Summary
Konjugering medierer horisontal genoverførsel ved at mobilisere plasmid-DNA på tværs af to forskellige celler, hvilket letter spredningen af gavnlige gener. Dette arbejde beskriver en udbredt metode til effektiv påvisning af konjugativ plasmidoverførsel, baseret på brugen af differentielle markører i det konjugative plasmid, donor og recipient til påvisning af transkonjugering.
Abstract
Konjugering repræsenterer en af de vigtigste mekanismer, der letter horisontal genoverførsel i gramnegative bakterier. Dette arbejde beskriver metoder til undersøgelse af mobilisering af naturligt forekommende konjugative plasmider ved hjælp af to naturligt forekommende plasmider som et eksempel. Disse protokoller er afhængige af den differentielle tilstedeværelse af valgbare markører i donor, modtager og konjugativt plasmid. Specifikt omfatter de beskrevne metoder 1) identifikation af naturlige konjugative plasmider, 2) kvantificering af konjugeringshastigheder i fast kultur og 3) diagnostisk påvisning af antibiotikaresistensgener og plasmidreplikontyper i transkonjugante recipienter ved polymerasekædereaktion (PCR). De her beskrevne protokoller er udviklet i forbindelse med studiet af den evolutionære økologi ved horisontal genoverførsel for at screene for tilstedeværelsen af konjugative plasmider, der bærer antibiotikaresistensgener i bakterier, der findes i miljøet. Den effektive overførsel af konjugative plasmider observeret i disse eksperimenter i kultur fremhæver den biologiske relevans af konjugering som en mekanisme, der fremmer horisontal genoverførsel generelt og spredning af antibiotikaresistens i særdeleshed.
Introduction
I 1946 beskrev Lederberg og Tatum1 en seksuel proces i Escherichia coli K-12, der nu er kendt som konjugering. Bakteriel konjugering er den proces, hvorved en bakteriecelle (donoren) overfører ensrettet genetisk materiale til en anden celle (modtageren) ved direkte celle-til-celle-kontakt. Konjugering er bredt fordelt i bakterier2,3, selvom fraktionen af donorceller, der udtrykker konjugeringsmaskineriet, typisk er meget lille4.
Plasmider er autonomt-replikerende ekstrakromosomale DNA-elementer. Ud over gener, der er involveret i plasmidreplikation og vedligeholdelse, bærer plasmider ofte en last af gener, der er involveret i tilpasning til miljømæssige udfordringer, såsom tungmetaller eller eksponering for antibiotika5. Konjugative plasmider er en klasse af plasmider med et sæt specialiserede gener, der tillader deres overførsel til modtagerceller og understøtter deres persistens efter overførslen6. Konjugative plasmider varierer i størrelse fra 21,8 kb til 1,35 Mb i bakterier i rækken Pseudomonadota (synonymt med proteobakterier), med medianen omkring 100 kb 5,7. De har også generelt et lavt kopinummer, muligvis for at holde den metaboliske byrde på værten lav 8,9.
Det typiske konjugative apparat består af fire komponenter: en overførselsoprindelse (oriT), en relaxase, et type IV-koblingsprotein og et type IV-sekretionssystem (en rørlignende struktur kaldet pilus, der gør det muligt for donorer at kontakte modtagere)6. Kun en meget lille brøkdel af celler, der bærer konjugative plasmider, udtrykker konjugationsmaskineriet4, men hvis plasmiderne giver en fitnessfordel, kan transkonjuganterne hurtigt ekspandere i populationen. Mellem 35% og over 80% af E. coli-isolater indsamlet fra forskellige levesteder har konjugative plasmider med gener, der giver resistens over for mindst et antibiotikum10,11; Derfor er horisontal genoverførsel medieret af konjugative plasmider en vigtig mekanisme, der driver den globale spredning af antibiotikaresistensgener12.
Parringsforsøg udført i laboratoriekultur har vist, at konjugationsfrekvensen påvirkes af flere faktorer, herunder recipientcellernes art, vækstfase, celletæthed, donor-til-recipient-forhold, om konjugering udføres i flydende eller faste medier, kulstof, oxygen, galdesalte, metalkoncentrationer, tilstedeværelse af pattedyrceller, temperatur, pH og parringstid13,14, 15.
Dette arbejde beskriver protokoller til påvisning af tilstedeværelsen af konjugative plasmider i en given værtsstamme, til kvantificering af konjugationshastighederne i fast kultur og til dobbeltkontrol af deres overførsel til modtagerceller. Disse protokoller kan bruges som et første skridt til identifikation af naturlige konjugative plasmider, der er egnede til forskning. De bruger et minimum antal forenklede trin, fordi de er designet til at screene tilstedeværelsen af konjugative plasmider i bakterier opnået fra flere kilder (miljømæssige, kommensale og patogene) i skala (snesevis til hundreder af donorer).
Derudover vises test til påvisning af, om mobiliseringen af et givet konjugativt plasmid er uafhængigt af det antibiotikum, der anvendes til påvisning (dvs. relevansen af antibiotikaresistensgenet under udvælgelse) og til sammenligning af konjugeringshastighederne for to konjugative plasmider, der findes i forskellige miljøisolater.
Baseret på den genetiske sammensætning af de relevante konjugative plasmider (plasmidreplikon og antibiotikaresistensgensammensætning) kan hvert trin i protokollen modificeres for at studere virkningen af en række faktorer, der sandsynligvis vil påvirke konjugationshastigheden.
Generelt eksperimentelt design:
De væsentlige komponenter, der er nødvendige for at oprette et parringseksperiment, er donorceller, en modtagerstamme og faste medier til udvælgelse af donorer (antibiotikum A), modtagere (antibiotikum B) og transkonjuganter (antibiotikum A og B). Transkonjuganter er modtagerceller, der stabilt opretholder donorens konjugative plasmid.
Donorceller er resistente over for et antibiotikum (antibiotikum A) og er modtagelige for den eller de markører, der bruges til at vælge modtagerceller (antibiotikum B). Den genomiske placering af antibiotikaresistensgenet (dvs. om det er placeret i kromosomet eller et plasmid i donorcellen) behøver ikke at være kendt på forhånd, fordi mobilisering af antibiotikaresistensmarkører til modtageren (efter en direkte donor-modtagerkontakt) indebærer, at de donorleverede markører var i et plasmid.
En recipientstamme (kendt for at tage konjugative plasmider) skal have en stabil, valgbar markør, der ikke er til stede i donoren; Denne valgbare markør er generelt resistent over for et antibiotikum eller biocid placeret i kromosomet. Udvælgelsen af modtageren, der skal bruges i parringsforsøg, er kritisk, fordi nogle E. coli-stammer varierer i deres evne til at tage konjugative plasmider16.
Når disse komponenter er etableret, er enhver koloni, der vokser på medier med både antibiotika (A og B) efter en donor-modtagerparkontakt, en formodet transkonjugant (figur 1). Dette forudsætter, at donorer kan vokse i medier med antibiotikum A, men ikke kan vokse i medier med antibiotikum B, og at modtagere er i stand til at vokse i medier med antibiotikum B, men ikke i stand til at vokse med antibiotikum A. Transkonjugering kan bekræftes ved hjælp af to diagnostiske tests. Den første test består af påvisning (ved polymerasekædereaktion [PCR] amplifikation af gener eller andre metoder) af gener, der findes i det konjugative plasmid i transkonjugante kolonier. Den anden test involverer brugen af differentielle kolonifarvemarkører baseret på lactosemetabolisme. Den differentierede kolonifarve afsløres ved brug af MacConkey agar; Laktosen i agaren kan bruges som gæringskilde af laktosefermenterende (LAC +) mikroorganismer. Disse mikroorganismer producerer organiske syrer, især mælkesyre, som sænker pH-værdien. Neutral rød er en pH-indikator, der indgår i mediet, og som skifter fra offwhite til lys rød/pink, når pH-værdien falder til under 6,817. Således producerer E. coli lactose-positive stammer større lyserøde kolonier på MacConkey agar, mens laktosenegative stammer producerer lysegule og mindre kolonier på MacConkey agar.
Figur 1: Eksperimentelt design anvendt til at detektere tilstedeværelsen af konjugative plasmider i donorstammer. I dette eksempel bærer donoren et konjugativt plasmid med et antibiotikaresistensgen, der giver resistens over for antibiotikum A, men de er modtagelige for antibiotika B. Omvendt har modtageren en kromosomresistensdeterminant, der giver beskyttelse mod antibiotikum B, men den er modtagelig for antibiotikum A. Transkonjuganter er resistente over for begge antibiotika (A og B), fordi de har donorens konjugative plasmid, der giver resistens over for antibiotikum A og modtagerens kromosom, der giver beskyttelse mod antibiotika B. Klik her for at se en større version af denne figur.
Konjugationsraten for et donor-recipient-par (under givne forsøgsbetingelser) kan beregnes ved at dividere antallet af transkonjuganter med antallet af donorer eller med antallet af recipienter; Den første rate angiver den brøkdel af donorceller, der udviser funktionel ekspression af konjugationsmaskineriet af donoren16,18, mens den anden rate angiver modtagerens evne til at tage konjugative plasmider 19,20. I denne undersøgelse, medmindre andet er angivet, repræsenterer konjugeringshastigheden den brøkdel af modtagerceller, der bliver transkonjugerende (dvs. hastighed pr. Modtager).
Her rapporteres to uafhængige parringsforsøg med en E. coli-modtager og to E. coli-donorer. Derudover blev forskellige antibiotika brugt til at vælge transkonjuganter til en af donorerne for at bekræfte, at et enkelt multiresistent plasmid kan vælges med et hvilket som helst af de antibiotikaresistensgener, der findes i det konjugative plasmid.
De donor- og modtagerstammer, der anvendes i dette arbejde, er blevet fuldt sekventeret for at forstå alle komponenter i dette eksperimentelle system; Disse protokoller blev imidlertid designet til at screene for tilstedeværelsen af konjugative plasmider i værter med ukendt sekvens og kan også bruges i denne eksperimentelle sammenhæng; I dette tilfælde sekventeres de relevante gener imidlertid først.
De donor- og modtagerstammer, der anvendes i protokollen, er følgende:
Donor: 1. E. coli SW4955 blev indsamlet i en sø i Baton Rouge (LA, USA). Det har et konjugativt plasmid på 134,797 bp (p134797) med IncFIC (FII) og IncFIB (AP001918) replicons. Dette konjugative plasmid har gener, der giver resistens over for tredje generations cephalosporiner (blaCTX-M-55), aminoglycosider (aac (3) -IIa og aadA1), phenicols (catA2), tetracycliner (tet (A)), trimethoprim (dfrA14) og sulfonamider (sul3). For et komplet kort over p134797, se figur 2A. E. coli SW4955 er laktose-positiv, producerer lyserøde kolonier på MacConkey agar.
Donor: 2. E. coli SW7037 blev indsamlet i Lake Erie (Ottawa County, OH, USA). Det bærer et konjugativt plasmid på 101.718 bp (p101718) med et IncI1-I (Alpha) replicon. Dette konjugative plasmid har et gen, der giver resistens over for beta-lactamer (blaCMY-2). For et komplet kort over p101718, se figur 2B. E. coli SW7037 er også laktosepositiv og producerer lyserøde kolonier på MacConkey-agar.
Figur 2: Genetisk kort over de konjugative plasmider, der anvendes i denne undersøgelse . (A) Plasmid p134797, det konjugative plasmid, der findes i E. coli-stamme SW4955. (B) Plasmid p101718, det konjugative plasmid, der findes i E. coli stamme SW7037. Antibiotikaresistensgener er fremhævet med blåt, og gener, der tilhører det konjugative apparat, fremhæves med rødt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Modtager. E. coli LMB100 bruges som modtager. Dette er en plasmidfri stamme, der er resistent over for rifampin (100 mg / L) og streptomycin (100 mg / L). At have resistens over for to antibiotika reducerer muligheden for, at der opstår resistensmutationer i donoren, som ville forstyrre fortolkningen af resultaterne. Derudover er E. coli LMB100 laktosenegativ og kan skelnes fra de to donorstammer, fordi den producerer lysegule og små kolonier (i modsætning til større, lyserøde kolonier) på MacConkey-agar.
Når donoren er laktosenegativ, anbefaler vi at bruge en laktosepositiv modtager (f.eks. E. coli J53). LMB100- og J53-stammerne er tilgængelige for andre laboratorier til brug. Send en anmodning til Dr. Gerardo Cortés-Cortés sammen med en adresse og FedEx-nummer.
Det faste medie, der er nødvendigt for at vælge og tælle donorer, modtagere og transkonjuganter, er MacConkey-agar i petriskåle med en diameter på 100 mm. Der er behov for tilsætning af følgende antibiotika: (i) Medier A: carbenicillin (100 mg/l) for at tælle donorer og for at sikre, at modtagerne ikke kan vokse med dette antibiotikum. ii) Medier B: rifampin (100 mg/l) + streptomycin (100 mg/l) for at tælle recipienter og sikre, at donorer ikke kan vokse i disse to antibiotika. iii) Media AB: carbenicillin (100 mg/l) + rifampin (100 mg/l) + streptomycin (100 mg/l) til opnåelse og tælling af transkonjuganter. iv) Medier C: ingen antibiotika til at stribe alle undersøgte isolater.
Konjugationshastighederne for konjugative plasmider fra E. coli SW4955 og E. coli SW7037 til E. coli LMB100 sammenlignes. I tilfælde af p134797 konjugativt plasmid (SW4955-stammen) erstattes antibiotikacarbenicillin (100 mg / l) med gentamicin (2 mg / l), chloramphenicol (25 mg / l), tetracyclin (10 mg / l), trimethoprim (20 mg / l) eller sulfamethoxazol (100 mg / l) i efterfølgende forsøg for at fastslå, om antibiotikaresistensmarkøren, der anvendes til udvælgelse, har nogen indflydelse på resultaterne.
Protocol
1. Metode 1: Konjugering
- Dag 1: Streak donorerne og modtageren. Stribe separat fra glycerolbestandene på medie C (MacConkey-agar uden antibiotika) og inkuberes natten over ved 37 °C.
BEMÆRK: Dette trin er nødvendigt for at sikre, at eksperimentet udføres med rene isolater og for at bekræfte lactosefænotypen ved koloniernes farve. - Dag 2: Mærk et 14,0 ml kulturrør for hver donor og modtager. Vælg en enkelt koloni af hver donor og modtager, og dyrk dem natten over (18 timer) i separate 14,0 ml kulturrør indeholdende 2 ml Mueller Hinton bouillon ved 37 ° C og ryster ved 200 o / min.
BEMÆRK: I de anvendte stammer nås den stationære fase efter dyrkning natten over på 18 timer. - Dag 3: Den optiske massefylde ved 600 nm (OD600) af hver donors og modtagers natkultur måles (ingen hvirvelstrøm) ved hjælp af en 1:10 fortynding af 900 μL saltopløsning og 100 μL af natkulturen.
- Den optiske tæthed for hver donor og modtager indstilles til 2,0 (OD600 = 2,0) med steriliseret saltopløsning (0,85% NaCl i vand).
BEMÆRK: En natkultur af E. coli med en OD600 = 2,0 har 1,6 x 109 CFU / ml. - Mærk et 1,5 ml mikrocentrifugerør "parringsrør", der angiver donor- og modtagerstammerne. Overfør 500 μL af den justerede (OD600 = 2,0) suspension af hver donor og modtager, og anbring dem i parringsrøret (dette parringsrør ville have 0,8 x 109 CFU/ml af hver donor og modtager). Bland forsigtigt parringsrøret ved invertering.
- Centrifuger parringsrøret i 10 minutter ved 500 x g ved stuetemperatur.
- Uden at forstyrre pillen pipetteres 800 μL af konjugationsrøret ud. Der skal være 200 μL tilbage i konjugationsrøret.
BEMÆRK: Supernatanten kasseres i en beholder med 10 % blegemiddel for at inaktivere bakterier i suspensionen. - Der inkuberes parringsrøret i 18 timer (natten over) ved 37 °C i en inkubator. Parring sker i inkubationstiden.
BEMÆRK: Dette trin skal udføres uden at ryste for ikke at bryde den konjugative pili. - Som en negativ kontrol skal du stribe donorernes overnatningskultur på medier B og modtagere på medier A. Inkuber pladerne natten over ved 37 °C
- Dag 4: Tilsæt 800 μL saltopløsning til parringsrøret og hvirvelstrømmen for at resuspendere (dette rekonstituerer parringsblandingen til 1 ml).
BEMÆRK: Vortexing bryder parringsbakterierne fra hinanden og homogeniserer kulturen for at kvantificere CFU / ml. - Forbered 1:10 fortyndinger (fra 1 x 100 til 1 x 10-7) af parringsblandingen. Plade 100 μL fortyndinger 10-5 til 10-7 på medier A og medier B og alle fortyndinger på medier AB.
BEMÆRK: Fortynding 100 refererer til det pæne rør. - Lad pladerne tørre, før du placerer dem i inkubatoren på hovedet. Pladerne inkuberes i 18 timer (natten over) ved 37 °C.
- Dag 5: Undersøg de negative kontroller for at sikre, at striberne af donorernes rene overnatte-kulturer ikke voksede på medier B, og modtagernes rene overnatningskultur ikke voksede på medier A.
- Optag antallet af kolonier og fortyndinger, der kan tælles:
- Tæl kolonierne i medier A; Det er donorerne. Kolonierne skal være lyserøde (figur 3A, B).
- Tæl kolonierne i medier B; Disse er modtagerne og transkonjuganterne. Kolonierne skal være lysegule (figur 3C).
- Tæl kolonierne i medier AB; Disse er transkonjuganterne. Kolonierne skal være lysegule.
BEMÆRK: Vælg en tællelig plade. En tællelig plade har mellem 30 og 300 kolonier (mere end 300 kolonier ville være vanskelige at tælle, og mindre end 30 kolonier anses for at være for lille en stikprøvestørrelse til at præsentere en nøjagtig repræsentation af den oprindelige prøve).
- Beregn hyppigheden af konjugering pr. donor eller pr. modtager
Konjugationshyppighed pr. donor = (CFU/ml transkonjugant [media AB])/ (CFU/ml donor [media A]) x 100
Konjugationsfrekvens pr. modtager = (CFU/ml af transkonjuganten [media AB])/ (CFU/ml af modtagere og transkonjuganter [media B]) x 100
BEMÆRK: Konjugationsfrekvensen for denne protokol blev beregnet som transkonjuganter divideret med modtagerens nummer ganget med 100. Ifølge litteraturen kunne den resulterende mængde konjugering navngives som ekskonjugantfrekvens, genoverførselsfrekvens, konjugationsfrekvens, rekombinant udbytte, plasmidoverførselseffektivitet, konjugationsfrekvens baseret på det totale bakterietal, andel af transkonjuganter, fraktion af transkonjuganter i modtagerpopulation, transkonjugantfrekvens, konjugationsfrekvens, logaritmen til konjugationshastighed, overførselshastighedskonstant, konjugationshastighed pr. parringspar, konjugationskoefficient eller konjugationseffektivitet20. Denne protokol refererer til udtrykket konjugationseffektivitet. - Transkonjuganterne opbevares i glycerolstammer ved -80 °C. Følg undertrinnene til fremstilling af glycerollagre.
- Vælg en enkelt koloni af transkonjuganter og dyrk dem natten over (18 timer) i 5,0 ml kulturrør indeholdende 2 ml Mueller Hinton bouillon suppleret med carbenicillin (100 mg / L), ved 37 ° C og omrystning ved 200 o / min.
- Mærk kryogene hætteglas, der angiver navnet på transkonjugant, som følger: Tc + donorens navn + antibiotikum til udvælgelse i medier A (da de er transkonjuganter, er det kendt, at deres baggrund er modtagerstammen, som allerede er resistent over for streptomycin og rifampin, men desuden har plasmidet, der bærer et beta-lactamresistensgen); for eksempel TcU1Carb. Tilføj kontinuerlige tal, hvis mere end en transkonjugant fra den samme donor skal opbevares (f.eks. TcU1Carb1, TcU1Carb2 osv.).
- Overfør 1 ml af natkulturen til 1 ml 50% glycerol (v / v; den endelige glycerolkoncentration skal være 25%) og bland forsigtigt ved inversion. Sæt de kryogene hætteglas på tøris i 15 minutter og opbevar kryoialerne ved -80 °C til fremtidige forsøg.
- Til DNA-ekstraktion stribes trasnkonjuganterne fra glycerolstammer på Mueller Hinton-agar suppleret med carbenicillin (100 mg/l), og der inkuberes natten over ved 37 °C; Følg derefter anbefalingerne fra trin 2.1.
2. Metode 2: Polymerasekædereaktion (PCR) til amplifikation af antibiotikaresistensgener og plasmidreplikoner i E. coli-transkonjuganter
BEMÆRK: Polymerasekædereaktion (PCR) blev udviklet af Dr. Kary Mullis i 1983. PCR afhænger af specifikke primere (et kort stykke DNA, der supplerer en given DNA-sekvens, der fungerer som et punkt, hvor replikation kan fortsætte, generelt 20-40 nukleotider i længden og ideelt med et guanincytosinindhold på 40% -60%), der udglødes til modsatte tråde af en denatureret, dobbeltstrenget DNA-skabelon og forlænges gennem en termostabil DNA-polymerase, således genereres en yderligere skabelon til den næste reaktionscyklus, hvilket fører til eksponentiel forstærkning af den oprindelige skabelon21. I denne protokol blev replicons og resistensgener, der var til stede i de konjugative plasmider, amplificeret for at bekræfte overførslen i transkonjugante modtagerceller.
- DNA-ekstraktion
- For at detektere overførslen af resistensgener, der bæres af konjugative plasmider, skal du bruge transkonjugant DNA som skabelon. Brug simpel kogeforberedelsesekstraktion til at lyse bakteriecellevæggene.
BEMÆRK: Simpel kogeforberedelsesekstraktion er en enkel tilgang til at lyse bakteriecellevæggene. Denne ekstraktion indeholder plasmid-DNA blandet med genomisk DNA, men da primere er designet i henhold til specifikke DNA-sekvenser af interesse, er denne skabelon også nyttig til PCR. Plasmider kan også specifikt renses, selvom udbyttet har tendens til at falde med stigende plasmidstørrelse22. Dette er et praktisk stoppested. DNA kan opbevares i flere måneder ved -20 °C.
- For at detektere overførslen af resistensgener, der bæres af konjugative plasmider, skal du bruge transkonjugant DNA som skabelon. Brug simpel kogeforberedelsesekstraktion til at lyse bakteriecellevæggene.
- PCR
- I betragtning af at eksperimentet har en negativ og en positiv kontrol, er det gavnligt at oprette en pulje til alle reaktionerne i et 1,5 ml rør. Mærk et 1,5 ml rør som "pool" og de krævede PCR-rør med navnet på genet og prøven (f.eks. OXA-U1).
- PCR-reagenserne pipetteres i følgende rækkefølge i et 1,5 ml rør: sterilt vand, 2x Master Mix, primere og polymerase (undtagen skabelon-DNA) (se tabel 1). Bland forsigtigt ved pipettering op og ned mindst 10 gange. Hold på is hele tiden.
BEMÆRK: Brug handsker for at undgå kontaminering af reaktionsblandingen eller reagenserne. Prøv at undgå at åbne og blande reagenser og håndtere prøver i samme område for at forhindre reagenskontaminering. Anbring reagenserne i isspanden for at undertrykke nukleaseaktivitet og uspecifik priming. Lad dem tø helt op, før du opretter en reaktion. Opbevar reagenserne på is under hele eksperimentet. Taq-polymerase tilsættes i slutningen, fordi den er følsom over for pH-ændringer; Det skal bufferes for at undgå nedbrydning eller forkert foldning. Sekvensen af primerne er anført i tabel 2 - antibiotikaresistensgener - og tabel 3-replicons 23,24,25,26,27,28. - Tilføj skabelon-DNA'et til det tilsvarende rør. Undgå at indføre bobler og sikre hætter på PCR-rørene.
- Placer PCR-rørene i den termiske cyklist.
- Start programmet. Se programindstillingerne for hvert gen i tabel 2 (resistensgener) og tabel 3 (replicons).
BEMÆRK: Indstil PCR-programmer til at holde prøverne ved 4 °C efter kørslen.- PCR-betingelser for replicons: en denatureringscyklus ved 94 °C i 5 min, efterfulgt af 30 denatureringscyklusser ved 94 °C i 1 min, udglødning ved 60 °C i 30 s, forlængelse ved 72 °C i 1 minut og en endelig forlængelse af en cyklus ved 72 °C i 5 min.
BEMÆRK: Dette er betingelserne standardiseret af Carattoli et al.29.
- PCR-betingelser for replicons: en denatureringscyklus ved 94 °C i 5 min, efterfulgt af 30 denatureringscyklusser ved 94 °C i 1 min, udglødning ved 60 °C i 30 s, forlængelse ved 72 °C i 1 minut og en endelig forlængelse af en cyklus ved 72 °C i 5 min.
- Når programmet er færdigt, opbevares PCR-rørene ved 4 °C.
BEMÆRK: Dette er et praktisk stoppested. PCR-produkter kan opbevares i flere måneder ved -20 °C - Forbered en 1% agarosegel ved at veje 0,6 g agarose i en 250 ml kolbe og tilsæt 60 ml 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffer (juster reagenser, hvis en anden gelstørrelse er nødvendig). Smelt agaroseen forsigtigt og langsomt i en mikrobølgeovn for at undgå, at agarose spildes ud over kolben, og lad den køle af til ca. 55 °C (10-15 min).
- Alle reagenserne fremstilles ved hjælp af ultrarent deioniseret vand og reagenser af analysekvalitet:
- TAE 50x buffer (Tris-base, eddikesyre og EDTA) (1 L): Bland 121,1 g Tris-base + 372,24 g EDTA, og tilsæt 500 ml destilleret vand. Opløs med en magnetisk omrører. Tilsæt 57,1 ml eddikesyre, og tilsæt destilleret vand til et samlet volumen på 1.000 ml.
- Autoklave ved 15 psi, 121 °C i 15 min, og opbevares ved stuetemperatur, indtil den er klar i op til 6 måneder.
- TAE 1x buffer (1 L): Kombiner 20 ml TAE 50x buffer med 980 ml destilleret vand og bland.
- Under en stinkhætte tilsættes 6 μL SYBR Green til den smeltede agarose, blandes og hældes ud i bakken (og kammen), der tidligere er forseglet med tape for at undgå spild. Lad gelen sætte sig i 15-25 min, indtil der opstår turbiditet.
BEMÆRK: Andre alternative farvestoffer er også tilgængelige30,31,32,33. - Fjern klæbebåndet, og læg gelen i elektroforesekammeret, og tilsæt nok 1x TAE-buffer til at dække gelen.
- Bland 5 μL 6x DNA-gelbelastende farvestof med 25 μL af hver reaktion. Bland forsigtigt ved pipettering op og ned mindst 10 gange.
BEMÆRK: Ikke alt PCR-produktet skal lægges i gelen for at visualisere det forventede produkt (juster mængden af farvestof som svarer). Den resterende PCR-prøve kunne gemmes og opbevares ved -20 °C i flere måneder. - Læg blandingen i brønde (undgå at indføre bobler) og læg kammerlåget ned.
BEMÆRK: Læg den første prøve i den anden brønd (reserver den første til stigen), begyndende med den negative kontrol. - Læg 4 μL 1 kb DNA-stige i den første brønd.
- Kør elektroforesen ved 120 V, 400 mA og 60 min.
- Visualiser gelen under UV-lys (med en UV-belysning) og optag billedet.
BEMÆRK: Hvis et PCR-produkt er til stede, kan DNA-bånd, der er farvet, detekteres ved hjælp af en standard UV-transilluminator, en transilluminator i synligt lys eller en laserbaseret scanner.
| Reagens | Lager løsning | Volumen tilsat til 50 μL reaktion (1x) | Endegyldig | Eksempel: volumen | Eksempel: volumen | Eksempel: volumen tilsat til hvert rør Final Vol. 50 μL | Volumen tilføjet til positiv kontrol | Volumen tilføjet til negativ kontrol |
| Koncentration | tilføjet til 1x | Tilføjet til 3x (pool) | ||||||
| Sterilt vand | - | 21,5 μL (q.s. til 50 μL) | - | 21,5 μL | 64,5 μL | 49 μL/rør | 49 μL/rør | 49 μL/rør |
| Master Mix | 2x | 25 μL | 1x | 25 μL | 75 μL | |||
| Fremadgående primer | 25 μM | 1 μL | 0,5 μM | 1 μL | 3 μL | |||
| Omvendt primer | 25 μM | 1 μL | 0,5 μM | 1 μL | 3 μL | |||
| Skabelon DNA | Variabel (100–200 ng/μL) | Variabel (1 μL) | Variabel | 0,5 μL | 1,5 μL | |||
| Polymerase | 5 enheder/μL | 0,5 μL | 2.5 Enheder | - | - | 1 μL (transkonjugant) | 1 μL (donor) | 1 μL (modtager) |
| BEMÆRK: q.s. er en latinsk forkortelse for quantum satis, der betyder den mængde, der er nødvendig. | ||||||||
Tabel 1: PCR-reagenser og pool for tre reaktioner (et eksempel).
| Primere (sekvens angivet i 5' - 3' retning) | PCR-program | Forventet størrelse |
| (BP) Ref. | ||
| blaCTX-M gruppe 1 | 94 oC 7 min | (864) 23 |
| CTX-M: GGTTAAAAAATCACTGCGYC | 94 oC 50 s (35 cyklusser) | |
| CTX-M: TTGGTGACGATTTTAGCCGC | 50 oC 40 s | |
| 68 oC 1 min | ||
| 68 oC 5 min | ||
| blaCMY-2 | 95 oC 3 min | (1855) 24 |
| CMY-2-F: GATTCCTTGGACTCTTCAG | 95 oC 30 s (30 cyklusser) | |
| CMY-2-R: TAAAACCAGGTTCCCAGATAGC | 53 oC 30 s | |
| 72 oC 30 s | ||
| 72 oC 3 min | ||
| aac(3')-II | 94 oC 5 min | (237) 25 |
| AAC(3')-II-F: ACTGTGATGGGATACGCGTC | 94 oC 30 s (32 cyklusser) | |
| AAC(3')-II-R: CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA | 60 oC 45 s | |
| 72 oC 2 min | ||
| 72 oC 8 min | ||
| aadA | 94 oC 5 min | (283) 26 |
| aadA1: GCAGCGCAATGACATTCTTG | 94 oC 1 min (35 cyklusser) | |
| aadA2: ATCCTTCGGCGCGATTTTG | 60 oC 1 min | |
| 72 oC 1 min | ||
| 72 oC 8 min | ||
| sul-3 | 94 oC 5 min | (799) 27 |
| sul-3-F: GAGCAAGATTTTTTGGAATCG | 94 oC 1 min (30 cyklusser) | |
| sul-3-R: CATCTGCAGCTAACCTAGGGCTTTGGA | 51 oC 1 min | |
| 72 oC 1 min | ||
| 72 oC 5 min | ||
| tet(A) | 95 oC 5 min | (957) 28 |
| TETA-1: GTAATTCTGAGCACTGTCGC | 95 oC 30 s (23 cyklusser) | |
| TETA-2: CTGCCTGGACAACATTGCTT | 62 oC 30 s | |
| 72 oC 45 s | ||
| 72 oC 7 min | ||
| DFR En | 95 oC 5 min | (302) Dette arbejde |
| DFRA-F: CATACCCTGGTCCGCGAAAG | 95 oC 1 min (30 cyklusser) | |
| 55 oC 1 min | ||
| DFRA-R: CGATGTCGATCGTCGATAAGTG | 72 oC 1 min | |
| 72 oC 7 min | ||
| katA2 | 95 oC 5 min | |
| catA2-F: GACCCGGTCTTTACTGTCTTTC | 95 oC 1 min (25 cyklusser) | (225) Dette arbejde |
| catA2-R: TCCGGTGATATTCAGATTAAAT | 60 oC 1 min | |
| 72 oC 1 min | ||
| 72 oC 7 min |
Tabel 2: Primere og PCR-programmer, der bruges til at forstærke diagnostiske resistensgener.
| Replicon | Primer (sekvens angivet i 5' - 3' retning) | Mål | PCR-program | Forventet størrelse (bp) | |||
| IncFIB | F: TCTGTTTATTCTTTTTACTGTCCAC | repA | 94 oC 5 min | 683 | |||
| R: CTCCCGTCGCTTCAGGGCATT | 94 oC 1 min (30 cyklusser) | ||||||
| 60 oC 30 s | |||||||
| IncFIC | F: GTGAACTGGCAGATGAGGAAGG | repA2 | 72 oC 1 min | 262 | |||
| R: TTCTCCTCGTCGCCAAACTAGAT | 72 oC 5 min | ||||||
| IncI1 | F: CGAAAGCCGGACGGCAGAA | RNAI | 139 | ||||
| R: TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGT | |||||||
Tabel 3: Primere og PCR-program anvendt til klassificering af plasmider p134797 og p101718 ved PCR-baseret replikontypning29.
Representative Results
Da donorerne SW4955 og SW7037 er blevet sekventeret, forventes disse to donorstammer at have resistensfænotyperne svarende til resistensgenprofilen identificeret i deres genomsekvens. Plasmid p134797 (fra SW4955) har gener, der giver resistens over for tredje generations cephalosporiner (blaCTX-M-55) og resistens over for aminoglycosider (aac (3) -IIa og aadA1), phenicols (catA2), tetracycliner (tet (A)), trimethoprim (dfrA14) og sulfonamider (sul3); Der blev ikke fundet antibiotikaresistensgener i SW4955-kromosomet. Plasmid p101718 (fra SW7037) bærer kun ét antibiotikaresistensgen (bla CMY-2), der forventes at give resistens over for tredje generations cefalosporiner (blaCTX-M-55). Igen blev der ikke fundet antibiotikaresistensgener i SW7037-kromosomet.
Efter parring forventedes påvisning af overførslen af de to konjugative plasmider med alle ovennævnte resistensgener. Positiv konjugationsdetektion indebærer, at modtagerne identificeret som transkonjuganter skulle have erhvervet de konjugative plasmider. Tilstedeværelsen af de diagnostiske resistensgener for de konjugative plasmider i transkonjuganterne (som påvist ved PCR) forventedes også.
For at illustrere de her beskrevne metoder blev to E. coli-miljøisolaters evne til at overføre plasmid-DNA ved konjugering testet. En skematisk gengivelse af forsøgsindstillingen er vist i figur 1. To donorer (E. coli SW4955 og SW7037) og en modtager (E. coli LMB100) blev parret uafhængigt. Genkortet over konjugative plasmider fundet i E. coli SW4955 (p134797) og SW7037 (p101718) er vist i figur 2.
Konjugative plasmider blev udvalgt med carbenicillin og modudvalgt under anvendelse af rifampin og streptomycin, hvis resistensdeterminanter er i modtagerens kromosom. MacConkey agar blev brugt til at skelne de laktosepositive donorer (som producerer store, lyserøde kolonier) fra modtageren og transkonjuganter (som er laktosenegative og producerer mindre, lysegule kolonier) (figur 3).
Figur 3: Illustration af de forskellige farvemarkører for donor- og modtagerkolonier på MacConkey-agar. Kolonierne svarende til donorer er lyserøde på MacConkey agar, fordi de er laktosepositive. Dette skelner donor fra modtagerkolonier, som er lysegule og mindre (laktosenegative). Klik her for at se en større version af denne figur.
Mobiliseringen af det konjugative plasmid p134797 blev detekteret, hvor hvert af de fem antibiotika svarer til de fem forskellige klasser af resistensgener, der findes i plasmidet.
Et eksempel på, hvordan man beregner konjugationseffektiviteten (CE) for stamme SW4955 præsenteres. Fra analysen med stamme SW4955 blev 172 CFU af transkonjuganter talt i pladen fra fortynding 10-2; antallet af modtageren fra den tilsvarende fortynding (10-2) var 10.300.000 CFU/ml (tabel 4).
CE beregnes som følger:
CE = (174 CFU/ml)/(10.300.000 CFU/ml)
CE= 1,67 x 10-5 transkonjuganter/modtager
| LMB100 | Transkonjuganter fra stamme SW4955 udvalgt med Carbelicillin | Konjugering effektivitet | ||
| Fortynding | CFU (tællelig plade) | Ca. CFU/ml | CFU (tællelig plade) | |
| 100 | sammenflydende | 1.03E+09 | ||
| 10-1 | sammenflydende | 1.03E+08 | ||
| 10-2 | sammenflydende | 10300000 | 172 | 1,67 x 10-5 transkonjuganter/modtager |
| 10-3 | sammenflydende | 1030000 | ||
| 10-4 | sammenflydende | 103000 | ||
| 10-5 | sammenflydende | 10300 | ||
| 10-6 | sammenflydende | 1030 | ||
| 10-7 | 103 | 103 | ||
| Værdier, der bruges til at beregne CE, er fremhævet med fed skrift. | ||||
Tabel 4: Et eksempel på, hvordan konjugationseffektiviteten (CE) for stamme SW4955 beregnes.
Resultaterne er vist i tabel 5, udtrykt som konjugeringseffektivitet pr. modtager. De fem konjugeringseffektivitetsgevinster opnået ved anvendelse af stamme SW4955 som donor var alle inden for samme størrelsesorden. Disse resultater indikerer, at mobiliseringen af det konjugative plasmid kan detekteres uanset det valg, der anvendes til transkonjugantidentifikation.
Ved anvendelse af stammen SW7037 som donor var den opnåede konjugeringseffektivitet tre størrelsesordener lavere; Disse resultater gør det muligt at sammenligne konjugeringseffektiviteten hos forskellige donorer og plasmidtyper med de samme modtagere.
| Konjugering effektivitet | |||||
| Stamme | Carbenicillin (100 mg/l) | Gentamicin (2 mg/l) | Chloramphenicol (25 mg/l) | Tetracyklin (10 mg/l) | Trimethoprim (20 mg/l) |
| SW4955 | 1,67 x 10-5 | 5,67 x 10-5 | 2,17 x 10-5 | 7,62 x 10-5 | 1,36 x 10-5 |
| SW7037 | 2,14 x 10-6 | ||||
Tabel 5: Konjugeringseffektivitet af E. coli-donorstammer SW4955 og SW7037 afhængigt af det anvendte antibiotikum.
I transkonjuganter blev tilstedeværelsen af replicons og alle resistensgener kodet i to konjugative plasmider testet og deres tilsvarende replicons kontrolleret ved PCR. De betingelser, der anvendes til disse diagnostiske PCR-reaktioner, er vist i tabel 3.
De diagnostiske geler er vist i figur 4. Disse geler bekræfter tilstedeværelsen af de forventede replicons i transkonjuganter (IncFIC og IncFIB i p1347975 og IncI1 i p101718). De bekræfter også tilstedeværelsen af de forventede antibiotikaresistensgener, nemlig bla CTX-M-55-gruppen (beta-lactam), aac(3)-II og aadA (aminoglycosid), catA2 (phenicol), tet(A) (tetracyclin), dfrA14 (trimethoprim) og sul3 (sulfonamid) for p1347975 og blaCMY-2 for p101718 (figur 4).
Figur 4: Diagnostisk elektroforese geler. Gelelektroforese af PCR-produkter af antibiotikaresistensgener og plasmid-replicons fundet i konjugative plasmider p134797 og p101718 i donorcellerne (stammer SW4955 og SW7037, henholdsvis) og i de tilsvarende LMB100-transkonjuganter. Carbenicillin blev brugt til plasmidudvælgelse. Forkortelser. -: negativ kontrol (DNA af stamme LMB100 blev brugt som negativ kontrol); D: donor; T: transkonjugant. Forventede amplicon størrelser: blaCTX-M-55: 864 pb; aac(3)-IIa: 237 bp; aadA1: 283 bp; katA2 : 225 bp; tet(A): 957 bp; dfrA14: 302 bp; sul3: 799 bp; IncFIC(FII): 262 bp; IncFIB: 683 bp; blaCMY-2: 1.855 bp; IncI1-I: 139 bp. Gelen har 1% agarose. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Konjugative plasmider giver adgang til en fælles pulje af gener inden for en bestemt miljøindstilling gennem rekombination og horisontal genoverførsel34. Konjugative plasmider er således evolutionære enheder, der er i stand til at erhverve og tildele funktioner, der gør det muligt for bakterier at tilpasse sig flere tilstande (herunder resistens over for antibiotika, resistens over for metaller, erhvervelse af metaller, biofilmdannelse og patogene gener, blandt andre) inden for en tidsmæssig skala på timer.
Dette arbejde præsenterer en protokol til identifikation af konjugative plasmider i bakterier. For at protokollen skal fungere, skal de anvendte markører differentiere donor- og modtagerstammer, som vist ved kontrollerne i medier A og B. De skal også effektivt vælge celler, der bærer plasmidet. Parringsreaktionen er kritisk. I denne reaktion skal donorer og modtagere tage langvarig kontakt (gennem pili) for at konjugering kan forekomme. Alt, hvad der kan forstyrre celle-til-celle-kontakt, såsom en utilstrækkelig inkubationstid eller omrystning eller omrøring af kulturen, reducerer således effektiviteten af konjugation. Valget af modtager er også kritisk, da nogle modtagerstammer er ildfaste over for konjugering35,36. LMB100 foreslås som den valgte modtager, da den er i stand til at tage plasmider af flere inkompatibilitetstyper.
Konjugationshastigheden er specifik for hvert plasmid-donorkromosompar, modtager og miljøtilstand. Konjugeringen af specifikke plasmider har vist sig at være følsom over for et stort antal variabler, herunder vækstfase, celletæthed, donor-til-modtager-forhold, om konjugering udføres i flydende eller faste medier, kulstof, ilt, galdesalte, metalkoncentrationer, tilstedeværelse af pattedyrceller, temperatur, pH og parringstid13,14,15 . Undersøgelsen af disse interaktioner afhænger af den indledende påvisning af et konjugativt plasmid, der skal undersøges i dybden. Således kan protokollen beskrevet her også ændres for at undersøge virkningen af forskellige eksperimentelle variabler, selvom dette kommer på bekostning af at begrænse antallet af screenede donorer. Det kan også identificere mobiliserbare plasmider i værter, der har hjælperplasmider (dvs. plasmider, der muliggør konjugering ved at tilvejebringe funktioner, der mangler fra de mobiliserbare plasmider i trans6).
Det anbefales at kende sekvensen af det konjugative plasmid (men ikke nødvendigt for at detektere konjugering som diskuteret ovenfor). Når donorerne er laktosenegative (producerer gule kolonier på MacConkey agar), kan en laktosepositiv modtager (der producerer lyserøde kolonier på MacConkey agar) bruges til at skelne ægte transkonjuganter fra donorceller, der er i stand til at vokse på medierne for at vælge transkonjuganter. Protokollen beskrevet her er designet til at detektere konjugative plasmider fra miljømæssige, kommensale og patogene medlemmer af familien Enterobacteriaceae; Det kan dog bruges med alle bakteriearter med en passende donor, modtager, antibiotika (er) og farvemarkører. Identifikation af disse kritiske komponenter i andre bakterier kræver systematiske undersøgelser ved hjælp af flere donorer, modtagere og markører (antibiotika og farver). Denne protokol er ikke testet i grampositive bakterier.
Flere varianter af den metode, der præsenteres her, er blevet rapporteret i litteraturen, for nylig gennemgået20. Det kvalitative resultat kan også refereres til på forskellige måder (f.eks. ekskonjugantfrekvens og genoverførselsfrekvens), og dimensionsløse enheder kan bruges til at rapportere konjugeringseffektivitet (ml/CFU x h)20.
Den her beskrevne protokol løser flere begrænsninger, der tidligere ikke blev behandlet ved hjælp af eksisterende metoder16,18,19,20. For det første er der fundet en egnet modtager. For det andet minimerer brugen af to antibiotika (rifampin og streptomycin) til udvælgelse af ægte transkonjuganter muligheden for, at donorer udvikler resistens over for et af de antibiotika, der bruges til at vælge transkonjuganter gennem spontan mutagenese. Falske transkonjuganter kan også skyldes beskyttelse af andre tilstedeværende ved hydrolyse af det antibiotikum, der anvendes til udvælgelse af transkonjuganter ved hjælp af enzymer (f.eks. beta-lactamaser), der produceres i store mængder af donoren. For det tredje er flere eksperimentelle kontroller inkluderet for at sikre, at produktet af parring er en ægte transkonjugant (dvs. en modtagercelle, der stabilt har inkorporeret donorens konjugative plasmid). Her præsenterede vi to uafhængige metoder til at teste transkonjuganternes autenticitet, nemlig en kolorimetrisk markør i MacConkey-agar og PCR-påvisning af replicons og antibiotikaresistensgener af det konjugative plasmid i modtageren. Protokollen beskrevet her er også designet til at isolere og karakterisere konjugative plasmider fra miljømæssige, kommensale og patogene medlemmer af familien Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigella og andre arter).
For at forstå konjugationsmekanikken er eksperimentelle observationer blevet modelleret ved hjælp af computersimuleringer. Disse prædiktive modeller estimerer hyppigheden af plasmidoverførsel for givne væksttætheder hos donorer, modtagere og transkonjuganter. En model kendt som endepunktsmodellen fandt tærskler, over hvilke hastigheden af plasmidoverførsel i flydende kultur og konkluderede, at overførselshastigheden er upåvirket af celletæthed, donor-modtager-forhold og parringstid19. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er blevet anvendt som en alternativ metode til transkonjugant plasmiddetektion. FISH tillader plasmidvisualisering ved hjælp af fluorescensmikroskopi gennem hybridisering af en DNA-sonde og et mål-DNA. FISH tillader således visuel påvisning af plasmidstrømme på tværs af forskellige cellepopulationer37, selvom det ikke har samme følsomhedsniveau som den metode, der præsenteres her, hvis transkonjuganter detekteres ved visuel screening i modsætning til selektion.
Der er et enormt behov for at forstå biologien bag konjugative plasmider, der spreder antibiotikaresistensgener gennem forskellige komponenter i økosystemet (klinik, landbrug, spildevand, dyreliv, husdyr, jord, floder og søer). Alt i alt letter de forenklede eksperimentelle betingelser, der præsenteres i de her beskrevne protokoller, screening af donorer i stor skala og udgør således et nøgleværktøj til undersøgelse af horisontal genoverførsel med oprindelse i konjugative plasmider fra en række forskellige kilder. De kan bruges til at undersøge forekomsten af antibiotikaresistensgener eller andre klinisk relevante gener i konjugative plasmider fra flere kilder og bakterier. De kan også tilpasses til undersøgelse af konjugering in vivo (f.eks. i tarmen hos hvirveldyr) og til at studere de forhold, der modulerer effektiviteten af konjugering. Alle disse undersøgelser vil i høj grad bidrage til forståelsen af, hvordan mobiliseringen af multiresistente konjugative plasmider bidrager til spredningen af multiresistens.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
LM-B, IMG, AT og IS blev støttet af NIH-bevilling GM055246 tildelt LM-B. GC-C blev tildelt UC MEXUS-CONACYT Postdoctoral Fellowship i to på hinanden følgende år: AY 2017-18 og 2018-19. Vi takker eleverne Sage Chavez og Pepper St. Clair fra Genentech-Foundation sponsorerede Academic Inspiration Network (GAIN) mentorprogram for deres tekniske støtte i eksperimenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube racks | Thermo Fisher Scientific | 22-313630 | It can be replaced for another brand |
| 2.0 mL Cryogenic vials | Corning | 430659 | It can be replaced for another brand |
| 14 mL conical tubes | FALCON | 149597 | It can be replaced for another brand |
| 14 mL tube racks | Thermo Fisher Scientific | 8850 | It can be replaced for another brand |
| 1 kb DNA ladder | New England Biolabs | N0552G | |
| 250 mL sterile flasks | PYREX | 5320 | It can be replaced for another permanent marker brand |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38SI-212 | It can be replaced for another brand |
| Agarose (molecular biology grade, multipurpose) | Fisher Scientific | BP160-500 | It can be replaced for another brand |
| Carbenicillin | GOLD BIOTECHNOLOGY | C-103-50 | It can be replaced for another brand |
| Disposable inoculating loops: 1 µL | Fisherbrand | 22-363-595 | It can be replaced for another brand |
| DNA gel loading dye 6x | New England Biolabs | B7024S | It can be replaced for another brand |
| EDTA | Fisher Scientific | BP119-500 | It can be replaced for another brand |
| Electronic digital scale | Denver Instrument | APX-2001 | It can be replaced for another brand |
| Eppendorf conical tubes: 1.5 mL | Eppendorf | 14-282-302 | It can be replaced for another brand |
| Equipment for agarose gel electrophoresis | Fisher Scientific | FP300 | It can be replaced for another brand |
| Ethanol-resistant markers | Sharpie | 37001; 37002; 37003 | It can be replaced for another brand |
| Gel documentation systems (UVP GelSolo) | Analytakjena | SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01 | It can be replaced for another brand |
| Gloves | X-GEN | 44-100M | Any nitrile gloves brand works |
| Ice bucket | Thermo Fisher Scientific | 432128 | It can be replaced for another brand |
| MacConkey agar | BD DIFCO | 212123 | |
| Master Mix | BioLabs | M0496S | It can be replaced for another brand |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | It can be replaced for another brand |
| Microcentrifuge tubes: 2.0 mL | Fisherbrand | 05-408-138 | It can be replaced for another brand |
| Mueller Hinton agar | BD DIFCO | DF0479-17-3 | |
| Mueller Hinton broth | BD DIFCO | 275730 | |
| NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL | 740588. 250 | |
| PCR tube racks | AXYGEN | R96PCRFSP | It can be replaced for another brand |
| PCR tubes (0.2 mL) | AXYGEN | PCR-02-C | It can be replaced for another brand |
| Rifampicin | Fisher Scientific | 50-164-7517 | |
| Set of micropipettes that dispense between 1 - 10 μL (P10), 2–20 μL (P20), 20–200 μL (P200) and 200–1000 μL (P1000) | RAININ | 17008648; 17008650; 17008652; 17008653 | Micropipettes should be calibrated; can be replaced for another brand |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-3 | It can be replaced for another brand |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | 335905P | It can be replaced for another brand |
| Sterilized tips for 10 μL, 200 μL and 1000 μL | Eclipse | 1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9 | It can be replaced for another brand |
| Streptomycin | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| Taq DNA Polymerase | BioLabs | M0273S | |
| Thermal cycler C1000 Touch | Bio-Rad | 1851196 | It can be replaced for another brand |
| Tris | Fisher Scientific | BP153-500 | It can be replaced for another brand |
References
- Lederberg, J., Tatum, E.
- de la Cruz, F., Frost, L. S., Meyer, R. J., Zechner, E. L. Conjugative DNA metabolism in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (1), 18-40 (2010).
- Grohmann, E., Muth, G., Espinosa, M. Conjugative plasmid transfer in gram-positive bacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (2), 277-301 (2003).
- Koraimann, G., Wagner, M. A. Social behavior and decision making in bacterial conjugation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 54 (2014).
- Dziewit, L., et al. Diversity and role of plasmids in adaptation of bacteria inhabiting the Lubin copper mine in Poland, an environment rich in heavy metals. Frontiers in Microbiology. 6, 152 (2015).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F.
- Balbuena-Alonso, M. G., et al. Genomic analysis of plasmid content in food isolates of E. coli strongly supports its role as a reservoir for the horizontal transfer of virulence and antibiotic resistance genes. Plasmid. 123-124, 102650 (2022).
- San Millan, A., MacLean, R. C. Fitness costs of plasmids: A limit to plasmid transmission. Microbiol Spectrum. 5 (5), (2017).
- Coluzzi, C., Garcillán-Barcia, M. P., de la Cruz, F., Rocha, E. P. C. Evolution of plasmid mobility: Origin and fate of conjugative and nonconjugative plasmids. Molecular Biology and Evolution. 39 (6), 1-23 (2022).
- Bevan, E. R., et al. Molecular characterization of plasmids encoding blaCTX-M from faecal Escherichia coli in travellers returning to the UK from South Asia. The Journal of Hospital Infection. 114, 134-143 (2021).
- Minja, C. A., Shirima, G., Mshana, S. E. Conjugative plasmids disseminating CTX-M-15 among human, animals and the environment in Mwanza Tanzania: a need to intensify one health approach. Antibiotics. 10 (7), 836 (2021).
- Carattoli, A.
- Sengupta, M., Austin, S. Prevalence and significance of plasmid maintenance functions in the virulence plasmids of pathogenic bacteria. Infection and Immunity. 79 (7), 2502-2509 (2011).
- Alderliesten, J. B., et al. Effect of donor-recipient relatedness on the plasmid conjugation frequency: a meta-analysis. BMC Microbiology. 20 (1), 135 (2020).
- Neil, K., Allard, N., Rodrigue, S. Molecular mechanisms influencing bacterial conjugation in the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 12, 673260 (2021).
- Liu, G., Bogaj, K., Bortolaia, V., Olsen, J. E., Thomsen, L. E. Antibiotic-induced, increased conjugative transfer is common to diverse naturally occurring ESBL plasmids in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 2119 (2019).
- Suchman, E.
- Watanabe, T. Infective heredity of multiple drug resistance in bacteria. Bacteriological Reviews. 27 (1), 87-115 (1963).
- Simonsen, L., Gordon, D. M., Stewart, F. M., Levin, B. R. Estimating the rate of plasmid transfer: an end-point method. Journal of General Microbiology. 136 (11), 2319-2325 (1990).
- Huisman, J. S., et al. Estimating plasmid conjugation rates: A new computational tool and a critical comparison of methods. Plasmid. 121, 102627 (2022).
- Jung, B., Hoilat, G. J.
- NucleoSpin Plasmid DNA purification. , Available from: https://www.mn-net.com/media/pdf/45/51/02/Instruction-NucleoSpin-Plasmid.pdf (2022).
- Jiang, X., et al. Detection of extended-spectrum beta-lactamases in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (9), 2990-2995 (2006).
- Stapleton, P. D., Shannon, K. P., French, G. L. Carbapenem resistance in Escherichia coli associated with plasmid-determined CMY-4 beta-lactamase production and loss of an outer membrane protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (5), 1206-1210 (1999).
- Ben Yahia, H., et al. Detection of CTX-M-15 harboring Escherichia coli isolated from wild birds in Tunisia. BMC Microbiology. 18 (1), 26 (2018).
- Madsen, L., Aarestrup, F. M., Olsen, J. E. Characterisation of streptomycin resistance determinants in Danish isolates of Salmonella Typhimurium. Veterinary Microbiology. 75 (1), 73-82 (2000).
- Perreten, V., Boerlin, P. A new sulfonamide resistance gene (sul3) in Escherichia coli is widespread in the pig population of Switzerland. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (3), 1169-1172 (2003).
- Guardabassi, L., Dijkshoorn, L., Collard, J. M., Olsen, J. E., Dalsgaard, A. Distribution and in-vitro transfer of tetracycline resistance determinants in clinical and aquatic Acinetobacter strains. Journal of Medical Microbiology. 49 (10), 929-936 (2000).
- Carattoli, A., et al. Identification of plasmids by PCR-based replicon typing. Journal of Microbiological Methods. 63 (3), 219-228 (2005).
- Green, M. R., Sambrook, J.
- Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutation Research. 439 (1), 37-47 (1999).
- Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold nucleic acid gel stain: a dye optimized for use with 300-nm ultraviolet transilluminators. Analytical Biochemistry. 268 (2), 278-288 (1999).
- Oatey, P. Imaging fluorescently stained DNA with CCD technology How to increase sensitivity and reduce integration times. Biotechniques. 42 (3), 376-377 (2007).
- Norman, A., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. Conjugative plasmids: vessels of the communal gene pool. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 364 (1527), 2275-2289 (2009).
- Du, L., Liu, R. H., Ying, L., Zhao, G. R. An efficient intergeneric conjugation of DNA from Escherichia coli to mycelia of the lincomycin-producer Streptomyces lincolnensis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (4), 4797-4806 (2012).
- Kirk, J. A., Fagan, R. P. Heat shock increases conjugation efficiency in Clostridium difficile. Anaerobe. 42, 1-5 (2016).
- Esteves, G. M., Pereira, J. A., Azevedo, N. F., Azevedo, A. S., Mendes, L. Friends with benefits: An inside look of periodontal microbes' interactions using fluorescence in situ hybridization-Scoping review. Microorganisms. 9 (7), 1504 (2021).
