Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تحليل تدفق الكالسيوم الناجم عن مستقبلات الخلايا التائية في الخلايا التائية الأولية عن طريق قياس التدفق الخلوي الكامل الطيف

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64526
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado-Anschutz School of Medicine

Summary

يعد تدفق الكالسيوم ، وهو مقياس لإشارات الخلايا التائية ، طريقة فعالة لتحليل الاستجابات لتحفيز مستقبلات الخلايا التائية. يستفيد هذا البروتوكول لتعدد إرسال Indo-1 مع لوحات من الأجسام المضادة الموجهة إلى جزيئات سطح الخلية من القدرات المرنة للغاية لقياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل.

Abstract

يعد تدفق الكالسيوم استجابة لتحفيز مستقبلات الخلايا التائية مقياسا شائعا لإشارات الخلايا التائية. تم تطوير العديد من أصباغ مؤشر الكالسيوم لتقييم إشارات الكالسيوم عن طريق قياس التدفق الخلوي لتمرير النطاق. تم تصميم هذا البروتوكول لقياس استجابات الكالسيوم في الخلايا التائية الأولية باستخدام قياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل. يتم تمييز الخلايا الطحالية الكلية بصبغة مؤشر الكالسيوم النسبي Indo-1 ، جنبا إلى جنب مع لوحة من الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروكروم لجزيئات سطح الخلية. توفر الاستفادة من قدرات قياس التدفق الخلوي كامل الطيف منصة لاستخدام مجموعة واسعة من بقع سطح الخلية بالاشتراك مع Indo-1. ثم يتم تحليل الخلايا في الوقت الفعلي عند 37 درجة مئوية قبل وبعد إضافة جسم مضاد ل CD3 لتحفيز مستقبلات الخلايا التائية. بعد فك خلط الإشارات الطيفية ، يتم حساب نسبة Indo-1 المرتبط بالكالسيوم إلى Indo-1 الخالي من الكالسيوم ويمكن تصوره بمرور الوقت لكل مجموعة مسورة من الخلايا الطحالية. يمكن أن تسمح هذه التقنية بالتحليل المتزامن لاستجابات الكالسيوم في مجموعات خلايا متعددة.

Introduction

يعد تدفق الكالسيوم الناجم عن مستقبلات الخلايا التائية (TCR) مقياسا مفيدا لتنشيط الخلايا التائية وكثيرا ما يستخدم لتحديد ما إذا كانت مجموعة الخلايا التائية قد ضعفت الاستجابات في الخطوات القريبة من مسار إشارات TCR1. يتم إجراء قياسات تدفق الكالسيوم بشكل عام عن طريق وضع العلامات المسبقة على الخلايا التائية بواحد أو زوج من أصباغ مؤشر الكالسيوم الفلورية ، ثم فحص إشارات الفلورسنت باستخدام قياس التدفق الخلوي في الوقت الفعلي بعد ربط TCRالمتقاطع 2،3،4. يتم إثارة Indo-1 ، صبغة الكالسيوم المترية النسبة ، بواسطة ليزر الأشعة فوق البنفسجية مع انبعاثات الذروة عند طولين موجيين مختلفين يعتمدان على ارتباط الكالسيوم5 ، وهو صبغة مؤشر شائعة الاستخدام لتحليل قياس التدفق الخلوي لاستجابات الكالسيوم في الخلايا الليمفاوية الحية. نظرا لأن ملف تعريف انبعاث Indo-1 واسع جدا ، فقد يكون من الصعب الجمع بين تقييم Indo-1 والتحليل المتزامن لعلامات سطح الخلية المتعددة عن طريق قياس التدفق الخلوي لتمرير النطاق. يقيد هذا القيد استخدام تحليل التدفق الخلوي لاستجابات الكالسيوم لمجموعات الخلايا التائية المنقاة مسبقا أو المجموعات التي تحددها مجموعة محدودة من جزيئات سطح الخلية.

لمعالجة قيود قياس استجابات الكالسيوم على المجموعات غير المتجانسة من الخلايا الليمفاوية الأولية باستخدام قياس التدفق الخلوي بتمرير النطاق ، تم تطوير بروتوكول لقياس مضان Indo-1 باستخدام قياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل. تسمح هذه الطريقة بتعدد إرسال Indo-1 بألواح من الأجسام المضادة الموجهة إلى جزيئات سطح الخلية ، مع الاستفادة من القدرات المرنة للغاية لقياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل. تتمثل ميزة استخدام قياس التدفق الخلوي الكامل الطيف على قياس التدفق الخلوي التقليدي في قدرته على تمييز إشارات الفلورسنت عن الأصباغ شديدة التداخل ، وبالتالي زيادة عدد العلامات السطحية التي يمكن تقييمها في وقت واحد في كل عينة. يستخدم قياس التدفق الخلوي التقليدي مرشحات تمرير النطاق ويقتصر على فلوروكروم واحد لكل نظام كاشف6. يجمع قياس التدفق الخلوي كامل الطيف الإشارات عبر الطيف الكامل للفلوروكروم باستخدام 64 كاشفا على نظام قياس التدفق الخلوي بخمسة ليزر 7,8. بالإضافة إلى ذلك ، يستفيد قياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل من كاشفات APD (Avalanche Photo Diode) التي زادت من الحساسية بالنسبة لكاشفات أنبوب المضاعف الضوئي الموجودة في مقاييس التدفق الخلويالتقليدية 8. وبالتالي ، فإن هذا النهج مثالي لمجموعات الخلايا غير المتجانسة ، مثل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية أو معلقات خلايا الأعضاء اللمفاوية الثانوية للفئران ، لأنه يلغي الحاجة إلى عزل مجموعات معينة من الخلايا التائية قبل وضع علامات صبغة الكالسيوم. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام ملفات تعريف تعبير علامات سطح الخلية وبوابات قياس التدفق الخلوي بعد جمع البيانات لتقييم استجابات الكالسيوم في كل مجموعة من السكان موضع الاهتمام. كما هو موضح في هذا التقرير ، يمكن بسهولة دمج Indo-1 مع ثمانية أجسام مضادة مقترنة بالفلوروكروم ، مما ينتج عنه ما مجموعه 10 توقيعات طيفية فريدة. علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق هذه الطريقة بسهولة على مخاليط الخلايا من خطوط الفئران المتميزة وراثيا ، مما يسمح بالتحليل المتزامن لاستجابات الكالسيوم في الخلايا التائية من النوع البري مقارنة بتلك الموجودة في خط الفئران المستهدف بالجينات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحفاظ على الفئران في حرم جامعة كولورادو أنشوتز الطبي وفقا لبروتوكولات IACUC. تم القتل الرحيم لجميع الفئران وفقا لمعايير AAALAC.

1. تحضير الخلايا المناعية من طحال الفأر

ملاحظة: القتل الرحيم للفئران الساذجة بالقتل الرحيمCO 2 . يتم استخدام الفئران C57BL / 6 التي تم شراؤها من مختبرات جاكسون وتربيتها في المنزل للتجارب في عمر 6-12 أسبوعا. يتم استخدام كل من الفئران الذكور والإناث للتجارب.

  1. تطهير جلد الفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول من أجل تقليل احتمالية دخول الملوثات الخارجية إلى العينة.
  2. تشريح طحال الفأر باستخدام أدوات التشريح والمقص الجراحي والملقط. احصد الطحال وضع الطحال المنفصل في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع ~ 5 مل من وسائط RPMI الكاملة (cRPMI) على الجليد.
    ملاحظة: يتكون RPMI الكامل من 10٪ FBS و 2 mM L-glutamine و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
    1. لحصاد طحال الفأر ، قم بعمل شق 5 سم في الفراء والجلد على طول الجانب الأيسر من الفأر في منتصف الطريق بين الساقين الأمامية والخلفية بالمقص. افتح تجويف الجسم ~ 5 سم وأزل الطحال باستخدام الملقط. الطحال هو لون حبة الكلى وهو أطول وأكثر تملقا من الكلى المجاورة.
  3. صب محتويات الخطوة 1.2 على مرشح معقم 70 ميكرومتر متصل بأنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. افصل الطحال ميكانيكيا إلى معلق خلية واحدة عن طريق دفع الطحال عبر المرشح باستخدام مكبس حقنة سعة 5 مل حتى لا يبقى لب الطحال على سطح المرشح.
  4. قم بحبيبات الخلايا الطحالية باستخدام جهاز طرد مركزي دوار متأرجح عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. صب بعناية طاف. تبقى الخلايا الطحالية الحبيبية في قاع الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.
  6. لإزالة خلايا الدم الحمراء ، أعد تعليق الخلايا الطحالية الحبيبية في 1 مل من محلول تحلل ACK لمدة 3 دقائق وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تخلط جيدا.
  7. قم بإخماد المخزن المؤقت لتحلل ACK ب 15 مل من cRPMI.
  8. بيليه الخلايا الليمفاوية كما هو موضح في الخطوة 1.4.
  9. أعد تعليق الخلية في 5 مل من cRPMI في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. ضع العينات على الثلج.
    1. لحساب عدد الخلايا ، انقل 10 ميكرولتر من معلق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.6 مل وقم بتخفيفه بنسبة 1: 1 باستخدام محلول Trypan الأزرق. ثم ، نقل إلى مقياس الدم أو نظام عد الخلايا الآلي.
  10. بعد العد ، اعتمادا على تركيز الخلية في تعليق الخلية كما في الخطوة 1.9 ، قم بتجميع الخلايا في جهاز طرد مركزي منضدية عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق للتحضير لإضافة وسائط cRMPI تحتوي على صبغة إستر Indo-1 AM.
  11. احسب حجم إعادة تعليق الخلايا لتحقيق 10-12 × 106 خلايا / مل. هذا هو تركيز 2x من إجمالي عدد الخلايا المطلوبة.
  12. أعد تعليق الخلايا في حجم cRPMI المحسوب في الخطوة 1.11. ضع الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 إما في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع تنفيس الغطاء أو لوحة زراعة الأنسجة.

2. صبغة Indo-1 النسبية ووسم الأجسام المضادة الفلورية

  1. وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، أضف 50 ميكرولتر من DMSO في قنينة تحتوي على 50 ميكروغرام من Indo-1 AM. تركيز محلول المخزون هو 1 ميكروغرام / ميكرولتر.
    ملاحظة: يتم توفير DMSO في قوارير صغيرة مع المجموعة لمنع أي أكسدة DMSO.
  2. قم بتخفيف حصصة المخزون (1 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى الحجم التجريبي المناسب (المحدد في 1.11) من cRPMI بتركيز 6 ميكروغرام / مل ، بتركيز 2x. لا تقم بتخزين Indo-1 في محلول مائي.
    ملاحظة: يمكن استخدام مخازن أخرى مع الكالسيوم المضاف حسب احتياجات الخلية.
  3. ضع الوسائط الكاملة مع Indo-1 جانبا في حمام مائي على درجة حرارة 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: استخدم الحد الأدنى من تركيز إستر Indo-1 AM اللازم للحصول على إشارة كافية. يجب معايرة هذا لأنواع الخلايا المختلفة. عادة ما يكون التركيز بين 3-5 ميكرومتر كافيا. بالنسبة للخلايا التائية الأولية ، فإن تحميل الخلايا مع Indo-1 بتركيز >5 ميكروغرام / مل يزيد من متوسط كثافة الفلورسنت (MFI) فوق سجل 6 على مقاييس التدفق الخلوي الطيفي. في حالة حدوث ذلك ، قم بتقليل شدة ليزر الأشعة فوق البنفسجية وقم بمعايرة Indo-1 إلى تركيز أقل.
  4. قم بتخفيف تعليق الخلية المعد مسبقا (في الخطوة 1.12) ، 1: 1 في cRPMI ، بما في ذلك وسائط Indo-1 2x المصنوعة في الخطوة 2.2. تأكد من أن الخلايا بتركيز يتراوح بين 5-6 × 106 / مل.
    ملاحظة: لا تقم بصبغ الحمل غير الملوث للتحكم في البقع المفردة أو عناصر التحكم في خلية بقعة واحدة لعلامة السطح باستخدام Indo-1. ستؤدي إضافة Indo-1 إلى عناصر التحكم في الأجسام المضادة أحادية الصبغة إلى إنشاء عينة متعددة الألوان بسبب إضافة Indo-1 إلى الخلايا الملطخة المفردة. تضمين indo-1 (خالي من الكالسيوم) EGTA إضافة تحكم إلى لوحة العينة التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.6.
  5. أضف 1 مل من الخلايا / البئر / الحالة التجريبية إلى لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئرا.
  6. قم بإنشاء عنصر تحكم ملطخ واحد لعينة Indo-1 (الخالية من الكالسيوم) باستخدام خلايا Indo-1 المحملة مسبقا بالصبغة وإضافة EGTA إلى تركيز نهائي يبلغ 2 mM. سيقوم EGTA بتخليب الكالسيوم في تعليق الخلية ، مما يعطي عينة تحكم أنظف.
    1. قم بإنشاء عنصر تحكم إيجابي Indo-1 (مرتبط بالكالسيوم Indo-1) عن طريق إضافة 50 ميكرومتر من الأيونوميسين إلى تعليق الخلية المحمل بالصبغة عند مقياس التدفق الخلوي. الأيونوميسين هو أيونوفور الكالسيوم المنفذ للغشاء الذي يربط أيونات الكالسيوم ويسهل نقل أيونات الكالسيوم إلى الخلايا.
  7. قم بإنشاء بئر للتحكم السلبي البيولوجي بدون فلوروفورات أو صبغة Indo-1.
  8. قم بإنشاء بئر للتحكم في البقع المفردة لأي مجموعات خلايا إضافية ذات أهمية (الأجسام المضادة المحددة من قبل المستخدم) باستخدام الفلوروفورات المترافقة للأجسام المضادة في تصميم لوحة قياس التدفق الخلوي. لن تشمل هذه صبغة Indo-1 النسبية.
  9. أضف الجسم المضاد الذي يحجب مستقبلات Fc (~ 2 ميكروغرام / 1 × 106 خلايا) ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، قبل إضافة أجسام مضادة إضافية مقترنة بالفلوروكروم لتلطيخ السطح.
  10. احتضان الطبق لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  11. أعد تعليق الخلايا في لوحة ذات 12 بئرا عن طريق النقر برفق على اللوحة كل 15 دقيقة.
  12. قم بخلط وإزالة الحجم الكامل للخلايا المعلقة في الوسائط من لوحة 12 بئرا. ثم أضف تعليق الخلية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.7 مل.
  13. بيليه الخلايا في جهاز طرد مركزي دقيق عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. صب المادة الطافية واغسل الخلايا بإضافة 1 مل من cRPMI المسخن مسبقا. بيليه مرة أخرى وصب طاف.
    ملاحظة: غسل الخلايا يزيل أي أجسام مضادة متبقية تمنع FC.
  14. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من cRPMI في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.7 مل واحتضان كل أنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إضافية عند 5٪ CO2 ، مع ترك الجزء العلوي من الأنبوب مفتوحا قليلا للسماح بتبادل الغازات. هذا يسمح بإزالة الأسترة الكاملة من استرات AM داخل الخلايا.
  15. انقل الخلايا مرة أخرى إلى لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئرا ، إذا لزم الأمر. يمكن إضافة أجسام مضادة فلوروكرومية مترافقة معايرة إضافية يحددها المستخدم في مرحلة الراحة.
    ملاحظة: تتضمن العلامات المستخدمة في لوحة الأساليب: Ghost 540 و CD4 و CD8 و TCRβ و TCRγδ و CD25 و CD1d / α-galcer tetramer. يتم اختيار العلامات لتحليل المجموعات الفرعية للخلايا التائية.
    1. قم بإنشاء مزيج رئيسي من جميع الأجسام المضادة المقترنة بالفلوروكروم المعرفة من قبل المستخدم وفقا لأنواع الخلايا ذات الأهمية بحجم معاير مسبقا في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مل.
    2. أضف مزيجا رئيسيا محسوبا ل 1 مل من حجم الخلية ، يعتمد على الأجسام المضادة المعايرة للخلايا المستريحة.
      ملاحظة: ميزة التلوين في الخطوة 2.15 بدلا من الخطوة اللاحقة 2.18 هي أن التلوين في الخطوة 2.15 سيقلل من وقت الحضانة الإجمالي للتجربة. ومع ذلك ، فإن التلوين بحجم إجمالي قدره 1 مل في الخطوة 2.15 يزيد من استخدام الأجسام المضادة.
  16. بعد الراحة ، قم بتجميع الخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يمكن تكوير الخلايا الموجودة في لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئرا في اللوحة باستخدام ملحق جهاز طرد مركزي للوحة. خلاف ذلك ، بيليه الخلايا في أنبوب طرد مركزي صغير 1.7 مل.
  17. اغسل الخلايا عن طريق تعليق الحبيبات في 1 مل من 4 درجات مئوية cRPMI بارد وحبيبات الخلايا مرة أخرى كما في الخطوة 2.16. ضع الخلايا على الجليد.
    ملاحظة: إذا كانت خلايا تلطيخ السطح منفصلة ، بعد إزالة الأسترة في الخطوة 2.18 ، هناك حاجة إلى حجم أقل من الأجسام المضادة. يمكن إجراء تلطيخ السطح في هذه الخطوة بعد مرحلة الراحة في محلول التدفق البارد (1x DPBS مع إضافة 1٪ FBS) ، باستخدام الأجسام المضادة المعرفة من قبل المستخدم ، على الجليد لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا بعد البقعة في cRPMI كما في الخطوة 2.17.
    1. أضف بقعة الجدوى Ghost540 المخففة 1: 7,500 في DPBS إلى العينات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تقتل الحرارة الخلايا عند 55 درجة مئوية على كتلة تدفئة للتحكم في الأحياء / الموتى الملطخين.
      ملاحظة: يتم إجراء تلطيخ الصبغة الوظيفية للقضاء على الخلايا الميتة في تحليل قياس التدفق الخلوي بدون FBS. يمكن ل FBS التفاعل مع أصباغ الأمين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  18. أعد تعليق العينات الفردية في 500 ميكرولتر من cRPMI (خال من الفينول الأحمر) باستخدام أنبوب تدفق البوليسترين سعة 5 مل مع غطاء.
    ملاحظة: يمكن ترك الخلايا عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى ساعة.
  19. قم بتسخين كل أنبوب سعة 5 مل يحتوي على خلايا ، بشكل فردي ، إلى 37 درجة مئوية باستخدام حمام خرز لمدة 7 دقائق قبل التحليل على مقياس التدفق الخلوي مع الحفاظ على اتساق الوقت بين العينات. استخدم مؤقتا.

3. أنبوب حمام الخرزة: الحفاظ على درجة الحرارة أثناء تحليل تدفق الكالسيوم

  1. أضف حبات الحمام إلى حمام مائي صغير ، بدون إضافة ماء ؛ الاحماء حتى 37 درجة مئوية.
  2. قطع بعناية أنبوب مخروطي 50 مل إلى النصف ، عند علامة 25 مل ، بشفرة حلاقة ؛ تخلص من الجزء العلوي من الأنبوب.
  3. املأ الأنبوب النصفي 3/4 من الطريق بخرز الحمام.
  4. ضع الأنبوب الذي تم إنشاؤه في الخطوة 3.2 في حمام الخرزة الذي تم إنشاؤه في الخطوة 3.1. أحضر الأنبوب والخرز إلى 37 درجة مئوية.
  5. قم بتوصيل حمام الخرزة بمأخذ كهربائي بجوار مقياس التدفق الخلوي من أجل الحفاظ على درجة الحرارة استعدادا لتحليل العينة.
  6. أضف رف الستايروفوم المخروطي سعة 50 مل لتثبيت أنبوب واحد لوضع الأنبوب في مكانه أثناء تشغيله على مقياس التدفق الخلوي. سيؤدي ذلك إلى التخلص من الحاجة إلى تثبيت الأنبوب يدويا طوال مدة تحليل المنحنى.

4. اكتساب تدفق الكالسيوم باستخدام تحليل التدفق الخلوي

  1. قم بتسجيل الدخول إلى برنامج مقياس التدفق الخلوي على محلل التدفق.
  2. انقر فوق علامة التبويب المكتبة لإضافة علامات الفلورسنت Indo-1 (المرتبطة بالكالسيوم) و Indo-1 (الخالية من الكالسيوم). حدد علامات الفلورسنت في قائمة البرامج على اليسار. حدد ليزر الأشعة فوق البنفسجية ضمن مجموعات علامات الفلورسنت وانقر فوق + إضافة لإضافة اسم علامة فلورسنت (Indo-1 (مرتبط بالكالسيوم) / Indo-1 (خال من الكالسيوم)) إلى المكتبة. اختر الطول الموجي لإثارة الليزر والطول الموجي للانبعاث ، ثم انقر فوق حفظ. تابع إلى الإعداد التجريبي.
    ملاحظة: يتم إثارة Indo-1 بواسطة ليزر الأشعة فوق البنفسجية بطول موجي 355 نانومتر. الطول الموجي للانبعاث من Indo-1 (مرتبط بالكالسيوم) هو 372 نانومتر. الطول الموجي للانبعاث من Indo-1 (خال من الكالسيوم) هو 514 نانومتر.
  3. انقر فوق علامة التبويب الاستحواذ. افتح / أنشئ تجربة جديدة وأضف علامات الفلورسنت المطلوبة إلى التجربة.
  4. إنشاء مجموعة مرجعية ومجموعة / مجموعات عينات جديدة للتجربة. قم بتسمية كل من العينات والمجموعات المرجعية حسب الضرورة.
  5. ضمن علامة التبويب عمليات الاستحواذ ، قم بتعيين الأحداث المراد تسجيلها إلى الحد الأقصى: 10,000,000.
  6. اضبط مستوى صوت الإيقاف على الحد الأقصى لمستوى الصوت: 3000 ميكرولتر.
  7. اضبط وقت التوقف على أقصى وقت: 36000 ثانية.
  8. احصل على عناصر تحكم مفردة ملونة للأجسام المضادة المترافقة المحددة المضمنة في اللوحة متعددة الألوان.
  9. احصل على عناصر تحكم مفردة ملطخة للصبغة الوظيفية Indo-1.
    1. أضف 50 ميكرومتر من الأيونوميسين إلى التحكم الإيجابي Indo-1 المرتبط بالكالسيوم. دوامة لخلط. أضف أنبوب التدفق إلى منفذ حقن العينة وانقر فوق تسجيل.
    2. أضف التحكم السلبي Indo-1 الخالي من الكالسيوم إلى مقياس التدفق الخلوي وانقر فوق تسجيل. تمت إضافة EGTA في الخطوة 2.6.
    3. قم بإلغاء خلط عناصر التحكم الملطخة الفردية بالنقر فوق الزر Unmix .
      ملاحظة: يجب تسجيل جميع عناصر التحكم الملطخة الفردية من جميع الأجسام المضادة المترافقة والأصباغ الوظيفية قبل فك خلط العينات. لكي يعمل زر Unmix ، يجب تسجيل جميع عناصر التحكم المرجعية أولا. يمكن إجراء فك الخلط قبل أو بعد جمع العينات.
  10. بمجرد اكتمال إلغاء الخلط ، قم بإنشاء مخططات متسلسلة باستخدام ورقة العمل غير المختلطة. SSC-A مقابل FSC-A لإزالة الحطام من العينة ، SSC-A مقابل SSC-H لإزالة المزدوجات. ويتبع ذلك بوابة تنظيف قابلة للتطبيق إلى جانب المزيد من البوابات على السكان المعنيين. لإنشاء بوابات ، انقر فوق مؤامرة. أضف قطعة أرض إلى ورقة العمل ، وانقر نقرا مزدوجا داخل البوابة لإنشاء مجموعة سكانية مسورة في اتجاه مجرى النهر. استمر حتى يتم حساب جميع السكان المعنيين.
  11. عينات التحكم المفردة الدافئة (من الخطوات 2.6-2.9 في قسم الصبغة النسبية الهندية -1 ووسم الأجسام المضادة الفلورية) إلى 37 درجة مئوية للتحليل المتسلسل. قم بإعداد برنامج قياس التدفق الخلوي.
  12. قم بتشغيل ماء DI على مقياس الخلايا لمدة 2-3 دقائق لضمان الاستقرار السائل لمقياس التدفق الخلوي.
  13. قم بإعداد مخططات متسلسلة على ورقة العمل غير المختلطة عن طريق إنشاء بوابات باستخدام أزرار البوابة المضلع أو المستطيل أو القطع الناقص. بوابة لتشمل السكان محل الاهتمام (أي الخلايا الليمفاوية باستخدام SSC-A مقابل FSC-A [تمييز الحجم / الخلايا الليمفاوية]). تظهر المجموعات السكانية السلبية متجمعة حول الصفر بينما يمكن تصور السكان الإيجابيين عن طريق زيادة MFI. سيتم تعريف السكان محل الاهتمام من قبل المستخدم بناء على السؤال البيولوجي.
  14. انقر نقرا مزدوجا داخل البوابة التي تم إنشاؤها وقم بتغيير معلمات المحور Y والمحور X إلى SSC-A مقابل SSC-H (التمييز الفردي). أكمل تحديد معلمات المحور عن طريق النقر بزر الماوس الأيسر على الكلمات الموجودة على المحور.
  15. قم بإنشاء مخطط باستخدام إشارة صبغة SSC-A مقابل الجدوى (معلمات بوابة الصلاحية). بوابة على الخلايا الحية ، والتي هي سلبية لتلطيخ صبغة أمين. الخلايا الحية ، السلبية للتلطيخ الميت الحي ، سوف تتجمع عند علامة 0 على كل من المحورين Y و X.
  16. انقر نقرا مزدوجا فوق المؤامرة الداخلية لإنشاء مؤامرة جديدة تحتوي على خلايا ليمفاوية حية أحادية الخلية فقط. قم بتغيير المحور Y إلى Indo-1 (الكالسيوم المقيد) (V1) و / أو Indo-1 (الكالسيوم الحر) (V7) مقابل الوقت على المحور X لتصور تدفق الكالسيوم.
  17. ضع العينة البيولوجية الدافئة على الجهاز SIT وقم بتشغيل العينات في 2,500-3,000 حدث / ثانية على الوسط للسماح بتصور تدفق الكالسيوم في مجموعات محدودة من الخلايا (على سبيل المثال ، iNKT).
    ملاحظة: من خلال تعليق الخلايا بتركيز 1 × 106 / مل ، يجب أن تساوي أحداث الخلية التي تم جمعها بمعدل تدفق متوسط 2500-3000 حدث / ثانية. قم بخفض معدل التدفق تحت التحكم في الاستحواذ بالنقر فوق القائمة المنسدلة أو قم بتخفيف العينة إذا كان تعليق الخلية يحتوي على تركيز متزايد. يمكن أن يؤدي تشغيل العينات بمعدل تدفق مرتفع إلى زيادة انتشار الإشارة من فلوروفور إلى فلوروفورات أخرى في اللوحة.
  18. أضف الأنبوب التالي إلى حمام الخرزة للتدفئة إلى 37 درجة مئوية.
  19. في التحكم في الاستحواذ ، اضغط على Record لتسجيل البيانات الأولية لمدة 30 ثانية للحصول على مستوى أساسي من إشارات الكالسيوم في العينة.
  20. في التحكم في الاستحواذ ، انقر فوق إيقاف وإزالة الأنبوب من منفذ حقن العينة (SIP).
  21. أضف 30 ميكروغرام من مضاد CD3 غير المقترن مباشرة إلى أنبوب العينة لبدء تدفق الكالسيوم. التركيز النهائي لكل أنبوب هو 60 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: لا توجد خطوة غسيل بعد إضافة مضاد CD3.
  22. ضع الأنبوب مرة أخرى على SIP للجهاز في أسرع وقت ممكن واضغط على Record (تسجيل ) في البرنامج.
  23. سجل البيانات لمدة 7 دقائق ، ومشاهدة الوقت المنقضي بموجب ضوابط الاستحواذ في البرنامج ، لمراقبة المسار الزمني لتدفق الكالسيوم داخل مجموعات العينة.
  24. بعد 7 دقائق ، اضغط على إيقاف في البرنامج وأضف 1 ميكروغرام / مل من الأيونوميسين. سجل لمدة 30 ثانية للحصول على أقصى إشارة الكالسيوم في الخلايا ذات الاهتمام. للحد من ترحيل الأيونوميسين إلى العينة التالية ، أكمل عمليتي شطف الحشرة العقيمة على الجهاز بين العينات.
  25. تابع إلى العينة التالية وكرر سير العمل حتى يتم جمع كافة العينات.
  26. احفظ التجربة وانقر على تصدير ملف مضغوط. يتم تحميل الملفات غير المختلطة (.fsc) إلى برنامج تحليل التدفق الخلوي الخارجي.

5. تحليل منحنى الكالسيوم

  1. باستخدام برنامج تحليل6 لقياس التدفق الخلوي ، قم بتحويل إشارات الفلورسنت Indo-1 إلى نسبة لقياسات الكالسيوم ذات الفاصل الزمني. اشتق المعلمات ضمن علامة تبويب الأدوات عن طريق إدراج مراجع Indo-1 (مرتبط بالكالسيوم) / Indo-1 (الكالسيوم الحر) باستخدام مقياس خطي. اضبط الحد الأدنى على الصفر والحد الأقصى وفقا لنسبة تدفق الكالسيوم ، عادة حوالي 10. تختلف النسبة القصوى حسب نوع الخلية و MFI للهند -1.
  2. قم بتمييز المعلمة المحددة. ضمن الأدوات ، أضف التحليل الحركي لاختيار المعلمة بالنقر فوق علامة التبويب الحركية . اضبط المحور ص على الاشتقاق.
  3. حدد MFI (متوسط شدة الفلورسنت) ضمن علامة التبويب الحركية.
  4. أضف التنعيم الغاوسي ، إذا رغبت في ذلك. لإضافة تجانس Gaussian ، حدد الخيار في قائمة الإحصائيات المنسدلة في برنامج تحليل التدفق. يمكن إضافة تجانس غاوسي لتنعيم تصور منحنى تدفق الكالسيوم للتحليل.
  5. إنشاء نطاقات متعددة للإحصاءات على طول الدورة الزمنية لتدفق الكالسيوم للمقارنات البيولوجية داخل العينات.
  6. اسحب العينات إلى محرر التخطيط وأضف الإحصائيات حسب الرغبة. يختلف التحليل الإحصائي حسب السؤال البيولوجي. لأغراض النشر ، يتم تحليل النسخ المتماثلة المتعددة باستخدام t-test أو ANOVA.
  7. للحظة من تحليل الوقت ، اضبط البوابة على لحظة زمنية محددة على طول تدفق الكالسيوم. فحص علامات السطح المطلوبة والبوابة على السكان المعنيين ؛ بعد ذلك ، قم بتقييم مخطط نقطي ثنائي الأبعاد ل Indo-1 (خال من الكالسيوم) مقابل Indo-1 (مرتبط بالكالسيوم) للخلايا المسورة خلال تلك اللحظة في المنطقة الزمنية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوضح الشكل 1 سير العمل التجريبي لتقييم استجابات الكالسيوم في الخلايا التائية الأولية باستخدام صبغة Indo-1 ذات البقع السطحية المتعددة. بعد حصاد ومعالجة خلايا الطحال الفأرية في تعليق خلية واحدة ، يتم تلطيخ الخلايا بإستر Indo-1 AM والسطح ملطخ بالأجسام المضادة المرتبطة بالفلوروكروم. بمجرد اكتمال تحميل الصبغة وتلطيخ الأجسام المضادة ، يتم تسخين عينات الخلايا الليمفاوية إلى درجة حرارة بيولوجية (37 درجة مئوية). ثم يتم تحليل العينات باستخدام قياس التدفق الخلوي الكامل الطيف لمضان Indo-1 بعد بوابات على أنواع الخلايا الفردية المطلوبة ، دون الحاجة إلى فرز العينات قبل التحليل. من أجل استخدام كاشفات Avalanche Photo Diode (APD) داخل مقياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل ، من الضروري تحويل الطول الموجي لذروة الانبعاث من الطول الموجي لمرشح تمرير النطاق المقاس بالنانومتر إلى قناته الخاصة على APD. يوفر الجدول الموضح في الشكل 2 إرشادات ، ولكن يجب تحديد الكاشفات المثلى لتوقيعي التألق في Indo-1 (المرتبط بالكالسيوم مقابل الكالسيوم الخالي من الكالسيوم) تجريبيا. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير عينات Indo-1 مصبوغة واحدة باستخدام Ionomycin لتوليد إشارة Indo-1 (المرتبطة بالكالسيوم) ، و EGTA ، وهو عامل مخلب للكالسيوم ، لتوليد إشارة Indo-1 (الخالية من الكالسيوم). بعد التحليل باستخدام القياس الخلوي لتدفق الطيف الكامل ، يمكن تصور القناة التي تعرض ذروة شدة التألق لكل توقيع Indo-1 (الشكل 3A). من خلال تطبيع مؤشر MFI للسكان الإيجابيين إلى السكان السلبيين ، يمكن تحديد التحول في مضان Indo-1 من خال من الكالسيوم إلى مرتبط بالكالسيوم (الشكل 3 ب). يتم إنشاء هذا العرض في مصنف (.xls) باستخدام عناصر التحكم المرجعية لكل من Indo-1 المرتبط والحر ، ورسم بوابة فاصل سالبة وموجبة مع بوابات موجبة وسالبة واضحة لتطبيع MFI كما هو موضح في (الشكل 3A). يمكن أيضا الحصول على عينة من إحصائيات مؤسسة التمويل الأصغر عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على جدول الإحصائيات. في البرنامج ، حدد نسبة MFI بقسمة السكان الموجب على السكان السالبين وتراكب الطيفين على شاشة واحدة (الشكل 3B ، يمين). يظهر السهم المنقط الأصفر الاختلافات الطيفية الطبيعية بين التوقيعات الطيفية لكل من Indo-1 المرتبط والحر.

لتقييم استجابات الكالسيوم بعد تحفيز مستقبلات الخلايا التائية ، يتم تقييم مضان Indo-1 بعد بوابة على مجموعات الخلايا ذات الأهمية ، كما هو موضح في الشكل 4. أولا ، يتم فحص مخطط زمني مقابل تشتت جانبي (SSC-A) لتقييم استقرار السوائل. تشير الإشارة المتسقة المستقرة عبر محور الوقت إلى الاستقرار (الشكل 4 أ). بعد ذلك ، يتم تصور التشتت الأمامي مقابل الجانبي (FSC-A مقابل SSC-A) ، ويتم إغلاق مجموعة الخلايا الليمفاوية كما هو موضح في (الشكل 4B). بعد بوابة الخلايا الليمفاوية ، يتم تطبيق بوابة تمييز خلية واحدة عن طريق إنشاء مخطط لارتفاع التشتت الجانبي مقابل المساحة (SSC-H مقابل SSC-A) ، ويتم إغلاق المفردات ، التي تقع على القطر ، كما هو موضح في الشكل 4C. ثم يتم تقييم المفردات للتأكد من صلاحيتها ، من خلال فحص التلوين بصبغة الصلاحية والبوابات على السكان السالبين (الشكل 4 د). أخيرا ، لتحليل الخلايا التائية ، يتم تطبيق بوابة تفريغ الخلايا البائية / بوابة التحكم السلبية الداخلية عن طريق البوابات على السكان السالبين CD19 (الشكل 4E). ثم يتم تقييم السكان السلبيين CD19 للمجموعات الفرعية للخلايا التائية باستخدام الأجسام المضادة ل CD4 و CD8 (الشكل 4F) ؛ يفحص المثال الموضح الخلايا التائية CD4 + لاستجابات الكالسيوم من خلال تصور مضان Indo-1 (المرتبط بالكالسيوم) مقابل الوقت (الشكل 4G). بعد البوابات على جزء زمني ، يمكن أيضا إنشاء مخطط Indo-1 (خال من الكالسيوم) مقابل Indo-1 (مرتبط بالكالسيوم) (الشكل 4H). سيتم استخدام هذا التحليل لاحقا لاشتقاق نسبة Indo-1 (انظر طرق تحليل منحنى تدفق الكالسيوم في برنامج تحليل التدفق الخلوي).

في هذه المرحلة من التحليل ، قد يكون من المفيد تحليل اللحظات الزمنية ضمن المخطط ثنائي الأبعاد ل Indo-1 (المرتبط بالكالسيوم) مقابل الوقت في مجموعات الخلايا الفردية ذات الأهمية. تشمل النقاط الزمنية المثلى خط الأساس للكالسيوم المرتبط ب Indo-1 قبل تحفيز TCR ، واستجابة الذروة ، ونقطة زمنية بعد عدة دقائق من استجابة الذروة مع انخفاض مستويات الكالسيوم داخل الخلايا ، وأخيرا استجابة الكالسيوم المستنبطة بإضافة الأيونوميسين (الشكل 5 أ). في عينة خط الأساس قبل إضافة الأجسام المضادة ل CD3 ، تم الكشف عن إشارة Indo-1 ضعيفة (مرتبطة بالكالسيوم). خلال استجابة الذروة ، تظهر الخلايا إشارة Indo-1 قوية (مرتبطة بالكالسيوم) وانخفاض مضان Indo-1 (خال من الكالسيوم). في 5 دقائق بعد الذروة ، عاد مضان Indo-1 تقريبا إلى خط الأساس. بعد إضافة الأيونوميسين إلى العينة ، يمكن تصور إشارة قوية من Indo-1 (مرتبطة بالكالسيوم) ، مما يضمن تحميل صبغة كافية للخلايا. يمكن أن تكون مجموعات الخلايا النادرة (<1٪) صعبة التحليل المشتق. للتغلب على هذا القيد ، يمكن إجراء تحليل للمجموعات النادرة عن طريق رسم Indo-1 (مرتبط بالكالسيوم) مقابل Indo-1 (خال من الكالسيوم) بعد البوابات على كل مجموعة من السكان موضع الاهتمام ، مثل خلايا CD4 + وخلايا TCRb + وخلايا TCRyg + وخلايا CD25 + وخلايا iNKT وخلايا CD19 + (الشكل 5B ، C). لاحظ استجابة الكالسيوم التي يمكن اكتشافها بسهولة في الخلايا التائية TCRγδ + وخلايا iNKT (CD1d / α-galcer +). لمقارنة البروتينات السطحية داخل مجموعة الخلايا التائية المختلطة للفئران ، تم إنشاء مخططات ثنائية الأبعاد تظهر مجموعات فرعية ذات أهمية. أدناه ، يتم عرض تحليل استجابة الكالسيوم على مدار الدورة الزمنية الكاملة لكل مجموعة فرعية (الشكل 5C).

يمكن أيضا استخدام هذا الاختبار لتحديد الاختلافات البيولوجية في الخلايا التائية من الفئران من النوع البري مقابل الفئران المستهدفة للجينات أو في الخلايا التائية غير المعالجة مقابل المعالجة بالمثبطات الدوائية. في المثال الموضح في الشكل 6 ، عولجت الخلايا التائية باستخدام PRN694 ، وهو مثبط جزيء صغير لكينازات التيروزين في الخلايا التائية ، ITK و RLK 9,10. تثبيط ITK / RLK يثبط إشارات مستقبلات الخلايا التائية ، مما يؤدي إلى انخفاض استجابة الكالسيوم بعد تحفيز مستقبلات الخلايا التائية11 (الشكل 6 أ). لتحديد آثار تثبيط ITK / RLK ، يمكن بعد ذلك تحليل المنحنيات التي تعرض نسبة مضان Indo-1 (المرتبط بالكالسيوم) إلى Indo-1 (الخالي من الكالسيوم) للمنطقة الواقعة أسفل المنحنى (AUC) أو ميل المنحنى لكل حالة (الشكل 6B ، C). يتم إجراء هذا القياس الكمي عن طريق تقسيم المسار الزمني لاستجابة الكالسيوم إلى مقاطع منفصلة (الشكل 6 أ) ، وتقييم المنطقة تحت المنحنى أو ميل المنحنى لكل جزء ، كما هو موضح (الشكل 6 ب ، ج). بشكل عام ، يوضح هذا البروتوكول أنه يمكن استخدام قياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل لقياس تدفق الكالسيوم جنبا إلى جنب مع علامات سطح الخلايا المتعددة في مجموعات الخلايا المناعية قيد التحقيق. تظهر هذه النتائج أنه يمكن تقييم مجموعات الخلايا الفرعية الممثلة بنسبة أكبر من 1٪ من إجمالي السكان لتدفق الكالسيوم بمرور الوقت. في المقابل ، تتطلب المجموعات الفرعية للخلايا الأقل وفرة تحليلا بديلا باستخدام لحظات من الزمن.

التحليل الإحصائي لبيانات استجابة الكالسيوم خاص بالسؤال التجريبي والمقايسات البيولوجية التي يتم إجراؤها. في البيانات المقدمة في المخطوطة ، أجريت التجارب مع النسخ المكررة لضمان الدقة التجريبية وقوة المنهجية. ومع ذلك ، لم يتم إجراء تجارب متعددة على عينات بيولوجية مختلفة على مدار أيام مختلفة. ولذلك، لن يكون من المناسب إجراء تحليلات إحصائية للبيانات المقدمة.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لسير عمل فحص الكالسيوم. يوفر استخدام صبغة مؤشر الكالسيوم Indo-1 AM أداة لتصور تدفق الكالسيوم في الخلايا المناعية ومجموعاتها الفرعية. يحدد هذا المخطط سير العمل لتحليل استجابات الكالسيوم في الخلايا التائية الطحالية الفئران. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحويل الأطوال الموجية PMT إلى قنوات APD. يحتوي مقياس التدفق الخلوي كامل الطيف على 16 كاشفا للكشف عن انبعاثات الفلورسنت بعد الإثارة بواسطة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. يشار إلى مواصفات كل كاشف في الجدول. تم تسليط الضوء على الكاشفين المستخدمين لتقييم مضان Indo-1 ، كما تم تحديدهما تجريبيا باستخدام عناصر تحكم مفردة ملطخة. تتوفر التحويلات إلى الطول الموجي APD ودليل المستخدم لمقياس التدفق الخلويالطيفي 11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تصور التوقيع الطيفي Indo-1. (أ) أعلى: التوقيع الطيفي لمضان Indo-1 في الخلايا التائية CD8+ بعد إدخال الأيونوميسين لاستنباط تدفق قوي من الكالسيوم. يمكن تصور ذروة Indo-1 (المرتبطة بالكالسيوم) في UV1. أسفل: التوقيع الطيفي ل Indo-1 (خال من الكالسيوم) يظهر ذروة التألق في UV7. تم إنشاء عينة التحكم هذه عن طريق معالجة الخلايا المحملة ب Indo-1 باستخدام EGTA12 لتخليب أي كالسيوم خال من خارج الخلية. (B) مجموعة من خمسة طبقات طيف ليزر لتوقيع Indo-1 ، تظهر MFI الطيفية الخام على اليسار والأطياف الطبيعية ل Indo-1 مقابل Indo-1 الحرة على اليمين. يمكن اكتشاف تصور التحول من Indo-1 (خال من الكالسيوم) باللون البرتقالي إلى Indo-1 (مرتبط بالكالسيوم) باللون الأزرق بسهولة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: استراتيجية البوابات لتصور استجابات الكالسيوم. تم تحديد سير العمل الخاص بالبوابات المتسلسلة للعينات. (أ) يتم فحص استقرار السوائل باستخدام بوابة زمنية مقابل بوابة SSC-A. (ب) يستخدم FSC-A مقابل SSC-A للبوابة على الخلايا الليمفاوية ، وبالتالي القضاء على بقايا الخلايا وخلايا الدم الحمراء المتبقية في العينة. (ج) يتم إغلاق الخلايا المفردة باستخدام مخطط SSC-H مقابل مخطط SSC-A. (د). ثم يتم تطبيق البوابة الفردية على قطعة من Ghost540 الميت الحي مقابل SSC-A ؛ البوابة على الخلايا السلبية Ghost540 تقضي على الخلايا غير القابلة للحياة من التحليل اللاحق. (ه) يتم تحليل الخلايا الحية بحثا عن CD19 مقابل SSC-A ، ويتم تشغيل الخلايا السالبة CD19 (الخلايا غير البائية). (F) يتم فحص الخلايا السالبة CD19 بحثا عن تلطيخ CD4 مقابل CD8. (G) ثم يتم إدخال خلايا CD4 + لتصور الوقت مقابل Indo-1 (مرتبط بالكالسيوم). (H) يتم اختيار لحظة زمنية لتمثيل بدء استجابة تدفق الكالسيوم بعد إضافة الأجسام المضادة المضادة ل CD3 عن طريق تصور مضان Indo-1 (خال من الكالسيوم) مقابل مضان Indo-1 (مرتبط بالكالسيوم). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تصور مضان Indo-1 في مجموعات مسورة من الخلايا الصعترية للفئران في نقاط زمنية منفصلة في استجابة الكالسيوم. تم تحفيز الخلايا الصعترية الكلية بجسم مضاد ل CD3 متبوعا بالأيونوميسين بعد 6 دقائق من جمع العينة. في أربع نقاط زمنية منفصلة ، كما هو موضح في المربعات المستطيلة الموضحة على المخططات ثنائية الأبعاد للوقت مقابل Indo-1 (مرتبطة بالكالسيوم) ، تم فحص مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا الصعترية لاستجابات الكالسيوم. (أ) مخططات ثنائية الأبعاد توضح بوابات إشارة خط الأساس Indo-1 ، واستجابة الذروة ، واستجابة 5 دقائق بعد الذروة ، والاستجابة للأيونوميسين. أسفل كل قطعة CD4 مقابل تلطيخ CD8 (يسار) ومخطط Indo-1 (خال من الكالسيوم) مقابل Indo-1 (مرتبط بالكالسيوم) على الخلايا الصعترية CD4 الموجبة المفردة (SP). (ب) تظهر مخططات Indo-1 (الخالية من الكالسيوم) مقابل Indo-1 (المرتبطة بالكالسيوم) على مجموعات فرعية مسورة من الخلايا التوتية عند كل نقطة من النقاط الزمنية الأربع، باستخدام استراتيجية البوابات الموضحة في (أ). (ج) تم إنشاء مخططات ثنائية الأبعاد توضح تلطيخ الخلايا التوتية الكلية بالأجسام المضادة المشار إليها. تم تشغيل مجموعات فرعية محددة (الصف العلوي) وفحصها بحثا عن استجابات الكالسيوم مقابل الوقت (أسفل). الأزرق الفاتح (SP) CD8 + السكان ، الأحمر (SP) CD4 السكان ، والذي يظهر أكبر تدفق للكالسيوم ، البرتقالي CD4 + CD8 + الخلايا الصعترية مزدوجة الإيجابية ، خلايا iNKT الخضراء الداكنة ، CD25 + الأخضر الفاتح ، الخلايا التائية TCRγδ + الأرجواني ، وخلايا CD19 + B السوداء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تثبيط استجابة الكالسيوم في الخلايا التائية CD8+ المعالجة بمثبط جزيء صغير من ITK / RLK. أثناء تحميل صبغة Indo-1 ، عولجت الخلايا الطحالية بجرعتين من PRN694 و 100 نانومتر (رمادي غامق) و 200 نانومتر (رمادي فاتح). (أ) تظهر نسبة Indo-1 (مرتبطة بالكالسيوم / خالية من الكالسيوم) مقابل الوقت للخلايا غير المعالجة (الحمراء) والخلايا المعالجة ب PRN694. تظهر المنحنيات استجابة الكالسيوم للخلايا التائية CD8 + المسورة. يمثل الخط الأسود التحكم السلبي في الخلايا الطحالية المحملة ب Indo-1 والسطح الملون ، ولكن لا يتم تحفيزه بالأجسام المضادة ل CD3. (ب، ج) يمكن تحليل البيانات عن طريق تقسيم محور الزمن الموضح في (A) إلى ثمانية أجزاء ، مصورة بخطوط منقطة سوداء ، وحساب المساحة أسفل المنحنى (AUC) (B) ، أو ميل كل منحنى (ميل) (C) في كل فترة زمنية للاستجابة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول مقايسة محسنة مصممة لقياس استجابات الكالسيوم في الخلايا التائية الأولية المحملة بصبغة مؤشر Indo-1 المعايرة باستخدام قياس التدفق الخلويلتدفق الطيف الكامل 7,8. تتمثل ميزة إجراء فحوصات تدفق الكالسيوم باستخدام قياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل في القدرة على مضاعفة تلطيخ علامات الخلايا السطحية مع تقييم مضان Indo-1. يتميز قياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل بميزة السماح باستخدام الأصباغ المتداخلة للغاية ، وبالتالي زيادة عدد العلامات التي يمكن استخدامها في اللوحة. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن مقياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل يجمع كل ضوء الليزر المنبعث عبر مجموعة من أجهزة الكشف لكل عينة تم تحليلها ، بدلا من وجود كاشف واحد مخصص لفلوروكروم واحد. يسمح استخدام الطيف الكامل لكل فلور بحساسية أعلى للفحص ويوفر وسيلة لتحديد الفلوروكرومات الفريدة طيفيا التي سيكون لها إشارات متداخلة إذا تم جمعها على مقياس التدفق الخلوي لتمرير النطاق. هذا يلغي أيضا الحاجة إلى العزل المسبق لمجموعة فرعية من الخلايا قيد التحقيق.

في هذه الدراسة ، تم تقييم لوحة من علامات سطح الخلية بأجسام مضادة مقترنة بالفلوروكروم. وشملت هذه اللجنة αCD4-APC-Cy7، وαCD8-FITC، وαCD19-PE، وαTCRβ-PerCP-Cy5.5، و α-TCRδ-PE-Cy5، وαCD25-PE-Cy7، وCD1d-αgal-cer tetramer-APC؛ بالإضافة إلى ذلك ، تضمنت اللوحة صبغة Ghost540 الميتة حية. تتوفر القناة المثلى للكشف عن كل من هذه الفلوروكرومات في دليل مستخدمي مقياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل13. في المقابل ، تم تحديد اكتشاف Indo-1 (خال من الكالسيوم) و Indo-1 (مرتبط بالكالسيوم) تجريبيا ، على الرغم من تقدير قناة ذروة تقريبية للكشف عن كل توقيع فلوري بناء على الأطوال الموجية المعروفة لانبعاث الذروة لشكلي Indo-1. ومن الممكن أيضا تحويل الأطوال الموجية لذروة الانبعاث من الأطوال الموجية لمرشح تمرير النطاق المستخدمة في مقاييس التدفق الخلوي التقليدية والمقاسة بالنانومتر إلى قنوات كل منها على كاشفات الصمام الثنائي للصور الجليدية (APD) التي يستخدمها مقياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل؛ يمكن أن يوفر هذا أيضا تقديرا للقنوات المثلى للكشف عن Indo-1 (خال من الكالسيوم) و Indo-1 (مرتبط بالكالسيوم) ، على التوالي. نظرا لأنه يتم تضمين عناصر تحكم ملونة مفردة لكل علامة فلورسنت ، فإن عملية فك الخلط تعمل على فك التواقيع الفلورية ، مما يسمح بتصور شدة كل فلوروكروم على الخلايا في كل عينة. كما هو موضح في هذه الطريقة ، يمكن إجراء تحليل البيانات عن طريق البوابات على مجموعات فرعية من الخلايا ذات الأهمية وتصور نسبة اكتشاف Indo-1 (خال من الكالسيوم) و Indo-1 (مرتبط بالكالسيوم) مقابل الوقت.

هناك قيود على هذا الفحص. على سبيل المثال ، لم تسمح تركيزات Indo-1 أقل من 3 ميكرومتر بالتصور الناجح لاستجابة تدفق الكالسيوم في الخلايا التائية. نظرا لأن هذا الفحص يستوعب أيضا قياسات تعدد الإرسال لاستجابة الكالسيوم مع تحليل علامات سطح الخلية المتعددة على مجموعات الخلايا غير المتجانسة باستخدام قياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل ، فمن الضروري معايرة جميع الأجسام المضادة الموسومة بالفلورسنت المستخدمة بعناية ، بما في ذلك تلك المستخدمة في عناصر التحكم الملطخة الفردية. هذا مهم للتنفيذ الناجح لخوارزمية فك الخلط الخطي عالية الحساسية14. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن تصور دورة زمنية كاملة لتدفق الكالسيوم لمجموعات فرعية من الخلايا تمثل أقل من 1٪ من إجمالي السكان الذين يتم تحليلهم. بدلا من ذلك ، تطلب تقييم استجابة الكالسيوم في هذه المجموعات الفرعية النادرة استراتيجية تحليل بديلة باستخدام لحظات في الوقت15. يوفر تحليل اللحظات الزمنية لقطات لإشارات الفلورسنت ل Indo-1 (خالية من الكالسيوم) مقابل Indo-1 (مرتبطة بالكالسيوم) في مراحل منفصلة من استجابة الكالسيوم ، بدلا من المسار الزمني الكامل للاستجابة. أخيرا ، من المهم أيضا التعرف على قيود استخدام علامات السطح الفردي لتحديد مجموعات فرعية من الخلايا التائية. على سبيل المثال، لا يكفي تلطيخ الخلايا الصعترية بالأجسام المضادة α-CD25 لتمييز الخلايا التائية التنظيمية CD4+ عن جميع مجموعات الخلايا الصعترية الأخرى. هذا يرجع إلى حقيقة أن غالبية الخلايا السلفية المبكرة للخلايا التوتية (CD4-CD8-) تعبر أيضا عن CD2516. من المحتمل أن يفسر هذا عدم وجود استجابة لتدفق الكالسيوم يمكن اكتشافها في الخلايا الصعترية CD4 + CD25 + المسورة.

يتطلب تحسين هذا البروتوكول تقييما دقيقا للعديد من المتغيرات التي كانت أساسية لنجاح المقايسة. وتشمل هذه تحسين استنساخ محدد من الأجسام المضادة المضادة CD3 المستخدمة ، معايرة التركيز الأمثل لهذا الجسم المضاد ، والحاجة إلى تشابك الأجسام المضادة باستخدام نظام البيوتين / الستربتافيدين التقليدي. بالنسبة للخلايا التائية الفأرة ، وجد أن تركيز 30 ميكروغرام / عينة ل 6 × 106 خلايا في حجم 500 ميكرولتر هو الحد الأدنى من الجسم المضاد اللازم لاستجابات الكالسيوم المثلى. ومن المثير للاهتمام ، لوحظت استجابات قوية للكالسيوم مع استنساخ الأجسام المضادة ل CD3 17A2 ، ولكن ليس مع استنساخ 145-2C11. علاوة على ذلك ، عند استخدام Clone 17A2 ، كانت إضافة كاشف تشابك ثانوي غير ضروري17. أظهرت الاختبارات التي تستخدم استنساخ 17A2 المضاد ل CD3 مع أو بدون الستربتافيدين عدم وجود تعزيز لاستجابة الكالسيوم في وجود التشابك مع الستربتافيدين . من الممكن أن يكون هذا الجسم المضاد قد تضمن مجاميع ، وأن هذه المجاميع تمثل فعالية تحفيز الجسم المضاد في غياب الارتباط المتقاطع العلني. ومع ذلك ، نظرا لأن هذه التجارب أجريت على مدار عدة أشهر باستخدام قوارير مختلفة من هذا الجسم المضاد ل CD3 ، كانت النتائج التي تم الحصول عليها قابلة للتكرار بدرجة كبيرة. لذلك ، من غير المحتمل أن تختلف قدرة هذا الجسم المضاد على تحفيز الخلايا التائية بين المستخدمين.

تتطلب استجابات الكالسيوم القوية في الخلايا التائية الأولية الحفاظ على الخلايا عند درجة حرارة بيولوجية تبلغ 37 درجة مئوية طوال فترة الحصول على العينة. في المقابل، تظهر الخلايا البائية الأولية استجابة كالسيوم للجسم المضاد للغلوبولين المناعي M في درجة حرارة الغرفة. بناء على حساسية استجابة الكالسيوم في الخلايا التائية لدرجة الحرارة ، من الأهمية بمكان ضمان معاملة كل عينة بنفس الطريقة ؛ على سبيل المثال ، يجب تسخين كل عينة إلى 37 درجة مئوية باستخدام نفس الطريقة ولنفس المدة الزمنية. في غياب هذا الاتساق ، يمكن ملاحظة الاختلافات في استجابات الكالسيوم ، ولكنها قد لا تكون مؤشرا على الاختلافات ذات الصلة بيولوجيا بين العينات.

باختصار ، يصف هذا البروتوكول تفاصيل إجراء فحوصات تدفق الكالسيوم بناء على تقييم مضان Indo-1 باستخدام قياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل مع تلطيخ علامات الخلايا السطحية المتعددة. تسمح هذه الطريقة للباحثين بتجنب الحاجة إلى عزل أو فرز مجموعات خلايا معينة قبل وضع علامات صبغة الكالسيوم. علاوة على ذلك ، يحدد هذا البروتوكول منهجية تحليل إضافية تستخدم لتصور استجابات الكالسيوم في لحظات منفصلة من الزمن داخل مجموعات فرعية متميزة من الخلايا. يمكن تطبيق تحليل اللحظات الزمنية بنجاح على مجموعات الخلايا النادرة (<1٪ من الإجمالي) ، والتي لا يمكن اكتشافها عند تقييم منحنى استجابة الكالسيوم بالكامل. في المستقبل ، يمكن توسيع هذا الاختبار لاستخدام أجسام مضادة إضافية مقترنة بالفلوروكروم ، مع الاستفادة من القدرات الواسعة لمقياس التدفق الخلوي كامل الطيف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة يعلنونها.

Acknowledgments

R01AI132419 ، CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource ، RRID: SCR_021321 ، شكرا جزيلا لزملائنا في Cytek على المناقشات المستمرة للتحليل الخلوي الطيفي الكامل على برنامج Aurora و SpectroFlo. تم إنشاء الأرقام مع BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 well TC treated plates Cell Treat 229111
50 mL conical Greiner Bio1 41-12-17-03 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap
5mL polysterene flow tubes Corning 352052
5mL syringe BD syringe 309646 plunger only is used sheith is discarded
70uM filter Greiner bio1 542070
aCD3 (17A2) Biolegend 100202
AKC lysis Buffer Gibco A1049201
Aurora Spectral Flowcytometer https://cytekbio.com/pages/aurora
Bath Beads coleparmer Item # UX-06274-52
CD19 PE Tonbo 50-0193-U100
CD1d Tetramer APC NIH
CD25 PECy7 ebioscience 15-0251
CD4 APC Cy7 Tonbo 25-0042-U100
CD8a FITC ebioscience 11-0081-85
Cell Incubator Formal Scientific
Dissection Tools forceps McKesson #487593 Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth
Dissection Tools Scissors McKesson #970135 Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip
DPBS 1x Gibco 14190-136 DPBS 
EGTA Fisher NC1280093
FBS Hyclond SH30071.03 lot AE29165301
FlowJo Software https://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dye ebioscience 65-085-39 Calcium Loading Dye 
ionomycin Millipore 407951-1mg
Live/Dead Ghost 540 Tonbo 13-0879-T100
Microcentrifuge tubes 1.7mL Light Labs A-7001
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine Gibco 10378-016
PRN694 Med Chem Express Hy-12688
Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) Tonbo 70-0161-M001 FC Block
RPMI Gibco 1875093  + phenol red
RPMI phenol free Gibco 11835030  -phenol red
Table top centrifuge Beckman Coulter Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5 ebioscience 45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5 ebioscience 15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent Pack Product No: C06019 Includes Tripan
Vi-Cell Blu Beckman Coulter
Waterbath Fisher Brand Dry bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
  2. Huang, G. N. Cell calcium mobilization study (flow cytometry). Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).
  3. June, C. H., Moore, J. S. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , Chapter 5, Unit 5.5 (2004).
  4. Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).
  5. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  6. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
  7. Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit1.27 (2013).
  8. Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).
  9. Zhong, Y., et al. Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).
  10. Gallagher, M. P., et al. Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).
  11. Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).
  12. Nakamura, Y. EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels. Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).
  13. Cytek Aurora Users Guide. Cytek. , Available from: https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf (2022).
  14. SpctroFlo Software. Cytek. , Available from: https://cytekbio.com/pages/spectro-flo (2022).
  15. FlowJo Software. Becton-Dickinson. , Available from: https://www.flowjo.com/solutions/flowjo (2022).
  16. Godfrey, D. I., Zlotnik, A. Control points in early T-cell development. Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).
  17. Vossen, A. C., et al. Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects. European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).

Tags

المناعة والعدوى ، العدد 190 ،
تحليل تدفق الكالسيوم الناجم عن مستقبلات الخلايا التائية في الخلايا التائية الأولية عن طريق قياس التدفق الخلوي الكامل الطيف
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perrenoud, L., Conley, J., Berg, L.… More

Perrenoud, L., Conley, J., Berg, L. J. Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (190), e64526, doi:10.3791/64526 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter