargestellt.

Konjugative Plasmide wurden mit Carbenicillin selektiert und mit Rifampicin und Streptomycin gegenselektiert, deren Resistenzdeterminanten im Chromosom des Empfängers liegen. MacConkey-Agar wurde verwendet, um die laktosepositiven Spender (die große, rosa Kolonien produzieren) vom Empfänger und den Transkonjuganten (die laktosenegativ sind und kleinere, hellgelbe Kolonien produzieren) zu unterscheiden (Abbildung 3).

Figure 3
Abbildung 3: Illustration der unterschiedlichen Farbmarker für Spender- und Empfängerkolonien auf MacConkey-Agar. Die Kolonien, die den Spendern entsprechen, sind auf MacConkey-Agar rosa, weil sie laktosepositiv sind. Dies unterscheidet Spender- von Empfängerkolonien, die blassgelb und kleiner (laktosenegativ) sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Mobilisierung des konjugativen Plasmids p134797 wurde nachgewiesen, wobei jedes der fünf Antibiotika den fünf verschiedenen Klassen von Resistenzgenen entsprach, die im Plasmid gefunden wurden.

Ein Beispiel für die Berechnung der Konjugationseffizienz (CE) für die Dehnung SW4955 wird vorgestellt. Aus dem Assay mit dem Stamm SW4955 wurden 172 KBE Transkonjuganten in der Platte aus der Verdünnung 10-2 gezählt; die Anzahl des Empfängers aus der entsprechenden Verdünnung (10-2) betrug 10.300.000 KBE/ml (Tabelle 4).

Der CE wird wie folgt berechnet:

CE = (174 KBE/ml)/(10.300.000 KBE/ml)

CE= 1,67 x 10-5 Transkonjumanten/Empfänger

LMB100 Transkonjuganten aus dem Stamm SW4955 mit Carbelicillin ausgewählt Effizienz der Konjugation
Verdünnung KBE (zählbare Platte) Ca. KBE/ml KBE (zählbare Platte)
100 konfluent 1.03E+09
10-1 konfluent 1.03E+08
10-2 konfluent 10300000 172 1,67 x 10-5 Transkonjulanten/Empfänger
10-3 konfluent 1030000
10-4 konfluent 103000
10-5 konfluent 10300
10-6 konfluent 1030
10-7 103 103
Die Werte, die zur Berechnung des CE verwendet werden, sind fett hervorgehoben.

Tabelle 4: Ein Beispiel für die Berechnung der Konjugationseffizienz (CE) für die Dehnung SW4955.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt, ausgedrückt als Konjugationseffizienz pro Empfänger. Die fünf Konjugationseffizienzen, die mit dem Stamm SW4955 als Donor erzielt wurden, lagen alle in der gleichen Größenordnung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Mobilisierung des konjugativen Plasmids unabhängig von der für die transkonjugante Identifizierung verwendeten Selektion nachgewiesen werden kann.

Unter Verwendung des Stammes SW7037 als Donor war die erhaltene Konjugationseffizienz um drei Größenordnungen geringer; Diese Ergebnisse ermöglichen den Vergleich der Konjugationseffizienz verschiedener Spender und Plasmidtypen mit denselben Empfängern.

Effizienz der Konjugation
Dehnung Carbenicillin (100 mg/L) Gentamicin (2 mg/L) Chloramphenicol (25 mg/L) Tetracyclin (10 mg/L) Trimethoprim (20 mg/L)
SW4955 1.67 x 10-5 cm Grösse: ca. 5.67 x 10-5 cm 2.17 x 10-5 cm 7.62 x 10-5 1.36 x 10-5 cm
SW7037 2.14 x 10-6 cm

Tabelle 5: Konjugationseffizienz der E. coli-Spenderstämme SW4955 und SW7037 in Abhängigkeit von dem zur Auswahl verwendeten Antibiotikum.

In Transkonjutanten wurde das Vorhandensein von Replikons und allen Resistenzgenen, die in zwei getesteten konjugativen Plasmiden kodiert sind, und ihren entsprechenden Replikonen durch PCR überprüft. Die Bedingungen, die für diese diagnostischen PCR-Reaktionen verwendet werden, sind in Tabelle 3 dargestellt.

Die diagnostischen Gele sind in Abbildung 4 dargestellt. Diese Gele bestätigen das Vorhandensein der erwarteten Replikons in Transkonjuganten (IncFIC und IncFIB in p1347975 und IncI1 in p101718). Sie bestätigen auch das Vorhandensein der erwarteten Antibiotikaresistenzgene, nämlich der blaCTX-M-55-Gruppe (Beta-Lactam), aac(3)-II und aadA (Aminoglykosid), catA2 (Phenicol), tet(A) (Tetracyclin), dfrA14 (Trimethoprim) und Sul3 (Sulfonamid) für p1347975 und blaCMY-2 für p101718 (Abbildung 4).

Figure 4
Abbildung 4: Diagnostische Elektrophoresegele. Gelelektrophorese von PCR-Produkten von Antibiotikaresistenzgenen und Plasmid-Replikons, die in den konjugativen Plasmiden p134797 und p101718 in den Spenderzellen (Stämme SW4955 bzw. SW7037) und in den entsprechenden LMB100-Transkonjudenten gefunden wurden. Carbenicillin wurde zur Plasmid-Selektion verwendet. Abkürzungen. -: Negativkontrolle (DNA des Stammes LMB100 wurde als Negativkontrolle verwendet); D: Spender; T: transkonjugierend. Erwartete Amplikongrößen: blaCTX-M-55: 864 pb; aac(3)-IIa: 237 bp; aadA1: 283 bp; catA2 : 225 bp; tet(A): 957 bp; dfrA14: 302 bp; Sul3: 799 bp; IncFIC(FII): 262 bp; IncFIB: 683 Basispunkte; blaCMY-2: 1.855 bp; IncI1-I: 139 bp. Das Gel hat 1% Agarose. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Konjugative Plasmide bieten durch Rekombination und horizontalen Gentransfer Zugang zu einem gemeinschaftlichen Pool von Genen innerhalb einer bestimmten Umgebung34. Somit sind konjugative Plasmide evolutionäre Einheiten, die in der Lage sind, Funktionen zu erwerben und zu übertragen, die es Bakterien ermöglichen, sich innerhalb einer zeitlichen Skala von Stunden an mehrere Bedingungen anzupassen (einschließlich Resistenz gegen Antibiotika, Resistenz gegen Metalle, Erwerb von Metallen, Biofilmbildung und pathogene Gene).

Diese Arbeit stellt ein Protokoll zur Identifizierung von konjugativen Plasmiden in Bakterien vor. Damit das Protokoll funktioniert, müssen die verwendeten Marker zwischen Spender- und Empfängerstämmen unterscheiden, wie die Kontrollen in den Medien A und B zeigen. Sie müssen auch effektiv Zellen auswählen, die das Plasmid tragen. Die Paarungsreaktion ist entscheidend. Bei dieser Reaktion müssen Spender und Empfänger einen längeren Kontakt (über Pili) herstellen, damit eine Konjugation stattfinden kann. Alles, was den Zell-zu-Zell-Kontakt stören kann, wie z. B. eine unzureichende Inkubationszeit oder das Schütteln oder Rühren der Kultur, verringert somit die Effizienz der Konjugation. Die Wahl des Empfängers ist ebenfalls entscheidend, da einige Empfängerstämme gegenüber der Konjugation refraktärsind 35,36. LMB100 wird als Empfänger der Wahl vorgeschlagen, da es in der Lage ist, Plasmide mehrerer Inkompatibilitätstypen aufzunehmen.

Die Konjugationsrate ist spezifisch für jedes Plasmid-Donor-Chromosomenpaar, jeden Empfänger und jede Umgebungsbedingung. Es wurde festgestellt, dass die Konjugation spezifischer Plasmide empfindlich auf eine Vielzahl von Variablen reagiert, darunter Wachstumsphase, Zelldichte, Spender-zu-Empfänger-Verhältnis, ob die Konjugation in flüssigen oder festen Medien durchgeführt wird, Kohlenstoff, Sauerstoff, Gallensalze, Metallkonzentrationen, Vorhandensein von Säugetierzellen, Temperatur, pH-Wert und Paarungszeit13,14,15 . Die Untersuchung dieser Wechselwirkungen hängt von der anfänglichen Detektion eines konjugativen Plasmids ab, das eingehend untersucht werden soll. Daher kann das hier beschriebene Protokoll auch modifiziert werden, um die Auswirkungen verschiedener experimenteller Variablen zu untersuchen, obwohl dies auf Kosten der Begrenzung der Anzahl der gescreenten Spender geht. Es kann auch mobilisierbare Plasmide in Wirten identifizieren, die über Helferplasmide verfügen (d.h. Plasmide, die die Konjugation ermöglichen, indem sie Funktionen bereitstellen, die in den mobilisierbaren Plasmiden in trans6 fehlen).

Es wird empfohlen, die Sequenz des konjugativen Plasmids zu kennen (aber nicht notwendig, um die Konjugation zu erkennen, wie oben diskutiert). Wenn die Spender laktosenegativ sind (gelbe Kolonien auf MacConkey-Agar produzieren), kann ein laktosepositiver Empfänger (der rosa Kolonien auf MacConkey-Agar produziert) verwendet werden, um echte Transkonjuganten von Spenderzellen zu unterscheiden, die in der Lage sind, auf dem Medium zu wachsen, um Transkonjuganten auszuwählen. Das hier beschriebene Protokoll dient zum Nachweis konjugativer Plasmide von umweltbedingten, kommensalen und pathogenen Mitgliedern der Familie Enterobacteriaceae; Es kann jedoch mit jeder Bakterienart mit einem geeigneten Spender, Empfänger, Antibiotikum und Farbmarkern verwendet werden. Die Identifizierung dieser kritischen Komponenten in anderen Bakterien erfordert systematische Studien mit mehreren Spendern, Empfängern und Markern (Antibiotika und Farbstoffe). Dieses Protokoll wurde nicht an grampositiven Bakterien getestet.

In der Literatur wurden mehrere Varianten der hier vorgestellten Methode beschrieben, die kürzlich überprüftwurden 20. Das qualitative Ergebnis kann auch auf unterschiedliche Weise bezeichnet werden (z. B. exkonjugante Häufigkeit und Gentransferfrequenz), und dimensionslose Einheiten können verwendet werden, um die Konjugationseffizienz (ml/KBE x h) zu melden20.

Das hier beschriebene Protokoll löst mehrere Einschränkungen, die bisher durch die bestehenden Methoden16,18,19,20 nicht behoben wurden. Zunächst wurde ein geeigneter Empfänger identifiziert. Zweitens minimiert die Verwendung von zwei Antibiotika (Rifampicin und Streptomycin) zur Selektion echter Transkonjuganten die Wahrscheinlichkeit, dass Spender eine Resistenz gegen eines der Antibiotika entwickeln, die zur Selektion von Transkonjuganten durch spontane Mutagenese verwendet werden. Falsche Transkonjuganten können auch durch den Schutz von Umstehenden durch Hydrolyse des Antibiotikums entstehen, das zur Selektion von Transkonjuganten durch Enzyme (z. B. Beta-Lactamasen) verwendet wird, die vom Spender in großen Mengen produziert werden. Drittens werden mehrere experimentelle Kontrollen einbezogen, um sicherzustellen, dass das Produkt der Paarung ein echter Transkonjugant ist (d.h. eine Empfängerzelle, die das konjugative Plasmid des Spenders stabil eingebaut hat). Hier stellten wir zwei unabhängige Methoden vor, um die Authentizität der Transkonjuganten zu testen, nämlich einen kolorimetrischen Marker in MacConkey-Agar und den PCR-Nachweis der Replikons und Antibiotikaresistenzgene des konjugativen Plasmids im Empfänger. Das hier beschriebene Protokoll dient auch dazu, konjugative Plasmide von umweltbedingten, kommensalen und pathogenen Mitgliedern der Familie Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonellen, Shigellen und andere Arten) zu isolieren und zu charakterisieren.

Um die Mechanik der Konjugation zu verstehen, wurden experimentelle Beobachtungen mit Hilfe von Computersimulationen modelliert. Diese Vorhersagemodelle schätzen die Häufigkeit des Plasmidtransfers für gegebene Wachstumsdichten von Spendern, Empfängern und Transkonjutanten. Ein Modell, das als Endpunktmodell bekannt ist, fand Schwellenwerte, oberhalb derer die Plasmidtransferrate in der Flüssigkeitskultur liegt, und kam zu dem Schluss, dass die Transferrate nicht von der Zelldichte, dem Spender-Empfänger-Verhältnis und der Paarungszeit beeinflusst wird19. Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) wurde als alternative Methode zur Detektion transkonjuganter Plasmide verwendet. FISH ermöglicht die Plasmid-Visualisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie durch die Hybridisierung einer DNA-Sonde und einer Ziel-DNA. Somit ermöglicht FISH die visuelle Detektion von Plasmidflüssen über verschiedene Zellpopulationenhinweg 37, obwohl es nicht die gleiche Sensitivität wie die hier vorgestellte Methode aufweist, wenn Transkonjuganten durch visuelles Screening und nicht durch Selektion nachgewiesen werden.

Es besteht ein enormer Bedarf, die Biologie konjugativer Plasmide zu verstehen, die Antibiotikaresistenzgene durch verschiedene Komponenten des Ökosystems (Klinik, Landwirtschaft, Abwasser, Wildtiere, Haustiere, Böden, Flüsse und Seen) verteilen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vereinfachten experimentellen Bedingungen, die in den hier beschriebenen Protokollen dargestellt werden, das Screening von Spendern in großem Maßstab erleichtern und somit ein Schlüsselinstrument für die Untersuchung des horizontalen Gentransfers darstellen, der von konjugativen Plasmiden aus einer Vielzahl von Quellen ausgeht. Sie können verwendet werden, um die Prävalenz von Antibiotikaresistenzgenen oder anderen klinisch relevanten Genen in konjugativen Plasmiden aus mehreren Quellen und Bakterien zu untersuchen. Sie können auch für die Untersuchung der Konjugation in vivo (z. B. im Darm von Wirbeltieren) und zur Untersuchung der Bedingungen angepasst werden, die die Effizienz der Konjugation modulieren. All diese Studien werden wesentlich zum Verständnis beitragen, wie die Mobilisierung multiresistenter konjugativer Plasmide zur Ausbreitung von Multidrug-Resistenzen beiträgt.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

LM-B, IMG, AT und IS wurden durch den NIH-Zuschuss GM055246 unterstützt, der LM-B gewährt wurde. GC-C wurde für zwei aufeinanderfolgende Jahre mit dem UC MEXUS-CONACYT Postdoctoral Fellowship ausgezeichnet: AY 2017-18 und 2018-19. Wir danken den Studenten Sage Chavez und Pepper St. Clair vom Mentoring-Programm des von der Genentech-Stiftung gesponserten Academic Inspiration Network (GAIN) für ihre technische Unterstützung bei den Experimenten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tube racks Thermo Fisher Scientific 22-313630 It can be replaced for another brand
2.0 mL Cryogenic vials Corning 430659 It can be replaced for another brand
14 mL conical tubes FALCON 149597 It can be replaced for another brand
14 mL tube racks Thermo Fisher Scientific 8850 It can be replaced for another brand
1 kb DNA ladder New England Biolabs N0552G 
250 mL sterile flasks  PYREX 5320 It can be replaced for another permanent marker brand
Acetic acid Fisher Scientific A38SI-212 It can be replaced for another brand
Agarose (molecular biology grade, multipurpose) Fisher Scientific BP160-500 It can be replaced for another brand
Carbenicillin GOLD BIOTECHNOLOGY C-103-50 It can be replaced for another brand
Disposable inoculating loops: 1 µL Fisherbrand 22-363-595 It can be replaced for another brand
DNA gel loading dye 6x  New England Biolabs B7024S It can be replaced for another brand
EDTA Fisher Scientific BP119-500 It can be replaced for another brand
Electronic digital scale Denver Instrument APX-2001 It can be replaced for another brand
Eppendorf conical tubes: 1.5 mL Eppendorf 14-282-302 It can be replaced for another brand
Equipment for agarose gel electrophoresis Fisher Scientific FP300 It can be replaced for another brand
Ethanol-resistant markers Sharpie 37001; 37002; 37003 It can be replaced for another brand
Gel documentation systems (UVP GelSolo) Analytakjena SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01 It can be replaced for another brand
Gloves X-GEN 44-100M Any nitrile gloves brand works
Ice bucket Thermo Fisher Scientific 432128 It can be replaced for another brand
MacConkey agar  BD DIFCO 212123
Master Mix  BioLabs M0496S  It can be replaced for another brand
Methanol Fisher Scientific A452-4 It can be replaced for another brand
Microcentrifuge tubes: 2.0 mL Fisherbrand 05-408-138 It can be replaced for another brand
Mueller Hinton agar BD DIFCO DF0479-17-3
Mueller Hinton broth BD DIFCO 275730
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL 740588. 250
PCR tube racks AXYGEN   R96PCRFSP It can be replaced for another brand
PCR tubes (0.2 mL) AXYGEN  PCR-02-C It can be replaced for another brand
Rifampicin Fisher Scientific 50-164-7517
Set of micropipettes that dispense between 1 - 10 μL (P10), 2–20 μL (P20), 20–200 μL (P200) and 200–1000 μL (P1000) RAININ 17008648; 17008650; 17008652; 17008653 Micropipettes should be calibrated; can be replaced for another brand
Sodium chloride Fisher Scientific S671-3 It can be replaced for another brand
Spectrophotometer Thermo Scientific 335905P It can be replaced for another brand
Sterilized tips for 10 μL, 200 μL and 1000 μL  Eclipse 1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9 It can be replaced for another brand
Streptomycin Fisher Scientific BP910-50
SYBR Safe DNA gel stain  Thermo Fisher Scientific S33102
Taq DNA Polymerase BioLabs M0273S
Thermal cycler C1000 Touch  Bio-Rad 1851196 It can be replaced for another brand
Tris  Fisher Scientific BP153-500 It can be replaced for another brand

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Genetik Ausgabe 193 Experimentelle Evolution horizontaler Gentransfer konjugative Plasmide Antibiotikaresistenz Escherichia coli
Nachweis eines horizontalen Gentransfers, der durch natürliche konjugative Plasmide in <em>E. coli</em> vermittelt wird
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Mota-Bravo, L., Camps, M., Muñoz-Gutiérrez, I., Tatarenkov, A., Warner, C., Suarez, I., Cortés-Cortés, G. Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli. J. Vis. Exp. (193), e64523, doi:10.3791/64523 (2023).

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