Summary
El protocolo describe una lesión cerebral traumática leve en un modelo de ratón. En particular, se explica completamente un protocolo paso a paso para inducir una lesión leve en la cabeza cerrada en la línea media y la caracterización del modelo animal.
Abstract
Se necesitan modelos animales altamente reproducibles de lesión cerebral traumática (LCT), con patologías bien definidas, para probar intervenciones terapéuticas y comprender los mecanismos de cómo una LCT altera la función cerebral. La disponibilidad de múltiples modelos animales de LCT es necesaria para modelar los diferentes aspectos y severidades de TBI observados en las personas. Este manuscrito describe el uso de una lesión en la cabeza cerrada de la línea media (CHI) para desarrollar un modelo de ratón de LCT leve. El modelo se considera leve porque no produce lesiones cerebrales estructurales basadas en neuroimagen o pérdida neuronal macroscópica. Sin embargo, un solo impacto crea suficiente patología que el deterioro cognitivo es medible al menos 1 mes después de la lesión. En el documento se define un protocolo paso a paso para inducir un CHI en ratones utilizando un impactador electromagnético guiado estereotaxísticamente. Los beneficios del modelo de CHI leve en la línea media incluyen la reproducibilidad de los cambios inducidos por la lesión con baja mortalidad. El modelo se ha caracterizado temporalmente hasta 1 año después de la lesión por neuroimagen, cambios neuroquímicos, neuropatológicos y de comportamiento. El modelo es complementario a los modelos de cráneo abierto de impacto cortical controlado utilizando el mismo dispositivo impactador. Por lo tanto, los laboratorios pueden modelar tanto la LCT difusa leve como la LCT focal de moderada a grave con el mismo impactador.
Introduction
La lesión cerebral traumática (TBI) es causada por una fuerza externa en el cerebro, a menudo asociada con caídas, lesiones deportivas, violencia física o accidentes de tráfico. En 2014, los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades determinaron que 2.53 millones de estadounidenses visitaron el departamento de emergencias para buscar ayuda médica para accidentes relacionados con TBI1. Dado que la LCT leve (LCTm) representa la mayoría de los casos de LCT, en las últimas décadas, se han adoptado múltiples modelos de LCTm, que incluyen pérdida de peso, lesión en la cabeza cerrada impulsada por el pistón e impacto cortical controlado, lesión rotacional, lesión leve por percusión de fluidos y modelos de lesiones por explosión 2,3. La heterogeneidad de los modelos de mTBI es útil para abordar las diferentes características asociadas con mTBI observadas en personas y para ayudar a evaluar los mecanismos celulares y moleculares asociados con la lesión cerebral.
De los modelos comúnmente utilizados de traumatismo craneoencefálico cerrado, uno de los primeros y más utilizados es el método de caída de peso, donde un objeto se deja caer desde una altura específica sobre la cabeza del animal (anestesiado o despierto)2,4. En el método de pérdida de peso, la gravedad de la lesión depende de varios parámetros, incluyendo craneotomía realizada o no, cabeza fija o libre, y la distancia y el peso del objeto que cae 2,4. Una desventaja de este modelo es la alta variabilidad en la gravedad de la lesión y la alta tasa de mortalidad asociada a la depresión respiratoria 5,6. Una alternativa común es administrar el impacto utilizando un dispositivo neumático o electromagnético, que se puede hacer directamente sobre la duramadre expuesta (impacto cortical controlado: CCI) o el cráneo cerrado (lesión cerrada en la cabeza: CHI). Uno de los puntos fuertes de la lesión impulsada por pistón es su alta reproducibilidad y baja mortalidad. Sin embargo, la ICC requiere craneotomía7,8, y una craneotomía en sí misma induce inflamación9. En cambio, en el modelo CHI, no hay necesidad de craneotomía. Como ya se ha dicho, cada modelo tiene limitaciones. Una de las limitaciones del modelo CHI descrito en este trabajo es que la cirugía se realiza utilizando un marco estereotáxico y la cabeza del animal está inmovilizada. Si bien la inmovilización completa de la cabeza asegura la reproducibilidad, no tiene en cuenta el movimiento después del impacto que podría contribuir a la lesión asociada con una mTBI.
Este protocolo describe un método básico para realizar un impacto CHI con un dispositivo impactador electromagnético disponible comercialmente10 en un ratón. Este protocolo detalla los parámetros exactos involucrados para lograr una lesión altamente reproducible. En particular, el investigador tiene un control preciso sobre los parámetros (profundidad de la lesión, tiempo de permanencia y velocidad de impacto) para definir con precisión la gravedad de la lesión. Como se ha descrito, este modelo de CHI produce una lesión que resulta en patología bilateral, tanto difusa como microscópica (es decir, activación crónica de la glía, daño axonal y vascular), y fenotipos conductuales 11,12,13,14,15. Además, el modelo descrito se considera leve ya que no induce lesiones cerebrales estructurales basadas en RM o lesiones macroscópicas en patología incluso 1 año después de la lesión16,17.
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Protocol
Los experimentos realizados fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Kentucky, y durante el estudio se siguieron las pautas ARRIVE y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Configuración quirúrgica
NOTA: Los ratones se alojan en grupos de 4-5 / jaula, la humedad en la sala de alojamiento se mantiene en 43% -47%, y la temperatura se mantiene a 22-23 ° C. A los ratones se les da acceso ad libitum a alimentos y agua y se les expone a un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h (7 a.m./7 p.m.).
- Use un área quirúrgica designada, como una capucha o una sala de procedimientos quirúrgicos dedicada, para realizar la cirugía con animales.
- Asegúrese de que el área quirúrgica incluya una almohadilla térmica, un marco estereotáxico equipado con un impactador electromagnético y una máscara de anestesia diseñada para administrar gas isoflurano (ver Figura 1A).
- Asegúrese de que el cirujano o el personal involucrado en la cirugía use una bata de laboratorio limpia, una máscara facial, guantes y una gorra quirúrgica.
- Use herramientas quirúrgicas estériles, aplicadores estériles con punta de algodón y almohadillas de gasa. Use un esterilizador de cuentas calientes para esterilizar los instrumentos entre ratones durante el día de la cirugía.
- Use una cámara de inducción de anestesia para preparar al ratón para la cirugía en un área preoperatoria.
- Use almohadillas térmicas para mantener la temperatura del animal, limpie las jaulas de retención del ratón después de la operación y temporizadores para registrar el reflejo de enderezamiento del ratón después de la cirugía.
2. Procedimiento preoperatorio
- Prepare el aparato de soporte de la cabeza (véase la figura 1B).
- Retire la cresta del extremo enrollado de una bombilla de pipeta de látex de 1 ml (extremo inflable) (véase la figura 1C).
- Conecte la bombilla al tubo usando parafilm (ver Figura 1C).
- Conecte el tubo a una jeringa de 10 ml usando una llave de paso. Llene la jeringa con agua (véase la figura 1C).
NOTA: La bombilla de pipeta de látex de 1 ml se colocará debajo de la cabeza del ratón para desplazar la fuerza de impacto lejos de las orejas. Trate de eliminar la mayor cantidad de aire posible de la bombilla antes de usarla para que la bombilla se llene principalmente con agua y no con aire.
- Configuración del impactador.
- Seleccione la punta de la sonda de 5 mm, atorníllela al pistón en la parte inferior central del actuador (dentro del cilindro más grande) y apriete suavemente la sonda sin aplicar una fuerza excesiva. Vuelva a apretar la punta entre impactos (ver Figura 1B).
- Antes de encender el impactador, asegúrese de que el interruptor Extender/Retraer esté colocado en la posición central de apagado. A continuación, conecte el cable del actuador al conector del panel frontal de la caja de control del impactador y el cable del sensor al conector del panel frontal. Luego, encienda el interruptor de encendido en el panel posterior (consulte la Figura 1D).
NOTA: El interruptor de palanca Extender/Retraer debe permanecer en la posición central de apagado cuando no esté en uso. - Configure la velocidad de impacto girando la perilla grande en el lado izquierdo de la caja de control hasta que aparezca una velocidad de impacto de 5,0 ± 0,2 m/s en la pantalla (consulte la figura 1D).
- Ajuste el contador de permanencia a 100 ms girando los diales hasta que la permanencia lea 0,01 (consulte la figura 1D).
NOTA: La permanencia es el tiempo de contacto antes de que se produzca la retracción automática. - Coloque el actuador del impactador en una bolsa de hielo para evitar que el cilindro de plástico se expanda, lo que bloquea el cilindro en su lugar, evitando el movimiento del cilindro y la entrega de impactos futuros (ver Figura 1E).
- Prepare al ratón para la cirugía.
- Inspeccione visualmente el ratón antes de la cirugía y elimine al ratón del estudio si se observa una de las siguientes condiciones: mal estado del pelaje, letargo o peso deficiente (<20 g) para un ratón de 4 meses de edad.
- Anestesiar al ratón con isoflurano al 4% -5% en oxígeno al 100% utilizando una cámara de inducción colocada en una almohadilla térmica durante 1-2 min.
- Afeite el pelaje del sitio operatorio con un cortapelos eléctrico.
- Limpie la cabeza con almohadillas estériles de preparación de alcohol y aplique un anestésico tópico en el cuero cabelludo afeitado al menos 15 minutos antes del inicio de la cirugía.
- Devuelva el ratón a una jaula de retención limpia antes de la cirugía. Comience la cirugía después de al menos 15 minutos de aplicación de anestesia tópica (tiempo de inducción).
NOTA: El tiempo para la anestesia puede variar dependiendo de la anestesia utilizada en el procedimiento.
- Compruebe una vez más que el marco estereotáxico, el impactador y la pantalla estereotáxica digital (consulte la figura 1F) estén listos para ser utilizados.
- Devuelva el ratón a la cámara de inducción de isoflurano con 4% -5% de isoflurano en oxígeno al 100% durante aproximadamente 3 minutos.
- Fije el ratón en el escenario de la cabeza.
3. Procedimiento quirúrgico
- Asegure el ratón en el marco estereotáxico utilizando barras para los oídos de punta cónica de resina acetálica ligera, una barra de mordida y una máscara de anestesia de ratón (consulte la Figura 1G, H). El gas isoflurano se suministra al 2% -3% en el aire ambiente a 100-200 ml / min. Controle cuidadosamente la respiración del ratón para garantizar la profundidad de la anestesia y ajustar el nivel de gas según sea necesario.
- Aplique lubricante estéril para los ojos en los ojos para evitar el secado de la córnea.
- Esterilice el cuero cabelludo con hisopos de povidona yodada y almohadillas de alcohol estériles tres veces.
- Asegúrese de que el ratón esté profundamente anestesiado verificando la falta de una respuesta de pellizco del dedo del pie.
- Haga una incisión de aproximadamente 1 cm en la línea media del cuero cabelludo entre los ojos y el cuello con un bisturí, exponiendo el cráneo (ver Figura 1I).
- Deje que el cráneo se seque durante 1-2 min.
- Identifique bregma (el punto de intersección de las suturas coronal y sagital) y lambda (la intersección de las suturas sagital y lambdoidea) (ver Figura 1J).
NOTA: Se podría usar un atlas cerebral de ratón como referencia. - Coloque el aparato de soporte de la cabeza debajo de la cabeza e infle la bombilla con agua hasta que presione contra la parte inferior de la cabeza del ratón, pero sin levantar la cabeza lejos de la barra de mordida.
NOTA: Este paso es esencial para reducir los posibles problemas de oído del CHI. Cualquier animal con daño en el oído de las barras del oído, lo que resulta en rodar o sangrar, debe ser eliminado del estudio y sacrificado. - Coloque el impactador en su lugar sobre la cabeza del animal.
- Extienda el impactador colocando el interruptor de palanca Extender /Retraer (en la caja de control del impactador) en Extender.
NOTA: Asegúrese de verificar que la punta esté completamente extendida tirando hacia abajo de la punta. - Alinee el impactador hasta que esté centrado sobre el bregma (ver Figura 1K).
- Restablezca las coordenadas x e y estereotáxicas digitales en el lector estereotáxico a 0 (en el control de pantalla táctil)
- Alinee la sonda sobre la ubicación del impacto moviendo la sonda desde el bregma hasta las coordenadas objetivo: medial-lateral = 0,0 mm, anterior-posterior = −1,6 mm.
- Sujete el sensor de contacto a la oreja del animal.
- Baje lentamente la punta de la sonda con la sonda extendida hasta que se haga el primer contacto con la superficie. Deténgase en el pitido.
- Restablezca las coordenadas z estereotáxicas digitales en el lector estereotáxico a 0.
- Inspeccione cuidadosamente si la punta está al ras del cráneo (planos medial-lateral y anterior-posterior).
NOTA: Colocar la punta de la sonda es el paso más crucial de este proceso para prevenir fracturas de cráneo y daño en el oído. - Retraiga el impactador colocando el interruptor de palanca en la caja de control en la posición Retraer. La punta se retira y no tiene más contacto con la cabeza del animal hasta el momento del impacto.
- Ajuste la profundidad de impacto ajustando la profundidad dorsal-ventral a -1,2 mm.
NOTA: La profundidad del impacto afecta la gravedad de la lesión. La profundidad debe ajustarse para diferentes edades, pesos y cepas de ratones a la gravedad de la lesión deseada. Es posible que sea necesario ajustar / volver a valorar la profundidad con el tiempo para mantener una gravedad constante de la lesión. La gravedad se puede evaluar neuropatológicamente: microglía y astrocitos (IHC), y conductualmente: el laberinto de agua del brazo radial y la prueba de evitación activa. - Controle cuidadosamente la respiración del ratón para asegurar la profundidad de la anestesia y ajustar el nivel de gas según sea necesario.
NOTA: A menudo, el porcentaje de gas isoflurano debe reducirse o apagarse durante 10-20 s antes del impacto. Observe atentamente que la respiración se acelere ligeramente. Si la respiración es demasiado lenta en el momento del impacto, el animal puede morir dentro de los primeros 60 s después del impacto de la apnea. Esto se puede prevenir ajustando la profundidad de la anestesia en los segundos previos al impacto. - Inducir el impacto presionando el interruptor de palanca derecho para impactar. La punta de la sonda baja a la velocidad mostrada y luego permanece hacia abajo durante el tiempo de permanencia establecido y se retrae.
NOTA: Los ratones simulados reciben un manejo idéntico al de los ratones CHI, pero el impacto no se entrega. - Inicie el temporizador inmediatamente después de que se entregue el impacto CHI para registrar los tiempos de enderezamiento (tiempo para regresar de la posición lateral a la posición prona) o inicie el temporizador cuando el mouse se retire del marco estereotáxico para los ratones simulados. El tiempo promedio de reflejo de enderezamiento es de 5-15 min.
NOTA: Los tiempos de reflejo de enderezamiento pueden variar según la tensión del ratón y la edad. - Evalúe a los ratones para detectar fracturas visibles de cráneo, hemorragias y apnea. Excluir a los ratones con una fractura de cráneo deprimida o hemorragia visible del estudio.
NOTA: Hay niveles graduados de fracturas de cráneo. Los animales con fracturas de cráneo descomprimidas, donde el hueso está presionando observablemente el tejido cerebral, son sacrificados (CO2 primero, y decapitación utilizada como método secundario). Si la punta del impactador está configurada correctamente, estos tipos de fracturas de cráneo son extremadamente raras. Si se produce una fractura de cráneo, la presentación más común es una pequeña gota de sangre en el cráneo y un ligero desbaste táctil del cráneo, a menudo a lo largo de la sutura que conecta la punta posterior del hueso nasal. Estos ratones se señalan como posible fractura de cráneo en los registros, pero normalmente no se excluyen del estudio. - Retire al animal del marco estereotáxico.
- Cierre el cuero cabelludo grapando la piel junta.
NOTA: Las suturas absorbibles o no absorbibles podrían usarse para cerrar el cuero cabelludo como alternativa a las grapas. - Aplique ungüento antibiótico triple con un aplicador estéril con punta de algodón en la incisión cerrada.
- Devuelva el ratón a una jaula de retención limpia para su recuperación. La mitad de la jaula de recuperación está en una almohadilla térmica (ajuste bajo), lo que proporciona la capacidad de alejarse del calor cuando está despierto y mantener la temperatura del animal mientras está inconsciente (ver Figura 1L).
NOTA: El ratón se coloca de lado en la jaula de recuperación. Para evitar la asfixia, coloque al animal en una jaula de recuperación sin ropa de cama o en un pañuelo desechable si la ropa de cama está en la jaula. - Vuelva a colocar el interruptor de alternancia Extender/Retraer a la posición Centro/Desactivado .
NOTA: La corriente continuará funcionando si el interruptor se deja en la posición de extensión o retracción, lo que hace que el pistón se hinche. El impactador no funcionará hasta que el pistón se enfríe. - Retire el impactador de su soporte y colóquelo suavemente sobre la bolsa de hielo.
NOTA: Mantener el impactador en una bolsa de hielo ayuda a reducir la posible hinchazón del impactador. - Monitoree al animal hasta que ocurra el reflejo de enderezamiento y documente el tiempo hasta el enderezamiento (ver Figura 1M).
NOTA: El reflejo de enderezamiento se define como el momento en que el ratón vuelve a una posición prona. La jaula debe dejarse intacta; El ratón podría enderezar si la jaula es tocada, movida o expuesta a algunos ruidos. - Devuelva a los ratones a la jaula de su casa cuando estén despiertos y alertas. Por lo general, dentro de 1 hora después de la lesión, los animales están completamente conscientes y deambulando. Además, agregue un poco de comida húmeda en el fondo de la jaula.
4. Cuidados postoperatorios
- Controle a los animales durante 5 días después de la cirugía.
- Registre su peso y cualquier cambio físico / conductual como frecuencia respiratoria (función respiratoria cualitativa), marcha, condición del cuerpo y el pelaje, comer, beber, defecar y orinar.
- Observe el ratón para detectar cualquier signo de incomodidad y la herida quirúrgica para detectar hinchazón, exudados o bordes rojos, ordehiscencia. Póngase en contacto con un veterinario si el animal muestra signos de dolor y malestar (vocalizaciones, no se mueve, hipotermia, no bebe ni come).
- Retire las grapas 7-10 días después de la cirugía bajo anestesia y en una almohadilla térmica.
NOTA: Si se utilizan suturas no absorbibles, deben retirarse 7-10 días después de la cirugía bajo anestesia.
5. Limpieza
- Limpie y esterilice el área quirúrgica y las herramientas.
- Limpie la punta de la sonda después de cada uso y al final del día con almohadillas de preparación de alcohol.
NOTA: El impactador se calibra en fábrica y se informa que es estable en el tiempo y el uso. No se necesita calibración de rutina. Sin embargo, el impactador y el marco estereotáxico deben inspeccionarse rutinariamente. Además, los perímetros del punto final del modelo, como el tiempo reflejo de enderezamiento, la mortalidad y la neuropatología, deben monitorearse para evaluar la posible deriva experimental.
6. Criterios de exclusión
- Excluya animales antes de la cirugía con un estado de salud deficiente, como peso deficiente < 20 g para un ratón de 4 meses de edad, letargo y mal estado del pelaje.
- Excluya animales con complicaciones durante la cirugía, como una fractura de cráneo deprimida, una hemorragia visible relacionada con la cirugía o sangrado del oído.
- Excluir animales del estudio con los siguientes síntomas postoperatorios: falta de comer y/o moverse normalmente, vocalizaciones inusuales, pérdida de peso o incapacidad de la cicatrización normal de la herida después de la cirugía.
NOTA: Este modelo podría usarse como un modelo repetitivo de LCT leve. Si los ratones reciben la segunda cirugía con 24 h de diferencia con la primera, se podrían quitar las grapas o la sutura, y se podría usar la misma incisión para exponer el cráneo. Se debe hacer una nueva incisión si transcurre más tiempo entre las cirugías.
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Representative Results
Este dispositivo impactador electromagnético estereotáxico es versátil. Se utiliza tanto para un impacto cortical controlado por el cráneo abierto (CCI) como para una cirugía de lesión cerrada en la cabeza (CHI). Además, la gravedad de la lesión se puede modular cambiando los parámetros de la lesión, como la velocidad del impacto, el tiempo de permanencia, la profundidad del impacto, la punta del impactador y el objetivo de la lesión. Aquí se describe una cirugía CHI utilizando un impactador de punta de acero de 5.0 mm. Esta lesión se considera leve porque no hay lesiones cerebrales estructurales. La tasa de mortalidad en ratones adultos es inferior al 0,9%11,14 y aumenta ligeramente hasta alcanzar ~2,5% en ratones más viejos (>8 meses de edad)11. La mortalidad ocurre durante los primeros 2 minutos debido a la apnea, que puede prevenirse en gran medida monitoreando cuidadosamente la profundidad de la anestesia en los segundos previos al impacto.
La ventaja de este modelo CHI es que el impacto produce patología difusa bilateral sin necesidad de exponer la superficie dural cortical (craneotomía). Otra característica que hace que este sea un modelo de LCT efectivo es que menos del 1% de los ratones están excluidos del estudio debido a fracturas de cráneo o problemas de oído después del procedimiento quirúrgico. Es importante destacar que el modelo produce alteraciones neuropatológicas y conductuales con un solo impacto, lo que reduce la complejidad experimental asociada con los modelos repetitivos de CHI leve15. Por ejemplo, se identifica un patrón temporal reproducible de microglía y cambios morfológicos de astrocitos11 (Figura 2A,B). Al validar el modelo, se recomienda utilizar los rangos iniciales de las coordenadas anterior-posterior como −1,5 mm ± 0,2 mm y la profundidad de impacto como 1,0 ± 0,2 mm. Es posible que sea necesario ajustar las coordenadas para la edad y la cepa de los ratones, así como la marca y el modelo del equipo utilizado. Una vez que se han validado los ajustes, deben mantenerse constantes para un experimento. Para la validación, se recomienda la caracterización neuropatológica de la microglía y los astrocitos a los 3 días posteriores a la lesión. La tinción inmunohistoquímica (IHC) se completó siguiendo los métodos de Bachstetter et al.18. Específicamente, se tiñeron secciones coronales de flotación libre de 30 μm para la activación glial con conejo anti-GFAP (1:10.000) y para astrocitos utilizando un conejo anti-IBA1 (1:10.000). Se utilizó una IgG anticonejo de cabra conjugada HRP (1:200) para detectar tanto GFAP como IBA-1. Se utilizó un software de cuantificación para cuantificar la tinción en cada región considerada. Además, a 1 día después de la lesión, se encontraron marcadores de lesión axonal en el neocórtex, y se encontraron cambios en el metabolismo mitocondrial a los 28 días después de CHI16 (datos no mostrados).
Los criterios de valoración secundarios para validar el modelo serían los ensayos de comportamiento. Se encontraron déficits reproducibles inducidos por CHI en el laberinto de agua del brazo radial (RAWM)12 y evitación activa13 comportamientos (Figura 3). Los ratones fueron probados en un RAWM de 8 brazos, una prueba especial de aprendizaje, como se describe en Macheda et al.12. Brevemente, los ratones fueron probados en un total de 28 ensayos durante un protocolo de 4 días y tuvieron 60 s para localizar la plataforma posicionada en el brazo objetivo. El número total de juicios por día fue de siete; El día 1 y el día 2 se consideraron días de entrenamiento y los días 3 y 4 como días de prueba. Durante los días de entrenamiento, los ratones fueron entrenados para localizar la plataforma, alternando entre ensayos visibles y ocultos; Durante los días de prueba, la plataforma se ocultó durante todas las pruebas. Los experimentos se registraron utilizando una cámara y se utilizó un sistema de seguimiento para el análisis del comportamiento (número de errores, distancia total y latencia). Los ratones fueron probados 2 semanas después de la lesión. Si bien no hubo efecto del sexo, los ratones CHI cometieron más errores para realizar con éxito la tarea y llegar a la plataforma (Figura 3A). Además, también se han detectado alteraciones de la memoria en una prueba RAWM de 6 brazos11,14,15,16. La evitación activa, una prueba asociativa basada en el aprendizaje, se ha utilizado para medir los déficits cognitivos asociados con este modelo leve de CHI. Los ratones fueron probados usando un protocolo de 5 días y expuestos a 50 ensayos / día13. Los ratones fueron entrenados para evitar un choque leve del pie (estímulo no condicionado, US) asociando un estímulo condicionado (CS, luz) con él. Con el tiempo, los ratones aprendieron a evitar los EE.UU. cuando se presentó el CS. Los ratones CHI tenían una función cognitiva deteriorada en la evitación activa en comparación con los ratones simulados (Figura 3B). Los ratones hembra simulados aprendieron significativamente más rápido en comparación con los machos, pero el sexo no jugó un papel en los ratones CHI13. El comportamiento se registró utilizando un software de evitación activa / pasiva. No se ha detectado un déficit reproducible en la función motora más allá de la primera semana después de la lesión11.
En este modelo de LCT leve, no se encontraron lesiones estructurales macroscópicas en el cerebro, y un solo impacto indujo activación glial bilateral y cambios en la morfología de la microglía. Además, los déficits cognitivos están asociados con este modelo de LCT.
Figura 1: Paso 1: Configuración del área quirúrgica. (A) Se muestra un ejemplo del área quirúrgica y las herramientas necesarias para realizar la cirugía CHI (bolsa de hielo para el impactador, marco estereotáxico equipado con el impactador, caja de control del impactador y herramientas quirúrgicas). (B) Una vista de primer plano de la punta de la sonda de acero de 5 mm, la barra de mordida y el aparato de soporte de la cabeza, que ilustra el posicionamiento necesario para el impacto de la línea media. (C) El aparato de soporte de la cabeza está hecho de una bombilla de pipeta de látex de 1 ml unida al tubo por parafilm. Una jeringa de 10 ml se llena con agua para inflar la bombilla, con una llave de paso para mantener la bombilla inflada una vez en posición. (D) Caja de control del impactador: (1) una perilla grande para ajustar la velocidad de impacto, (2) un contador de permanencia, (3) un interruptor de palanca de extender / retraer, (4) un interruptor de palanca que, cuando se presiona hacia abajo, entregará el impacto. (E) Cuando no está en uso, el impactador se mantiene en una bolsa de hielo para evitar el sobrecalentamiento y el posible mal funcionamiento. (F) Se utiliza una pantalla estereotáxica digital para establecer las coordenadas x (anterior-posterior), y (medial-lateral) y z (dorsal-ventral). Paso 2: Procedimiento quirúrgico. (G,H) El ratón anestesiado y afeitado se asegura en el marco estereotáxico, (I) se realiza una incisión en la línea media para exponer el (J) bregma, (K) que se usa durante la cirugía para alinear el impactador. Paso 3: Recuperación. (L) El ratón se retira del marco estereotáxico. Después de cerrar el cuero cabelludo grapando o suturando la piel, se coloca en una jaula de recuperación limpia de lado. (M) El ratón es monitoreado hasta que el ratón se da vuelta y se produce el reflejo de enderezamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los patrones temporales de los cambios morfológicos de astrocitos (GFAP) y microglía (IBA1) después de un CHI. (A) La tinción GFAP a bajo aumento muestra el aumento regional de la tinción observado en la corteza del grupo CHI. La apariencia morfológica de los astrocitos se muestra en los recuadros de mayor aumento, que se tomaron de las secciones del cerebro medio y de las mismas regiones de la corteza. (B) La tinción positiva para IBA1 en la corteza a 1 día, 7 días y 2 meses después de la lesión muestra cambios en la morfología de la microglía en el neocórtex después del CHI (n = 7-14, 50/50 hombre/mujer). Los ratones (fondo CD-1/129) tenían 8 meses de edad en el momento de la cirugía. Esta figura ha sido adaptada de 11 y reproducida con permiso. Barra de escala = 1 mm, 50 μm y 100 μm como se indica en la figura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Déficits de memoria inducidos por CHI en RAWM y evitación activa . (A) A las 2 semanas después de la lesión, tanto los ratones operados por CHI como los simulados pudieron aprender la tarea de RAWM, pero los ratones CHI cometieron más errores en comparación con los ratones simulados (*** p < 0.0005); simulado (n = 20/20 hombre/mujer); CHI (n = 20/20 hombre/mujer). Los ratones (C57BL / 6J) tenían 3-4 meses de edad en el momento de la cirugía. (B) A las 4 semanas después de la lesión, los ratones CHI y los ratones operados simulados pudieron aprender la tarea de evitación activa, pero los ratones CHI evitaron menos descargas en los pies en comparación con los ratones simulados (*** p = 0.0005; **** p < 0.0001); simulado (n = 10/10 hombre/mujer); CHI (n = 9/10 hombre/mujer). Los ratones (C57BL / 6J) tenían entre 3 y 5 meses de edad en el momento de la cirugía. Los datos se muestran como media ± SEM. (A) Esta figura ha sido adaptada de 12 y reproducida con permiso. (B) Esta figura ha sido adaptada de 13 y reproducida con autorización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Varios pasos están involucrados en la recreación de un modelo de lesión consistente utilizando el modelo descrito. Primero, es fundamental asegurar correctamente al animal en el marco estereotáxico. La cabeza del animal no debe poder moverse lateralmente, y el cráneo debe estar completamente plano con bregma y lambda leyendo las mismas coordenadas. Colocar correctamente las barras para los oídos es el aspecto más difícil de esta cirugía, y esto solo se puede aprender con la práctica. Si el cráneo no está nivelado, la cabeza debe ajustarse antes de inducir CHI. Si no se ajusta la posición de la cabeza, se producirá una fractura de cráneo. Para evaluar que el cráneo es plano, uno debe mirar el espacio entre el cráneo y la punta de impacto desde todos los ángulos alrededor de la punta. Los ratones con fracturas de cráneo deprimidas deben ser excluidos de los experimentos, ya que tienen una respuesta inflamatoria mucho más fuerte y una lesión más grave en comparación con los ratones que no sufrieron fracturas de cráneo19. Además, los ratones con fracturas de cráneo muestran resultados de LCT más graves, como depresión respiratoria postraumática, lesión de rebote secundario y, finalmente, la muerte20.
En este estudio, la cabeza del animal se aseguró con barras para los oídos. En particular, solo se recomienda usar barras para los oídos de resina acetal específicas para ratones con un punto cónico, no barras grandes para orejas de rata. Es posible usar barras auriculares con punta de goma sin perforación, pero estas barras para los oídos comprimirán el cráneo, alterando la biomecánica del CHI, y son menos reproducibles. Además, existe una limitación para el uso de barras para los oídos, ya que no permite ninguna fuerza de rotación. Sin embargo, la mayor reproducibilidad de las barras auriculares supera el número limitado de fuerzas de rotación que se pueden generar si el cabezal no está fijado.
Sin embargo, fijar la cabeza con barras para los oídos también puede causar lesiones en el oído en el momento del impacto si todas las fuerzas de impacto se colocan en las orejas. Se desarrolló un aparato de soporte de la cabeza colocado debajo de la cabeza para desplazar las fuerzas lejos de las orejas. Después de probar múltiples objetos parecidos a almohadas, el que funcionó mejor fue la bombilla de pipeta de látex de 1 ml llena de agua. La bombilla de pipeta debajo de la cabeza del animal se puede expandir después de que el animal esté en el marco estereotáxico, lo que le permite tener un ajuste ajustado y proporcionar un soporte completo debajo de la cabeza. Cuando se coloca correctamente, no debe haber sangrado de las orejas o indicaciones conductuales de daño en el oído (balanceo / inclinación de la cabeza) después de la lesión.
Algunas versiones del modelo CHI utilizan una sonda de punta de goma 21,22 o un casco de metal 23,24 para reducir la aparición de fracturas de cráneo. Siempre que la punta del impactador de 5 mm esté al ras del cráneo, no es necesario usar ninguno de ellos. Puede ser tentador para los nuevos usuarios que no tienen una amplia experiencia con la cirugía estereotáxica inducir la lesión con la punta no al ras con el cráneo en el plano medial-lateral. Si el cráneo no está nivelado en el plano medial-lateral, es porque las barras auriculares no están colocadas correctamente. La única solución para este problema es quitar al animal del impactador y asignar al ratón a una lesión simulada. Si la punta no está al ras en el plano anterior-posterior, entonces la altura de la barra de mordida debe ajustarse y la punta debe realinearse con el bregma. Además, el uso de un impactador de 5 mm con una punta plana reduce la posibilidad de causar fracturas de cráneo19 en comparación con las puntas de impactador de diámetros más pequeños. Otros factores importantes a considerar son la edad y el peso del sujeto, así como el grosor del cráneo25 y las cepas de los ratones26.
En las personas, una LCT leve no se asocia con la muerte durante los primeros minutos después de la lesión. En los animales, incluso una lesión leve puede causar la muerte. Sin embargo, en este modelo, la mortalidad casi siempre se asocia con complicaciones quirúrgicas, no solo con la lesión. La razón más común por la que un ratón moriría después del impacto es la profundidad de la anestesia. Esto podría ocurrir si la cirugía tomó más tiempo de lo esperado o si el gas isoflurano estaba en una concentración más alta de lo necesario para ese animal. Si la respiración del animal es lenta o dificultosa, esto podría ser una señal de que la profundidad de la anestesia debe reducirse antes de administrar el impacto. Si la respiración del animal es lenta o laboriosa en el momento del impacto, es probable que el animal tenga apnea y pueda morir.
Hay muchos modelos de LCT leve. Cada uno tiene fortalezas y debilidades, y este modelo no es diferente. Como se informó, aquí se describe un modelo de un solo golpe de TBI, sin embargo, el modelo se ha utilizado para causar un TBIrepetitivo 15. Los pasos descritos en este protocolo se pueden repetir para inducir una lesión cerebral traumática repetitiva. Al evaluar los diferentes modelos de LCT, es importante considerar si el modelo tiene la patología deseada que se está tratando de modelar. También se debe considerar cuán reproducible es el modelo. Se recomienda encarecidamente que el punto de partida para usar este o cualquier modelo de LCT sea validar y caracterizar de forma independiente que el modelo funciona como se informó anteriormente.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de adjudicación R01NS120882, RF1NS119165 y R01NS103785 y el número de premio del Departamento de Defensa AZ190017. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud o el Departamento de Defensa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9 mm Autoclip Applier | Braintree scientific | ACS- APL | Surgery |
| 9 mm Autoclip Remover | Braintree scientific | ACS- RMV | Surgery |
| 9 mm Autoclip, Case of 1,000 clips | Braintree scientific | ACS- CS | Surgery (Staples) |
| Aperio ImageScope software | Leica BioSystems | NA | IHC |
| BladeFLASK Blade Remover | Fisher Scientific | 22-444-275 | Surgery |
| Cotton tip applicator | VWR | 89031-270 | Surgery |
| Digitial mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730D | Surgery |
| Dumont #7 Forceps | Roboz | RS-5047 | Surgery |
| Ear bars | Stoelting | 51649 | Surgery |
| EthoVision XT 11.0 | Noldus Information Technology | NA | RAWM |
| Fiber-Lite | Dolan-Jeffer Industries | UN16103-DG | Surgery |
| Fisherbrand Bulb for Small Pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | Head support apparatus |
| Gemini Avoidance System | San Diego Instruments | NA | Active avoidance |
| Heating Pad | Sunbeam | 732500000U | Surgery prep |
| HRP conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immuno Research laboratories | 111-065-144 | IHC |
| Induction chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530XS | Surgery prep |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC: 11695-6777-2 | Surgery |
| Mouse gas anesthesia head holder | Stoelting | 51609M | Surgery |
| Neuropactor Stereotaxic Impactor | Neuroscience Tools | n/a | Surgery: Formally distributed by Lecia as impact one |
| NexGen Mouse 500 | Allentown | n/a | Post-surgery, holding cage |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Head support apparatus |
| Peanut - Professional Hair Clipper | Whal | 8655-200 | Surgery prep |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) available Iodine, for laboratory | Ricca | 3955-16 | Surgery |
| Puralube Vet Oinment,petrolatum ophthalmic ointment, Sterile ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Surgery |
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | IHC |
| Rabbit anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | IHC |
| 8-arm Radial Arm Water Maze | MazeEngineers | n/a | RAWM |
| Scale | OHAUS CS series | BAL-101 | Surgery prep |
| Scalpel Handle #7 Solid 6.25" | Roboz | RS-9847 | Surgery |
| Sterile Alcohol Prep Pads (isopropyl alcohol 70% v/v) | Fisher Brand | 22-363-750 | Surgery prep |
| SumnoSuite low-flow anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Surgery |
| 10 mL syringe Luer-Lok Tip | BD Bard-Parker | 302995 | Head support apparatus |
| Timers | Fisher Scientific | 6KED8 | Surgery |
| Topical anesthetic cream | L.M.X 4 | NDC 0496-0882-15 | Surgery prep |
| Triple antibiotic ointment | Major | NDC 0904-0734-31 | Post-surgery |
| Tubing | MasterFlex | 96410-16 | Head support apparatus |
| Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Surgery prep |
References
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