Summary
Kalciuminflöde, ett mått på T-cellsignalering, är ett effektivt sätt att analysera svar på T-cellreceptorstimulering. Detta protokoll för multiplexering av Indo-1 med paneler av antikroppar riktade mot cellytemolekyler utnyttjar de mycket flexibla funktionerna hos fullspektrumflödescytometri.
Abstract
Kalciuminflöde som svar på T-cellreceptorstimulering är ett vanligt mått på T-cellsignalering. Flera kalciumindikatorfärgämnen har utvecklats för att bedöma kalciumsignalering med bandpassflödescytometri. Detta protokoll är utformat för att mäta kalciumsvar i primära murina T-celler med hjälp av fullspektrumflödescytometri. Totala splenocyter är märkta med det ratiometriska kalciumindikatorfärgämnet Indo-1, tillsammans med en panel av fluorkromkonjugerade antikroppar mot cellytmolekyler. Att utnyttja kapaciteten hos fullspektrumflödescytometri ger en plattform för att använda ett brett spektrum av cellytefläckar i kombination med Indo-1. Cellerna analyseras sedan i realtid vid 37 °C före och efter tillsats av en anti-CD3-antikropp för att stimulera T-cellreceptorn. Efter blandning av spektralsignalerna beräknas förhållandet mellan kalciumbundet och kalciumfritt Indo-1 och kan visualiseras över tid för varje gated population av splenocyter. Denna teknik kan möjliggöra samtidig analys av kalciumsvar i flera cellpopulationer.
Introduction
T-cellreceptor (TCR) inducerad kalciuminflöde är ett användbart mått på T-cellaktivering och används ofta för att bestämma om en population av T-celler har nedsatt respons i de proximala stegen i TCR-signalvägen1. Mätningar av kalciuminflöde utförs vanligtvis genom att T-cellerna förmärks med ett eller ett par fluorescerande kalciumindikatorfärgämnen och sedan undersöker de fluorescerande signalerna med hjälp av flödescytometri i realtid efter TCR-tvärbindning 2,3,4. Indo-1, ett kvotmetriskt kalciumfärgämne, exciteras av UV-lasern med topputsläpp vid två olika våglängder beroende på kalciumbindning5, och är ett vanligt indikatorfärgämne för flödescytometrianalys av kalciumsvar i levande lymfocyter. Eftersom emissionsprofilen för Indo-1 är ganska bred kan det vara utmanande att kombinera Indo-1-bedömning med samtidig analys av flera cellytemarkörer med bandpassflödescytometri. Denna begränsning begränsar användningen av flödescytometrianalys av kalciumsvar till förrenade populationer av T-celler eller till populationer identifierade av en begränsad uppsättning cellytemolekyler.
För att ta itu med begränsningarna för att mäta kalciumsvar på heterogena populationer av primära lymfocyter med hjälp av bandpassflödescytometri utvecklades ett protokoll för att mäta Indo-1-fluorescens med fullspektrumflödescytometri. Denna metod möjliggör multiplexering av Indo-1 med paneler av antikroppar riktade mot cellytemolekyler, vilket utnyttjar de mycket flexibla funktionerna hos fullspektrumflödescytometri. Fördelen med att använda fullspektrumflödescytometri jämfört med konventionell flödescytometri är dess förmåga att skilja de fluorescerande signalerna från mycket överlappande färgämnen, vilket ökar antalet ytmarkörer som samtidigt kan bedömas i varje prov. Konventionell flödescytometri använder bandpassfilter och är begränsad till en fluorokrom per detektorsystem6. Fullspektrumflödescytometri samlar signaler över hela spektrumet av fluorokrom med hjälp av 64 detektorer på ett femlaserspektralflödescytometrisystem 7,8. Dessutom utnyttjar fullspektrumflödescytometri APD-detektorer (Avalanche Photo Diode) som har ökad känslighet i förhållande till fotomultiplikatorrördetektorer som finns på konventionella flödescytometrar8. Följaktligen är detta tillvägagångssätt idealiskt för de heterogena cellpopulationerna, såsom perifera mononukleära celler eller murina sekundära lymfoida organcellsuspensioner, eftersom det eliminerar behovet av isolering av specifika T-cellpopulationer före kalciumfärgmärkning. Istället kan cellytemarköruttrycksprofiler och flödescytometri gating efter datainsamling användas för att bedöma kalciumsvar i varje population av intresse. Som framgår av denna rapport kan Indo-1 enkelt kombineras med åtta fluorkromkonjugerade antikroppar, vilket resulterar i totalt 10 unika spektrala signaturer. Dessutom kan denna metod lätt tillämpas på blandningar av celler från kongeniskt distinkta muslinjer, vilket möjliggör samtidig analys av kalciumsvar i T-celler av vildtyp jämfört med dem från en genriktad muslinje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Möss upprätthölls vid University of Colorado Anschutz Medical campus i enlighet med IACUC-protokoll. Alla möss avlivades enligt AAALAC-standarder.
1. Beredning av immunceller från mjälten
OBS: Avliva naiva möss med CO2 eutanasi. C57BL / 6 möss som köpts från Jackson Laboratories och avlats internt används för experiment vid 6-12 veckors ålder. Både manliga och kvinnliga möss används för experiment.
- Desinficera mushuden med 70% etanol för att minska risken för att externa föroreningar kommer in i provet.
- Dissekera musmjälten med dissektionsverktyg, kirurgisk sax och pincett. Skörda mjälten och placera den fristående mjälten i 50 ml koniskt rör med ~ 5 ml komplett RPMI-media (cRPMI) på is.
OBS: Komplett RPMI består av 10% FBS, 2 mM L-glutamin och 1% penicillin / streptomycin.- För att skörda musmjälten, gör ett 5 cm snitt i pälsen och huden längs musens vänstra sida halvvägs mellan fram- och bakbenen med sax. Öppna kroppshålan ~ 5 cm och ta bort mjälten med pincett. Mjälten är färgen på en njurböna och är längre och plattare än den närliggande njuren.
- Häll innehållet i steg 1.2 på ett sterilt 70 μm-filter fäst vid ett nytt 50 ml koniskt rör. Separera mjälten mekaniskt i en encellssuspension genom att trycka mjälten genom filtret med en 5 ml sprutkolv tills ingen mjältmassa finns kvar på filterytan.
- Pelletera splenocyterna med hjälp av en utsvängbar rotorbänkcentrifug vid 500 x g i 5 min vid 4 °C.
- Dekantera försiktigt supernatanten. De pelleterade splenocyterna förblir i botten av det 50 ml koniska röret.
- För att avlägsna röda blodkroppar, suspendera de pelleterade splenocyterna i 1 ml ACK-lysbuffert i 3 minuter enligt tillverkarens instruktioner. Blanda väl.
- Släck ACK-lysbufferten med 15 ml cRPMI.
- Pellet lymfocyterna enligt anvisningarna i steg 1.4.
- Återsuspendera cellsuspensionen i 5 ml cRPMI i ett 50 ml koniskt rör. Lägg proverna på is.
- För att räkna cellerna, överför 10 μL av cellsuspensionen till ett 0,6 ml mikrocentrifugrör och späd i förhållandet 1:1 med Trypan-blå lösning. Överför sedan till en hemocytometer eller automatiserat cellräkningssystem.
- Efter räkning, beroende på cellkoncentrationen i cellsuspensionen som i steg 1.9, pelleterar cellerna i en bordscentrifug vid 500 x g vid 4 °C i 5 minuter för att förbereda för tillsats av cRMPI-media innehållande Indo-1 AM-esterfärgämne.
- Beräkna volymen för resuspension av cellerna för att uppnå 10-12 x 106 celler/ml. Detta är en 2x koncentration av det totala cellantalet som krävs.
- suspendera cellerna igen i volymen cRPMI beräknad i steg 1.11. Placera cellerna vid 37 °C med 5 %CO2 i antingen ett 50 ml E-rör med locket ventilerat eller en vävnadsodlingsplatta.
2. Indo-1-ratiometrisk färgämne och fluorescerande antikroppsmärkning
- Enligt tillverkarens instruktioner, tillsätt 50 μL DMSO i en injektionsflaska innehållande 50 μg Indo-1 AM. Stamlösningens koncentration är 1 μg/μl.
OBS: DMSO tillhandahålls i mikroflaskor med satsen för att förhindra oxidation av DMSO. - Späd alikvoten (1 μg/μl) till lämplig försöksvolym (fastställd enligt 1.11) cRPMI vid en koncentration på 6 μg/ml, en koncentration på 2x. Förvara inte Indo-1 i vattenlösning.
OBS: Andra buffertar med tillsatt kalcium kan användas beroende på cellbehovet. - Lägg hela medier med Indo-1 åt sidan i ett vattenbad vid 37 °C.
OBS: Använd den minsta koncentration av Indo-1 AM-ester som krävs för att erhålla en adekvat signal. Detta måste titreras för olika celltyper. Typiskt är en koncentration mellan 3-5 μM tillräcklig. För primära T-celler ökar laddning av celler med Indo-1 i en koncentration >5 μg/ml den genomsnittliga fluorescerande intensiteten (MFI) över en logg på 6 på spektralflödescytometrar. Om detta inträffar, minska UV-laserintensiteten och titrera Indo-1 till en lägre koncentration. - Späd tidigare beredd cellsuspension (i steg 1.12), 1:1 i cRPMI, inklusive 2x Indo-1-media som gjordes i steg 2.2. Se till att cellerna har en koncentration mellan 5-6 x 106 / ml.
OBS: Färga inte belastning ofärgade enkelfläckskontroll eller ytmarkör enstaka fläckcellskontroller med Indo-1. Att lägga till Indo-1 till enstaka fläckantikroppskontroller kommer att skapa ett flerfärgsprov på grund av att Indo-1 läggs till enstaka färgade celler. Inkludera indo-1 (kalciumfri) EGTA extra kontroll till provplattan som skapades i steg 2.6. - Tillsätt 1 ml celler / brunn / experimentellt tillstånd i en 12-brunns vävnadsodlingsplatta.
- Skapa en enda färgad kontroll för Indo-1 (kalciumfritt) prov med tidigare Indo-1 färgämnesladdade celler och tillsätt EGTA till en slutlig koncentration på 2 mM. EGTA kommer att kelera kalcium i cellsuspensionen, vilket ger ett renare kontrollprov.
- Skapa en Indo-1-positiv kontroll (Indo-1-kalciumbunden) genom att tillsätta 50 μM jonomycin till den färgämnesladdade cellsuspensionen vid flödescytometern. Jonomycin är en membranpermeabel kalciumjonofor som binder kalciumjoner och underlättar överföringen av kalciumjoner till celler.
- Skapa en brunn för biologisk negativ kontroll utan fluoroforer eller Indo-1-färgämne.
- Skapa en brunn för enstaka fläckkontroller för eventuella ytterligare cellpopulationer av intresse (antikroppar användardefinierade) med hjälp av antikroppskonjugerade fluoroforer i en flödescytometripaneldesign. Dessa kommer inte att inkludera Indo-1-förhållandemetriskt färgämne.
- Tillsätt Fc-receptorblockerande antikropp (~ 2 μg / 1 x 106 celler), enligt tillverkarens instruktioner, innan du lägger till ytterligare fluorkromkonjugerade antikroppar för ytfärgning.
- Inkubera plattan i 45 minuter vid 37 °C med 5 %CO2.
- Återsuspendera cellerna i en platta med 12 brunnar genom att försiktigt knacka på plattan var 15: e minut.
- Blanda och ta bort hela volymen celler suspenderade i mediet från 12-brunnsplattan. Tillsätt sedan cellsuspensionen till 1,7 ml mikrocentrifugrör.
- Pellet cellerna i en mikrocentrifug vid 500 x g i 5 min vid rumstemperatur. Dekantera supernatanten och tvätta cellerna genom att tillsätta 1 ml förvärmd cRPMI. Pellet igen och dekantera supernatanten.
OBS: Tvätta cellerna tar bort eventuell kvarvarande FC-blockerande antikropp. - Återsuspendera cellerna i 1 ml cRPMI i 1,7 ml mikrocentrifugrör och inkubera varje rör vid 37 °C i ytterligare 30 minuter vid 5% CO2, vilket lämnar toppen av röret något öppen för att möjliggöra gasutbyte. Detta möjliggör fullständig avesterifiering av de intracellulära AM-estrarna.
- Överför cellerna tillbaka till en 12-brunns vävnadsodlingsplatta, om det behövs. Ytterligare användardefinierade titrerade fluorkromkonjugerade antikroppar kan tillsättas i vilofas.
OBS: Markörer som används i metodpanelen inkluderar: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 och CD1d / α-galcer tetramer. Markörer väljs för att analysera T-celldelmängder.- Skapa en mastermix av alla användardefinierade fluorkromkonjugerade antikroppar enligt celltyperna av intresse vid en tidigare titrerad volym i ett 1,7 ml mikrocentrifugrör.
- Tillsätt en beräknad mastermix för 1 ml av cellvolymen, beroende på titrerade antikroppar mot vilande celler.
OBS: Fördelen med färgning vid steg 2.15 istället för det senare steg 2.18 är att färgning vid steg 2.15 kommer att minska den totala inkubationstiden för experimentet. Färgning i en total volym på 1 ml vid steg 2.15 ökar dock antikroppsanvändningen.
- Efter vila, pellet cellerna vid 500 x g i 5 min vid rumstemperatur.
OBS: Celler i en vävnadsodlingsplatta med 12 brunnar kan pelleteras i plattan med ett plattcentrifugtillbehör. Annars pellets cellerna i ett 1,7 ml mikrocentrifugrör. - Tvätta cellerna genom att suspendera pelleten i 1 ml 4 °C kallt cRPMI och pellet cellerna igen som i steg 2.16. Placera cellerna på is.
OBS: Om ytfärgande celler separat, efter de-förestring vid steg 2.18, behövs mindre antikroppsvolym. Ytfärgning i detta steg kan utföras efter vilofasen i kallflödesbuffert (1x DPBS med tillsatt 1% FBS), med hjälp av användardefinierade antikroppar, på is i 30 minuter. Tvätta cellerna efter fläcken i cRPMI som i steg 2.17.- Tillsätt viabilitetsfläck Ghost540 utspädd 1:7 500 i DPBS till prover enligt tillverkarens instruktioner. Värmedöda cellerna vid 55 °C på ett uppvärmningsblock för enkelfärgad levande/död kontroll.
OBS: Viabilitet funktionell färgfärgning för att eliminera döda celler i flödescytometrisk analys utförs utan FBS. FBS kan interagera med aminfärgämnen enligt tillverkarens instruktioner.
- Tillsätt viabilitetsfläck Ghost540 utspädd 1:7 500 i DPBS till prover enligt tillverkarens instruktioner. Värmedöda cellerna vid 55 °C på ett uppvärmningsblock för enkelfärgad levande/död kontroll.
- Återsuspendera enskilda prover i 500 μl cRPMI (fenolrödfritt) med ett 5 ml polystyrenflödesrör med lock.
OBS: Celler kan lämnas vid 4 ° C i upp till en timme. - Värm varje 5 ml rör som innehåller celler, individuellt, till 37 °C med ett pärlbad i 7 minuter före analysen på flödescytometern och håll tiden konsekvent mellan proverna. Använd en timer.
3. Pärlbadrör: bibehålla temperaturen under kalciumflödesanalys
- Lägg till badpärlor i ett litet vattenbad, utan tillsatt vatten; värm upp till 37 °C.
- Skär försiktigt ett 50 ml koniskt rör i hälften, vid 25 ml märket, med ett rakblad; Kassera toppen av röret.
- Fyll det halverade röret 3/4 av vägen med badpärlor.
- Placera röret som skapades i steg 3.2 i pärlbadet som skapades i steg 3.1. Ta tuben och pärlorna till 37 °C.
- Anslut pärlbadet till ett eluttag bredvid flödescytometern för att bibehålla temperaturen som förberedelse för provanalys.
- Lägg till ett 50 ml koniskt frigolitställ för att hålla ett rör för att placera röret på plats medan du kör på flödescytometern. Detta eliminerar behovet av att manuellt hålla röret under kurvanalysens varaktighet.
4. Förvärv av kalciuminflöde med hjälp av flödescytometrisk analys
- Logga in på flödescytometerprogramvaran på en flödesanalysator.
- Klicka på fliken Bibliotek för att lägga till Indo-1 (kalciumbunden) och Indo-1 (kalciumfri) fluorescerande taggar. Välj Fluorescerande taggar på programvarumenyn till vänster. Välj UV-laser under fluorescerande tagggrupper och klicka på +lägg till för att lägga till ett fluorescerande taggnamn (Indo-1 (kalciumbunden)/Indo-1 (kalciumfri)) i biblioteket. Välj laserexcitationsvåglängd och emissionsvåglängd och klicka sedan på Spara. Fortsätt till experimentkonfigurationen.
OBS: Indo-1 exciteras av UV-lasern vid en våglängd på 355 nm. Emissionsvåglängden för Indo-1 (kalciumbunden) är 372 nm. Emissionsvåglängden för Indo-1 (kalciumfri) är 514 nm. - Klicka på fliken Förvärv. Öppna/skapa ett nytt experiment och lägg till önskade fluorescerande taggar i experimentet.
- Skapa referensgrupp och en ny exempelgrupp/er för experimentet. Märk både proverna och referensgrupperna efter behov.
- Under fliken Förvärv anger du att händelserna ska registreras till max: 10 000 000.
- Ställ in stoppvolymen på maximal volym: 3 000 μl.
- Ställ in stopptiden på maximal tid: 36 000 s.
- Skaffa enstaka färgade kontroller för definierade konjugerade antikroppar som ingår i flerfärgspanelen.
- Skaffa enstaka färgade kontroller för Indo-1 funktionellt färgämne.
- Tillsätt 50 μM jonomycin till den kalciumbundna positiva kontrollen av Indo-1. Vortex att blanda. Lägg till flödesröret i provinjektionsporten och klicka på Spela in.
- Tillsätt kalciumfri Indo-1 negativ kontroll till flödescytometern och klicka på Spela in. EGTA lades till i steg 2.6.
- Blanda upp de enkla färgade kontrollerna genom att klicka på knappen Unmix .
OBS: Alla enkelfärgade kontroller från alla konjugerade antikroppar och funktionella färgämnen måste registreras innan proverna blandas ihop. För att Unmix-knappen ska fungera måste alla referenskontroller registreras först. Blandning kan göras före eller efter provtagning.
- När omblandningen är klar skapar du sekventiella diagram med hjälp av det oblandade kalkylbladet. SSC-A kontra FSC-A tar bort skräp från provet, SSC-A kontra SSC-H för att ta bort dubbletter. Detta följs av en livskraftsrensningsport tillsammans med ytterligare grind på populationer av intresse. För att skapa grindar, klicka på Plot. Lägg till ett diagram i kalkylbladet och dubbelklicka inuti porten för att skapa en nedströms gated population. Fortsätt tills alla populationer av intresse har redovisats.
- Varma enkelfärgade kontrollprover (från steg 2.6–2.9 i avsnitt Indo-1-ratiometrisk färgämne och fluorescerande antikroppsmärkning) till 37 °C för sekventiell analys. Ställ in flödescytometriprogramvaran.
- Kör DI-vatten på cytometern i 2-3 minuter för att säkerställa flödescytometerns fluidiska stabilitet.
- Ställ in sekventiella diagram i det oblandade kalkylbladet genom att skapa grindar med hjälp av grindknapparna Polygon, Rektangel eller Ellips. Gate för att inkludera populationen av intresse (dvs. lymfocyter som använder SSC-A vs. FSC-A [storlek/lymfocyter diskriminering]). Negativa populationer verkar grupperade runt noll medan positiva populationer kan visualiseras genom att öka MFI. Populationer av intresse kommer att användardefinieras baserat på den biologiska frågan.
- Dubbelklicka inuti grinden som skapats och ändra Y-axel- och X-axelparametrar till SSC-A kontra SSC-H (singlettdiskriminering). Slutför definitionen av axelparametrarna genom att vänsterklicka på orden på axeln.
- Skapa ett diagram med SSC-A kontra viabilitetsfärgsignal (viabilitetsportparametrar). Grind på levande celler, som är negativa för aminfärgfärgning. Levande celler, negativa för levande dödfärgning, kommer att samlas vid 0-märket på både Y- och X-axlarna.
- Dubbelklicka på det inre diagrammet för att skapa ett nytt diagram som endast innehåller levande lymfocyter med en cell. Ändra Y-axeln till Indo-1 (bundet kalcium) (V1) och/eller Indo-1 (fritt kalcium) (V7) jämfört med tiden på X-axeln för visualisering av kalciuminflödet.
- Placera det uppvärmda biologiska provet på maskinen SIT och kör proverna vid 2 500-3 000 händelser/s på medium för att möjliggöra visualisering av kalciuminflöde i begränsade cellantalspopulationer (t.ex. iNKT).
OBS: Genom att resuspendera cellerna i en koncentration av 1 x 106/ml bör cellhändelserna som samlas in vid medelflödeshastighet vara lika med 2 500-3 000 händelser/s. Sänk flödeshastigheten under förvärvskontroll genom att klicka på rullgardinsmenyn eller späd provet om cellsuspensionen har en ökad koncentration. Att köra proverna med hög flödeshastighet kan öka spridningen av signalen från en fluorofor till andra fluoroforer i panelen. - Tillsätt nästa tub i pärlbadet för att värma till 37 °C.
- I förvärvskontrollen trycker du på Spela in för att registrera initialdata i 30 sekunder för att erhålla en basal nivå av kalciumsignalering i provet.
- I förvärvskontrollen klickar du på Stopp och tar bort röret från provinjektionsporten (SIP).
- Tillsätt 30 μg okonjugerad anti-CD3 direkt i provröret för att initiera kalciuminflödet. Den slutliga koncentrationen per rör är 60 μg/ml.
OBS: Det finns inget tvättsteg efter tillsats av anti-CD3. - Sätt tillbaka röret på maskinens SIP så snabbt som möjligt och tryck på Spela in i programvaran.
- Registrera data i 7 minuter, titta på den tid som förflutit under förvärvskontrollerna i programvaran, för att observera tidsförloppet för kalciuminflöde inom provpopulationerna.
- Efter 7 minuter trycker du på Stopp i programvaran och tillsätter 1 μg/ml jonomycin. Spela in i 30 s för att erhålla maximal kalciumsignal i cellerna av intresse. För att begränsa överföringen av jonomycin till nästa prov, slutför två SIT-spolningar på instrumentet mellan proverna.
- Fortsätt till nästa exempel och upprepa arbetsflödet tills alla exempel har samlats in.
- Spara experimentet och klicka på zip-filen för export . Oblandade filer (.fsc) laddas upp till programvara för analys av extern flödescytometri.
5. Analys av kalciumkurvan
- Med hjälp av en analysprogramvara6 för flödescytometri, konvertera Indo-1 fluorescerande signaler till ett förhållande för time-lapse kalciummätningar. Härled parametrar under verktygsfliken genom att infoga referenser Indo-1 (kalciumbunden)/Indo-1 (fritt kalcium) med hjälp av en linjär skala. Ställ in minimum till noll och maximum enligt tillströmningen av kalciumförhållande, vanligtvis runt 10. Det maximala förhållandet varierar beroende på celltyp och MFI för Indo-1.
- Markera den valda parametern. Under verktyg lägger du till kinetisk analys för att välja parameter genom att klicka på fliken Kinetik . Ställ in Y-axeln på härledd.
- Välj MFI (genomsnittlig fluorescerande intensitet) på fliken Kinetik.
- Tillsätt Gaussisk utjämning, om så önskas. För att lägga till gaussisk utjämning, välj alternativet i rullgardinsmenyn statistik i flödesanalysprogrammet. Gaussisk utjämning kan tillsättas för att jämna visualiseringen av kalciuminflödeskurvan för analys.
- Skapa flera intervall för statistik längs kalciumflödestidsförloppet för biologiska jämförelser inom proverna.
- Dra exemplen till layoutredigeraren och lägg till statistiken efter behov. Statistisk analys varierar beroende på den biologiska frågan. För publiceringsändamål analyseras flera replikat med t-test eller ANOVA.
- För ett ögonblick av tidsanalys, sätt porten på ett visst ögonblick längs kalciumflödet. Undersök önskade ytmarkörer och grind på populationen av intresse; bedöm sedan ett tvådimensionellt punktdiagram av Indo-1 (kalciumfritt) kontra Indo-1 (kalciumbundet) för gated celler inom det ögonblicket i tidsregionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det experimentella arbetsflödet för att bedöma kalciumsvar i primära murina T-celler med användning av ett Indo-1-ratiometriskt färgämne med multiplexerande ytfläckar visas i figur 1. Efter skörd och bearbetning av mussplenocyterna till en enda cellsuspension färgas cellerna med en Indo-1 AM-ester och ytfärgas med fluorkrombundna antikroppar. När färgämnesladdningen och antikroppsfärgningen är klar värms lymfocytproverna upp till en biologisk temperatur (37 °C). Proverna analyseras sedan med fullspektrumflödescytometri för Indo-1-fluorescens efter grindning på de önskade enskilda celltyperna, utan att proverna behöver sorteras före analys. För att kunna använda Avalanche Photo Diode (APD) detektorer inom fullspektrumflödescytometern är det nödvändigt att konvertera toppemissionsvåglängden från en bandpassfiltervåglängd mätt i nm till dess respektive kanal på APD. Tabellen i figur 2 ger en riktlinje, men de optimala detektorerna för de två fluorescenssignaturerna för Indo-1 (kalciumbundet kontra kalciumfritt) måste bestämmas empiriskt. Detta uppnås genom att förbereda enstaka färgade Indo-1-prover med användning av jonomycin för att generera Indo-1 (kalciumbunden) signal och EGTA, ett kalciumkelatbildande medel, för att generera Indo-1 (kalciumfri) signal. Efter analys med fullspektrumflödescytometri kan kanalen som visar maximal fluorescensintensitet för varje Indo-1-signatur visualiseras (figur 3A). Genom att normalisera MFI för de positiva populationerna till för de negativa populationerna kan skiftet i Indo-1-fluorescens från kalciumfritt till kalciumbundet bestämmas (Figur 3B). Den här visningen genereras i en arbetsbok (.xls) med referenskontroller för både bunden och fri Indo-1, vilket ritar en negativ och positiv intervallgrind med tydliga positiva och negativa grindar för MFI-normalisering som visas i (figur 3A). Exempel på MFI-statistik kan också erhållas genom att högerklicka på statistiktabellen. I programvaran bestämmer du MFI-förhållandet genom att dividera den positiva befolkningen med den negativa befolkningen och lägga över de två spektra på en enda skärm (figur 3B, höger). Den gula prickade pilen visar de normaliserade spektrala skillnaderna mellan spektralsignaturerna för både bunden och fri Indo-1.
För att utvärdera kalciumsvar efter stimulering av T-cellreceptorn bedöms Indo-1-fluorescensen efter grindning på cellpopulationerna av intresse, som visas i figur 4. Först undersöks ett diagram över tid kontra sidospridning (SSC-A) för att bedöma fluidisk stabilitet; en stabil konsekvent signal över tidsaxeln indikerar stabilitet (figur 4A). Därefter visualiseras framåt-mot-sidospridningen (FSC-A vs. SSC-A) och lymfocytpopulationen är gated som visas i (figur 4B). Efter lymfocytgrinden appliceras en enda celldiskrimineringsport genom att generera en plot av sidospridningshöjd kontra area (SSC-H vs. SSC-A), och singletsna, som faller på diagonalen, är gated som visas i figur 4C. Singletsna bedöms sedan för livskraft genom att undersöka färgning med livskraftsfärgen och grindning på den negativa populationen (figur 4D). Slutligen, för att analysera T-celler, appliceras en B-cell dump / intern negativ kontrollgrind genom grind på den CD19-negativa populationen (figur 4E). Den CD19-negativa populationen bedöms sedan för T-cellsundergrupper med antikroppar mot CD4 och CD8 (figur 4F); exemplet som visas undersöker CD4 + T-celler för kalciumsvar genom att visualisera Indo-1 (kalciumbunden) fluorescens kontra tid (figur 4G). Efter grindning på ett tidssegment kan diagrammet Indo-1 (kalciumfritt) kontra Indo-1 (kalciumbundet) också genereras (figur 4H). Denna analys kommer senare att användas för att härleda Indo-1-förhållandet (se metoder för analys av kalciuminflödeskurva i programvara för flödescytometrianalys).
Vid denna punkt i analysen kan det vara användbart att analysera ögonblick i tiden inom det tvådimensionella diagrammet av Indo-1 (kalciumbunden) kontra tid i enskilda cellpopulationer av intresse. De optimala tidpunkterna inkluderar baslinjekalcium bundet till Indo-1 före TCR-stimulering, toppresponsen, en tidpunkt flera minuter efter toppresponsen när intracellulära kalciumnivåer minskar och slutligen kalciumsvaret som framkallas genom tillsats av jonomycin (figur 5A). I baslinjeprovet före anti-CD3-antikroppstillsats detekteras en svag Indo-1 (kalciumbunden) signal. Under toppresponsen visar cellerna en stark Indo-1 (kalciumbunden) signal och en minskad fluorescens av Indo-1 (kalciumfri). Vid 5 min post-peak återvände Indo-1-fluorescensen nästan till baslinjen. Efter att jonomycin har tillsatts provet kan en robust signal av Indo-1 (kalciumbunden) visualiseras, vilket säkerställer adekvat färgladdning av cellerna. Sällsynta cellpopulationer (<1 %) kan vara svåra för derivatanalys. för att övervinna denna begränsning kan analys av de sällsynta populationerna utföras genom att plotta Indo-1 (kalciumbunden) kontra Indo-1 (kalciumfri) efter gating på varje population av intresse, såsom CD4 + -celler, TCRb + -celler, TCRyg + -celler, CD25 + -celler, iNKT-celler och CD19 + -celler (figur 5B, C). Observera det lätt detekterbara kalciumsvaret i TCRγδ+ T-celler och iNKT-celler (CD1d/α-galcer+). För jämförelse av ytproteiner inom en blandad murin T-cellpopulation skapades tvådimensionella diagram som visar undergrupper av intresse. Nedan visas analysen av kalciumsvaret över hela tidsförloppet för varje delmängd (figur 5C).
Denna analys kan också användas för att fastställa biologiska skillnader i T-celler från vildtypsmöss kontra genriktade möss eller i T-celler obehandlade jämfört med behandlade med farmakologiska hämmare. I exemplet som visas i figur 6 behandlades T-celler med PRN694, en småmolekylär hämmare av T-celltyrosinkinaserna, ITK och RLK 9,10. Hämning av ITK/RLK dämpar T-cellsreceptorsignalering, vilket leder till ett minskat kalciumsvar efter stimulering av T-cellsreceptor11 (figur 6A). För att kvantifiera effekterna av ITK/RLK-hämning kan kurvorna som visar förhållandet mellan Indo-1 (kalciumbunden) och Indo-1 (kalciumfri) fluorescens sedan analyseras för arean under kurvan (AUC) eller kurvans lutning för varje tillstånd (figur 6B,C). Denna kvantifiering utförs genom att tidsförloppet för kalciumsvaret delas in i diskreta segment (figur 6A) och att arean under kurvan eller kurvans lutning för varje segment bedöms enligt bilden (figur 6B,C). Sammantaget visar detta protokoll att fullspektrumflödescytometri kan användas för att mäta kalciuminflöde tillsammans med flera cellytmarkörer i immuncellpopulationer som undersöks. Dessa resultat visar att cellundergrupper representerade vid mer än 1% av den totala befolkningen kan bedömas för kalciuminflöde över tid. Däremot kräver mindre rikliga celldelmängder alternativ analys med hjälp av tidsmoment.
Statistisk analys av kalciumresponsdata är specifik för den experimentella frågan och de biologiska analyser som utförs. I de data som presenteras i manuskriptet utfördes experiment med replikat för att säkerställa experimentell noggrannhet och metodens robusthet; Flera experiment på olika biologiska prover under olika dagar utfördes emellertid inte. Det skulle därför inte vara lämpligt att utföra statistiska analyser på grundval av de uppgifter som presenteras.
Figur 1: Schematisk bild av arbetsflödet för kalciumanalys. Användningen av Indo-1 AM-esterkalciumindikatorfärgämnet ger ett verktyg för att visualisera tillströmningen av kalcium i immunceller och deras delpopulationer. Detta schema beskriver arbetsflödet för analys av kalciumsvar i murina mjält-T-celler. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Omvandling av PMT-våglängder till APD-kanaler. Fullspektrumflödescytometern har 16 detektorer för att detektera fluorescerande utsläpp efter excitation av UV-lasern. Specifikationerna för varje detektor anges i tabellen. Markerade är de två detektorer som används för bedömning av Indo-1-fluorescens, som bestämdes empiriskt med hjälp av enstaka färgade kontroller. Konverteringar till APD-våglängd och användarmanual för spektralflödescytometer finns tillgängliga11. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Visualisering av Indo-1-spektralsignaturen. (A) Överst: Spektral signatur av Indo-1-fluorescens i CD8+ T-celler efter jonomycinintroduktion för att framkalla ett robust inflöde av kalcium. Toppen av Indo-1 (kalciumbunden) kan visualiseras i UV1. Botten: Spektral signatur av Indo-1 (kalciumfri) som visar toppfluorescensen i UV7. Detta kontrollprov genererades genom att behandla Indo-1-laddade celler med EGTA12 för att kelera eventuellt extracellulärt fritt kalcium. (B) Kombinerad fem laserspektrumöverlagring av Indo-1-signaturen, som visar rå spektral MFI till vänster och de normaliserade spektra för Indo-1 bunden kontra fri Indo-1 till höger. Visualisering av övergången från Indo-1 (kalciumfri) i orange till Indo-1 (kalciumbunden) i blått kan lätt detekteras. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Gating strategi för visualisering av kalciumsvar. Arbetsflödet för sekventiell grindning av exemplen beskrivs. (A) Fluidisk stabilitet undersöks med hjälp av en tid kontra SSC-A-grind. (B) FSC-A kontra SSC-A används för att grinda på lymfocyter, varigenom cellskräp och kvarvarande röda blodkroppar i provet elimineras. (C) Enstaka celler är gated på med hjälp av en SSC-H kontra SSC-A-plot. (D). Singlettgrinden appliceras sedan på en tomt av levande död Ghost540 kontra SSC-A; gating på Ghost540-negativa celler eliminerar icke-livskraftiga celler från efterföljande analys. (E) Levande celler analyseras för CD19 kontra SSC-A, och CD19-negativa celler (icke-B-celler) är gated på. (F) De CD19-negativa cellerna undersöks för CD4 kontra CD8-färgning. (G) CD4 + -celler är sedan gated på för att visualisera tid kontra Indo-1 (kalciumbunden). (H) Ett ögonblick i tiden väljs för att representera initieringen av kalciuminflödessvaret efter anti-CD3-antikroppstillsats genom att visualisera Indo-1 (kalciumfri) kontra Indo-1 (kalciumbunden) fluorescens. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Visualisering av Indo-1-fluorescens i gated populationer av murina tymocyter vid diskreta tidpunkter i kalciumsvaret. Totalt tymocyter stimulerades med anti-CD3-antikroppar följt av jonomycin efter 6 min av provinsamlingen. Vid fyra diskreta tidpunkter, som indikeras i de rektangulära rutorna som skisseras på de tvådimensionella tidsdiagrammen kontra Indo-1 (kalciumbunden), undersöktes olika subpopulationer av tymocyter för kalciumsvar. (A) Tvådimensionella diagram som visar grindar för baslinjens Indo-1-signal, toppresponsen, 5 min respons efter topp och svaret på jonomycin. Under varje diagram visas CD4 kontra CD8-färgning (vänster) och diagrammet för Indo-1 (kalciumfritt) kontra Indo-1 (kalciumbundet) på gated CD4 enstaka positiva (SP) tymocyter. (B) Diagram över Indo-1 (kalciumfri) kontra Indo-1 (kalciumbunden) på gated undergrupper av tymocyter visas vid var och en av de fyra tidpunkterna, med användning av grindstrategin som visas i (A). (C) Tvådimensionella diagram skapades som visar färgning av totala tymocyter med de indikerade antikropparna. Specifika undergrupper gated (övre raden) på och undersöktes för kalciumsvar kontra tid (botten). Ljusblå (SP) CD8 + -population, röd (SP) CD4-befolkning, som uppvisar störst tillströmning av kalcium, orange CD4 + CD8 + dubbelpositiva tymocyter, mörkgröna iNKT-celler, ljusgröna CD25 +, lila TCRγδ + T-celler och svarta CD19 + B-celler. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Hämning av kalciumsvaret i CD8+ T-celler behandlade med en småmolekylär hämmare av ITK/RLK. Under Indo-1-färgladdningen behandlades splenocyter med två doser PRN694, 100 nM (mörkgrå) och 200 nM (ljusgrå). (A) Indo-1-förhållandet (kalciumbundet/kalciumfritt) visas mot tiden för obehandlade celler (röda) och celler behandlade med PRN694. Kurvor visar kalciumrespons hos gated CD8+ T-celler. Den svarta linjen representerar den negativa kontrollen av splenocyter laddade med Indo-1 och ytfärgade, men inte stimulerade med anti-CD3-antikropp. (B,C) Data kan analyseras genom att dividera tidsaxeln som visas i (A) i åtta segment, visualiserade med svarta prickade linjer, och beräkna arean under kurvan (AUC) (B), eller lutningen för varje kurva (lutning) (C) vid varje tidsintervall för svaret. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en optimerad analys utformad för att mäta kalciumsvar i primära murina T-celler laddade med titrerade Indo-1-ratiometriska indikatorfärgämne med fullspektrumflödescytometri 7,8. Fördelen med att utföra kalciumflödesanalyser med fullspektrumflödescytometri är förmågan att multiplexera ytcellmarkörfärgning i kombination med bedömning av Indo-1-fluorescens. Fullspektrumflödescytometri har fördelen att tillåta användning av mycket överlappande färgämnen, vilket ökar antalet markörer som kan användas i en panel. Detta beror på det faktum att fullspektrumflödescytometern samlar allt laserljus som emitteras över en rad detektorer för varje analyserat prov, snarare än att ha en detektor dedikerad till en fluorokrom. Användning av hela spektrumet för varje fluor möjliggör högre känslighet hos analysen och ger ett sätt att identifiera spektralt unika fluorokromer som skulle ha överlappande signaler om de samlades in på en bandpassflödescytometer. Detta eliminerar också behovet av förisolering av en celldelmängd som undersöks.
I denna studie utvärderades en panel av cellytemarkörer med fluorkromkonjugerade antikroppar. Denna panel inkluderade αCD4-APC-Cy7, αCD8-FITC, αCD19-PE, αTCRβ-PerCP-Cy5.5, α-TCRδ-PE-Cy5, αCD25-PE-Cy7 och CD1d-αgal-cer tetramer-APC; Dessutom inkluderade panelen det levande döda Ghost540-färgämnet. Den optimala kanalen för att detektera var och en av dessa fluorokromer finns i användarhandboken för fullspektrumflödescytometer13. Däremot bestämdes detektionen av Indo-1 (kalciumfri) och Indo-1 (kalciumbunden) empiriskt, även om en ungefärlig toppkanal för detektion av varje fluorescerande signatur uppskattades baserat på de kända toppemissionsvåglängderna för de två formerna av Indo-1. Det är också möjligt att omvandla toppemissionsvåglängderna från bandpassfiltervåglängder som används på konventionella flödescytometrar och mäts i nm till deras respektive kanaler på Avalanche Photo Diode (APD) -detektorerna som används av fullspektrumflödescytometern; Detta kan också ge en uppskattning av optimala kanaler för att detektera Indo-1 (kalciumfri) respektive Indo-1 (kalciumbunden). Eftersom enkelfärgade kontroller ingår för varje fluorescerande tagg, dekonvoluerar blandningsprocessen de fluorescerande signaturerna, vilket möjliggör visualisering av varje fluorokroms intensitet på celler i varje prov. Som beskrivs i denna metod kan dataanalys utföras genom grindning på celldelmängder av intresse och visualisera förhållandet mellan detektera Indo-1 (kalciumfri) och Indo-1 (kalciumbunden) kontra tid.
Det finns begränsningar för denna analys. Till exempel möjliggjorde koncentrationer av Indo-1 under 3 μM inte framgångsrik visualisering av kalciuminflödessvaret i T-celler. Eftersom denna analys också rymmer multiplexeringsmätningar av kalciumsvaret med analys av flera cellytmarkörer på heterogena populationer av celler med användning av fullspektrumflödescytometri, är det absolut nödvändigt att noggrant titrera alla fluorescerande märkta antikroppar som används, inklusive de som används för de enda färgade kontrollerna. Detta är viktigt för en framgångsrik implementering av den mycket känsliga linjära oblandningsalgoritmen14. Dessutom kunde en fullständig tidsförlopp av kalciuminflöde inte visualiseras för cellundergrupper som representerar mindre än 1% av den totala populationen som analyseras. Istället krävde en bedömning av kalciumsvaret i dessa sällsynta undergrupper en alternativ analysstrategi med hjälp av moment i tid15. Momenten i tidsanalysen ger ögonblicksbilder av de fluorescerande signalerna från Indo-1 (kalciumfri) kontra Indo-1 (kalciumbunden) vid diskreta stadier av kalciumsvaret, snarare än hela svarets tidsförlopp. Slutligen är det också viktigt att känna igen begränsningarna med att använda enstaka ytmarkörer för att definiera delmängder av T-celler. Till exempel är färgning av tymocyter med α-CD25-antikropp inte tillräcklig för att skilja CD4 + regulatoriska T-celler från alla andra tymocytpopulationer. Detta beror på det faktum att majoriteten av tidiga tymocytprogenitorceller (CD4-CD8-) också uttrycker CD2516. Detta kommer sannolikt att förklara frånvaron av ett detekterbart kalciuminflödessvar i gated CD4 + CD25 + tymocyter.
Optimeringen av detta protokoll krävde noggrann bedömning av flera variabler som var nyckeln till analysframgång. Dessa inkluderar optimering av den specifika klonen av anti-CD3-antikropp som används, titrering av den optimala koncentrationen av denna antikropp och behovet av antikroppstvärbindning med det traditionella biotin/streptavidin-systemet. För murina T-celler befanns koncentrationen av 30 μg/prov för 6 x 106 celler i en volym på 500 μl vara den minsta mängd antikroppar som krävs för optimala kalciumsvar. Intressant nog observerades robusta kalciumsvar med anti-CD3-antikroppsklon 17A2, men inte med klon 145-2C11; Vid användning av klon 17A2 var det dessutom onödigt att lägga till ett sekundärt tvärbindningsreagens17. Tester med biotinylerad anti-CD3-klon 17A2 med eller utan streptavidin visade ingen förbättring av kalciumsvaret i närvaro av streptavidins tvärbindning. Det är möjligt att denna antikropp inkluderade aggregat och att dessa aggregat stod för antikroppens stimuleringseffekt i frånvaro av öppen tvärbindning. Eftersom dessa experiment utfördes under många månader med olika injektionsflaskor av denna anti-CD3-antikropp, var de erhållna resultaten mycket reproducerbara; därför är det inte troligt att denna antikropps förmåga att stimulera T-celler varierar mellan användare.
Robusta kalciumreaktioner i primära T-celler kräver att cellerna hålls vid den biologiska temperaturen 37 °C under hela provförvärvet. Däremot kommer primära B-celler att visa ett kalciumsvar på anti-IgM-antikroppar vid rumstemperatur. Baserat på känsligheten hos T-cellens kalciumsvar på temperaturen är det viktigt att säkerställa att varje prov behandlas på samma sätt; Till exempel måste varje prov värmas till 37 °C med samma metod och under samma tid. I avsaknad av denna konsistens kan variationer i kalciumreaktioner observeras, men behöver inte vara en indikation på biologiskt relevanta skillnader mellan prover.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll detaljerna för att utföra kalciumflödesanalyser baserat på bedömningen av Indo-1-fluorescens med fullspektrumflödescytometri i kombination med multiplex ytcellmarkörfärgning. Metoden gör det möjligt för utredare att undvika behovet av isolering eller sortering av specifika cellpopulationer före märkning av kalciumfärgämne. Dessutom beskriver detta protokoll en ytterligare analysmetod som används för att visualisera kalciumsvar vid diskreta ögonblick i tiden inom distinkta cellsubpopulationer. Momenten i tidsanalysen kan framgångsrikt tillämpas på sällsynta (<1% av totala) cellpopulationer, som annars inte kan detekteras vid bedömning av hela kalciumresponskurvan. I framtiden kan denna analys utvidgas till användning av ytterligare fluorkromkonjugerade antikroppar, med utnyttjande av den omfattande kapaciteten hos fullspektrumflödescytometern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande intressen att deklarera.
Acknowledgments
R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Stort tack till våra kollegor på Cytek för kontinuerliga diskussioner om fullständig spektralcytometrisk analys på Aurora och SpectroFlo-programvaran. Siffror skapades med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well TC treated plates | Cell Treat | 229111 | |
| 50 mL conical | Greiner Bio1 | 41-12-17-03 | 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap |
| 5mL polysterene flow tubes | Corning | 352052 | |
| 5mL syringe | BD syringe | 309646 | plunger only is used sheith is discarded |
| 70uM filter | Greiner bio1 | 542070 | |
| aCD3 (17A2) | Biolegend | 100202 | |
| AKC lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Aurora Spectral Flowcytometer | https://cytekbio.com/pages/aurora | ||
| Bath Beads | coleparmer | Item # UX-06274-52 | |
| CD19 PE | Tonbo | 50-0193-U100 | |
| CD1d Tetramer APC | NIH | ||
| CD25 PECy7 | ebioscience | 15-0251 | |
| CD4 APC Cy7 | Tonbo | 25-0042-U100 | |
| CD8a FITC | ebioscience | 11-0081-85 | |
| Cell Incubator | Formal Scientific | ||
| Dissection Tools forceps | McKesson | #487593 | Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth |
| Dissection Tools Scissors | McKesson | #970135 | Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip |
| DPBS 1x | Gibco | 14190-136 | DPBS |
| EGTA | Fisher | NC1280093 | |
| FBS | Hyclond | SH30071.03 | lot AE29165301 |
| FlowJo Software | https://www.flowjo.com/ | ||
| Indo1-AM Ester Dye | ebioscience | 65-085-39 | Calcium Loading Dye |
| ionomycin | Millipore | 407951-1mg | |
| Live/Dead Ghost 540 | Tonbo | 13-0879-T100 | |
| Microcentrifuge tubes 1.7mL | Light Labs | A-7001 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| PRN694 | Med Chem Express | Hy-12688 | |
| Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) | Tonbo | 70-0161-M001 | FC Block |
| RPMI | Gibco | 1875093 | + phenol red |
| RPMI phenol free | Gibco | 11835030 | -phenol red |
| Table top centrifuge | Beckman Coulter | Allegra612 | |
| TCRβ PerCP Cy5.5 | ebioscience | 45-5961-82 | |
| TCRγ/δ Pe Cy5 | ebioscience | 15-5961-82 | |
| Vi-Cell Blu Reagent Pack | Product No: C06019 | Includes Tripan | |
| Vi-Cell Blu | Beckman Coulter | ||
| Waterbath | Fisher Brand Dry bath |
References
- Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
- Huang, G. N. Cell calcium mobilization study (flow cytometry). Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).
- June, C. H., Moore, J. S. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , Chapter 5, Unit 5.5 (2004).
- Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- McKinnon, K. M.
- Nolan, J. P., Condello, D.
- Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).
- Zhong, Y., et al. Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).
- Gallagher, M. P., et al. Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).
- Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).
- Nakamura, Y. EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels. Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).
- Cytek Aurora Users Guide. Cytek. , Available from: https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf (2022).
- SpctroFlo Software. Cytek. , Available from: https://cytekbio.com/pages/spectro-flo (2022).
- FlowJo Software. Becton-Dickinson. , Available from: https://www.flowjo.com/solutions/flowjo (2022).
- Godfrey, D. I., Zlotnik, A. Control points in early T-cell development. Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).
- Vossen, A. C., et al. Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects. European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).
