Konjugering förmedlar horisontell genöverföring genom att mobilisera plasmid-DNA över två olika celler, vilket underlättar spridningen av fördelaktiga gener. Detta arbete beskriver en allmänt använd metod för effektiv detektion av konjugativ plasmidöverföring, baserad på användningen av differentialmarkörer i konjugativ plasmid, givare och mottagare för att detektera transkonjugering.
Konjugering representerar en av de viktigaste mekanismerna som underlättar horisontell genöverföring i gramnegativa bakterier. Detta arbete beskriver metoder för studier av mobilisering av naturligt förekommande konjugativa plasmider, med två naturligt förekommande plasmider som exempel. Dessa protokoll förlitar sig på differentiell närvaro av valbara markörer i donator, mottagare och konjugativ plasmid. Specifikt innefattar de beskrivna metoderna 1) identifiering av naturliga konjugativa plasmider, 2) kvantifiering av konjugeringshastigheter i fast kultur och 3) diagnostisk detektion av antibiotikaresistensgener och plasmidreplicontyper hos transkonjuganta mottagare genom polymeraskedjereaktion (PCR). De protokoll som beskrivs här har utvecklats i samband med att studera den evolutionära ekologin för horisontell genöverföring, för att screena för närvaron av konjugativa plasmider som bär antibiotikaresistensgener i bakterier som finns i miljön. Den effektiva överföringen av konjugativa plasmider som observerats i dessa experiment i odling belyser den biologiska relevansen av konjugering som en mekanism som främjar horisontell genöverföring i allmänhet och spridningen av antibiotikaresistens i synnerhet.
År 1946 beskrev Lederberg och Tatum1 en sexuell process i Escherichia coli K-12 som nu är känd som konjugation. Bakteriell konjugering är den process genom vilken en bakteriecell (donatorn) överför enkelriktat genetiskt material till en annan cell (mottagaren) genom direkt cell-till-cell-kontakt. Konjugering är brett fördelad i bakterier2,3, även om fraktionen av donatorceller som uttrycker konjugeringsmaskineriet vanligtvis är mycket liten4.
Plasmider är autonomt replikerande extrakromosomala DNA-element. Förutom gener som är involverade i plasmidreplikation och underhåll bär plasmider ofta en last av gener som är involverade i anpassning till miljöutmaningar, såsom tungmetaller eller exponering för antibiotika5. Konjugativa plasmider är en klass av plasmider med en uppsättning specialiserade gener som tillåter deras överföring till mottagarceller och stöder deras uthållighet efter överföringen6. Konjugativa plasmider varierar i storlek från 21,8 kb till 1,35 Mb i bakterier i fylumet Pseudomonadota (synonymt med proteobakterier), med medianen runt 100 kb 5,7. De har också i allmänhet ett lågt antal kopior, möjligen för att hålla den metaboliska belastningen på värden låg 8,9.
Den typiska konjugativa apparaten består av fyra komponenter: ett överföringsursprung (oriT), ett relaxas, ett typ IV-kopplingsprotein och ett typ IV-sekretionssystem (en rörliknande struktur som kallas pilus som gör det möjligt för givare att kontakta mottagare)6. Endast en mycket liten del av celler som bär konjugativa plasmider uttrycker konjugeringsmaskineriet4, men om plasmiderna ger en fitnessfördel kan transkonjuganterna snabbt expandera i befolkningen. Mellan 35% och över 80% av E. coli-isolat som samlats in från olika livsmiljöer har konjugativa plasmider med gener som ger resistens mot minst ett antibiotikum10,11; Därför är horisontell genöverföring medierad av konjugativa plasmider en viktig mekanism som driver den globala spridningen av antibiotikaresistensgener12.
Parningsexperiment utförda i laboratorieodling har visat att konjugeringsfrekvensen påverkas av flera faktorer, inklusive mottagarcellernas natur, tillväxtfas, celldensitet, donator-till-mottagarförhållande, huruvida konjugering utförs i flytande eller fast media, kol, syre, gallsalter, metallkoncentrationer, närvaro av däggdjursceller, temperatur, pH och parningstid13,14, 15.
Detta arbete beskriver protokoll för att detektera närvaron av konjugativa plasmider i en given värdstam, för att kvantifiera konjugeringshastigheterna i fast kultur och för att dubbelkontrollera deras överföring till mottagarceller. Dessa protokoll kan användas som ett första steg för identifiering av naturliga konjugativa plasmider som är lämpliga för forskning. De använder ett minimalt antal förenklade steg eftersom de är utformade för att screena närvaron av konjugativa plasmider i bakterier erhållna från flera källor (miljö, kommensal och patogen) i stor skala (dussintals till hundratals givare).
Dessutom visas tester för att detektera om mobiliseringen av en given konjugativ plasmid är oberoende av det antibiotikum som används för detektion (dvs. relevansen av antibiotikaresistensgenen under urval) och för att jämföra konjugeringshastigheterna för två konjugativa plasmider som finns i olika miljöisolat.
Baserat på den genetiska sammansättningen av de relevanta konjugativa plasmiderna (plasmidreplikon och antibiotikaresistensgensammansättning) kan varje steg i protokollet modifieras för att studera effekterna av en mängd olika faktorer som sannolikt påverkar konjugeringshastigheten.
Allmän experimentell design:
De väsentliga komponenterna som behövs för att inrätta ett parningsexperiment är donatorceller, en mottagarstam och fasta medier för att välja givare (antibiotikum A), mottagare (antibiotikum B) och transkonjuganter (antibiotikum A och B). Transkonjuganter är mottagarceller som stabilt upprätthåller donatorns konjugativa plasmid.
Donatorceller är resistenta mot ett antibiotikum (antibiotikum A) och är känsliga för markören eller markörerna som används för att välja mottagarceller (antibiotikum B). Den genomiska placeringen av antibiotikaresistensgenen (dvs. om den är belägen i kromosomen eller en plasmid i donatorcellen) behöver inte vara känd a priori, eftersom mobilisering av antibiotikaresistensmarkörer till mottagaren (efter en direkt kontakt mellan givare och mottagare) innebär att de givartillhandahållna markörerna fanns i en plasmid.
En mottagarstam (känd för att ta konjugativa plasmider) måste ha en stabil valbar markör som inte finns i givaren; Denna valbara markör är i allmänhet resistent mot ett antibiotikum eller biocid som finns i kromosomen. Valet av mottagaren som ska användas i parningsexperiment är kritiskt, eftersom vissa E. coli-stammar varierar i sin förmåga att ta konjugativa plasmider16.
När dessa komponenter har etablerats är varje koloni som växer på media med både antibiotika (A och B) efter en kontakt mellan givare och mottagare en förmodad transkonjugant (figur 1). Detta förutsätter att donatorer kan växa i medier med antibiotika A men inte kan växa i media med antibiotikum B, och att mottagare kan växa i media med antibiotika B, men inte kunna växa med antibiotikum A. Transkonjugering kan bekräftas med hjälp av två diagnostiska tester. Det första testet består av detektion (genom polymeraskedjereaktion [PCR] amplifiering av gener eller andra metoder) av gener som finns i den konjugativa plasmiden i transkonjuganta kolonier. Det andra testet innefattar användning av differentiella kolonifärgmarkörer baserade på laktosmetabolism. Den differentiella kolonifärgen avslöjas genom användning av MacConkey-agar; Laktosen i agarn kan användas som jäsningskälla av laktosfermenterande (LAC+) mikroorganismer. Dessa mikroorganismer producerar organiska syror, särskilt mjölksyra, vilket sänker pH. Neutralrött är en pH-indikator som ingår i media som växlar från benvitt till ljusrött / rosa när pH sjunker under 6,817. Således producerar E. coli laktospositiva stammar större rosa kolonier på MacConkey-agar, medan laktosnegativa stammar producerar blekgul och mindre kolonier på MacConkey-agar.
Figur 1: Experimentell design som används för att detektera närvaron av konjugativa plasmider i givarstammar. I detta exempel bär givaren en konjugativ plasmid med en antibiotikaresistensgen som ger resistens mot antibiotikum A, men de är mottagliga för antibiotikum B. Omvänt har mottagaren en kromosomal resistensdeterminant som ger skydd mot antibiotikum B, men det är mottagligt för antibiotikum A. Transkonjuganter är resistenta mot både antibiotika (A och B), eftersom de har donatorns konjugativa plasmid som ger resistens mot antibiotikum A och mottagarens kromosom som ger skydd mot antibiotikum B. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Konjugeringshastigheten för ett donator-mottagarpar (under givna experimentella betingelser) kan beräknas genom att dividera antalet transkonjuganter med antalet givare eller med antalet mottagare; Den första graden anger andelen donatorceller som uppvisar funktionellt uttryck av konjugeringsmaskineriet av givaren16,18, medan den andra hastigheten indikerar mottagarens förmåga att ta konjugativa plasmider 19,20. I denna studie, om inte annat anges, representerar konjugeringshastigheten fraktionen av mottagarceller som blir transkonjuganta (dvs. hastighet per mottagare).
Här rapporteras två oberoende parningsexperiment, som involverar en E. coli-mottagare och två E. coli-donatorer. Dessutom användes olika antibiotika för att välja transkonjuganter för en av givarna för att bekräfta att en enda multiresistent plasmid kan väljas med någon av de antibiotikaresistensgener som finns i den konjugativa plasmiden.
Donator- och mottagarstammarna som används i detta arbete har sekvenserats fullständigt för att förstå alla komponenter i detta experimentella system; Dessa protokoll utformades emellertid för att screena för närvaron av konjugativa plasmider i värdar med okänd sekvens och kan också användas i detta experimentella sammanhang; I detta fall sekvenseras emellertid de relevanta generna först.
De donator- och mottagarstammar som används i protokollet är följande:
Donator 1. E. coli SW4955 samlades i en sjö i Baton Rouge (LA, USA). Den har en konjugativ plasmid på 134 797 bp (p134797) med IncFIC(FII) och IncFIB (AP001918) svar. Denna konjugativa plasmid har gener som ger resistens mot tredje generationens cefalosporiner (blaCTX-M-55), aminoglykosider (aac(3)-IIa och aadA1), fenikoler (catA2), tetracykliner (tet(A)), trimetoprim (dfrA14) och sulfonamider (sul3). För en fullständig karta över p134797, se figur 2A. E. coli SW4955 är laktospositiv och producerar rosa kolonier på MacConkey-agar.
Donator 2. E. coli SW7037 samlades in i Lake Erie (Ottawa County, OH, USA). Den bär en konjugativ plasmid på 101 718 bp (p101718) med en IncI1-I (Alpha) replikon. Denna konjugativa plasmid har en gen som ger resistens mot betalaktamer (blaCMY-2). För en fullständig karta över p101718, se figur 2B. E. coli SW7037 är också laktospositiv och producerar rosa kolonier på MacConkey-agar.
Figur 2: Genetisk karta över de konjugativa plasmiderna som användes i denna studie . (A) Plasmid p134797, den konjugativa plasmiden som finns i E. coli-stam SW4955. (B) Plasmid p101718, den konjugativa plasmiden som finns i E. coli-stammen SW7037 . Antibiotikaresistensgener markeras i blått och gener som tillhör den konjugativa apparaten markeras i rött. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Mottagare. E. coli LMB100 används som mottagare. Detta är en plasmidfri stam som är resistent mot rifampicin (100 mg / L) och streptomycin (100 mg / L). Att ha resistens mot två antibiotika minskar risken för resistensmutationer som uppstår hos givaren som skulle störa tolkningen av resultaten. Dessutom är E. coli LMB100 laktosnegativ och kan särskiljas från de två givarstammarna eftersom den producerar blekgula och små kolonier (i motsats till större, rosa kolonier) på MacConkey-agar.
När donatorn är laktosnegativ rekommenderar vi att man använder en laktospositiv mottagare (t.ex . E. coli J53). LMB100- och J53-stammarna är tillgängliga för andra laboratorier för användning. Skicka en förfrågan till Dr. Gerardo Cortés-Cortés tillsammans med en adress och ett FedEx-nummer.
Det fasta mediet som behövs för att välja och räkna givare, mottagare och transkonjuganter är MacConkey-agar i petriskålar med en diameter på 100 mm. Tillsats av följande antibiotika behövs: (i) Media A: karbenicillin (100 mg / L) för att räkna givare och för att säkerställa att mottagarna inte kan växa med detta antibiotikum. ii) Media B: rifampicin (100 mg/l) + streptomycin (100 mg/l) för att räkna mottagare och säkerställa att donatorer inte kan växa i dessa två antibiotika. iii) Media AB: karbenicillin (100 mg/l) + rifampicin (100 mg/l) + streptomycin (100 mg/l) för att erhålla och räkna transkonjuganter. iv) Media C: inga antibiotika för att stryka alla isolat som studerats.
Konjugeringshastigheterna för konjugativa plasmider från E. coli SW4955 och E. coli SW7037 till E. coli LMB100 jämförs. När det gäller den konjugativa plasmiden p134797 (SW4955-stammen) ersätts dessutom antibiotikumet karbenicillin (100 mg/L) med gentamicin (2 mg/L), kloramfenikol (25 mg/L), tetracyklin (10 mg/L), trimetoprim (20 mg/L) eller sulfametoxazol (100 mg/L) i efterföljande experiment för att fastställa om den antibiotikaresistensmarkör som används för selektion har någon inverkan på resultaten.
Konjugativa plasmider ger tillgång till en gemensam pool av gener inom en viss miljö genom rekombination och horisontell genöverföring34. Således är konjugativa plasmider evolutionära enheter som kan förvärva och tilldela funktioner som gör det möjligt för bakterier att anpassa sig till flera tillstånd (inklusive resistens mot antibiotika, resistens mot metaller, förvärv av metaller, biofilmbildning och patogena gener, bland andra) inom en tidsskala av timmar.
Detta arbete presenterar ett protokoll för identifiering av konjugativa plasmider i bakterier. För att protokollet ska fungera måste markörerna som används skilja givar- och mottagarstammar, vilket visas av kontrollerna i media A och B. De behöver också effektivt välja celler som bär plasmiden. Parningsreaktionen är kritisk. I denna reaktion måste givare och mottagare göra långvarig kontakt (genom pili) för att konjugering ska inträffa. Allt som kan störa cell-till-cell-kontakt, såsom otillräcklig inkubationstid eller skakning eller omrörning av kulturen, minskar därmed konjugeringens effektivitet. Valet av mottagare är också kritiskt, eftersom vissa mottagarstammar är eldfasta mot konjugering35,36. LMB100 föreslås som mottagare av val, eftersom det kan ta plasmider av flera inkompatibilitetstyper.
Konjugeringshastigheten är specifik för varje plasmid-donatorkromosompar, mottagare och miljötillstånd. Konjugeringen av specifika plasmider har visat sig vara känslig för ett stort antal variabler, inklusive tillväxtfas, celldensitet, donator-till-mottagarförhållande, huruvida konjugering utförs i flytande eller fast media, kol, syre, gallsalter, metallkoncentrationer, närvaro av däggdjursceller, temperatur, pH och parningstid13,14,15 . Studien av dessa interaktioner beror på den initiala detektionen av en konjugativ plasmid som ska studeras på djupet. Således kan protokollet som beskrivs här också modifieras för att utforska effekterna av olika experimentella variabler, även om detta kommer på bekostnad av att begränsa antalet screenade givare. Det kan också identifiera mobiliserbara plasmider i värdar som har hjälparplasmider (dvs plasmider som möjliggör konjugering genom att tillhandahålla funktioner som saknas i de mobiliserbara plasmiderna i trans6).
Att känna till sekvensen av den konjugativa plasmiden rekommenderas (men inte nödvändigt för att detektera konjugering, som diskuterats ovan). När donatorerna är laktosnegativa (producerar gula kolonier på MacConkey-agar) kan en laktospositiv mottagare (som producerar rosa kolonier på MacConkey-agar) användas för att skilja sanna transkonjuganter från donatorceller som kan växa på media för att välja transkonjuganter. Protokollet som beskrivs här är utformat för att detektera konjugativa plasmider från miljö-, kommensala och patogena medlemmar av familjen Enterobacteriaceae; Det kan dock användas med alla bakteriearter med en lämplig donator, mottagare, antibiotika och färgmarkörer. Identifieringen av dessa kritiska komponenter i andra bakterier kräver systematiska studier med flera givare, mottagare och markörer (antibiotika och färger). Detta protokoll har inte testats i grampositiva bakterier.
Flera varianter av metoden som presenteras här har rapporterats i litteraturen, nyligen granskad20. Det kvalitativa utfallet kan också refereras till på olika sätt (t.ex. exkonjugantfrekvens och genöverföringsfrekvens), och dimensionslösa enheter kan användas för att rapportera konjugeringseffektivitet (ml/CFU x h)20.
Protokollet som beskrivs här löser flera begränsningar som tidigare inte åtgärdats med befintliga metoder16,18,19,20. För det första har en lämplig mottagare identifierats. För det andra minimerar användningen av två antibiotika (rifampicin och streptomycin) för att välja sanna transkonjuganter möjligheten att givare utvecklar resistens mot ett av de antibiotika som används för att välja transkonjuganter genom spontan mutagenes. Falska transkonjuganter kan också bero på skydd av åskådare genom hydrolys av det antibiotikum som används för att välja transkonjuganter av enzymer (t.ex. betalaktamaser) som produceras i stora mängder av givaren. För det tredje ingår flera experimentella kontroller för att säkerställa att parningsprodukten är en sann transkonjugant (dvs. en mottagarcell som stabilt har införlivat donatorns konjugativa plasmid). Här presenterade vi två oberoende metoder för att testa transkonjuganternas äkthet, nämligen en kolorimetrisk markör i MacConkey-agar och PCR-detektion av replicons och antibiotikaresistensgener hos den konjugativa plasmiden i mottagaren. Protokollet som beskrivs här är också utformat för att isolera och karakterisera konjugativa plasmider från miljö-, kommensala och patogena medlemmar av familjen Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigella och andra arter).
För att förstå konjugationens mekanik har experimentella observationer modellerats med hjälp av datorsimuleringar. Dessa prediktiva modeller uppskattar frekvensen av plasmidöverföring för givna tillväxttätheter hos givare, mottagare och transkonjuganter. En modell känd som slutpunktsmodellen fann tröskelvärden över vilka plasmidöverföringshastigheten i flytande kultur och drog slutsatsen att överföringshastigheten inte påverkas av celldensitet, förhållandet mellan givare och mottagare och parningstid19. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) har använts som en alternativ metod för transkonjugant plasmiddetektion. FISH möjliggör plasmidvisualisering med hjälp av fluorescensmikroskopi genom hybridisering av en DNA-sond och ett mål-DNA. Således möjliggör FISH visuell detektion av plasmidflöden över olika cellpopulationer37, även om den inte har samma känslighetsnivå som den metod som presenteras här om transkonjuganter detekteras genom visuell screening i motsats till selektion.
Det finns ett enormt behov av att förstå biologin hos konjugativa plasmider som sprider antibiotikaresistensgener genom olika komponenter i ekosystemet (klinik, jordbruk, avloppsvatten, vilda djur, husdjur, jordar, floder och sjöar). Sammanfattningsvis underlättar de förenklade experimentella förhållanden som presenteras i de protokoll som beskrivs här screening av givare i stor skala och utgör därmed ett viktigt verktyg för studier av horisontell genöverföring med ursprung i konjugativa plasmider från en mängd olika källor. De kan användas för att undersöka förekomsten av antibiotikaresistensgener eller andra kliniskt relevanta gener i konjugativa plasmider från flera källor och bakterier. De kan också anpassas för studier av konjugering in vivo (t.ex. i tarmen hos ryggradsdjur) och för att studera de förhållanden som modulerar konjugeringens effektivitet. Alla dessa studier kommer i hög grad att bidra till förståelsen av hur mobiliseringen av multiresistenta konjugativa plasmider bidrar till spridningen av multiresistens.
The authors have nothing to disclose.
LM-B, IMG, AT och IS stöddes av NIH-bidrag GM055246 som tilldelades LM-B. GC-C tilldelades UC MEXUS-CONACYT Postdoctoral Fellowship två år i rad: AY 2017-18 och 2018-19. Vi tackar studenterna Sage Chavez och Pepper St. Clair från Genentech-Foundation sponsrade Academic Inspiration Network (GAIN) mentorprogram för deras tekniska stöd i experiment.
1.5 mL tube racks | Thermo Fisher Scientific | 22-313630 | It can be replaced for another brand |
2.0 mL Cryogenic vials | Corning | 430659 | It can be replaced for another brand |
14 mL conical tubes | FALCON | 149597 | It can be replaced for another brand |
14 mL tube racks | Thermo Fisher Scientific | 8850 | It can be replaced for another brand |
1 kb DNA ladder | New England Biolabs | N0552G | |
250 mL sterile flasks | PYREX | 5320 | It can be replaced for another permanent marker brand |
Acetic acid | Fisher Scientific | A38SI-212 | It can be replaced for another brand |
Agarose (molecular biology grade, multipurpose) | Fisher Scientific | BP160-500 | It can be replaced for another brand |
Carbenicillin | GOLD BIOTECHNOLOGY | C-103-50 | It can be replaced for another brand |
Disposable inoculating loops: 1 µL | Fisherbrand | 22-363-595 | It can be replaced for another brand |
DNA gel loading dye 6x | New England Biolabs | B7024S | It can be replaced for another brand |
EDTA | Fisher Scientific | BP119-500 | It can be replaced for another brand |
Electronic digital scale | Denver Instrument | APX-2001 | It can be replaced for another brand |
Eppendorf conical tubes: 1.5 mL | Eppendorf | 14-282-302 | It can be replaced for another brand |
Equipment for agarose gel electrophoresis | Fisher Scientific | FP300 | It can be replaced for another brand |
Ethanol-resistant markers | Sharpie | 37001; 37002; 37003 | It can be replaced for another brand |
Gel documentation systems (UVP GelSolo) | Analytakjena | SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01 | It can be replaced for another brand |
Gloves | X-GEN | 44-100M | Any nitrile gloves brand works |
Ice bucket | Thermo Fisher Scientific | 432128 | It can be replaced for another brand |
MacConkey agar | BD DIFCO | 212123 | |
Master Mix | BioLabs | M0496S | It can be replaced for another brand |
Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | It can be replaced for another brand |
Microcentrifuge tubes: 2.0 mL | Fisherbrand | 05-408-138 | It can be replaced for another brand |
Mueller Hinton agar | BD DIFCO | DF0479-17-3 | |
Mueller Hinton broth | BD DIFCO | 275730 | |
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL | 740588. 250 | |
PCR tube racks | AXYGEN | R96PCRFSP | It can be replaced for another brand |
PCR tubes (0.2 mL) | AXYGEN | PCR-02-C | It can be replaced for another brand |
Rifampicin | Fisher Scientific | 50-164-7517 | |
Set of micropipettes that dispense between 1 – 10 μL (P10), 2–20 μL (P20), 20–200 μL (P200) and 200–1000 μL (P1000) | RAININ | 17008648; 17008650; 17008652; 17008653 | Micropipettes should be calibrated; can be replaced for another brand |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-3 | It can be replaced for another brand |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | 335905P | It can be replaced for another brand |
Sterilized tips for 10 μL, 200 μL and 1000 μL | Eclipse | 1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9 | It can be replaced for another brand |
Streptomycin | Fisher Scientific | BP910-50 | |
SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
Taq DNA Polymerase | BioLabs | M0273S | |
Thermal cycler C1000 Touch | Bio-Rad | 1851196 | It can be replaced for another brand |
Tris | Fisher Scientific | BP153-500 | It can be replaced for another brand |