Summary
이 프로토콜은 마우스 모델에서 경미한 외상성 뇌 손상을 설명합니다. 특히, 경미한 정중선 폐쇄 두부 손상을 유도하기 위한 단계별 프로토콜 및 동물 모델의 특성화가 충분히 설명된다.
Abstract
잘 정의된 병리를 가진 외상성 뇌 손상(TBI)의 재현성이 높은 동물 모델은 치료적 개입을 테스트하고 TBI가 뇌 기능을 어떻게 변화시키는지에 대한 메커니즘을 이해하는 데 필요합니다. TBI의 여러 동물 모델의 가용성은 사람에게서 볼 수 있는 TBI의 다양한 측면과 중증도를 모델링하는 데 필요합니다. 이 원고는 경미한 TBI의 마우스 모델을 개발하기 위해 정중선 폐쇄 두부 손상(CHI)을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 모델은 신경 영상 또는 육안적 신경 손실을 기반으로 하는 구조적 뇌 병변을 생성하지 않기 때문에 경미한 것으로 간주됩니다. 그러나 한 번의 충격으로 부상 후 최소 1개월 후에 인지 장애를 측정할 수 있을 만큼 충분한 병리가 형성됩니다. 정위 유도 전자기 충격기를 사용하여 마우스에서 CHI를 유도하는 단계별 프로토콜이 논문에 정의되어 있습니다. 경미한 정중선 CHI 모델의 이점에는 낮은 사망률로 부상으로 인한 변화의 재현성이 포함됩니다. 이 모델은 신경 영상, 신경 화학적, 신경 병리학 적 및 행동 변화에 대해 손상 후 최대 1 년까지 시간적으로 특성화되었습니다. 이 모델은 동일한 임팩터 장치를 사용하여 제어된 피질 충격의 개방형 두개골 모델을 보완합니다. 따라서 실험실에서는 동일한 임팩터를 사용하여 경미한 확산 TBI와 초점 중등도에서 중증 TBI를 모두 모델링할 수 있습니다.
Introduction
외상성 뇌 손상(TBI)은 종종 낙상, 스포츠 부상, 신체적 폭력 또는 교통사고와 관련된 뇌의 외력에 의해 발생합니다. 2014년 미국 질병통제예방센터(Centers for Disease Control and Prevention)는 253만 명의 미국인이 TBI 관련 사고에 대한 의료 도움을 받기 위해 응급실을 방문했다고 밝혔습니다 1. 경증 TBI(mTBI)가 TBI 사례의 대부분을 차지하기 때문에 지난 수십 년 동안 체중 감소, 피스톤 구동 폐쇄 두부 손상 및 제어된 피질 충격, 회전 손상, 경미한 유체 타격 손상 및 폭발 손상 모델 2,3을 포함하는 여러 mTBI 모델이 채택되었습니다. mTBI 모델의 이질성은 사람에게서 볼 수 있는 mTBI와 관련된 다양한 특징을 해결하고 뇌 손상과 관련된 세포 및 분자 메커니즘을 평가하는 데 유용합니다.
폐쇄 두부 손상의 일반적으로 사용되는 모델 중 최초이자 가장 널리 사용되는 모델 중 하나는 물체를 특정 높이에서 동물의 머리 위로 떨어 뜨리는 체중 낙하 방법입니다 (마취 또는 깨어 있음) 2,4. 체중 감량 방법에서, 부상의 중증도는 개두술 수행 여부, 머리 고정 또는 자유, 낙하물의 거리 및 무게 2,4를 포함한 여러 매개 변수에 따라 달라집니다. 이 모델의 한 가지 단점은 부상의 중증도가 다양하고 호흡 억제와 관련된 사망률이 높다는것입니다 5,6. 일반적인 대안은 공압 또는 전자기 장치를 사용하여 충격을 전달하는 것인데, 이는 노출된 경막(제어된 피질 충격: CCI) 또는 폐쇄된 두개골(폐쇄 두부 손상: CHI)에 직접 수행할 수 있습니다. 피스톤 구동 부상의 장점 중 하나는 높은 재현성과 낮은 사망률입니다. 그러나 CCI는 개두술7,8을 필요로 하며, 개두술 자체는 염증을 유발한다9. 대신 CHI 모델에서는 개두술이 필요하지 않습니다. 이미 언급했듯이 각 모델에는 한계가 있습니다. 본 논문에서 기술한 CHI 모델의 한계 중 하나는 수술이 정위 프레임을 이용하여 수행되고, 동물의 머리가 고정되어 있다는 점이다. 전체 머리 고정은 재현성을 보장하지만 mTBI와 관련된 부상에 기여할 수 있는 충격 후의 움직임을 설명하지 않습니다.
이 프로토콜은 마우스에서 시판되는 전자기 충격기 장치(10)를 사용하여 CHI 충격을 수행하는 기본 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 재현성이 높은 부상을 달성하기 위해 관련된 정확한 매개 변수를 자세히 설명합니다. 특히, 조사자는 부상 심각도를 정확하게 정의하기 위해 매개변수(부상 깊이, 체류 시간 및 충격 속도)를 정밀하게 제어할 수 있습니다. 설명된 바와 같이, 이 CHI 모델은 미만성 및 현미경적 양측 병리(즉, 신경교의 만성 활성화, 축삭 및 혈관 손상) 및 행동 표현형 11,12,13,14,15를 초래하는 손상을 생성합니다. 또한, 기술된 모델은 손상 후 1년이 지나도 MRI에 기초한 구조적 뇌 병변 또는 병리학상의 육안적 병변을 유도하지 않기 때문에 경미한 것으로 간주된다16,17.
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Protocol
수행된 실험은 켄터키 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며 연구 기간 동안 ARRIVE와 실험실 동물 관리 및 사용 가이드라인을 모두 따랐습니다.
1. 외과적 설정
참고: 마우스는 4-5/케이지 그룹으로 사육되며 주거실의 습도는 43%-47%로 유지되며 온도는 22-23°C로 유지됩니다. 생쥐는 음식과 물에 임의로 접근할 수 있으며 12시간/12시간 명암 주기(오전 7시/오후 7시)에 노출됩니다.
- 후드 또는 전용 수술 수술실과 같은 지정된 수술 영역을 사용하여 동물 수술을 수행합니다.
- 수술 부위에 가열 패드, 전자기 충격기가 장착된 정위 프레임, 이소플루란 가스를 투여하도록 설계된 마취 마스크가 포함되어 있는지 확인합니다( 그림 1A 참조).
- 외과 의사 또는 수술에 관련된 직원이 깨끗한 실험실 코트, 안면 마스크, 장갑 및 수술 모자를 착용하도록 하십시오.
- 멸균 수술 도구, 멸균 면봉 어플리케이터 및 거즈 패드를 사용하십시오. 수술 당일 동안 마우스 사이의기구를 멸균하기 위해 뜨거운 구슬 살균기를 사용하십시오.
- 마취 유도 챔버를 사용하여 수술 전 영역에서 수술을 위해 마우스를 준비합니다.
- 가열 패드를 사용하여 동물의 체온을 유지하고, 수술 후 마우스 고정 케이지를 청소하고, 타이머를 사용하여 수술 후 마우스의 오른쪽 반사를 기록합니다.
2. 수술 전 절차
- 머리 지지 장치를 준비합니다( 그림 1B 참조).
- 1mL 라텍스 피펫 전구(팽창식 끝)에서 롤링된 끝 융기를 제거합니다( 그림 1C 참조).
- 파라필름을 사용하여 전구를 튜브에 부착합니다( 그림 1C 참조).
- 스톱콕을 사용하여 튜브를 10mL 주사기에 연결합니다. 주사기에 물을 채웁니다( 그림 1C 참조).
알림: 1mL 라텍스 피펫 전구는 마우스 머리 아래에 배치되어 충격력을 귀에서 멀어지게 합니다. 전구가 공기가 아닌 물로 대부분 채워지도록 사용하기 전에 전구에서 가능한 한 많은 공기를 제거하십시오.
- 임팩터 설정.
- 5mm 프로브 팁을 선택하고 액추에이터 하단 중앙(더 큰 실린더 내부)에 있는 피스톤에 나사로 고정한 다음 과도한 힘을 가하지 않고 프로브를 부드럽게 조입니다. 충격 사이에 팁을 다시 조입니다( 그림 1B 참조).
- 임팩터를 켜기 전에 확장/수축 스위치가 중앙 꺼짐 위치에 있는지 확인하십시오. 그런 다음 액추에이터의 케이블을 임팩터 컨트롤 박스의 전면 패널에 있는 잭에 연결하고 센서 케이블을 전면 패널의 잭에 연결합니다. 그런 다음 후면 패널의 전원 스위치를 켭니다( 그림 1D 참조).
알림: 확장/수축 토글 스위치는 사용하지 않을 때 중앙 꺼짐 위치에 있어야 합니다. - 디스플레이에 5.0 ± 0.2m/s의 충격 속도가 나타날 때까지 컨트롤 박스의 왼쪽에 있는 큰 손잡이를 돌려 충격 속도를 설정합니다( 그림 1D 참조).
- 드웰이 100을 가리킬 때까지 다이얼을 돌려 드웰 카운터를 0.01ms로 설정합니다( 그림 1D 참조).
알림: 드웰은 자동 후퇴가 발생하기 전의 접촉 시간입니다. - 임팩터 액츄에이터를 얼음 팩에 올려 플라스틱 실린더가 팽창하는 것을 방지하여 실린더를 제자리에 고정하여 실린더의 움직임과 향후 충격 전달을 방지합니다( 그림 1E 참조).
- 수술을 위해 마우스를 준비하십시오.
- 수술 전에 마우스를 육안으로 검사하고 4개월 된 마우스의 털 상태가 좋지 않거나 무기력 또는 체중이 좋지 않은 경우(<20g) 조건 중 하나가 관찰되는 경우 연구에서 마우스를 제거합니다.
- 가열 패드에 1-2분 동안 놓인 유도 챔버를 사용하여 100% 산소에 4%-5% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다.
- 전기 머리 깎기를 사용하여 수술 부위의 모피를 면도하십시오.
- 멸균 알코올 준비 패드로 머리를 닦고 수술 시작 최소 15분 전에 면도한 두피에 국소 마취제를 바릅니다.
- 수술 전에 마우스를 깨끗한 고정 케이지로 되돌립니다. 국소 마취 도포 최소 15분(유도 시간) 후 수술을 시작합니다.
참고: 마취 시간은 시술에 사용된 마취제에 따라 다를 수 있습니다.
- 스테레오탁싱 프레임, 임팩터 및 디지털 스테레오탁싱 디스플레이( 그림 1F 참조)를 사용할 준비가 되었는지 한 번 더 확인하십시오.
- 약 3분 동안 100% 산소에 4%-5% 이소플루란이 있는 이소플루란 유도 챔버로 마우스를 되돌립니다.
- 헤드 스테이지에 마우스를 고정하십시오.
3. 수술 절차
- 경량 아세탈 수지 테이퍼 포인트 이어 바, 바이트 바 및 마우스 마취 마스크를 사용하여 마우스를 정위 프레임에 고정합니다( 그림 1G, H 참조). 이소플루란 가스는 100-200mL/min의 실내 공기에서 2%-3%로 전달됩니다. 마우스의 호흡을 주의 깊게 모니터링하여 마취 깊이를 확인하고 필요에 따라 가스 수준을 조정하십시오.
- 각막 건조를 방지하기 위해 멸균 눈 윤활제를 눈에 바르십시오.
- 포비돈 요오드 면봉과 멸균 알코올 패드로 두피를 세 번 소독하십시오.
- 발가락 핀치 반응이 없는지 확인하여 마우스가 심하게 마취되었는지 확인하십시오.
- 메스를 사용하여 눈과 목 사이에 약 1cm의 정중선 두피 절개를 하여 두개골을 노출시킵니다( 그림 1I 참조).
- 두개골을 1-2분 동안 건조시키십시오.
- 브레그마(관상 봉합사와 시상 봉합사의 교차점)와 람다(시상 봉합사와 람도드 봉합사의 교차점)를 식별합니다( 그림 1J 참조).
참고: 마우스 두뇌 지도는 참조용으로 사용할 수 있습니다. - 머리 지지 장치를 머리 아래에 놓고 전구가 마우스 머리 바닥을 누르되 바이트바에서 머리를 들어 올리지 않을 때까지 물로 전구를 팽창시킵니다.
알림: 이 단계는 CHI에서 발생할 수 있는 귀 문제를 줄이는 데 필수적입니다. 귀 막대에서 귀에 손상되어 구르거나 출혈이 있는 동물은 연구에서 제거하고 안락사시켜야 합니다. - 임팩터를 동물의 머리 위로 옮깁니다.
- 확장(Extend)에 확장/수축(Extend)/후퇴(Extend) 토글 스위치(임팩터 컨트롤 박스에 있음)를 배치하여 임팩터를 확장합니다.
알림: 팁을 아래로 당겨 팁이 완전히 확장되었는지 확인하십시오. - 임팩터가 브레그마 중앙에 올 때까지 임팩터를 정렬합니다( 그림 1K 참조).
- 스테레오탁스 리더의 디지털 스테레오택시 x 및 y 좌표를 0으로 재설정(터치 스크린 컨트롤에서)
- 브레그마에서 목표 좌표로 프로브를 이동하여 충격 위치에 프로브를 맞춥니다: 내측-측면 = 0.0mm, 전방-후방 = −1.6mm.
- 접촉 센서를 동물의 귀에 끼웁니다.
- 표면에 처음 닿을 때까지 확장된 프로브로 프로브 팁을 천천히 내립니다. 신호음이 울리면 멈춥니다.
- stereotaxic 판독기의 디지털 stereotaxic z 좌표를 0으로 재설정합니다.
- 팁이 두개골(내측 및 전후면)과 같은 높이인지 주의 깊게 검사합니다.
알림: 프로브 팁의 위치는 두개골 골절과 귀 손상을 방지하기 위한 이 과정의 가장 중요한 단계입니다. - 컨트롤 박스의 토글 스위치를 후퇴 위치에 놓아 임팩터를 후퇴시킵니다. 팁은 물러나고 충격을 받을 때까지 동물의 머리에 더 이상 닿지 않습니다.
- 등쪽 복부 깊이를 -1.2mm로 조정하여 충격 깊이를 설정합니다.
알림: 충격의 깊이는 부상의 심각성에 영향을 미칩니다. 깊이는 원하는 부상 심각도에 따라 다양한 연령, 체중 및 생쥐 균주에 맞게 조정해야 합니다. 일관된 부상 심각도를 유지하기 위해 시간이 지남에 따라 깊이를 조정/재조정해야 할 수도 있습니다. 중증도는 신경병리학적으로 평가할 수 있습니다: 미세아교세포 및 성상교세포(IHC), 행동학적으로: 요골 팔 수중 미로 및 능동적 회피 테스트. - 마우스의 호흡을 주의 깊게 모니터링하여 마취 깊이를 확인하고 필요에 따라 가스 레벨을 조정합니다.
알림: 종종, 퍼센트tage isoflurane 가스는 충격을 받기 전에 10-20초 동안 낮추거나 차단해야 합니다. 호흡이 약간 가속되는지 자세히 관찰하십시오. 충격시 호흡이 너무 느리면 동물은 무호흡 충격 후 처음 60 초 이내에 사망 할 수 있습니다. 이것은 충격 전 몇 초 동안 마취 깊이를 조정하여 예방할 수 있습니다. - 임팩트하려면 오른쪽 토글 스위치를 눌러 임팩트를 유도합니다. 프로브 팁은 표시된 속도로 내려간 다음 설정된 체류 시간 동안 아래로 유지되고 수축됩니다.
참고: 가짜 마우스는 CHI 마우스와 동일한 취급을 받지만 영향은 전달되지 않습니다. - CHI 충격이 전달된 직후 타이머를 시작하여 정정 시간(측면 위치에서 엎드린 위치로 복귀하는 시간)을 기록하거나 가짜 마우스에 대한 스테렉택스 프레임에서 마우스를 제거할 때 타이머를 시작합니다. 평균 교정 반사 시간은 5-15 분입니다.
알림: 교정 반사 시간은 마우스의 긴장과 나이에 따라 달라질 수 있습니다. - 눈에 보이는 두개골 골절, 출혈 및 무호흡증에 대해 마우스를 평가합니다. 우울한 두개골 골절 또는 눈에 보이는 출혈이 있는 마우스는 연구에서 제외합니다.
참고: 두개골 골절의 등급이 매겨진 수준이 있습니다. 뼈가 뇌 조직으로 눈에 띄게 눌려지는 감압 된 두개골 골절이있는 동물은 안락사됩니다 (CO2 첫 번째, 두 번째 방법으로 참수 사용). 임팩터 팁이 올바르게 설정되면 이러한 유형의 두개골 골절은 매우 드뭅니다. 두개골 골절이 발생하면 두개골에 작은 혈액 방울이 떨어지고 두개골이 약간 촉각적으로 거칠어지며 종종 비강 뼈의 뒤쪽 끝을 연결하는 봉합사를 따라 나타납니다. 이 마우스는 기록에서 두개골 골절 가능성이 있는 것으로 기록되어 있지만 일반적으로 연구에서 제외되지는 않습니다. - 입체 프레임에서 동물을 제거하십시오.
- 피부를 함께 스테이플러로 고정하여 두피를 닫습니다.
참고: 흡수성 또는 비흡수성 봉합사는 스테이플의 대안으로 두피를 닫는 데 사용할 수 있습니다. - 닫힌 절개 부위에 멸균된 면봉 어플리케이터를 사용하여 삼중 항생제 연고를 바릅니다.
- 복구를 위해 마우스를 깨끗한 고정 케이지로 되돌립니다. 회복 케이지의 절반은 가열 패드(낮은 설정)에 있어 깨어 있을 때 열에서 멀어지고 의식이 없는 동안 동물의 체온을 유지할 수 있습니다( 그림 1L 참조).
주: 마우스는 회수 케이지에서 옆으로 눕혀집니다. 질식을 방지하려면 침구가없는 회복 케이지 또는 침구가 케이지에있는 경우 조직 위에 동물을 놓으십시오. - 확장/수축 토글 스위치를 중앙/끄기 위치로 되돌립니다.
알림: 스위치가 확장 또는 후퇴 위치에 남아 있으면 전류가 계속 작동하여 피스톤이 팽창합니다. 그러면 피스톤이 식을 때까지 임팩터가 작동하지 않습니다. - 홀더에서 임팩터를 제거하고 얼음 팩 위에 부드럽게 놓습니다.
알림: 임팩터를 얼음 팩에 유지하면 임팩터의 잠재적인 팽창을 줄이는 데 도움이 됩니다. - 바로잉 반사가 발생할 때까지 동물을 모니터링하고 바로잡을 때까지의 시간을 문서화합니다( 그림 1M 참조).
알림: 교정 반사는 마우스가 엎드린 자세로 돌아가는 순간으로 정의됩니다. 케이지는 방해받지 않고 그대로 두어야 합니다. 케이지를 만지거나 움직이거나 일부 소음에 노출되면 마우스가 바로 잡힐 수 있습니다. - 쥐가 깨어 있고 깨어있을 때 집 케이지로 되돌려 보내십시오. 일반적으로 부상 후 1 시간 이내에 동물은 완전히 의식이 있고 걸을 수 있습니다. 또한 케이지 바닥에 촉촉한 음식을 추가하십시오.
4. 수술 후 관리
- 수술 후 5 일 동안 동물을 모니터링하십시오.
- 체중과 호흡수(질적 호흡 기능), 보행, 신체 및 모발 상태, 식사, 음주, 배변 및 배뇨와 같은 신체적/행동적 변화를 기록합니다.
- 마우스에 불편 함의 징후가 있는지 관찰하고 부기, 삼출물 또는 붉은 가장자리, 열개에 대한 수술 상처를 관찰하십시오. 동물이 통증과 불편 함의 징후를 보이면 수의사에게 연락하십시오 (발성, 움직이지 않음, 저체온증, 마시거나 먹지 않음).
- 수술 후 7-10일 후에 마취 및 가열 패드에서 스테이플을 제거합니다.
참고: 비흡수성 봉합사를 사용하는 경우 마취 상태에서 수술 후 7-10일 후에 제거해야 합니다.
5. 청소
- 수술 부위와 도구를 청소하고 소독하십시오.
- 사용 후와 하루가 끝나면 알코올 준비 패드로 프로브 팁을 청소하십시오.
알림: 임팩터는 공장에서 보정되며 시간이 지남에 따라 안정적인 것으로 보고됩니다. 일상적인 교정이 필요하지 않습니다. 그러나 임팩터와 정체 프레임은 정기적으로 검사해야 합니다. 또한 가능한 실험 드리프트를 평가하기 위해 정정 반사 시간, 사망률 및 신경병리학과 같은 모델 종점 경계를 모니터링해야 합니다.
6. 제외 기준
- 4개월 생후 생쥐의 체중 <20g, 무기력, 털 상태 불량 등 건강 상태가 좋지 않은 동물은 수술 전에 제외합니다.
- 함몰된 두개골 골절, 수술과 관련된 눈에 보이는 출혈 또는 귀 출혈과 같은 수술 중 합병증이 있는 동물은 제외합니다.
- 다음과 같은 수술 후 증상이 있는 동물을 연구에서 제외합니다: 식사 실패 및/또는 정상적으로 움직이지 않음, 비정상적인 발성, 체중 감소 또는 수술 후 상처가 정상적으로 치유되지 않음.
참고: 이 모델은 경미한 TBI의 반복 모델로 사용할 수 있습니다. 생쥐가 첫 번째 수술과 24시간 간격으로 두 번째 수술을 받으면 스테이플이나 봉합사를 제거할 수 있으며 동일한 절개를 사용하여 두개골을 노출시킬 수 있습니다. 수술 사이에 더 긴 시간이 경과하면 새로운 절개가 필요합니다.
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Representative Results
이 입체 전자기 충격기 장치는 다재다능합니다. 개방 두개골 제어 피질 충격(CCI) 또는 폐쇄성 두부 손상(CHI) 수술 모두에 사용됩니다. 또한 충격 속도, 체류 시간, 충격 깊이, 충격기 팁 및 부상 목표와 같은 부상 매개변수를 변경하여 부상 심각도를 조절할 수 있습니다. 본원은 5.0 mm 강철 팁 임팩터를 사용한 CHI 수술을 설명한다. 이 부상은 구조적 뇌 병변이 없기 때문에 경미한 것으로 간주됩니다. 성체 생쥐의 폐사율은 0.9% 미만이며11,14 나이가 많은 생쥐(>8개월령)에서 ~2.5%에 도달하기 위해 약간 증가합니다11. 사망은 무호흡으로 인해 처음 2분 동안 발생하며, 이는 충격 전 몇 초 동안 마취 깊이를 주의 깊게 모니터링하여 크게 예방할 수 있습니다.
이 CHI 모델의 장점은 충격이 피질 경막 표면을 노출시킬 필요 없이 양측 미만성 병리를 생성한다는 것입니다(개두술). 이것을 효과적인 TBI 모델로 만드는 또 다른 특징은 수술 후 두개골 골절이나 귀 문제로 인해 마우스의 1% 미만이 연구에서 제외된다는 것입니다. 중요한 것은 이 모델이 단일 충격으로 신경병리학적 및 행동적 장애를 일으켜 반복적인 경증 CHI 모델과 관련된 실험적 복잡성을 감소시킨다는 것이다 15. 예를 들어, 미세아교세포의 재현 가능한 시간적 패턴과 성상교세포 형태학적 변화가 확인된다11(그림 2A,B). 모델을 검증할 때 전후 좌표의 시작 범위를 -1.5mm ± 0.2mm로, 충격 깊이를 1.0mm ± 0.2mm로 사용하는 것이 좋습니다. 좌표는 마우스의 나이와 변형, 사용된 장비의 브랜드 및 모델에 맞게 조정해야 할 수도 있습니다. 설정의 유효성이 검사되면 실험을 위해 일정하게 유지되어야 합니다. 검증을 위해 손상 후 3일에 미세아교세포와 성상교세포의 신경병리학적 특성화가 권장됩니다. 면역조직화학(IHC) 염색은 Bachstetter et al.18의 방법에 따라 완료되었습니다. 구체적으로, 30μm 관상 자유 부동 절편은 토끼 항-GFAP(1:10,000)로 신경교세포 활성화를 위해, 토끼 항-IBA1(1:10,000)을 사용하여 성상교세포에 대해 염색되었습니다. HRP 접합 염소 항-토끼 IgG(1:200)를 사용하여 GFAP와 IBA-1을 모두 검출했습니다. 정량화 소프트웨어는 고려된 각 영역에서 염색을 정량화하기 위해 사용되었다. 또한, 손상 후 1일째에 신피질에서 축삭 손상 마커가 발견되었고, CHI16 후 28일까지 미토콘드리아 대사의 변화가 발견되었습니다(데이터는 표시되지 않음).
모델을 검증하기 위한 2차 종점은 행동 분석입니다. 방사형 팔 수중 미로(RAWM)12 및 능동적 회피13 행동에서 재현 가능한 CHI 유발 결손이 발견되었습니다(그림 3). 마우스는 Macheda et al.12에 설명된 바와 같이 특수 학습 테스트인 8-arm RAWM에서 테스트되었습니다. 간단히 말해서, 마우스는 4일 프로토콜에 걸쳐 총 28번의 시험에서 테스트되었으며 표적 팔에 위치한 플랫폼을 찾는 데 60초가 걸렸습니다. 하루 총 시험 횟수는 7회였다. 1일차와 2일차는 훈련일로, 3일차와 4일차는 시험일로 간주되었습니다. 훈련 기간 동안 생쥐는 눈에 보이는 시도와 숨겨진 시도를 번갈아 가며 플랫폼을 찾도록 훈련되었습니다. 테스트 기간 동안 플랫폼은 모든 시험 기간 동안 숨겨졌습니다. 실험은 카메라를 사용하여 기록되었으며 행동 분석(오류 수, 총 거리 및 대기 시간)을 위해 추적 시스템이 사용되었습니다. 마우스는 부상 후 2 주 후에 테스트되었습니다. 성의 영향은 없었지만 CHI 마우스는 작업을 성공적으로 수행하고 플랫폼에 도달하기 위해 더 많은 오류를 범했습니다(그림 3A). 또한 6-arm RAWM 테스트11,14,15,16에서도 기억 장애가 감지되었습니다. 연관 학습 기반 테스트인 능동적 회피는 이 경미한 CHI 모델과 관련된 인지 결함을 측정하는 데 사용되었습니다. 마우스는 5일 프로토콜을 사용하여 테스트되었으며13일당 50회 시험에 노출되었습니다. 마우스는 조건 자극(CS, 빛)을 연관시켜 가벼운 발 충격(unconditioned stimulus, US)을 피하도록 훈련되었습니다. 시간이 지남에 따라 마우스는 CS가 제시되었을 때 미국을 피하는 법을 배웠습니다. CHI 마우스는 가짜 마우스에 비해 능동적 회피에서 인지 기능이 손상되었습니다(그림 3B). 가짜 암컷 마우스는 수컷에 비해 유의하게 더 빨리 학습했지만, CHI 마우스에서는 성별이 역할을 하지 않았다13. 행동은 능동/수동 회피 소프트웨어를 사용하여 기록되었습니다. 부상 후 첫 주가 지난 운동 기능의 재현 가능한 결손이 감지되지 않은 경우11.
이 경미한 TBI 모델에서는 뇌에 대한 전체적인 구조적 병변이 발견되지 않았으며 단일 충격으로 양측 신경교 활성화 및 미세아교세포 형태의 변화가 유도되었습니다. 또한 인지 장애는 이 TBI 모델과 관련이 있습니다.
그림 1: 1단계: 수술 영역 설정. (A) CHI 수술을 수행하는 데 필요한 수술 영역 및 도구(임팩터용 아이스팩, 임팩터가 장착된 정위 프레임, 임팩터 컨트롤 박스 및 수술 도구)의 예가 표시됩니다. (B) 정중선 충격에 필요한 위치를 보여주는 5mm 강철 프로브 팁, 바이트 바 및 헤드 지지 장치의 클로즈업 보기. (C) 헤드 지지 장치는 파라필름에 의해 튜브에 부착된 1mL 라텍스 피펫 전구로 만들어집니다. 10mL 주사기에 물을 채워 전구를 팽창시키고 마개가 있어 전구를 한 번 부풀린 상태로 유지합니다. (D) 임팩터 컨트롤 박스: (1) 충격 속도를 조정하는 큰 손잡이, (2) 드웰 카운터, (3) 확장/수축 토글 스위치, (4) 아래로 눌렀을 때 충격을 전달하는 토글 스위치. (E) 사용하지 않을 때는 과열 및 오작동 가능성을 방지하기 위해 충격기를 얼음 팩에 보관합니다. (F) 디지털 정체 디스플레이는 x(전후), y(내측-측면) 및 z(등-복부) 좌표를 설정하는 데 사용됩니다. 2 단계 : 수술 절차. (지, H) 마취 및 면도된 마우스는 정위 프레임에 고정되고, (I) 정중선 절개는 (J) 브레그마를 노출시키기 위해 이루어지며, (K) 충격기를 정렬하기 위해 수술 중에 사용된다. 3단계: 회복. (L) 마우스가 입체 프레임으로부터 제거된다. 두피를 스테이플링하거나 피부를 함께 봉합하여 봉합한 후 옆구리에 있는 깨끗한 회복 케이지에 넣습니다. (M) 마우스가 뒤집히고 바로잉 반사가 발생할 때까지 마우스를 모니터링합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: CHI 후 성상교세포(GFAP) 및 미세아교세포(IBA1) 형태학적 변화의 시간적 패턴 . (A) 저배율에서의 GFAP 염색은 CHI 그룹의 피질에서 나타나는 염색의 국소적 증가를 보여줍니다. 성상 교세포의 형태 학적 외관은 중간 뇌 부분과 피질의 동일한 영역에서 채취 한 고배율 삽입물에 표시됩니다. (B) 손상 후 1일, 7일 및 2개월에 피질의 IBA1 양성 염색은 CHI 후 신피질의 미세아교세포 형태의 변화를 보여줍니다(n = 7-14, 50/50 남성/여성). 마우스(CD-1/129 배경)는 수술 당시 생후 8개월이었다. 이 그림은 11 에서 각색되었으며 허가를 받아 복제되었습니다. 스케일 바 = 그림에 표시된 대로 1mm, 50μm 및 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: RAWM에서 CHI로 인한 기억력 결핍 및 능동적 회피 . (A) 손상 후 2주째에 CHI로 조작된 마우스와 가짜 마우스는 모두 RAWM 작업을 학습할 수 있었지만 CHI 마우스는 가짜 마우스에 비해 더 많은 오류를 범했습니다(***p < 0.0005). 가짜(n = 20/20 남성/여성); CHI(n = 20/20 남성/여성). 마우스(C57BL/6J)는 수술 당시 생후 3-4개월이었습니다. (B) 손상 후 4주째에, CHI 및 가짜 수술 마우스는 능동적 회피 작업을 학습할 수 있었지만, CHI 마우스는 가짜 마우스에 비해 더 적은 발 충격을 피했다(*** p = 0.0005; **** p < 0.0001); 가짜(n = 10/10 남성/여성); CHI(n = 9/10 남성/여성). 마우스(C57BL/6J)는 수술 당시 생후 3-5개월이었습니다. 데이터는 SEM± 평균으로 나타내었다. (A) 이 그림은 12 에서 각색되었으며 허가를 받아 복제되었습니다. (B) 이 그림은 13 에서 각색되었으며 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
설명된 모델을 사용하여 일관된 부상 모델을 재현하는 데는 몇 가지 단계가 포함됩니다. 첫째, 동물을 입체 프레임에 올바르게 고정시키는 것이 중요합니다. 동물의 머리는 옆으로 움직일 수 없어야하며, 두개골은 브레그마와 람다가 같은 좌표를 읽는 완전히 평평해야합니다. 이어바를 올바르게 배치하는 것은 이 수술에서 가장 어려운 부분이며, 이는 연습을 통해서만 배울 수 있습니다. 두개골이 수평이 아닌 경우 CHI를 유도하기 전에 머리를 조정해야 합니다. 머리 위치를 조정하지 않으면 두개골 골절이 발생합니다. 두개골이 평평한지 평가하려면 끝 주변의 모든 각도에서 두개골과 충격 끝 사이의 간격을 살펴봐야 합니다. 두개골 골절이 있는 쥐는 두개골 골절을 겪지 않은 쥐에 비해 염증 반응이 훨씬 강하고 부상이 더 심하기 때문에 실험에서 제외해야 한다19. 또한 두개골 골절이 있는 마우스는 외상 후 호흡 억제, 2차 반동 손상, 결국 사망과 같은 더 심각한 TBI 결과를 보인다20.
이 연구에서는 동물의 머리를 이어 바(ear bar)로 고정했습니다. 특히, 테이퍼 포인트가있는 마우스 전용 아세탈 수지 이어 바 만 사용하는 것이 좋으며 큰 쥐 이어 바는 사용하지 않는 것이 좋습니다. 구멍이 뚫리지 않는 고무 팁 이어 바를 사용할 수 있지만 이 이어 바는 두개골을 압축하여 CHI의 생체 역학을 변경하고 재현성이 떨어집니다. 또한 이어바는 회전력을 허용하지 않기 때문에 사용에도 한계가 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이어 바의 더 큰 재현성은 헤드가 고정되지 않은 경우 생성될 수 있는 제한된 수의 회전력보다 큽니다.
그러나 이어 바로 머리를 고정하면 충격력이 모두 귀에 가해지면 충격 시 귀에 부상을 입을 수도 있습니다. 귀에서 힘을 옮기기 위해 머리 아래에 배치된 머리 지지 장치가 개발되었습니다. 베개와 같은 여러 물체를 테스트한 후 가장 잘 작동한 것은 물로 채워진 1mL 라텍스 피펫 전구였습니다. 동물의 머리 아래에 있는 피펫 전구는 동물이 정위 프레임에 들어간 후 확장될 수 있으므로 꼭 맞고 머리 아래를 완전히 지지할 수 있습니다. 올바르게 배치하면 귀에서 출혈이 없거나 부상 후 귀 손상(구르기/머리 기울임)의 행동 징후가 없어야 합니다.
CHI 모델의 일부 버전은 두개골 골절의 발생을 줄이기 위해 고무 팁 프로브 (21,22) 또는 금속 헬멧(23,24)을 사용합니다. 5mm 임팩터 팁이 두개골과 같은 높이에 있는 한 아무 것도 사용할 필요가 없습니다. 정위 수술에 대한 광범위한 경험이 없는 신규 사용자는 팁이 내측 측면 평면의 두개골과 같은 높이가 아닌 상태에서 부상을 유도하고 싶을 수 있습니다. 두개골이 내측면과 수평이 맞지 않으면 이어바가 올바르게 배치되지 않았기 때문입니다. 이 문제에 대한 유일한 해결책은 임팩터에서 동물을 제거하고 마우스를 가짜 부상에 할당하는 것입니다. 팁이 전후면에서 같은 높이가 아닌 경우 바이트 바의 높이를 조정하고 팁을 브레그마와 다시 정렬해야 합니다. 또한, 팁이 평평한 5 mm 임팩터를 사용하면 직경이 작은 임팩터 팁에 비해 두개골 골절(19)을 일으킬 가능성이 줄어든다. 고려해야 할 다른 중요한 요소는 피험자의 나이와 체중, 두개골 두께 (25) 및 생쥐(26)의 균주이다.
사람들의 경우 경미한 TBI는 부상 후 처음 몇 분 동안 사망과 관련이 없습니다. 동물의 경우 경미한 부상으로도 사망 할 수 있습니다. 그러나 이 모델에서 사망률은 부상 단독이 아니라 거의 항상 수술 합병증과 관련이 있습니다. 충격 후 마우스가 죽는 가장 일반적인 이유는 마취의 깊이입니다. 수술이 예상보다 오래 걸리거나 이소플루란 가스가 해당 동물에게 필요한 것보다 더 높은 농도인 경우 발생할 수 있습니다. 동물의 호흡이 느리거나 힘들다면 충격을 주기 전에 마취 깊이를 줄여야 한다는 신호일 수 있습니다. 충격을 받을 때 동물의 호흡이 느리거나 힘들다면 동물은 무호흡증을 앓고 죽을 수 있습니다.
가벼운 TBI에는 많은 모델이 있습니다. 각각의 강점과 약점이 있으며 이 모델도 다르지 않습니다. 보고된 바와 같이, 여기에 TBI의 단일 히트 모델이 기재되어 있지만, 이 모델은 반복적인 TBI를 발생시키는데 사용되어 왔다(15). 이 프로토콜에 설명된 단계는 반복적인 TBI 손상을 유도하기 위해 반복될 수 있습니다. 다른 TBI 모델을 평가할 때 모델이 모델링하려는 원하는 병리를 가지고 있는지 여부를 고려하는 것이 중요합니다. 또한 모델이 얼마나 재현 가능한지도 고려해야 합니다. 이 모델 또는 TBI 모델을 사용하기 위한 출발점은 모델이 이전에 보고된 대로 작동하는지 독립적으로 검증하고 특성화하는 것이 좋습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 수상 번호 R01NS120882, RF1NS119165 및 R01NS103785 및 국방부 수상 번호 AZ190017로 국립 보건원(National Institutes of Health)에서 부분적으로 지원했습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 국립 보건원 또는 국방부의 공식 견해를 나타내지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9 mm Autoclip Applier | Braintree scientific | ACS- APL | Surgery |
| 9 mm Autoclip Remover | Braintree scientific | ACS- RMV | Surgery |
| 9 mm Autoclip, Case of 1,000 clips | Braintree scientific | ACS- CS | Surgery (Staples) |
| Aperio ImageScope software | Leica BioSystems | NA | IHC |
| BladeFLASK Blade Remover | Fisher Scientific | 22-444-275 | Surgery |
| Cotton tip applicator | VWR | 89031-270 | Surgery |
| Digitial mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730D | Surgery |
| Dumont #7 Forceps | Roboz | RS-5047 | Surgery |
| Ear bars | Stoelting | 51649 | Surgery |
| EthoVision XT 11.0 | Noldus Information Technology | NA | RAWM |
| Fiber-Lite | Dolan-Jeffer Industries | UN16103-DG | Surgery |
| Fisherbrand Bulb for Small Pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | Head support apparatus |
| Gemini Avoidance System | San Diego Instruments | NA | Active avoidance |
| Heating Pad | Sunbeam | 732500000U | Surgery prep |
| HRP conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immuno Research laboratories | 111-065-144 | IHC |
| Induction chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530XS | Surgery prep |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC: 11695-6777-2 | Surgery |
| Mouse gas anesthesia head holder | Stoelting | 51609M | Surgery |
| Neuropactor Stereotaxic Impactor | Neuroscience Tools | n/a | Surgery: Formally distributed by Lecia as impact one |
| NexGen Mouse 500 | Allentown | n/a | Post-surgery, holding cage |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Head support apparatus |
| Peanut - Professional Hair Clipper | Whal | 8655-200 | Surgery prep |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) available Iodine, for laboratory | Ricca | 3955-16 | Surgery |
| Puralube Vet Oinment,petrolatum ophthalmic ointment, Sterile ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Surgery |
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | IHC |
| Rabbit anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | IHC |
| 8-arm Radial Arm Water Maze | MazeEngineers | n/a | RAWM |
| Scale | OHAUS CS series | BAL-101 | Surgery prep |
| Scalpel Handle #7 Solid 6.25" | Roboz | RS-9847 | Surgery |
| Sterile Alcohol Prep Pads (isopropyl alcohol 70% v/v) | Fisher Brand | 22-363-750 | Surgery prep |
| SumnoSuite low-flow anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Surgery |
| 10 mL syringe Luer-Lok Tip | BD Bard-Parker | 302995 | Head support apparatus |
| Timers | Fisher Scientific | 6KED8 | Surgery |
| Topical anesthetic cream | L.M.X 4 | NDC 0496-0882-15 | Surgery prep |
| Triple antibiotic ointment | Major | NDC 0904-0734-31 | Post-surgery |
| Tubing | MasterFlex | 96410-16 | Head support apparatus |
| Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Surgery prep |
References
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