Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Detektion av horisontell genöverföring medierad av naturliga konjugativa plasmider i E. coli

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64523
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1, 2
1School of Biological Sciences, University of California Irvine, 2Department of Microbiology & Environmental Toxicology, University of California Santa Cruz

Summary

Konjugering förmedlar horisontell genöverföring genom att mobilisera plasmid-DNA över två olika celler, vilket underlättar spridningen av fördelaktiga gener. Detta arbete beskriver en allmänt använd metod för effektiv detektion av konjugativ plasmidöverföring, baserad på användningen av differentialmarkörer i konjugativ plasmid, givare och mottagare för att detektera transkonjugering.

Abstract

Konjugering representerar en av de viktigaste mekanismerna som underlättar horisontell genöverföring i gramnegativa bakterier. Detta arbete beskriver metoder för studier av mobilisering av naturligt förekommande konjugativa plasmider, med två naturligt förekommande plasmider som exempel. Dessa protokoll förlitar sig på differentiell närvaro av valbara markörer i donator, mottagare och konjugativ plasmid. Specifikt innefattar de beskrivna metoderna 1) identifiering av naturliga konjugativa plasmider, 2) kvantifiering av konjugeringshastigheter i fast kultur och 3) diagnostisk detektion av antibiotikaresistensgener och plasmidreplicontyper hos transkonjuganta mottagare genom polymeraskedjereaktion (PCR). De protokoll som beskrivs här har utvecklats i samband med att studera den evolutionära ekologin för horisontell genöverföring, för att screena för närvaron av konjugativa plasmider som bär antibiotikaresistensgener i bakterier som finns i miljön. Den effektiva överföringen av konjugativa plasmider som observerats i dessa experiment i odling belyser den biologiska relevansen av konjugering som en mekanism som främjar horisontell genöverföring i allmänhet och spridningen av antibiotikaresistens i synnerhet.

Introduction

År 1946 beskrev Lederberg och Tatum1 en sexuell process i Escherichia coli K-12 som nu är känd som konjugation. Bakteriell konjugering är den process genom vilken en bakteriecell (donatorn) överför enkelriktat genetiskt material till en annan cell (mottagaren) genom direkt cell-till-cell-kontakt. Konjugering är brett fördelad i bakterier2,3, även om fraktionen av donatorceller som uttrycker konjugeringsmaskineriet vanligtvis är mycket liten4.

Plasmider är autonomt replikerande extrakromosomala DNA-element. Förutom gener som är involverade i plasmidreplikation och underhåll bär plasmider ofta en last av gener som är involverade i anpassning till miljöutmaningar, såsom tungmetaller eller exponering för antibiotika5. Konjugativa plasmider är en klass av plasmider med en uppsättning specialiserade gener som tillåter deras överföring till mottagarceller och stöder deras uthållighet efter överföringen6. Konjugativa plasmider varierar i storlek från 21,8 kb till 1,35 Mb i bakterier i fylumet Pseudomonadota (synonymt med proteobakterier), med medianen runt 100 kb 5,7. De har också i allmänhet ett lågt antal kopior, möjligen för att hålla den metaboliska belastningen på värden låg 8,9.

Den typiska konjugativa apparaten består av fyra komponenter: ett överföringsursprung (oriT), ett relaxas, ett typ IV-kopplingsprotein och ett typ IV-sekretionssystem (en rörliknande struktur som kallas pilus som gör det möjligt för givare att kontakta mottagare)6. Endast en mycket liten del av celler som bär konjugativa plasmider uttrycker konjugeringsmaskineriet4, men om plasmiderna ger en fitnessfördel kan transkonjuganterna snabbt expandera i befolkningen. Mellan 35% och över 80% av E. coli-isolat som samlats in från olika livsmiljöer har konjugativa plasmider med gener som ger resistens mot minst ett antibiotikum10,11; Därför är horisontell genöverföring medierad av konjugativa plasmider en viktig mekanism som driver den globala spridningen av antibiotikaresistensgener12.

Parningsexperiment utförda i laboratorieodling har visat att konjugeringsfrekvensen påverkas av flera faktorer, inklusive mottagarcellernas natur, tillväxtfas, celldensitet, donator-till-mottagarförhållande, huruvida konjugering utförs i flytande eller fast media, kol, syre, gallsalter, metallkoncentrationer, närvaro av däggdjursceller, temperatur, pH och parningstid13,14, 15.

Detta arbete beskriver protokoll för att detektera närvaron av konjugativa plasmider i en given värdstam, för att kvantifiera konjugeringshastigheterna i fast kultur och för att dubbelkontrollera deras överföring till mottagarceller. Dessa protokoll kan användas som ett första steg för identifiering av naturliga konjugativa plasmider som är lämpliga för forskning. De använder ett minimalt antal förenklade steg eftersom de är utformade för att screena närvaron av konjugativa plasmider i bakterier erhållna från flera källor (miljö, kommensal och patogen) i stor skala (dussintals till hundratals givare).

Dessutom visas tester för att detektera om mobiliseringen av en given konjugativ plasmid är oberoende av det antibiotikum som används för detektion (dvs. relevansen av antibiotikaresistensgenen under urval) och för att jämföra konjugeringshastigheterna för två konjugativa plasmider som finns i olika miljöisolat.

Baserat på den genetiska sammansättningen av de relevanta konjugativa plasmiderna (plasmidreplikon och antibiotikaresistensgensammansättning) kan varje steg i protokollet modifieras för att studera effekterna av en mängd olika faktorer som sannolikt påverkar konjugeringshastigheten.

Allmän experimentell design:
De väsentliga komponenterna som behövs för att inrätta ett parningsexperiment är donatorceller, en mottagarstam och fasta medier för att välja givare (antibiotikum A), mottagare (antibiotikum B) och transkonjuganter (antibiotikum A och B). Transkonjuganter är mottagarceller som stabilt upprätthåller donatorns konjugativa plasmid.

Donatorceller är resistenta mot ett antibiotikum (antibiotikum A) och är känsliga för markören eller markörerna som används för att välja mottagarceller (antibiotikum B). Den genomiska placeringen av antibiotikaresistensgenen (dvs. om den är belägen i kromosomen eller en plasmid i donatorcellen) behöver inte vara känd a priori, eftersom mobilisering av antibiotikaresistensmarkörer till mottagaren (efter en direkt kontakt mellan givare och mottagare) innebär att de givartillhandahållna markörerna fanns i en plasmid.

En mottagarstam (känd för att ta konjugativa plasmider) måste ha en stabil valbar markör som inte finns i givaren; Denna valbara markör är i allmänhet resistent mot ett antibiotikum eller biocid som finns i kromosomen. Valet av mottagaren som ska användas i parningsexperiment är kritiskt, eftersom vissa E. coli-stammar varierar i sin förmåga att ta konjugativa plasmider16.

När dessa komponenter har etablerats är varje koloni som växer på media med både antibiotika (A och B) efter en kontakt mellan givare och mottagare en förmodad transkonjugant (figur 1). Detta förutsätter att donatorer kan växa i medier med antibiotika A men inte kan växa i media med antibiotikum B, och att mottagare kan växa i media med antibiotika B, men inte kunna växa med antibiotikum A. Transkonjugering kan bekräftas med hjälp av två diagnostiska tester. Det första testet består av detektion (genom polymeraskedjereaktion [PCR] amplifiering av gener eller andra metoder) av gener som finns i den konjugativa plasmiden i transkonjuganta kolonier. Det andra testet innefattar användning av differentiella kolonifärgmarkörer baserade på laktosmetabolism. Den differentiella kolonifärgen avslöjas genom användning av MacConkey-agar; Laktosen i agarn kan användas som jäsningskälla av laktosfermenterande (LAC+) mikroorganismer. Dessa mikroorganismer producerar organiska syror, särskilt mjölksyra, vilket sänker pH. Neutralrött är en pH-indikator som ingår i media som växlar från benvitt till ljusrött / rosa när pH sjunker under 6,817. Således producerar E. coli laktospositiva stammar större rosa kolonier på MacConkey-agar, medan laktosnegativa stammar producerar blekgul och mindre kolonier på MacConkey-agar.

Figure 1
Figur 1: Experimentell design som används för att detektera närvaron av konjugativa plasmider i givarstammar. I detta exempel bär givaren en konjugativ plasmid med en antibiotikaresistensgen som ger resistens mot antibiotikum A, men de är mottagliga för antibiotikum B. Omvänt har mottagaren en kromosomal resistensdeterminant som ger skydd mot antibiotikum B, men det är mottagligt för antibiotikum A. Transkonjuganter är resistenta mot både antibiotika (A och B), eftersom de har donatorns konjugativa plasmid som ger resistens mot antibiotikum A och mottagarens kromosom som ger skydd mot antibiotikum B. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Konjugeringshastigheten för ett donator-mottagarpar (under givna experimentella betingelser) kan beräknas genom att dividera antalet transkonjuganter med antalet givare eller med antalet mottagare; Den första graden anger andelen donatorceller som uppvisar funktionellt uttryck av konjugeringsmaskineriet av givaren16,18, medan den andra hastigheten indikerar mottagarens förmåga att ta konjugativa plasmider 19,20. I denna studie, om inte annat anges, representerar konjugeringshastigheten fraktionen av mottagarceller som blir transkonjuganta (dvs. hastighet per mottagare).

Här rapporteras två oberoende parningsexperiment, som involverar en E. coli-mottagare och två E. coli-donatorer. Dessutom användes olika antibiotika för att välja transkonjuganter för en av givarna för att bekräfta att en enda multiresistent plasmid kan väljas med någon av de antibiotikaresistensgener som finns i den konjugativa plasmiden.

Donator- och mottagarstammarna som används i detta arbete har sekvenserats fullständigt för att förstå alla komponenter i detta experimentella system; Dessa protokoll utformades emellertid för att screena för närvaron av konjugativa plasmider i värdar med okänd sekvens och kan också användas i detta experimentella sammanhang; I detta fall sekvenseras emellertid de relevanta generna först.

De donator- och mottagarstammar som används i protokollet är följande:

Donator 1. E. coli SW4955 samlades i en sjö i Baton Rouge (LA, USA). Den har en konjugativ plasmid på 134 797 bp (p134797) med IncFIC(FII) och IncFIB (AP001918) svar. Denna konjugativa plasmid har gener som ger resistens mot tredje generationens cefalosporiner (blaCTX-M-55), aminoglykosider (aac(3)-IIa och aadA1), fenikoler (catA2), tetracykliner (tet(A)), trimetoprim (dfrA14) och sulfonamider (sul3). För en fullständig karta över p134797, se figur 2A. E. coli SW4955 är laktospositiv och producerar rosa kolonier på MacConkey-agar.

Donator 2. E. coli SW7037 samlades in i Lake Erie (Ottawa County, OH, USA). Den bär en konjugativ plasmid på 101 718 bp (p101718) med en IncI1-I (Alpha) replikon. Denna konjugativa plasmid har en gen som ger resistens mot betalaktamer (blaCMY-2). För en fullständig karta över p101718, se figur 2B. E. coli SW7037 är också laktospositiv och producerar rosa kolonier på MacConkey-agar.

Figure 2
Figur 2: Genetisk karta över de konjugativa plasmiderna som användes i denna studie . (A) Plasmid p134797, den konjugativa plasmiden som finns i E. coli-stam SW4955. (B) Plasmid p101718, den konjugativa plasmiden som finns i E. coli-stammen SW7037 . Antibiotikaresistensgener markeras i blått och gener som tillhör den konjugativa apparaten markeras i rött. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Mottagare. E. coli LMB100 används som mottagare. Detta är en plasmidfri stam som är resistent mot rifampicin (100 mg / L) och streptomycin (100 mg / L). Att ha resistens mot två antibiotika minskar risken för resistensmutationer som uppstår hos givaren som skulle störa tolkningen av resultaten. Dessutom är E. coli LMB100 laktosnegativ och kan särskiljas från de två givarstammarna eftersom den producerar blekgula och små kolonier (i motsats till större, rosa kolonier) på MacConkey-agar.

När donatorn är laktosnegativ rekommenderar vi att man använder en laktospositiv mottagare (t.ex . E. coli J53). LMB100- och J53-stammarna är tillgängliga för andra laboratorier för användning. Skicka en förfrågan till Dr. Gerardo Cortés-Cortés tillsammans med en adress och ett FedEx-nummer.

Det fasta mediet som behövs för att välja och räkna givare, mottagare och transkonjuganter är MacConkey-agar i petriskålar med en diameter på 100 mm. Tillsats av följande antibiotika behövs: (i) Media A: karbenicillin (100 mg / L) för att räkna givare och för att säkerställa att mottagarna inte kan växa med detta antibiotikum. ii) Media B: rifampicin (100 mg/l) + streptomycin (100 mg/l) för att räkna mottagare och säkerställa att donatorer inte kan växa i dessa två antibiotika. iii) Media AB: karbenicillin (100 mg/l) + rifampicin (100 mg/l) + streptomycin (100 mg/l) för att erhålla och räkna transkonjuganter. iv) Media C: inga antibiotika för att stryka alla isolat som studerats.

Konjugeringshastigheterna för konjugativa plasmider från E. coli SW4955 och E. coli SW7037 till E. coli LMB100 jämförs. När det gäller den konjugativa plasmiden p134797 (SW4955-stammen) ersätts dessutom antibiotikumet karbenicillin (100 mg/L) med gentamicin (2 mg/L), kloramfenikol (25 mg/L), tetracyklin (10 mg/L), trimetoprim (20 mg/L) eller sulfametoxazol (100 mg/L) i efterföljande experiment för att fastställa om den antibiotikaresistensmarkör som används för selektion har någon inverkan på resultaten.

Protocol

1. Metod 1: Konjugering

  1. Dag 1: Streak givarna och mottagaren. Stryk separat från glycerolstammarna på media C (MacConkey-agar utan antibiotika) och inkubera över natten vid 37 °C.
    OBS: Detta steg är nödvändigt för att säkerställa att experimentet utförs med rena isolat och för att bekräfta laktosfenotypen med koloniernas färg.
  2. Dag 2: Märk ett 14,0 ml odlingsrör för varje givare och mottagare. Välj en enda koloni av varje givare och mottagare och odla dem över natten (18 timmar) i separata 14,0 ml odlingsrör innehållande 2 ml Mueller Hinton buljong vid 37 ° C och skaka vid 200 rpm.
    OBS: I de använda stammarna uppnås den stationära fasen efter nattkulturen på 18 timmar.
  3. Dag 3: Mät den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) i varje givares och mottagares nattkultur (ingen virvel) genom att använda en spädning på 1:10 av 900 μL saltlösning och 100 μL av nattkulturen.
  4. Justera den optiska densiteten hos varje givare och mottagare till 2,0 (OD600 = 2,0) med steriliserad saltlösning (0,85% NaCl i vatten).
    OBS: En nattkultur av E. coli med en OD600 = 2,0 har 1,6 x 109 CFU / ml.
  5. Märk ett 1,5 ml mikrocentrifugrör "parningsrör", vilket indikerar givar- och mottagarstammarna. Överför 500 μL av den justerade (OD600 = 2,0) suspensionen för varje givare och mottagare och placera dem i parningsröret (detta parningsrör skulle ha 0,8 x 109 CFU/ml för varje givare och mottagare). Blanda försiktigt parningsröret genom inversion.
  6. Centrifugera parningsröret i 10 minuter vid 500 x g vid rumstemperatur.
  7. Utan att störa pelleten, pipettera ut 800 μL av konjugeringsröret. Det bör finnas 200 μL kvar i konjugeringsröret.
    OBS: Kassera supernatanten i en 10% blekmedelsbehållare för att inaktivera bakterier i suspensionen.
  8. Inkubera parningsröret i 18 timmar (över natten) vid 37 °C i en inkubator. Parning sker under inkubationstiden.
    OBS: Detta steg måste göras utan skakning för att inte bryta den konjugativa pili.
  9. Som en negativ kontroll, stryk över natten kulturen av givare på media B och mottagare på media A. Inkubera plattorna över natten vid 37 ° C
  10. Dag 4: Tillsätt 800 μL saltlösning till parningsröret och virveln för att återsuspendera (detta bereder parningsblandningen till 1 ml).
    OBS: Virvelning bryter isär parningsbakterierna och homogeniserar kulturen för att kvantifiera CFU / ml.
  11. Förbered 1:10 utspädningar (från 1 x 100 till 1 x 10-7) av parningsblandningen. Platta 100 μL utspädningar 10-5 till 10-7 på media A och media B, och alla utspädningar på media AB.
    OBS: Dlution 100 avser det snygga röret.
  12. Låt plattorna torka innan du placerar dem i inkubatorn upp och ner. Inkubera plattorna i 18 timmar (över natten) vid 37 °C.
  13. Dag 5: Inspektera de negativa kontrollerna för att säkerställa att ränderna av rena nattkulturer av givare inte växte på media B, och mottagarnas rena nattkultur inte växte på media A.
  14. Anteckna antalet kolonier och utspädningar som kan räknas:
    1. Räkna kolonierna i media A; Dessa är givarna. Kolonierna ska vara rosa (figur 3A, B).
    2. Räkna kolonierna i media B; Dessa är mottagarna och transkonjuganterna. Kolonierna ska vara blekgula (figur 3C).
    3. Räkna kolonierna i media AB; Dessa är transkonjuganterna. Kolonierna ska vara blekgula.
      OBS: Välj en uppräkningsbar platta. En räknebar platta har mellan 30 och 300 kolonier (mer än 300 kolonier skulle vara svåra att räkna, och mindre än 30 kolonier anses vara för liten provstorlek för att presentera en korrekt representation av det ursprungliga provet).
  15. Beräkna konjugeringsfrekvensen per givare eller per mottagare
    Konjugeringsfrekvens per givare = (CFU/ml för det transkonjugerade mediet [media AB])/ (CFU/ml för givare [media A]) x 100
    Konjugeringsfrekvens per mottagare = (CFU/ml för transkonjuganten [media AB])/ (CFU/ml för mottagare och transkonjuganter [media B]) x 100
    OBS: Konjugeringsfrekvensen för detta protokoll beräknades som transkonjuganter dividerat med mottagarens antal, multiplicerat med 100. Enligt litteraturen kan den resulterande mängden konjugering namnges som exkonjugantfrekvens, genöverföringsfrekvens, konjugeringsfrekvens, rekombinant utbyte, plasmidöverföringseffektivitet, konjugeringsfrekvens baserat på det totala bakterieantalet, andel transkonjuganter, fraktion av transkonjuganter i mottagarpopulationen, transkonjugantfrekvens, konjugeringsfrekvens, logaritmen för konjugeringshastighet, överföringshastighetskonstant, konjugeringshastighet per parningspar, konjugeringskoefficient eller konjugeringseffektivitet20. Detta protokoll hänvisar till termen konjugeringseffektivitet.
  16. Förvara transkonjuganterna i glycerollager vid -80 °C. Följ delstegen för beredning av glycerollager.
    1. Välj en enda koloni av transkonjuganter och odla dem över natten (18 timmar) i 5,0 ml odlingsrör innehållande 2 ml Mueller Hinton buljong kompletterad med karbenicillin (100 mg / L), vid 37 ° C och skaka vid 200 rpm.
    2. Märk kryogena injektionsflaskor, som anger namnet på transkonjugant, enligt följande: Tc + givarens namn + selektionsantibiotika i media A (eftersom de är transkonjuganter är det känt att deras bakgrund är mottagarstammen, som redan är resistent mot streptomycin och rifampicin men dessutom har plasmiden som bär en beta-laktamresistensgen); till exempel TcU1Carb. Lägg till kontinuerliga nummer om mer än ett transkonjugant från samma donator behöver lagras (t.ex. TcU1Carb1, TcU1Carb2, etc.).
    3. Överför 1 ml av nattkulturen till 1 ml 50% glycerol (v/v; den slutliga glycerolkoncentrationen bör vara 25%) och blanda försiktigt genom inversion. Lägg de kryogena injektionsflaskorna på torris i 15 minuter och förvara kryovialerna vid -80 ° C för framtida experiment.
  17. För DNA-extraktion, stryk trasnkonjuganterna från glycerolstammar på Mueller Hinton-agar kompletterad med karbenicillin (100 mg/l) och inkubera över natten vid 37 °C. Följ sedan rekommendationerna från steg 2.1.

2. Metod 2: Polymeraskedjereaktion (PCR) för att förstärka antibiotikaresistensgener och plasmidreplikoner i E. coli-transkonjuganter

OBS: Polymeraskedjereaktion (PCR) utvecklades av Dr. Kary Mullis 1983. PCR beror på specifika primrar (en kort bit DNA som kompletterar en given DNA-sekvens som fungerar som en punkt där replikation kan fortsätta, vanligtvis 20-40 nukleotider i längd och helst med ett guanin-cytosininnehåll på 40% -60%), som glödgas till motsatta strängar av en denaturerad, dubbelsträngad DNA-mall och utsträcks genom ett termostabilt DNA-polymeras, vilket genererar en ytterligare mall för nästa reaktionscykel, vilket leder till exponentiell förstärkning av den ursprungliga mallen21. I detta protokoll amplifierades replicons och resistensgener närvarande i de konjugativa plasmiderna för att bekräfta överföringen i transkonjuganta mottagarceller.

  1. DNA-extraktion
    1. För att detektera överföringen av resistensgener som bärs av konjugativa plasmider, använd transkonjugant DNA som mall. Använd enkel koka prep extraktion för att lysera bakteriecellväggarna.
      OBS: Enkel kokningsberedning extraktion är ett enkelt tillvägagångssätt för att lysera bakteriecellväggarna. Denna extraktion innehåller plasmid-DNA blandat med genomiskt DNA, men eftersom primrar är utformade enligt specifika DNA-sekvenser av intresse är denna mall också användbar för PCR. Plasmider kan också renas specifikt, även om utbytet tenderar att sjunka med ökande plasmidstorlek22. Detta är en bekväm stopppunkt. DNA kan lagras i flera månader vid -20 °C.
  2. PCR
    1. Med tanke på att experimentet har en negativ och en positiv kontroll är det fördelaktigt att skapa en pool för alla reaktioner i ett 1,5 ml rör. Märk ett 1,5 ml rör som "pool" och de nödvändiga PCR-rören med namnet på genen och provet (t.ex. OXA-U1).
    2. Pipettera PCR-reagenserna i följande ordning till ett 1,5 ml rör: sterilt vatten, 2x Master Mix, primers och polymeras (utom mall-DNA) (se tabell 1). Blanda försiktigt genom pipettering upp och ner minst 10 gånger. Håll dig på is hela tiden.
      OBS: Använd handskar för att undvika kontaminering av reaktionsblandningen eller reagenserna. Försök att undvika att öppna och blanda reagens och hantera prover i samma område för att förhindra kontaminering av reagens. Placera reagenserna i ishinken för att undertrycka nukleasaktivitet och ospecifik grundning. Låt dem tina helt innan du skapar en reaktion. Håll reagenserna på is under hela experimentet. Taq-polymeras tillsätts i slutet eftersom det är känsligt för pH-förändringar; Det måste buffras för att undvika nedbrytning eller felveckning. Primers sekvens listas i tabell 2 - antibiotikaresistensgener - och tabell 3 - replicons 23,24,25,26,27,28.
    3. Lägg till mall-DNA i motsvarande rör. Undvik att införa bubblor och säkra lock på PCR-rören.
    4. Placera PCR-rören i termocyklerna.
    5. Starta programmet. Se programinställningarna för varje gen i tabell 2 (resistensgener) och tabell 3 (svar).
      OBS: Ställ in PCR-program så att proverna hålls vid 4 °C efter körningen.
      1. PCR-villkor för svar: en denatureringscykel vid 94 °C i 5 minuter, följt av 30 denatureringscykler vid 94 °C i 1 minut, glödgning vid 60 °C i 30 sekunder, töjning vid 72 °C i 1 minut och en slutlig förlängning av en cykel vid 72 °C i 5 minuter.
        OBS: Detta är de villkor som standardiserats av Carattoli et al.29.
    6. När programmet är klart, förvara PCR-rören vid 4 °C.
      OBS: Detta är en bekväm stopppunkt. PCR-produkter kan förvaras i flera månader vid -20 °C
    7. Bered en 1% agarosgel genom att väga 0,6 g agaros i en 250 ml kolv och tillsätta 60 ml 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffert (justera reagens om en annan gelstorlek behövs). Smält agarosen försiktigt och långsamt i mikrovågsugn för att undvika att agaros spills över kolven och låt den svalna till ca 55 °C (10–15 min).
      1. Bered alla reagens med ultrarent avjoniserat vatten och reagens av analytisk kvalitet:
      2. TAE 50x buffert (Tris-bas, ättiksyra och EDTA) (1 liter): Blanda 121,1 g Tris-bas + 372,24 g EDTA och tillsätt 500 ml destillerat vatten. Lös upp med en magnetomrörare. Tillsätt 57,1 ml ättiksyra och tillsätt destillerat vatten till en total volym på 1 000 ml.
      3. Autoklav vid 15 psi, 121 °C i 15 minuter och förvaras i rumstemperatur tills den är klar i upp till 6 månader.
      4. TAE 1x buffert (1 L): Kombinera 20 ml TAE 50x buffert med 980 ml destillerat vatten och blanda.
    8. Tillsätt 6 μL SYBR Green under en dragskåp till den smälta agarosen, blanda och häll ut i brickan (och kammen), tidigare förseglad med tejp för att undvika spill. Låt gelén stelna i 15-25 minuter tills grumlighet uppträder.
      OBS: Andra alternativa färgämnen finns också30,31,32,33.
    9. Ta bort tejpen och placera gelén i elektroforeskammaren och tillsätt tillräckligt med 1x TAE-buffert för att täcka gelén.
    10. Blanda 5 μL 6x DNA-gelladdningsfärgämne med 25 μL av varje reaktion. Blanda försiktigt genom pipettering upp och ner minst 10 gånger.
      OBS: Inte alla PCR-produkter behöver laddas i gelén för att visualisera den förväntade produkten (justera mängden färgämne som motsvarar). Det återstående PCR-provet kunde sparas och lagras vid -20 °C i flera månader.
    11. Ladda blandningen i brunnar (undvik att införa bubblor) och lägg ner kammarlocket.
      OBS: Ladda det första provet i den andra brunnen (reservera det första till stegen), börja med den negativa kontrollen.
    12. Fyll 4 μL 1 kb DNA-stege i den första brunnen.
    13. Kör elektroforesen vid 120 V, 400 mA och 60 min.
    14. Visualisera gelen under UV-ljus (med UV-belysning) och spela in bilden.
      OBS: Om en PCR-produkt är närvarande kan DNA-band färgade detekteras med hjälp av en standard UV-transilluminator, en synlig ljustransilluminator eller en laserbaserad skanner.
Reagens Lagerlösning Volym tillsatt till 50 μl reaktion (1x) Sist Exempel: volym Exempel: volym Exempel: volym tillsatt till varje rör Final Vol. 50 μL Volym som läggs till positiv kontroll Volym tillagd till negativ kontroll
Koncentration Tillagd i 1x Tillagd i 3x (pool)
Sterilt vatten - 21,5 μL (qs till 50 μL) - 21,5 μL 64,5 μL 49 μl/rör 49 μl/rör 49 μl/rör
Master Mix 2x 25 μL 1x 25 μL 75 μL
Framåt primer 25 μM 1 μL 0,5 μM 1 μL 3 μL
Omvänd primer 25 μM 1 μL 0,5 μM 1 μL 3 μL
Mall DNA Variabel (100–200 ng/μL) Variabel (1 μL) Variabel 0,5 μL 1,5 μL
Polymeras 5 enheter/μl 0,5 μL 2.5 Enheter - - 1 μL (transkonjugant) 1 μL (givare) 1 μL (mottagare)
OBS: q.s. är en latinsk förkortning för quantum satis som betyder den mängd som behövs.

Tabell 1: PCR-reagens och pool för tre reaktioner (ett exempel). 

Primers (sekvens listad i 5' - 3' orientering) PCR-programmet Förväntad storlek
(BP) Ref.
blaCTX-M grupp 1 94 oC 7 min (864) 23
CTX-M: GGTTAAAAAATCACTGCGYC 94 oC 50 s (35 cykler)
CTX-M: TTGGTGACGATTTTAGCCGC 50 oC 40 s
68 oC 1 min
68 oC 5 min
blaCMY-2 95 oC 3 min (1855) 24
CMY-2-F: GATTCCTTGGACTCTTCAG 95 oC 30 s (30 cykler)
CMY-2-R: TAAAACCAGGTTCCCAGATAGC 53 oC 30 s
72 oC 30 s
72 oC 3 min
AAC(3')-II 94 oC 5 min (237) 25
AAC(3')-II-F: ACTGTGATGGGATACGCGTC 94 oC 30 s (32 cykler)
AAC(3')-II-R: CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA 60 oC 45 s
72 oC 2 min
72 oC 8 min
aadA 94 oC 5 min (283) 26
aadA1: GCAGCGCAATGACATTCTTG 94 oC 1 min (35 cykler)
aadA2: ATCCTTCGGCGCGATTTTG 60 oC 1 min
72 oC 1 min
72 oC 8 min
SUL-3 94 oC 5 min (799) 27
sul-3-F: GAGCAAGATTTTTGGAATCG 94 oC 1 min (30 cykler)
sul-3-R: CATCTGCAGCTAACCTAGGGCTTTGGA 51 oC 1 min
72 oC 1 min
72 oC 5 min
tet(A) 95 oC 5 min (957) 28
TETA-1: GTAATTCTGAGCACTGTCGC 95 oC 30 s (23 cykler)
TETA-2: CTGCCTGGACAACATTGCTT 62 oC 30 s
72 oC 45 s
72 oC 7 min
DFR A 95 oC 5 min (302) Detta arbete
dfrA-F: CATACCCTGGTCCGCGAAAG 95 oC 1 min (30 cykler)
55 oC 1 min
dfrA-R: CGATGTCGATCGTCGATAAGTG 72 oC 1 min
72 oC 7 min
katA2 95 oC 5 min
catA2-F: GACCCGGTCTTTACTGTCTTTC 95 oC 1 min (25 cykler) (225) Detta arbete
katA2-R: TCCGGTGATATTCAGATTAAAT 60 oC 1 min
72 oC 1 min
72 oC 7 min

Tabell 2: Primers och PCR-program som används för att förstärka diagnostiska resistensgener. 

Replicon Primer (sekvens listad i 5' - 3' orientering) Mål PCR-programmet Förväntad storlek (bp)
IncFIB F: TCTGTTTATTCTTTTTTACTGTCCAC repA 94 oC 5 min 683
R: CTCCCGTCGCTTCAGGGCATT 94 oC 1 min (30 cykler)
60 oC 30 s
IncFIC F: GTGAACTGGCAGATGAGGAAGG repA2 72 oC 1 min 262
R: TTCTCCTCGTCGCCAAACTAGAT 72 oC 5 min
IncI1 F: CGAAAGCCGGACGGCAGAA RNAI 139
R: TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGTGT

Tabell 3: Primers och PCR-program som används för att klassificera plasmiderna p134797 och p101718 genom PCR-baserad replikontypning29. 

Representative Results

Med tanke på att donatorerna SW4955 och SW7037 har sekvenserats förväntas dessa två donatorstammar ha resistensfenotyper som motsvarar resistensgenprofilen identifierad i deras genomsekvens. Plasmid p134797 (från SW4955) har gener som ger resistens mot tredje generationens cefalosporiner (blaCTX-M-55) och resistens mot aminoglykosider (aac (3) -IIa och aadA1), fenikoler (catA2), tetracykliner (tet (A)), trimetoprim (dfrA14) och sulfonamider (sul3); Inga antibiotikaresistensgener hittades i SW4955-kromosomen. Plasmid p101718 (från SW7037) bär endast en antibiotikaresistensgen (bla CMY-2), som förväntas ge resistens mot tredje generationens cefalosporiner (blaCTX-M-55). Återigen hittades inga antibiotikaresistensgener i SW7037-kromosomen.

Efter parning förväntades detektion av överföringen av de två konjugativa plasmiderna med alla ovan nämnda resistensgener. Positiv konjugeringsdetektion innebär att mottagarna identifierade som transkonjuganter bör ha förvärvat de konjugativa plasmiderna. Förekomsten av diagnostiska resistensgener för de konjugativa plasmiderna i transkonjuganterna (som detekteras med PCR) förväntades också.

För att illustrera de metoder som beskrivs här testades förmågan hos två E. coli-miljöisolat att överföra plasmid-DNA genom konjugering . En schematisk representation av experimentmiljön visas i figur 1. Två donatorer (E. coli SW4955 och SW7037) och en mottagare (E. coli LMB100) parades oberoende av varandra. Genkartan för konjugativa plasmider som finns i E. coli SW4955 (p134797) och SW7037 (p101718) visas i figur 2.

Konjugativa plasmider selekterades med karbenicillin och motvaldes med användning av rifampicin och streptomycin, vars resistensdeterminanter finns i mottagarens kromosom. MacConkey-agar användes för att skilja de laktospositiva givarna (som producerar stora, rosa kolonier) från mottagaren och transkonjuganter (som är laktosnegativa och producerar mindre, blekgula kolonier) (figur 3).

Figure 3
Figur 3: Illustration av differentiella färgmarkörer för givar- och mottagarkolonier på MacConkey-agar. Kolonierna som motsvarar donatorer är rosa på MacConkey-agar eftersom de är laktospositiva. Detta skiljer givaren från mottagarkolonierna, som är blekgula och mindre (laktosnegativa). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Mobiliseringen av den konjugativa plasmiden p134797 detekterades, där vart och ett av de fem antibiotika som motsvarade de fem olika klasserna av resistensgener som finns i plasmiden.

Ett exempel på hur man beräknar konjugeringseffektiviteten (CE) för töjning SW4955 presenteras. Från analysen med stam SW4955 räknades 172 CFU transkonjuganter i plattan från utspädning 10-2; antalet mottagare från motsvarande utspädning (10-2) var 10 300 000 CFU/ml (tabell 4).

CE beräknas enligt följande:

CE = (174 CFU/mL)/(10,300,000 CFU/mL)

CE= 1,67 x 10-5 transkonjuganter/mottagare

LMB100 Transkonjuganter från stam SW4955 utvalda med karbelicillin Konjugeringseffektivitet
Utspädning CFU (räknebar platta) Ca CFU/ml CFU (räknebar platta)
100 sammanflytande 1.03E+09
10-1 sammanflytande 1.03E+08
10-2 sammanflytande 10300000 172 1,67 x 10-5 transkonjuganter/mottagare
10-3 sammanflytande 1030000
10-4 sammanflytande 103000
10-5 sammanflytande 10300
10-6 sammanflytande 1030
10-7 103 103
Värden som används för att beräkna CE markeras med fetstil.

Tabell 4: Ett exempel på hur man beräknar konjugeringseffektiviteten (CE) för töjning SW4955.

Resultaten visas i tabell 5, uttryckt som konjugeringseffektivitet per mottagare. De fem konjugeringseffektiviteter som erhölls med stam SW4955 som givare var alla inom samma storleksordning. Dessa resultat indikerar att mobiliseringen av den konjugativa plasmiden kan detekteras oavsett vilket urval som används för transkonjugant identifiering.

Med stammen SW7037 som givare var den erhållna konjugeringseffektiviteten tre storleksordningar lägre; Dessa resultat gör det möjligt att jämföra konjugeringseffektiviteten hos olika donatorer och plasmidtyper med samma mottagare.

Konjugeringseffektivitet
Anstränga Karbenicillin (100 mg/l) Gentamicin (2 mg/l) Kloramfenikol (25 mg/l) Tetracyklin (10 mg/l) Trimetoprim (20 mg/l)
SW4955 1,67 x 10-5 5,67 x 10-5 2,17 x 10-5 7,62 x 10-5 1,36 x 10-5
SW7037 2,14 x 10-6

Tabell 5: Konjugeringseffektivitet för E. coli-donatorstammarna SW4955 och SW7037 beroende på vilket antibiotikum som används för urvalet.

I transkonjuganter kontrollerades förekomsten av replicons och alla resistensgener kodade i två konjugativa plasmider som testades, och deras motsvarande svar, med PCR. Förhållandena som används för dessa diagnostiska PCR-reaktioner visas i tabell 3.

Diagnosgelerna visas i figur 4. Dessa geler bekräftar närvaron av de förväntade replikonerna i transkonjuganter (IncFIC och IncFIB i p1347975 och IncI1 i p101718). De bekräftar också förekomsten av de förväntade antibiotikaresistensgenerna, nämligen gruppen bla CTX-M-55 (beta-laktam), aac (3)-II och aadA (aminoglykosid), catA2 (phenicol), tet(A) (tetracyklin), dfrA14 (trimetoprim) och sul3 (sulfonamid) för p1347975 och blaCMY-2 för p101718 (figur 4).

Figure 4
Figur 4: Diagnostiska elektroforesgeler. Gelelektrofores av PCR-produkter av antibiotikaresistensgener och plasmidreplikoner som finns i konjugativa plasmider p134797 och p101718 i donatorcellerna (stammarna SW4955 respektive SW7037) och i motsvarande LMB100-transkonjuganter. Karbenicillin användes för plasmidval. Förkortningar. -: negativ kontroll (DNA av stam LMB100 användes som en negativ kontroll); D: givare; T: transkonjugant. Förväntade amplikonstorlekar: blaCTX-M-55: 864 pb; AAC(3)–IIa: 237 punkter. AADA1: 283 punkter. katA2 : 225 bp; tet(A): 957 bp; dfrA14: 302 bp; SUL3: 799 BP; IncFIC(FII): 262 punkter; IncFIB: 683 bp; blaCMY-2: 1 855 bp; IncI1-I: 139 bp. Gelén har 1% agaros. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Konjugativa plasmider ger tillgång till en gemensam pool av gener inom en viss miljö genom rekombination och horisontell genöverföring34. Således är konjugativa plasmider evolutionära enheter som kan förvärva och tilldela funktioner som gör det möjligt för bakterier att anpassa sig till flera tillstånd (inklusive resistens mot antibiotika, resistens mot metaller, förvärv av metaller, biofilmbildning och patogena gener, bland andra) inom en tidsskala av timmar.

Detta arbete presenterar ett protokoll för identifiering av konjugativa plasmider i bakterier. För att protokollet ska fungera måste markörerna som används skilja givar- och mottagarstammar, vilket visas av kontrollerna i media A och B. De behöver också effektivt välja celler som bär plasmiden. Parningsreaktionen är kritisk. I denna reaktion måste givare och mottagare göra långvarig kontakt (genom pili) för att konjugering ska inträffa. Allt som kan störa cell-till-cell-kontakt, såsom otillräcklig inkubationstid eller skakning eller omrörning av kulturen, minskar därmed konjugeringens effektivitet. Valet av mottagare är också kritiskt, eftersom vissa mottagarstammar är eldfasta mot konjugering35,36. LMB100 föreslås som mottagare av val, eftersom det kan ta plasmider av flera inkompatibilitetstyper.

Konjugeringshastigheten är specifik för varje plasmid-donatorkromosompar, mottagare och miljötillstånd. Konjugeringen av specifika plasmider har visat sig vara känslig för ett stort antal variabler, inklusive tillväxtfas, celldensitet, donator-till-mottagarförhållande, huruvida konjugering utförs i flytande eller fast media, kol, syre, gallsalter, metallkoncentrationer, närvaro av däggdjursceller, temperatur, pH och parningstid13,14,15 . Studien av dessa interaktioner beror på den initiala detektionen av en konjugativ plasmid som ska studeras på djupet. Således kan protokollet som beskrivs här också modifieras för att utforska effekterna av olika experimentella variabler, även om detta kommer på bekostnad av att begränsa antalet screenade givare. Det kan också identifiera mobiliserbara plasmider i värdar som har hjälparplasmider (dvs plasmider som möjliggör konjugering genom att tillhandahålla funktioner som saknas i de mobiliserbara plasmiderna i trans6).

Att känna till sekvensen av den konjugativa plasmiden rekommenderas (men inte nödvändigt för att detektera konjugering, som diskuterats ovan). När donatorerna är laktosnegativa (producerar gula kolonier på MacConkey-agar) kan en laktospositiv mottagare (som producerar rosa kolonier på MacConkey-agar) användas för att skilja sanna transkonjuganter från donatorceller som kan växa på media för att välja transkonjuganter. Protokollet som beskrivs här är utformat för att detektera konjugativa plasmider från miljö-, kommensala och patogena medlemmar av familjen Enterobacteriaceae; Det kan dock användas med alla bakteriearter med en lämplig donator, mottagare, antibiotika och färgmarkörer. Identifieringen av dessa kritiska komponenter i andra bakterier kräver systematiska studier med flera givare, mottagare och markörer (antibiotika och färger). Detta protokoll har inte testats i grampositiva bakterier.

Flera varianter av metoden som presenteras här har rapporterats i litteraturen, nyligen granskad20. Det kvalitativa utfallet kan också refereras till på olika sätt (t.ex. exkonjugantfrekvens och genöverföringsfrekvens), och dimensionslösa enheter kan användas för att rapportera konjugeringseffektivitet (ml/CFU x h)20.

Protokollet som beskrivs här löser flera begränsningar som tidigare inte åtgärdats med befintliga metoder16,18,19,20. För det första har en lämplig mottagare identifierats. För det andra minimerar användningen av två antibiotika (rifampicin och streptomycin) för att välja sanna transkonjuganter möjligheten att givare utvecklar resistens mot ett av de antibiotika som används för att välja transkonjuganter genom spontan mutagenes. Falska transkonjuganter kan också bero på skydd av åskådare genom hydrolys av det antibiotikum som används för att välja transkonjuganter av enzymer (t.ex. betalaktamaser) som produceras i stora mängder av givaren. För det tredje ingår flera experimentella kontroller för att säkerställa att parningsprodukten är en sann transkonjugant (dvs. en mottagarcell som stabilt har införlivat donatorns konjugativa plasmid). Här presenterade vi två oberoende metoder för att testa transkonjuganternas äkthet, nämligen en kolorimetrisk markör i MacConkey-agar och PCR-detektion av replicons och antibiotikaresistensgener hos den konjugativa plasmiden i mottagaren. Protokollet som beskrivs här är också utformat för att isolera och karakterisera konjugativa plasmider från miljö-, kommensala och patogena medlemmar av familjen Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigella och andra arter).

För att förstå konjugationens mekanik har experimentella observationer modellerats med hjälp av datorsimuleringar. Dessa prediktiva modeller uppskattar frekvensen av plasmidöverföring för givna tillväxttätheter hos givare, mottagare och transkonjuganter. En modell känd som slutpunktsmodellen fann tröskelvärden över vilka plasmidöverföringshastigheten i flytande kultur och drog slutsatsen att överföringshastigheten inte påverkas av celldensitet, förhållandet mellan givare och mottagare och parningstid19. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) har använts som en alternativ metod för transkonjugant plasmiddetektion. FISH möjliggör plasmidvisualisering med hjälp av fluorescensmikroskopi genom hybridisering av en DNA-sond och ett mål-DNA. Således möjliggör FISH visuell detektion av plasmidflöden över olika cellpopulationer37, även om den inte har samma känslighetsnivå som den metod som presenteras här om transkonjuganter detekteras genom visuell screening i motsats till selektion.

Det finns ett enormt behov av att förstå biologin hos konjugativa plasmider som sprider antibiotikaresistensgener genom olika komponenter i ekosystemet (klinik, jordbruk, avloppsvatten, vilda djur, husdjur, jordar, floder och sjöar). Sammanfattningsvis underlättar de förenklade experimentella förhållanden som presenteras i de protokoll som beskrivs här screening av givare i stor skala och utgör därmed ett viktigt verktyg för studier av horisontell genöverföring med ursprung i konjugativa plasmider från en mängd olika källor. De kan användas för att undersöka förekomsten av antibiotikaresistensgener eller andra kliniskt relevanta gener i konjugativa plasmider från flera källor och bakterier. De kan också anpassas för studier av konjugering in vivo (t.ex. i tarmen hos ryggradsdjur) och för att studera de förhållanden som modulerar konjugeringens effektivitet. Alla dessa studier kommer i hög grad att bidra till förståelsen av hur mobiliseringen av multiresistenta konjugativa plasmider bidrar till spridningen av multiresistens.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

LM-B, IMG, AT och IS stöddes av NIH-bidrag GM055246 som tilldelades LM-B. GC-C tilldelades UC MEXUS-CONACYT Postdoctoral Fellowship två år i rad: AY 2017-18 och 2018-19. Vi tackar studenterna Sage Chavez och Pepper St. Clair från Genentech-Foundation sponsrade Academic Inspiration Network (GAIN) mentorprogram för deras tekniska stöd i experiment.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tube racks Thermo Fisher Scientific 22-313630 It can be replaced for another brand
2.0 mL Cryogenic vials Corning 430659 It can be replaced for another brand
14 mL conical tubes FALCON 149597 It can be replaced for another brand
14 mL tube racks Thermo Fisher Scientific 8850 It can be replaced for another brand
1 kb DNA ladder New England Biolabs N0552G 
250 mL sterile flasks  PYREX 5320 It can be replaced for another permanent marker brand
Acetic acid Fisher Scientific A38SI-212 It can be replaced for another brand
Agarose (molecular biology grade, multipurpose) Fisher Scientific BP160-500 It can be replaced for another brand
Carbenicillin GOLD BIOTECHNOLOGY C-103-50 It can be replaced for another brand
Disposable inoculating loops: 1 µL Fisherbrand 22-363-595 It can be replaced for another brand
DNA gel loading dye 6x  New England Biolabs B7024S It can be replaced for another brand
EDTA Fisher Scientific BP119-500 It can be replaced for another brand
Electronic digital scale Denver Instrument APX-2001 It can be replaced for another brand
Eppendorf conical tubes: 1.5 mL Eppendorf 14-282-302 It can be replaced for another brand
Equipment for agarose gel electrophoresis Fisher Scientific FP300 It can be replaced for another brand
Ethanol-resistant markers Sharpie 37001; 37002; 37003 It can be replaced for another brand
Gel documentation systems (UVP GelSolo) Analytakjena SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01 It can be replaced for another brand
Gloves X-GEN 44-100M Any nitrile gloves brand works
Ice bucket Thermo Fisher Scientific 432128 It can be replaced for another brand
MacConkey agar  BD DIFCO 212123
Master Mix  BioLabs M0496S  It can be replaced for another brand
Methanol Fisher Scientific A452-4 It can be replaced for another brand
Microcentrifuge tubes: 2.0 mL Fisherbrand 05-408-138 It can be replaced for another brand
Mueller Hinton agar BD DIFCO DF0479-17-3
Mueller Hinton broth BD DIFCO 275730
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL 740588. 250
PCR tube racks AXYGEN   R96PCRFSP It can be replaced for another brand
PCR tubes (0.2 mL) AXYGEN  PCR-02-C It can be replaced for another brand
Rifampicin Fisher Scientific 50-164-7517
Set of micropipettes that dispense between 1 - 10 μL (P10), 2–20 μL (P20), 20–200 μL (P200) and 200–1000 μL (P1000) RAININ 17008648; 17008650; 17008652; 17008653 Micropipettes should be calibrated; can be replaced for another brand
Sodium chloride Fisher Scientific S671-3 It can be replaced for another brand
Spectrophotometer Thermo Scientific 335905P It can be replaced for another brand
Sterilized tips for 10 μL, 200 μL and 1000 μL  Eclipse 1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9 It can be replaced for another brand
Streptomycin Fisher Scientific BP910-50
SYBR Safe DNA gel stain  Thermo Fisher Scientific S33102
Taq DNA Polymerase BioLabs M0273S
Thermal cycler C1000 Touch  Bio-Rad 1851196 It can be replaced for another brand
Tris  Fisher Scientific BP153-500 It can be replaced for another brand

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lederberg, J., Tatum, E. Gene recombination in Escherichia coli. Nature. 158 (4016), 558 (1946).
  2. de la Cruz, F., Frost, L. S., Meyer, R. J., Zechner, E. L. Conjugative DNA metabolism in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (1), 18-40 (2010).
  3. Grohmann, E., Muth, G., Espinosa, M. Conjugative plasmid transfer in gram-positive bacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (2), 277-301 (2003).
  4. Koraimann, G., Wagner, M. A. Social behavior and decision making in bacterial conjugation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 54 (2014).
  5. Dziewit, L., et al. Diversity and role of plasmids in adaptation of bacteria inhabiting the Lubin copper mine in Poland, an environment rich in heavy metals. Frontiers in Microbiology. 6, 152 (2015).
  6. Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).
  7. Balbuena-Alonso, M. G., et al. Genomic analysis of plasmid content in food isolates of E. coli strongly supports its role as a reservoir for the horizontal transfer of virulence and antibiotic resistance genes. Plasmid. 123-124, 102650 (2022).
  8. San Millan, A., MacLean, R. C. Fitness costs of plasmids: A limit to plasmid transmission. Microbiol Spectrum. 5 (5), (2017).
  9. Coluzzi, C., Garcillán-Barcia, M. P., de la Cruz, F., Rocha, E. P. C. Evolution of plasmid mobility: Origin and fate of conjugative and nonconjugative plasmids. Molecular Biology and Evolution. 39 (6), 1-23 (2022).
  10. Bevan, E. R., et al. Molecular characterization of plasmids encoding blaCTX-M from faecal Escherichia coli in travellers returning to the UK from South Asia. The Journal of Hospital Infection. 114, 134-143 (2021).
  11. Minja, C. A., Shirima, G., Mshana, S. E. Conjugative plasmids disseminating CTX-M-15 among human, animals and the environment in Mwanza Tanzania: a need to intensify one health approach. Antibiotics. 10 (7), 836 (2021).
  12. Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. International Journal of Medical Microbiology. 303 (6-7), 298-304 (2013).
  13. Sengupta, M., Austin, S. Prevalence and significance of plasmid maintenance functions in the virulence plasmids of pathogenic bacteria. Infection and Immunity. 79 (7), 2502-2509 (2011).
  14. Alderliesten, J. B., et al. Effect of donor-recipient relatedness on the plasmid conjugation frequency: a meta-analysis. BMC Microbiology. 20 (1), 135 (2020).
  15. Neil, K., Allard, N., Rodrigue, S. Molecular mechanisms influencing bacterial conjugation in the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 12, 673260 (2021).
  16. Liu, G., Bogaj, K., Bortolaia, V., Olsen, J. E., Thomsen, L. E. Antibiotic-induced, increased conjugative transfer is common to diverse naturally occurring ESBL plasmids in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 2119 (2019).
  17. Suchman, E. Polymerase chain reaction protocol. American Society for Microbiology. , 1-14 (2011).
  18. Watanabe, T. Infective heredity of multiple drug resistance in bacteria. Bacteriological Reviews. 27 (1), 87-115 (1963).
  19. Simonsen, L., Gordon, D. M., Stewart, F. M., Levin, B. R. Estimating the rate of plasmid transfer: an end-point method. Journal of General Microbiology. 136 (11), 2319-2325 (1990).
  20. Huisman, J. S., et al. Estimating plasmid conjugation rates: A new computational tool and a critical comparison of methods. Plasmid. 121, 102627 (2022).
  21. Jung, B., Hoilat, G. J. MacConkey medium. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2022).
  22. NucleoSpin Plasmid DNA purification. , Available from: https://www.mn-net.com/media/pdf/45/51/02/Instruction-NucleoSpin-Plasmid.pdf (2022).
  23. Jiang, X., et al. Detection of extended-spectrum beta-lactamases in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (9), 2990-2995 (2006).
  24. Stapleton, P. D., Shannon, K. P., French, G. L. Carbapenem resistance in Escherichia coli associated with plasmid-determined CMY-4 beta-lactamase production and loss of an outer membrane protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (5), 1206-1210 (1999).
  25. Ben Yahia, H., et al. Detection of CTX-M-15 harboring Escherichia coli isolated from wild birds in Tunisia. BMC Microbiology. 18 (1), 26 (2018).
  26. Madsen, L., Aarestrup, F. M., Olsen, J. E. Characterisation of streptomycin resistance determinants in Danish isolates of Salmonella Typhimurium. Veterinary Microbiology. 75 (1), 73-82 (2000).
  27. Perreten, V., Boerlin, P. A new sulfonamide resistance gene (sul3) in Escherichia coli is widespread in the pig population of Switzerland. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (3), 1169-1172 (2003).
  28. Guardabassi, L., Dijkshoorn, L., Collard, J. M., Olsen, J. E., Dalsgaard, A. Distribution and in-vitro transfer of tetracycline resistance determinants in clinical and aquatic Acinetobacter strains. Journal of Medical Microbiology. 49 (10), 929-936 (2000).
  29. Carattoli, A., et al. Identification of plasmids by PCR-based replicon typing. Journal of Microbiological Methods. 63 (3), 219-228 (2005).
  30. Green, M. R., Sambrook, J. Agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor protocols. 2019 (1), (2019).
  31. Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutation Research. 439 (1), 37-47 (1999).
  32. Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold nucleic acid gel stain: a dye optimized for use with 300-nm ultraviolet transilluminators. Analytical Biochemistry. 268 (2), 278-288 (1999).
  33. Oatey, P. Imaging fluorescently stained DNA with CCD technology How to increase sensitivity and reduce integration times. Biotechniques. 42 (3), 376-377 (2007).
  34. Norman, A., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. Conjugative plasmids: vessels of the communal gene pool. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 364 (1527), 2275-2289 (2009).
  35. Du, L., Liu, R. H., Ying, L., Zhao, G. R. An efficient intergeneric conjugation of DNA from Escherichia coli to mycelia of the lincomycin-producer Streptomyces lincolnensis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (4), 4797-4806 (2012).
  36. Kirk, J. A., Fagan, R. P. Heat shock increases conjugation efficiency in Clostridium difficile. Anaerobe. 42, 1-5 (2016).
  37. Esteves, G. M., Pereira, J. A., Azevedo, N. F., Azevedo, A. S., Mendes, L. Friends with benefits: An inside look of periodontal microbes' interactions using fluorescence in situ hybridization-Scoping review. Microorganisms. 9 (7), 1504 (2021).

Tags

Genetik utgåva 193 Experimentell evolution horisontell genöverföring konjugativa plasmider antibiotikaresistens Escherichia coli
Detektion av horisontell genöverföring medierad av naturliga konjugativa plasmider i <em>E. coli</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mota-Bravo, L., Camps, M.,… More

Mota-Bravo, L., Camps, M., Muñoz-Gutiérrez, I., Tatarenkov, A., Warner, C., Suarez, I., Cortés-Cortés, G. Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli. J. Vis. Exp. (193), e64523, doi:10.3791/64523 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter