Analisi dell'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T nelle cellule T murine primarie mediante citometria a flusso a spettro completo

Summary

L'afflusso di calcio, una misura della segnalazione delle cellule T, è un modo efficace per analizzare le risposte alla stimolazione del recettore delle cellule T. Questo protocollo per il multiplexing di Indo-1 con pannelli di anticorpi diretti alle molecole della superficie cellulare sfrutta le capacità altamente flessibili della citometria a flusso a spettro completo.

Abstract

L'afflusso di calcio in risposta alla stimolazione del recettore delle cellule T è una misura comune della segnalazione delle cellule T. Sono stati sviluppati diversi coloranti indicatori di calcio per valutare la segnalazione del calcio mediante citometria a flusso passa-banda. Questo protocollo è progettato per misurare le risposte del calcio nelle cellule T murine primarie utilizzando la citometria a flusso a spettro completo. Gli splenociti totali sono marcati con il colorante indicatore raziometrico del calcio Indo-1, insieme a un pannello di anticorpi coniugati con fluorocromo alle molecole della superficie cellulare. Sfruttando le capacità della citometria a flusso a spettro completo, si fornisce una piattaforma per l'utilizzo di una vasta gamma di colorazioni della superficie cellulare in combinazione con Indo-1. Le cellule vengono quindi analizzate in tempo reale a 37 °C prima e dopo l'aggiunta di un anticorpo anti-CD3 per stimolare il recettore delle cellule T. Dopo aver mescolato i segnali spettrali, viene calcolato il rapporto tra Indo-1 legato al calcio e Indo-1 privo di calcio e può essere visualizzato nel tempo per ogni popolazione gated di splenociti. Questa tecnica può consentire l'analisi simultanea delle risposte del calcio in più popolazioni cellulari.

Introduction

L'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T (TCR) è una misura utile dell'attivazione delle cellule T e viene spesso utilizzato per determinare se una popolazione di cellule T ha risposte compromesse nelle fasi prossimali della via di segnalazione TCR¹. Le misurazioni dell'afflusso di calcio vengono generalmente eseguite pre-marcando le cellule T con uno o un paio di coloranti indicatori di calcio fluorescenti e quindi esaminando i segnali fluorescenti utilizzando la citometria a flusso in tempo reale dopo la reticolazione TCR ^2,3,4. Indo-1, un colorante di calcio metrico proporzionale, è eccitato dal laser UV con emissioni di picco a due diverse lunghezze d'onda dipendenti dal legame del calcio⁵ ed è un colorante indicatore comunemente usato per l'analisi citometrica a flusso delle risposte del calcio nei linfociti vivi. Poiché il profilo di emissione di Indo-1 è piuttosto ampio, può essere difficile combinare la valutazione di Indo-1 con l'analisi simultanea di più marcatori di superficie cellulare mediante citometria a flusso passa-banda. Questa limitazione limita l'utilizzo dell'analisi citometrica a flusso delle risposte del calcio a popolazioni pre-purificate di cellule T o a popolazioni identificate da un insieme limitato di molecole di superficie cellulare.

Per affrontare i limiti della misurazione delle risposte del calcio su popolazioni eterogenee di linfociti primari utilizzando la citometria a flusso passa-banda, è stato sviluppato un protocollo per misurare la fluorescenza Indo-1 utilizzando la citometria a flusso a spettro completo. Questo metodo consente di multiplexare Indo-1 con pannelli di anticorpi diretti alle molecole della superficie cellulare, sfruttando le capacità altamente flessibili della citometria a flusso a spettro completo. Il vantaggio di utilizzare la citometria a flusso a spettro completo rispetto alla citometria a flusso convenzionale è la sua capacità di distinguere i segnali fluorescenti da coloranti altamente sovrapposti, aumentando così il numero di marcatori di superficie che possono essere valutati simultaneamente in ciascun campione. La citometria a flusso convenzionale utilizza filtri passa-banda ed è limitata a un fluorocromo per sistema rivelatore⁶. La citometria a flusso a spettro completo raccoglie segnali attraverso l'intero spettro del fluorocromo utilizzando 64 rivelatori su un sistema di citometria a flusso spettrale a cinque laser ^7,8. Inoltre, la citometria a flusso a spettro completo sfrutta i rivelatori APD (Avalanche Photo Diode) che hanno una maggiore sensibilità rispetto ai rivelatori a tubo fotomoltiplicatore presenti sui citometri a flusso convenzionali⁸. Di conseguenza, questo approccio è ideale per le popolazioni cellulari eterogenee, come le cellule mononucleate del sangue periferico o le sospensioni di cellule di organi linfoidi secondari murini, in quanto elimina la necessità di isolare specifiche popolazioni di cellule T prima della marcatura del colorante di calcio. Invece, i profili di espressione dei marcatori della superficie cellulare e il gating della citometria a flusso dopo la raccolta dei dati possono essere utilizzati per valutare le risposte al calcio in ciascuna popolazione di interesse. Come mostrato in questo rapporto, Indo-1 può essere facilmente combinato con otto anticorpi coniugati con fluorocromo, risultando in un totale di 10 firme spettrali uniche. Inoltre, questo metodo può essere facilmente applicato a miscele di cellule provenienti da linee di topo congenitamente distinte, consentendo l'analisi simultanea delle risposte del calcio nelle cellule T wild-type rispetto a quelle di una linea di topo mirata al gene.

Protocol

I topi sono stati mantenuti presso il campus medico Anschutz dell'Università del Colorado in conformità con i protocolli IACUC. Tutti i topi sono stati sottoposti a eutanasia secondo gli standard AAALAC.

1. Preparazione delle cellule immunitarie dalla milza del topo

NOTA: eutanasia di topi naïve con eutanasia CO₂ . I topi C57BL / 6 acquistati dai Jackson Laboratories e allevati internamente vengono utilizzati per esperimenti a 6-12 settimane di età. Sia i topi maschi che le femmine sono utilizzati per gli esperimenti.

1. Disinfettare la pelle del topo con etanolo al 70% per ridurre la possibilità che contaminanti esterni entrino nel campione.
2. Sezionare la milza del topo usando strumenti di dissezione, forbici chirurgiche e pinze. Raccogliere la milza e posizionare la milza distaccata in un tubo conico da 50 mL con ~ 5 ml di mezzo RPMI completo (cRPMI) su ghiaccio.
   NOTA: RPMI completo è composto da 10% FBS, 2 mM L-glutammina e 1% penicillina / streptomicina.
   1. Per raccogliere la milza del topo, praticare un'incisione di 5 cm nella pelliccia e nella pelle lungo il lato sinistro del topo a metà strada tra le zampe anteriori e posteriori con le forbici. Aprire la cavità del corpo ~ 5 cm e rimuovere la milza con una pinza. La milza è del colore di un fagiolo ed è più lunga e piatta del rene vicino.
3. Versare il contenuto del punto 1.2 su un filtro sterile da 70 μm collegato a un nuovo tubo conico da 50 ml. Separare meccanicamente la milza in una sospensione a cella singola spingendo la milza attraverso il filtro con uno stantuffo della siringa da 5 mL fino a quando non rimane polpa di milza sulla superficie del filtro.
4. Pellettare gli splenociti utilizzando una centrifuga da banco a rotore oscillante a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
5. Decantare con cura il surnatante. Gli splenociti pellettati rimangono sul fondo del tubo conico da 50 ml.
6. Per rimuovere i globuli rossi, risospendere gli splenociti pellettati in 1 mL di tampone di lisi ACK per 3 minuti secondo le istruzioni del produttore. Mescolare bene.
7. Spegnere il tampone di lisi ACK con 15 mL di cRPMI.
8. Pellet i linfociti come indicato al punto 1.4.
9. Risospendere la sospensione cellulare in 5 mL di cRPMI in un tubo conico da 50 mL. Posizionare i campioni sul ghiaccio.
   1. Per contare le cellule, trasferire 10 μL della sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 0,6 mL e diluire in rapporto 1:1 con la soluzione di blu di Trypan. Quindi, trasferire a un emocitometro o a un sistema automatico di conteggio delle cellule.
10. Dopo il conteggio, a seconda della concentrazione cellulare nella sospensione cellulare come nella fase 1.9, pellettare le celle in una centrifuga da tavolo a 500 x g a 4 °C per 5 minuti per preparare l'aggiunta di mezzi cRMPI contenenti colorante estere Indo-1 AM.
11. Calcolare il volume per la risospensione delle cellule per ottenere 10-12 x 10⁶ celle / ml. Questa è una concentrazione 2x del conteggio totale delle cellule richiesto.
12. Risospendere le celle nel volume di cRPMI calcolato nel passaggio 1.11. Porre le cellule a 37 °C con il 5% di CO₂ in un tubo conico da 50 mL con il coperchio ventilato o in una piastra di coltura tissutale.

2. Colorante raziometrico Indo-1 ed etichettatura degli anticorpi fluorescenti

1. Secondo le istruzioni del produttore, aggiungere 50 μL di DMSO in un flaconcino contenente 50 μg di Indo-1 AM. La concentrazione della soluzione madre è di 1 μg/μL.
   NOTA: DMSO è fornito in micro-fiale con il kit per prevenire qualsiasi ossidazione di DMSO.
2. Diluire l'aliquota madre (1 μg/μL) nel volume sperimentale appropriato (stabilito in 1.11) di cRPMI ad una concentrazione di 6 μg/mL, una concentrazione 2x. Non conservare Indo-1 in una soluzione acquosa.
   NOTA: Altri tamponi con aggiunta di calcio possono essere utilizzati a seconda delle esigenze della cellula.
3. Mettere da parte il fluido completo con Indo-1 a bagnomaria a 37 °C.
   NOTA: Utilizzare la concentrazione minima di estere Indo-1 AM necessaria per ottenere un segnale adeguato. Questo deve essere titolato per diversi tipi di cellule. Tipicamente, una concentrazione compresa tra 3-5 μM è sufficiente. Per le cellule T primarie, caricare le cellule con Indo-1 ad una concentrazione >5 μg/mL aumenta l'intensità fluorescente media (MFI) al di sopra di un log di 6 sui citometri a flusso spettrale. In tal caso, ridurre l'intensità del laser UV e titolare l'Indo-1 a una concentrazione inferiore.
4. Diluire la sospensione cellulare precedentemente preparata (al punto 1.12), 1:1 in cRPMI, inclusi i 2 supporti Indo-1 realizzati nella fase 2.2. Assicurarsi che le cellule siano ad una concentrazione compresa tra 5-6 x 10⁶ / ml.
   NOTA: Non colorare il controllo della singola macchia non macchiata o i controlli delle celle della singola macchia del marcatore di superficie con Indo-1. L'aggiunta di Indo-1 ai controlli anticorpali a singola macchia creerà un campione multicolore a causa dell'Indo-1 aggiunto alle singole cellule colorate. Includi indo-1 (senza calcio) EGTA ha aggiunto il controllo alla piastra campione creata nel passaggio 2.6.
5. Aggiungere 1 mL di cellule/pozzetto/condizione sperimentale in una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti.
6. Creare un singolo controllo colorato per il campione Indo-1 (privo di calcio) utilizzando cellule precedentemente caricate con colorante Indo-1 e aggiungere EGTA a una concentrazione finale di 2 mM. EGTA chelerà il calcio nella sospensione cellulare, fornendo un campione di controllo più pulito.
   1. Creare un controllo positivo Indo-1 (Indo-1 calcio-legato) aggiungendo 50 μM di ionomicina alla sospensione cellulare caricata con colorante al citometro a flusso. La ionomicina è uno ionoforo di calcio permeabile alla membrana che lega gli ioni calcio e facilita il trasferimento di ioni calcio nelle cellule.
7. Creare un pozzo per il controllo biologico negativo senza fluorofori o colorante Indo-1.
8. Creare un pozzo per i controlli a singola colorazione per eventuali popolazioni cellulari aggiuntive di interesse (anticorpi definiti dall'utente) utilizzando fluorofori coniugati con anticorpi in un pannello di citometria a flusso. Questi non includeranno il colorante raziometrico Indo-1.
9. Aggiungere l'anticorpo bloccante del recettore Fc (~ 2 μg / 1 x 10⁶ cellule), secondo le istruzioni del produttore, prima di aggiungere ulteriori anticorpi coniugati al fluorocromo per la colorazione superficiale.
10. Incubare la piastra per 45 minuti a 37 °C con il 5% di CO_2.
11. Risospendere le celle in una piastra a 12 pozzetti picchiettando delicatamente la piastra ogni 15 minuti.
12. Mescolare e rimuovere l'intero volume di celle sospese nel supporto dalla piastra a 12 pozzetti. Quindi aggiungere la sospensione cellulare a provette da microcentrifuga da 1,7 ml.
13. Pellettare le celle in una microcentrifuga a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Decantare il surnatante e lavare le celle aggiungendo 1 mL di cRPMI preriscaldato. Pellet di nuovo e decantare il surnatante.
    NOTA: il lavaggio delle cellule rimuove qualsiasi anticorpo bloccante FC rimanente.
14. Risospendere le cellule in 1 mL di cRPMI in provette da microcentrifuga da 1,7 mL e incubare ciascuna provetta a 37 °C per altri 30 minuti al 5% di CO₂, lasciando la parte superiore del tubo leggermente aperta per consentire lo scambio di gas. Ciò consente la completa deesterificazione degli esteri AM intracellulari.
15. Trasferire le cellule in una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti, se necessario. Ulteriori anticorpi titolati al fluorocromo definiti dall'utente possono essere aggiunti in una fase di riposo.
    NOTA: i marcatori utilizzati nel pannello dei metodi includono: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 e CD1d/α-galcer tetramero. I marcatori vengono scelti per analizzare i sottoinsiemi delle cellule T.
    1. Creare un master mix di tutti gli anticorpi coniugati al fluorocromo definiti dall'utente in base ai tipi di cellule di interesse a un volume precedentemente titolato in una provetta da microcentrifuga da 1,7 ml.
    2. Aggiungere una miscela master calcolata per 1 mL del volume cellulare, dipendente dagli anticorpi titolati alle cellule a riposo.
       NOTA: il vantaggio della colorazione al passaggio 2.15 anziché al successivo passaggio 2.18 è che la colorazione al passaggio 2.15 ridurrà il tempo complessivo di incubazione per l'esperimento. Tuttavia, la colorazione in un volume totale di 1 mL al punto 2.15 aumenta l'uso di anticorpi.
16. Dopo il riposo, pellettare le celle a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Le cellule in una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti possono essere pellettate nella piastra con un accessorio centrifuga a piastre. Altrimenti, pellettare le celle in una provetta da microcentrifuga da 1,7 ml.
17. Lavare le celle risospendendo il pellet in 1 mL di cRPMI freddo a 4 °C e pellettare nuovamente le celle come al punto 2.16. Metti le celle sul ghiaccio.
    NOTA: Se le cellule di colorazione superficiale separatamente, dopo la deesterificazione al punto 2.18, è necessario un volume di anticorpi inferiore. La colorazione superficiale in questa fase può essere eseguita dopo la fase di riposo in tampone di flusso freddo (1x DPBS con aggiunta di FBS all'1%), utilizzando anticorpi definiti dall'utente, su ghiaccio per 30 minuti. Lavare le celle dopo la macchia in cRPMI come al punto 2.17.
    1. Aggiungere la macchia di vitalità Ghost540 diluita 1:7.500 in DPBS ai campioni secondo le istruzioni del produttore. Il calore uccide le cellule a 55 °C su un blocco riscaldante per il controllo di singole macchie vive / morte.
       NOTA: La colorazione funzionale del colorante di vitalità per eliminare le cellule morte nell'analisi citometrica a flusso viene eseguita senza FBS. FBS può interagire con i coloranti amminici secondo le istruzioni del produttore.
18. Risospendere i singoli campioni in 500 μL di cRPMI (privo di rosso fenolo) utilizzando un tubo di flusso in polistirene da 5 mL con tappo.
    NOTA: Le celle possono essere lasciate a 4 °C per un massimo di un'ora.
19. Riscaldare ogni tubo da 5 mL contenente cellule, singolarmente, a 37 °C usando un bagno di perline per 7 minuti prima dell'analisi sul citometro a flusso mantenendo il tempo coerente tra i campioni. Utilizzare un timer.

3. Tubo a bagno di perline: mantenimento della temperatura durante l'analisi del flusso di calcio

1. Aggiungi perline da bagno a un piccolo bagnomaria, senza aggiunta di acqua; riscaldare fino a 37 °C.
2. Tagliare con cura un tubo conico da 50 mL a metà, al segno di 25 ml, con una lama di rasoio; Scartare la parte superiore del tubo.
3. Riempire il tubo dimezzato 3/4 del percorso con perline da bagno.
4. Posizionare il tubo creato al punto 3.2 nel bagno di perline creato al punto 3.1. Portare il tubo e le perline a 37 °C.
5. Collegare il bagno di perline a una presa elettrica accanto al citometro a flusso per mantenere la temperatura in preparazione per l'analisi del campione.
6. Aggiungere un taglio conico in polistirolo da 50 mL per tenere un tubo per posizionare il tubo in posizione durante il funzionamento del citometro a flusso. Ciò eliminerà la necessità di tenere manualmente il tubo per tutta la durata dell'analisi della curva.

4. Acquisizione dell'afflusso di calcio mediante analisi citometrica a flusso

1. Accedere al software del citometro a flusso su un analizzatore di flusso.
2. Fare clic sulla scheda Libreria per aggiungere tag fluorescenti Indo-1 (legati al calcio) e Indo-1 (senza calcio). Selezionare Tag fluorescenti nel menu del software a sinistra. Selezionare il laser UV sotto i gruppi di tag fluorescenti e fare clic su +aggiungi per aggiungere un nome di tag fluorescente (Indo-1 (legato al calcio)/Indo-1 (senza calcio)) alla libreria. Scegli la lunghezza d'onda dell'eccitazione laser e la lunghezza d'onda dell'emissione, quindi fai clic su Salva. Continuare con la configurazione sperimentale.
   NOTA: Indo-1 è eccitato dal laser UV ad una lunghezza d'onda di 355 nm. La lunghezza d'onda di emissione di Indo-1 (legato al calcio) è di 372 nm. La lunghezza d'onda di emissione di Indo-1 (senza calcio) è 514 nm.
3. Fare clic sulla scheda Acquisizione. Apri/crea un nuovo esperimento e aggiungi i tag fluorescenti desiderati all'esperimento.
4. Creare un gruppo di riferimento e un nuovo gruppo di esempio per l'esperimento. Etichettare sia i campioni che i gruppi di riferimento, se necessario.
5. Nella scheda Acquisizioni , imposta gli eventi da registrare al massimo: 10.000.000.
6. Impostare il volume di arresto sul volume massimo: 3.000 μL.
7. Impostare il tempo di arresto sul tempo massimo: 36.000 s.
8. Acquisire controlli a singola colorazione per anticorpi coniugati definiti inclusi nel pannello multicolore.
9. Acquisire controlli a colorazione singola per il colorante funzionale Indo-1.
   1. Aggiungere 50 μM di ionomicina al controllo positivo Indo-1 legato al calcio. Vortice da mescolare. Aggiungere il tubo di flusso alla porta di iniezione del campione e fare clic su Registra.
   2. Aggiungere il controllo negativo Indo-1 privo di calcio al citometro a flusso e fare clic su Registra. EGTA è stato aggiunto nel passaggio 2.6.
   3. Smescolare i singoli controlli colorati facendo clic sul pulsante Unmix .
      NOTA: Tutti i singoli controlli colorati di tutti gli anticorpi coniugati e coloranti funzionali devono essere registrati prima di scombinare i campioni. Affinché il pulsante Unmix funzioni, è necessario registrare prima tutti i controlli di riferimento. La miscelazione può essere effettuata prima o dopo la raccolta del campione.
10. Una volta completata la miscelazione, create grafici sequenziali utilizzando il foglio di lavoro non miscelato. SSC-A contro FSC-A rimuovendo i detriti dal campione, SSC-A contro SSC-H per rimuovere i doppietti. Questo è seguito da un cancello di pulizia della viabilità insieme a ulteriori gating sulle popolazioni di interesse. Per creare cancelli, fare clic su Plot. Aggiungere un grafico al foglio di lavoro e fare doppio clic all'interno del cancello per creare una popolazione gated a valle. Continuare fino a quando tutte le popolazioni di interesse sono contabilizzate.
11. Campioni di controllo caldi a colorazione singola (dai punti 2.6-2.9 nella sezione Colorante raziometrico Indo-1 e marcatura degli anticorpi fluorescenti) a 37 °C per l'analisi sequenziale. Configurare il software di citometria a flusso.
12. Far scorrere l'acqua DI sul citometro per 2-3 minuti per garantire la stabilità fluidica del citometro a flusso.
13. Impostare grafici sequenziali sul foglio di lavoro non miscelato creando porte utilizzando i pulsanti Porta poligono, Rettangolo o Ellisse. Gate per includere la popolazione di interesse (ad esempio, i linfociti che utilizzano SSC-A rispetto a FSC-A [discriminazione dimensione/linfociti]). Le popolazioni negative appaiono raggruppate intorno allo zero, mentre le popolazioni positive possono essere visualizzate aumentando le IFM. Le popolazioni di interesse saranno definite dall'utente in base alla domanda biologica.
14. Fare doppio clic all'interno del gate creato e modificare i parametri dell'asse Y e dell'asse X in SSC-A anziché SSC-H (discriminazione singoletto). Completare la definizione dei parametri dell'asse facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sulle parole sull'asse.
15. Creare un grafico con SSC-A rispetto al segnale di colorante di vitalità (parametri del cancello di vitalità). Cancello su cellule vive, che sono negative per la colorazione del colorante amminico. Le celle vive, negative per la colorazione dei morti vivi, si raggrupperanno al segno 0 su entrambi gli assi Y e X.
16. Fare doppio clic sul grafico interno per creare un nuovo grafico contenente solo linfociti vivi a singola cellula. Modificare l'asse Y in Indo-1 (calcio-legato) (V1) e/o Indo-1 (calcio libero) (V7) rispetto al tempo sull'asse X per la visualizzazione dell'afflusso di calcio.
17. Posizionare il campione biologico riscaldato sul SIT della macchina ed eseguire i campioni a 2.500-3.000 eventi / s su supporto per consentire la visualizzazione dell'afflusso di calcio in popolazioni a numero limitato di cellule (ad esempio, iNKT).
    NOTA: Risospendendo le cellule ad una concentrazione di 1 x 10⁶/ml, gli eventi cellulari raccolti a portata media dovrebbero essere pari a 2.500-3.000 eventi/s. Abbassare la portata sotto il controllo dell'acquisizione facendo clic sul menu a discesa o diluire il campione se la sospensione cellulare ha una concentrazione maggiore. L'esecuzione dei campioni ad alta portata può aumentare la diffusione del segnale da un fluoroforo ad altri fluorofori nel pannello.
18. Aggiungere il tubo successivo al bagno di perline per riscaldare a 37 °C.
19. Nel controllo dell'acquisizione, premere Record per registrare i dati iniziali per 30 s per ottenere un livello basale di segnalazione del calcio nel campione.
20. Nel controllo dell'acquisizione, fare clic su Stop e rimuovere il tubo dalla porta di iniezione del campione (SIP).
21. Aggiungere 30 μg di anti-CD3 non coniugato direttamente nella provetta per avviare l'afflusso di calcio. La concentrazione finale per tubo è di 60 μg/ml.
    NOTA: Non vi è alcuna fase di lavaggio dopo l'aggiunta di anti-CD3.
22. Riposizionare il tubo sul SIP della macchina il più rapidamente possibile e premere Record nel software.
23. Registrare i dati per 7 minuti, osservando il tempo trascorso sotto i controlli di acquisizione nel software, per osservare il decorso temporale dell'afflusso di calcio all'interno delle popolazioni campione.
24. Dopo 7 minuti, premere Stop nel software e aggiungere 1 μg/mL di ionomicina. Registrare per 30 s per ottenere il massimo segnale di calcio nelle cellule di interesse. Per limitare il trascinamento della ionomicina nel campione successivo, completare due sonde SIT sullo strumento tra i campioni.
25. Passare all'esempio successivo e ripetere il flusso di lavoro fino a quando non sono stati raccolti tutti i campioni.
26. Salva l'esperimento e fai clic sul file zip di esportazione . I file non misti (.fsc) vengono caricati su un software di analisi citometrica a flusso esterno.

5. Analisi della curva del calcio

1. Utilizzando un software di analisi⁶ per la citometria a flusso, convertire i segnali fluorescenti Indo-1 in un rapporto per le misurazioni del calcio time-lapse. Derivare i parametri nella scheda Strumenti inserendo riferimenti Indo-1 (legato al calcio)/Indo-1 (calcio libero) utilizzando una scala lineare. Impostare il minimo a zero e il massimo in base al rapporto di afflusso di calcio, in genere intorno a 10. Il rapporto massimo varia in base al tipo di cellula e all'MFI di Indo-1.
2. Evidenziare il parametro selezionato. In strumenti, aggiungere l'analisi cinetica per scegliere il parametro facendo clic sulla scheda Cinetica . Impostate l'asse Y su derivato.
3. Selezionare MFI (intensità fluorescente media) nella scheda Cineticas.
4. Se lo si desidera, aggiungere la levigatura gaussiana. Per aggiungere l'arrotondamento gaussiano, selezionare l'opzione nel menu delle statistiche a discesa nel software di analisi del flusso. Il livellamento gaussiano può essere aggiunto per facilitare la visualizzazione della curva di afflusso di calcio dell'analisi.
5. Creare più intervalli per le statistiche lungo il corso del tempo di flusso del calcio per confronti biologici all'interno dei campioni.
6. Trascinare gli esempi nell'editor di layout e aggiungere le statistiche come desiderato. L'analisi statistica varia a seconda della domanda biologica. Ai fini della pubblicazione, più repliche vengono analizzate utilizzando t-test o ANOVA.
7. Per un momento di analisi del tempo, impostare il cancello su un momento specifico nel tempo lungo il flusso di calcio. Esaminare i marcatori di superficie desiderati e il cancello sulla popolazione di interesse; quindi, valutare un dot-plot bidimensionale di Indo-1 (privo di calcio) rispetto a Indo-1 (legato al calcio) per le cellule gated all'interno di quel momento nella regione temporale.

Representative Results

Il flusso di lavoro sperimentale per valutare le risposte del calcio nelle cellule T murine primarie utilizzando un colorante raziometrico Indo-1 con colorazioni superficiali multiplexing è mostrato in Figura 1. Dopo aver raccolto e processato gli splenociti di topo in una sospensione a singola cellula, le cellule vengono colorate con un estere Indo-1 AM e colorate con anticorpi legati al fluorocromo. Una volta completato il carico del colorante e la colorazione degli anticorpi, i campioni di linfociti vengono riscaldati fino a una temperatura biologica (37 °C). I campioni vengono quindi analizzati utilizzando la citometria a flusso a spettro completo per la fluorescenza Indo-1 dopo il gating sui singoli tipi di cellule desiderati, senza la necessità di ordinare i campioni prima dell'analisi. Per utilizzare i rivelatori APD (Avalanche Photo Diode) all'interno del citometro a flusso a spettro completo, è necessario convertire la lunghezza d'onda di emissione di picco da una lunghezza d'onda del filtro passa-banda misurata in nm al rispettivo canale sull'APD. La tabella mostrata nella Figura 2 fornisce una linea guida, ma i rivelatori ottimali per le due firme di fluorescenza di Indo-1 (legato al calcio rispetto al calcio-free) devono essere determinati empiricamente. Ciò si ottiene preparando singoli campioni di Indo-1 colorati utilizzando la ionomicina per generare il segnale Indo-1 (legato al calcio) e EGTA, un agente chelante del calcio, per generare il segnale Indo-1 (privo di calcio). Dopo l'analisi utilizzando la citometria a flusso a spettro completo, è possibile visualizzare il canale che mostra l'intensità di fluorescenza di picco per ciascuna firma Indo-1 (Figura 3A). Normalizzando l'IFM delle popolazioni positive a quella delle popolazioni negative, è possibile determinare lo spostamento della fluorescenza indo-1 da priva di calcio a legata al calcio (Figura 3B). Questa visualizzazione viene generata in una cartella di lavoro (.xls) utilizzando i controlli di riferimento sia per Indo-1 associato che libero, disegnando un gate di intervallo negativo e positivo con porte positive e negative chiare per la normalizzazione MFI, come mostrato nella (Figura 3A). Le statistiche di esempio delle IFM possono anche essere ottenute facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla tabella delle statistiche. Nel software, determinare il rapporto MFI dividendo la popolazione positiva con la popolazione negativa e sovrapporre i due spettri su un singolo display (Figura 3B, a destra). La freccia tratteggiata gialla mostra le differenze spettrali normalizzate tra le firme spettrali dell'indo-1 legato e libero.

Per valutare le risposte del calcio dopo la stimolazione del recettore delle cellule T, la fluorescenza Indo-1 viene valutata dopo il gating sulle popolazioni cellulari di interesse, come mostrato in Figura 4. In primo luogo, viene esaminato un grafico di tempo rispetto alla dispersione laterale (SSC-A) per valutare la stabilità fluidica; un segnale stabile e coerente lungo l'asse temporale indica stabilità (Figura 4A). Successivamente, viene visualizzata la dispersione diretta rispetto a quella laterale (FSC-A vs. SSC-A) e la popolazione linfocitaria viene controllata come mostrato in (Figura 4B). Dopo la porta dei linfociti, viene applicata una porta di discriminazione a singola cellula generando un grafico dell'altezza di dispersione laterale rispetto all'area (SSC-H vs. SSC-A) e i singoletti, che cadono sulla diagonale, vengono controllati come mostrato nella Figura 4C. I singoletti vengono quindi valutati per la vitalità, esaminando la colorazione con il colorante di vitalità e il gating sulla popolazione negativa (Figura 4D). Infine, per analizzare le cellule T, viene applicato un dump delle cellule B / porta di controllo negativo interno mediante gating sulla popolazione CD19-negativa (Figura 4E). La popolazione CD19-negativa viene quindi valutata per sottogruppi di cellule T utilizzando anticorpi contro CD4 e CD8 (Figura 4F); l'esempio mostrato esamina le cellule T CD4 ⁺ per le risposte al calcio visualizzando la fluorescenza Indo-1 (legata al calcio) rispetto al tempo (Figura 4G). Dopo il gating su un segmento temporale, è possibile generare anche il grafico Indo-1 (privo di calcio) rispetto a Indo-1 (legato al calcio) (Figura 4H). Questa analisi sarà successivamente utilizzata per derivare il rapporto Indo-1 (vedi metodi di analisi della curva di afflusso di calcio nel software di analisi della citometria a flusso).

A questo punto dell'analisi, può essere utile analizzare i momenti nel tempo all'interno del grafico bidimensionale di Indo-1 (legato al calcio) rispetto al tempo nelle singole popolazioni cellulari di interesse. I timepoint ottimali includono il calcio basale legato all'Indo-1 prima della stimolazione TCR, la risposta di picco, un timepoint diversi minuti dopo la risposta di picco quando i livelli di calcio intracellulare diminuiscono, e infine la risposta al calcio suscitata dall'aggiunta di ionomicina (Figura 5A). Nel campione basale prima dell'aggiunta di anticorpi anti-CD3, viene rilevato un debole segnale Indo-1 (legato al calcio). Durante la risposta di picco, le cellule mostrano un forte segnale Indo-1 (legato al calcio) e una ridotta fluorescenza di Indo-1 (privo di calcio). A 5 minuti dopo il picco, la fluorescenza Indo-1 è quasi tornata al basale. Dopo che la ionomicina è stata aggiunta al campione, è possibile visualizzare un robusto segnale di Indo-1 (legato al calcio), garantendo un adeguato carico di colorante delle cellule. Popolazioni cellulari rare (<1%) possono essere difficili per l'analisi derivata; per superare questa limitazione, l'analisi delle popolazioni rare può essere eseguita tracciando Indo-1 (legato al calcio) rispetto a Indo-1 (privo di calcio) dopo il gating su ciascuna popolazione di interesse, come cellule CD4+, cellule TCRb+, cellule TCRyg+, cellule CD25+, cellule iNKT e cellule CD19⁺ (Figura 5B,C). Si noti la risposta del calcio facilmente rilevabile nelle cellule T TCRγδ+ e nelle cellule iNKT (CD1d/α-galcer⁺). Per il confronto delle proteine di superficie all'interno di una popolazione mista di cellule T murine, sono stati creati grafici bidimensionali che mostrano sottoinsiemi di interesse. Di seguito, viene visualizzata l'analisi della risposta del calcio durante l'intero corso temporale per ciascun sottogruppo (Figura 5C).

Questo test può anche essere utilizzato per stabilire differenze biologiche nelle cellule T da topi wild-type rispetto a topi mirati al gene o in cellule T non trattate rispetto a trattate con inibitori farmacologici. Nell'esempio mostrato in Figura 6, le cellule T sono state trattate con PRN694, una piccola molecola inibitrice delle tirosin-chinasi a cellule T, ITK e RLK ^9,10. L'inibizione di ITK/RLK smorza la segnalazione del recettore delle cellule T, portando ad una ridotta risposta del calcio dopo la stimolazione del recettore delle cellule T¹¹ (Figura 6A). Per quantificare gli effetti dell'inibizione ITK/RLK, le curve che mostrano il rapporto tra fluorescenza Indo-1 (legata al calcio) e Indo-1 (priva di calcio) possono quindi essere analizzate per l'area sotto la curva (AUC) o la pendenza della curva per ciascuna condizione (Figura 6B, C). Questa quantificazione viene eseguita sezionando il corso temporale della risposta del calcio in segmenti discreti (Figura 6A) e valutando l'area sotto la curva o la pendenza della curva per ciascun segmento, come mostrato (Figura 6B,C). Nel complesso, questo protocollo dimostra che la citometria a flusso a spettro completo può essere utilizzata per misurare l'afflusso di calcio insieme a più marcatori di superficie cellulare nelle popolazioni di cellule immunitarie in esame. Questi risultati mostrano che i sottogruppi cellulari rappresentati in più dell'1% della popolazione totale possono essere valutati per l'afflusso di calcio nel tempo. Al contrario, sottoinsiemi cellulari meno abbondanti richiedono un'analisi alternativa utilizzando momenti di tempo.

L'analisi statistica dei dati di risposta al calcio è specifica per la domanda sperimentale e i saggi biologici che vengono eseguiti. Nei dati presentati nel manoscritto, sono stati eseguiti esperimenti con repliche per garantire l'accuratezza sperimentale e la robustezza della metodologia; Tuttavia, non sono stati eseguiti più esperimenti su diversi campioni biologici in giorni diversi. Pertanto, non sarebbe opportuno effettuare analisi statistiche sui dati presentati.

Figura 1: Schema del flusso di lavoro del saggio del calcio. L'uso del colorante indicatore di calcio estere Indo-1 AM fornisce uno strumento per visualizzare l'afflusso di calcio nelle cellule immunitarie e nelle loro sottopopolazioni. Questo schema delinea il flusso di lavoro per l'analisi delle risposte del calcio nelle cellule T spleniche murine. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Conversione delle lunghezze d'onda PMT in canali APD. Il citometro a flusso a spettro completo ha 16 rivelatori per rilevare le emissioni fluorescenti dopo l'eccitazione da parte del laser UV. Le specifiche di ciascun rilevatore sono indicate nella tabella. Sono evidenziati i due rivelatori utilizzati per la valutazione della fluorescenza Indo-1, come sono stati determinati empiricamente utilizzando controlli a singola colorazione. Le conversioni in lunghezza d'onda APD e il manuale utente per il citometro a flusso spettrale sono disponibili¹¹. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Visualizzazione della firma spettrale Indo-1. (A) In alto: Firma spettrale della fluorescenza dell'Indo-1 nelle cellule T CD8⁺ dopo l'introduzione della ionomicina per provocare un robusto afflusso di calcio. Il picco di Indo-1 (legato al calcio) può essere visualizzato in UV1. In basso: firma spettrale di Indo-1 (privo di calcio) che mostra il picco di fluorescenza in UV7. Questo campione di controllo è stato generato trattando cellule caricate con Indo-1 con EGTA¹² per chelare qualsiasi calcio libero extracellulare. (B) Sovrapposizione combinata di cinque spettri laser della firma Indo-1, che mostra MFI spettrali grezzi a sinistra e gli spettri normalizzati di Indo-1 legati rispetto a Indo-1 libero a destra. La visualizzazione del passaggio da Indo-1 (privo di calcio) in arancione a Indo-1 (legato al calcio) in blu può essere facilmente rilevata. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Strategia di gating per la visualizzazione delle risposte del calcio. Viene delineato il flusso di lavoro per il gating sequenziale degli esempi. (A) La stabilità fluidica viene esaminata utilizzando un tempo rispetto al gate SSC-A. (B) FSC-A contro SSC-A viene utilizzato per il gate sui linfociti, eliminando così i detriti cellulari e i globuli rossi residui nel campione. (C) Le singole celle sono recintate utilizzando un grafico SSC-H rispetto a SSC-A. (D). Il cancello singoletto viene quindi applicato a una trama di Ghost540 morti vivi contro SSC-A; Il gating sulle cellule Ghost540-negative elimina le cellule non vitali dalle analisi successive. (E) Le cellule vive vengono analizzate per CD19 rispetto a SSC-A e le cellule CD19-negative (cellule non B) sono gated. (F) Le cellule CD19-negative vengono esaminate per la colorazione CD4 rispetto a CD8. (G) Le cellule CD4 ⁺ vengono quindi attivate per visualizzare il tempo rispetto all'Indo-1 (legato al calcio). (H) Viene selezionato un momento nel tempo per rappresentare l'inizio della risposta di afflusso di calcio dopo l'aggiunta di anticorpi anti-CD3 visualizzando la fluorescenza Indo-1 (senza calcio) rispetto a Indo-1 (legata al calcio). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Visualizzazione della fluorescenza Indo-1 in popolazioni gate di timociti murini in punti temporali discreti nella risposta del calcio. I timociti totali sono stati stimolati con anticorpi anti-CD3 seguiti da ionomicina dopo 6 minuti dalla raccolta del campione. A quattro punti temporali discreti, come indicato nelle caselle rettangolari delineate sui grafici bidimensionali del tempo rispetto all'Indo-1 (legato al calcio), sono state esaminate diverse sottopopolazioni di timociti per le risposte del calcio. (A) Grafici bidimensionali che mostrano il gating per il segnale Indo-1 di base, la risposta di picco, la risposta post-picco di 5 minuti e la risposta alla ionomicina. Sotto ogni grafico viene mostrata la colorazione CD4 contro CD8 (a sinistra) e il grafico di Indo-1 (privo di calcio) contro Indo-1 (legato al calcio) su timociti CD4 singoli positivi (SP) gated. (B) Grafici di Indo-1 (privo di calcio) rispetto a Indo-1 (legato al calcio) su sottoinsiemi controllati di timociti sono mostrati in ciascuno dei quattro punti temporali, utilizzando la strategia di gating mostrata in (A). (C) Sono stati creati grafici bidimensionali che mostrano la colorazione dei timociti totali con gli anticorpi indicati. Sottogruppi specifici sono stati controllati (riga superiore) ed esaminati per le risposte al calcio rispetto al tempo (in basso). Popolazione CD8+ blu chiaro (SP), popolazione CD4 rossa (SP), che presenta il maggior afflusso di calcio, timociti doppi positivi ^CD4+CD8⁺ arancioni, cellule iNKT verde scuro, CD25+ verde chiaro, cellule T TCRγδ+ viola e cellule B CD19⁺ nere. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Inibizione della risposta del calcio nelle cellule T CD8⁺ trattate con una piccola molecola inibitrice di ITK/RLK. Durante il caricamento del colorante Indo-1, gli splenociti sono stati trattati con due dosi di PRN694, 100 nM (grigio scuro) e 200 nM (grigio chiaro). (A) Il rapporto Indo-1 (legato al calcio/privo di calcio) è mostrato rispetto al tempo per le cellule non trattate (rosso) e le cellule trattate con PRN694. Le curve mostrano la risposta del calcio delle cellule T CD8⁺ gated. La linea nera rappresenta il controllo negativo degli splenociti caricati con Indo-1 e colorati in superficie, ma non stimolati con anticorpi anti-CD3. (B,C) I dati possono essere analizzati dividendo l'asse temporale mostrato in (A) in otto segmenti, visualizzati con linee tratteggiate nere, e calcolando l'area sotto la curva (AUC) (B), o la pendenza di ciascuna curva (pendenza) (C) ad ogni intervallo di tempo della risposta. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussion

Questo protocollo descrive un saggio ottimizzato progettato per misurare le risposte del calcio nelle cellule T murine primarie caricate con colorante indicatore raziometrico Indo-1 titolato utilizzando la citometria a flusso a spettro completo ^7,8. Il vantaggio di eseguire saggi di flusso di calcio utilizzando la citometria a flusso a spettro completo è la capacità di multiplexare la colorazione dei marcatori cellulari superficiali in combinazione con la valutazione della fluorescenza indo-1. La citometria a flusso a spettro completo ha il vantaggio di consentire l'uso di coloranti altamente sovrapposti, aumentando così il numero di marcatori che possono essere utilizzati in un pannello. Ciò è dovuto al fatto che il citometro a flusso a spettro completo raccoglie tutta la luce laser emessa attraverso una serie di rivelatori per ogni campione analizzato, piuttosto che avere un rivelatore dedicato a un fluorocromo. L'utilizzo dell'intero spettro di ciascun fluor consente una maggiore sensibilità del saggio e fornisce un mezzo per identificare fluorocromi spettralmente unici che avrebbero segnali sovrapposti se raccolti su un citometro a flusso passa-banda. Ciò elimina anche la necessità di pre-isolamento di un sottoinsieme di cellule in esame.

In questo studio, un pannello di marcatori di superficie cellulare è stato valutato con anticorpi coniugati con fluorocromo. Questo pannello comprendeva αCD4-APC-Cy7, αCD8-FITC, αCD19-PE, αTCRβ-PerCP-Cy5.5, α-TCRδ-PE-Cy5, αCD25-PE-Cy7 e CD1d-αgal-cer tetramero-APC; inoltre, il pannello includeva il colorante Ghost540 vivo morto. Il canale ottimale per rilevare ciascuno di questi fluorocromi è disponibile nel manuale per l'utente del citometro a flusso a spettro completo¹³. Al contrario, la rilevazione di Indo-1 (privo di calcio) e Indo-1 (legato al calcio) è stata determinata empiricamente, sebbene sia stato stimato un canale di picco approssimativo per il rilevamento di ciascuna firma fluorescente sulla base delle lunghezze d'onda di emissione di picco note per le due forme di Indo-1. È anche possibile convertire le lunghezze d'onda di emissione di picco dalle lunghezze d'onda del filtro passa-banda utilizzate sui citometri a flusso convenzionali e misurate in nm ai rispettivi canali sui rivelatori APD (Avalanche Photo Diode) utilizzati dal citometro a flusso a spettro completo; questo può anche fornire una stima dei canali ottimali per rilevare rispettivamente Indo-1 (privo di calcio) e Indo-1 (calcio legato). Poiché per ogni tag fluorescente sono inclusi singoli controlli colorati, il processo di dismiscelazione deconvoluta le firme fluorescenti, consentendo la visualizzazione dell'intensità di ciascun fluorocromo sulle cellule di ciascun campione. Come descritto in questo metodo, l'analisi dei dati può essere eseguita gating su sottoinsiemi cellulari di interesse e visualizzando il rapporto tra rilevare Indo-1 (privo di calcio) e Indo-1 (calcio legato) rispetto al tempo.

Ci sono limitazioni di questo test. Ad esempio, concentrazioni di Indo-1 inferiori a 3 μM non hanno consentito una corretta visualizzazione della risposta di afflusso di calcio nelle cellule T. Poiché questo test consente anche misurazioni multiplexing della risposta al calcio con l'analisi di marcatori di superficie cellulare multipli su popolazioni eterogenee di cellule utilizzando la citometria a flusso a spettro completo, è imperativo titolare attentamente tutti gli anticorpi marcati con fluorescenza utilizzati, compresi quelli utilizzati per i controlli a singola colorazione. Questo è importante per la corretta implementazione dell'algoritmo di unmixing lineare altamente sensibile¹⁴. Inoltre, non è stato possibile visualizzare un corso temporale completo di afflusso di calcio per sottogruppi cellulari che rappresentano meno dell'1% della popolazione totale analizzata. Invece, una valutazione della risposta del calcio in questi rari sottogruppi ha richiesto una strategia di analisi alternativa utilizzando momenti nel tempo¹⁵. L'analisi dei momenti nel tempo fornisce istantanee dei segnali fluorescenti di Indo-1 (privo di calcio) rispetto a Indo-1 (legato al calcio) in fasi discrete della risposta del calcio, piuttosto che l'intero corso temporale della risposta. Infine, è anche importante riconoscere i limiti dell'utilizzo di marcatori a superficie singola per definire sottoinsiemi di cellule T. Ad esempio, la colorazione dei timociti con l'anticorpo α-CD25 non è sufficiente per distinguere le cellule T regolatorie CD4+ da tutte le altre popolazioni di timociti. Ciò è dovuto al fatto che la maggior parte delle cellule progenitrici dei timociti precoci (CD4-CD8-) esprimono anche CD25¹⁶. È probabile che ciò spieghi l'assenza di una risposta di afflusso di calcio rilevabile nei timociti CD4 + CD25 + gated.

L'ottimizzazione di questo protocollo ha richiesto un'attenta valutazione di diverse variabili che sono state fondamentali per il successo del test. Questi includono l'ottimizzazione del clone specifico dell'anticorpo anti-CD3 utilizzato, la titolazione della concentrazione ottimale di questo anticorpo e la necessità di reticolazione anticorpale utilizzando il tradizionale sistema biotina/streptavidina. Per le cellule T murine, la concentrazione di 30 μg/campione per 6 x 10⁶ cellule in un volume di 500 μL è risultata essere la quantità minima di anticorpi necessaria per risposte ottimali al calcio. È interessante notare che sono state osservate robuste risposte al calcio con il clone anticorpale anti-CD3 17A2, ma non con il clone 145-2C11; inoltre, quando si utilizzava il clone 17A2, l'aggiunta di un reagente di reticolazione secondario non era necessaria¹⁷. I test che utilizzano il clone 17A2 anti-CD3 biotinilato con o senza streptavidina non hanno mostrato alcun miglioramento della risposta del calcio in presenza di reticolazione della streptavidina. È possibile che questo anticorpo includa aggregati e che questi aggregati rappresentino l'efficacia di stimolazione dell'anticorpo in assenza di cross-linking evidente. Tuttavia, poiché questi esperimenti sono stati eseguiti nel corso di molti mesi con diverse fiale di questo anticorpo anti-CD3, i risultati ottenuti sono stati altamente riproducibili; pertanto, la capacità di questo anticorpo di stimolare le cellule T non è probabile che vari tra gli utenti.

Robuste risposte al calcio nelle cellule T primarie richiedono il mantenimento delle cellule alla temperatura biologica di 37 °C durante l'acquisizione del campione; al contrario, le cellule B primarie mostreranno una risposta di calcio agli anticorpi anti-IgM a temperatura ambiente. Sulla base della sensibilità della risposta del calcio delle cellule T alla temperatura, è fondamentale garantire che ogni campione sia trattato allo stesso modo; ad esempio, ogni campione deve essere riscaldato a 37 °C utilizzando lo stesso metodo e per lo stesso periodo di tempo. In assenza di questa coerenza, possono essere osservate variazioni nelle risposte del calcio, ma potrebbero non essere indicative di differenze biologicamente rilevanti tra i campioni.

In sintesi, questo protocollo descrive i dettagli dell'esecuzione di saggi di flusso di calcio basati sulla valutazione della fluorescenza Indo-1 utilizzando la citometria a flusso a spettro completo in combinazione con la colorazione dei marcatori cellulari di superficie multiplex. Il metodo consente ai ricercatori di evitare la necessità di isolamento o ordinamento di specifiche popolazioni cellulari prima dell'etichettatura del colorante di calcio. Inoltre, questo protocollo delinea una metodologia di analisi aggiuntiva utilizzata per visualizzare le risposte del calcio in momenti discreti nel tempo all'interno di sottopopolazioni cellulari distinte. L'analisi dei momenti nel tempo può essere applicata con successo a popolazioni cellulari rare (<1% del totale), che altrimenti non sono rilevabili quando si valuta l'intera curva di risposta del calcio. In futuro, questo test potrebbe essere esteso all'uso di ulteriori anticorpi coniugati con fluorocromo, sfruttando le ampie capacità del citometro a flusso a spettro completo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well TC treated plates	Cell Treat	229111
50 mL conical	Greiner Bio1	41-12-17-03	50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap
5mL polysterene flow tubes	Corning	352052
5mL syringe	BD syringe	309646	plunger only is used sheith is discarded
70uM filter	Greiner bio1	542070
aCD3 (17A2)	Biolegend	100202
AKC lysis Buffer	Gibco	A1049201
Aurora Spectral Flowcytometer	https://cytekbio.com/pages/aurora
Bath Beads	coleparmer	Item # UX-06274-52
CD19 PE	Tonbo	50-0193-U100
CD1d Tetramer APC	NIH
CD25 PECy7	ebioscience	15-0251
CD4 APC Cy7	Tonbo	25-0042-U100
CD8a FITC	ebioscience	11-0081-85
Cell Incubator	Formal Scientific
Dissection Tools forceps	McKesson	#487593	Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth
Dissection Tools Scissors	McKesson	#970135	Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip
DPBS 1x	Gibco	14190-136	DPBS
EGTA	Fisher	NC1280093
FBS	Hyclond	SH30071.03	lot AE29165301
FlowJo Software	https://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dye	ebioscience	65-085-39	Calcium Loading Dye
ionomycin	Millipore	407951-1mg
Live/Dead Ghost 540	Tonbo	13-0879-T100
Microcentrifuge tubes 1.7mL	Light Labs	A-7001
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine	Gibco	10378-016
PRN694	Med Chem Express	Hy-12688
Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)	Tonbo	70-0161-M001	FC Block
RPMI	Gibco	1875093	+ phenol red
RPMI phenol free	Gibco	11835030	-phenol red
Table top centrifuge	Beckman Coulter	Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5	ebioscience	45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5	ebioscience	15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent Pack		Product No: C06019	Includes Tripan
Vi-Cell Blu	Beckman Coulter
Waterbath	Fisher Brand Dry bath