Summary
Protokollet beskriver mild traumatisk hjärnskada i en musmodell. I synnerhet förklaras ett steg-för-steg-protokoll för att inducera en mild sluten huvudskada och karakteriseringen av djurmodellen fullständigt.
Abstract
Mycket reproducerbara djurmodeller av traumatisk hjärnskada (TBI), med väldefinierade patologier, behövs för att testa terapeutiska ingrepp och förstå mekanismerna för hur en TBI förändrar hjärnans funktion. Tillgängligheten av flera djurmodeller av TBI är nödvändig för att modellera de olika aspekterna och svårighetsgraderna av TBI som ses hos människor. Detta manuskript beskriver användningen av en mittlinjesluten huvudskada (CHI) för att utveckla en musmodell av mild TBI. Modellen anses vara mild eftersom den inte producerar strukturella hjärnskador baserade på neuroimaging eller grov neuronal förlust. En enda påverkan skapar dock tillräckligt med patologi för att kognitiv försämring är mätbar minst 1 månad efter skada. Ett steg-för-steg-protokoll för att inducera en CHI hos möss med hjälp av en stereotaxiskt styrd elektromagnetisk slaganordning definieras i papperet. Fördelarna med den milda mittlinjen CHI-modellen inkluderar reproducerbarheten av de skadeinducerade förändringarna med låg dödlighet. Modellen har tidsmässigt karakteriserats upp till 1 år efter skadan för neuroimaging, neurokemiska, neuropatologiska och beteendemässiga förändringar. Modellen kompletterar öppna skallmodeller av kontrollerad kortikal påverkan med samma slaganordning. Således kan laboratorier modellera både mild diffus TBI och fokal måttlig till svår TBI med samma slaganordning.
Introduction
Traumatisk hjärnskada (TBI) orsakas av en yttre kraft på hjärnan, ofta förknippad med fall, idrottsskador, fysiskt våld eller trafikolyckor. År 2014 bestämde Centers for Disease Control and Prevention att 2,53 miljoner amerikaner besökte akutavdelningen för att söka medicinsk hjälp för TBI-relaterade olyckor1. Eftersom mild TBI (mTBI) representerar majoriteten av TBI-fallen har flera modeller av mTBI antagits under de senaste decennierna, som inkluderar viktfall, kolvdriven sluten huvudskada och kontrollerad kortikal påverkan, rotationsskada, mild vätskeslagskada och sprängskademodeller 2,3. Heterogeniteten hos mTBI-modellerna är användbar för att ta itu med de olika funktionerna associerade med mTBI som ses hos människor och för att hjälpa till att utvärdera de cellulära och molekylära mekanismerna associerade med hjärnskada.
Av de vanligaste modellerna för sluten huvudskada är en av de första och mest använda modellerna viktfallmetoden, där ett föremål tappas från en viss höjd på djurets huvud (bedövat eller vaket)2,4. I viktminskningsmetoden beror skadans svårighetsgrad på flera parametrar, inklusive kraniotomi utförd eller inte, huvudet fixerat eller fritt och avståndet och vikten på det fallande föremålet 2,4. En nackdel med denna modell är den stora variationen i skadans svårighetsgrad och den höga dödligheten i samband med andningsdepression 5,6. Ett vanligt alternativ är att leverera påverkan med hjälp av en pneumatisk eller elektromagnetisk enhet, vilket kan göras direkt på den exponerade dura (kontrollerad kortikal påverkan: CCI) eller sluten skalle (sluten huvudskada: CHI). En av styrkorna med den kolvdrivna skadan är dess höga reproducerbarhet och låga dödlighet. CCI kräver dock kraniotomi7,8, och en kraniotomi i sig inducerar inflammation9. Istället finns det i CHI-modellen inget behov av kraniotomi. Som redan nämnts har varje modell begränsningar. En av begränsningarna med CHI-modellen som beskrivs i detta dokument är att operationen utförs med hjälp av en stereotaxisk ram och djurets huvud är immobiliserat. Medan hela huvudimmobiliseringen säkerställer reproducerbarhet, tar den inte hänsyn till rörelse efter påverkan som kan bidra till skadan i samband med en mTBI.
Detta protokoll beskriver en grundläggande metod för att utföra en CHI-kollision med en kommersiellt tillgänglig elektromagnetisk slaganordning10 i en mus. Detta protokoll beskriver de exakta parametrarna för att uppnå en mycket reproducerbar skada. I synnerhet har utredaren exakt kontroll över parametrarna (skadans djup, uppehållstid och slaghastighet) för att exakt definiera skadans svårighetsgrad. Som beskrivits producerar denna CHI-modell en skada som resulterar i bilateral patologi, både diffus och mikroskopisk (dvs. kronisk aktivering av glia, axonal och vaskulär skada) och beteendefenotyper 11,12,13,14,15. Dessutom anses den beskrivna modellen vara mild eftersom den inte inducerar strukturella hjärnskador baserade på MR eller grova skador på patologi även 1 år efter skadan16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De utförda experimenten godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Kentucky, och både ARRIVE och Guide for the Care and Use of Laboratory Animals riktlinjer följdes under studien.
1. Kirurgisk installation
OBS: Möss hålls i grupper om 4-5 / bur, luftfuktigheten i bostadsrummet hålls på 43% -47% och temperaturen hålls vid 22-23 ° C. Möss ges ad libitum tillgång till mat och vatten och utsätts för en 12 h / 12 h ljus / mörk cykel (7 am / 7 pm ).
- Använd ett särskilt kirurgiskt område, till exempel en huva eller ett särskilt kirurgiskt ingreppsrum, för att utföra djurkirurgi.
- Se till att operationsområdet innehåller en värmedyna, en stereotaxisk ram utrustad med en elektromagnetisk slaganordning och en anestesimask utformad för att administrera isoflurangas (se figur 1A).
- Se till att kirurgen eller personalen som är involverad i operationen bär en ren labbrock, ansiktsmask, handskar och en kirurgisk keps.
- Använd sterila kirurgiska verktyg, sterila bomullsspetsade applikatorer och gasbindor. Använd en varm pärlsterilisator för att sterilisera instrumenten mellan möss under operationsdagen.
- Använd en anestesiinduktionskammare för att förbereda musen för operation i ett pre-op-område.
- Använd värmedynor för att bibehålla djurets temperatur, rengör post-op mushållare och timers för att spela in musens rätningsreflex efter operationen.
2. Pre-kirurgi ingrepp
- Förbered huvudstödsapparaten (se figur 1B).
- Ta bort den rullade ändkammen från en 1 ml latexpipettlampa (uppblåsbar ände) (se figur 1C).
- Fäst glödlampan på slangen med parafilm (se figur 1C).
- Anslut slangen till en 10 ml spruta med en stoppkran. Fyll sprutan med vatten (se figur 1C).
OBS: 1 ml latexpipettlampa placeras under musens huvud för att förskjuta slagkraften bort från öronen. Försök att ta bort så mycket luft som möjligt från glödlampan före användning så att glödlampan fylls med mestadels vatten och inte luft.
- Inställning av slaganordning.
- Välj 5 mm sondspets, skruva fast den i kolven i ställdonets nedre mitt (inuti den större cylindern) och dra åt sonden försiktigt utan att använda överdriven kraft. Dra åt spetsen mellan islagen igen (se figur 1B).
- Innan du slår på slaganordningen ska du se till att omkopplaren för förlängning/indragning är placerad i mittläget Av. Anslut sedan kabeln på ställdonet till uttaget på frontpanelen på slaganordningens styrbox och sensorkabeln till uttaget på frontpanelen. Slå sedan på strömbrytaren på bakpanelen (se bild 1D).
OBS: Vippomkopplaren Förläng/dra in måste förbli i mitten Av-läge när den inte används. - Ställ in islagshastigheten genom att vrida den stora ratten på vänster sida av kontrollboxen tills en islagshastighet på 5,0 ± 0,2 m/s visas på displayen (se figur 1D).
- Ställ in uppehållsräknaren på 100 ms genom att vrida på rattarna tills uppehållet visar 0,01 (se bild 1D).
OBS: Uppehållet är tiden för kontakt innan automatisk indragning sker. - Placera slaganordningens ställdon på ett ispaket för att förhindra att plastcylindern expanderar, vilket låser cylindern på plats, vilket förhindrar cylinderns rörelse och leverans av framtida stötar (se figur 1E).
- Förbered musen för operation.
- Inspektera musen visuellt före operationen och eliminera musen från studien om något av följande villkor observeras: dåligt pälstillstånd, slöhet eller dålig vikt (<20 g) för en 4 månader gammal mus.
- Bedöva musen med 4%-5% isofluran i 100% syre med hjälp av en induktionskammare placerad på en värmedyna i 1-2 min.
- Raka pälsen från operationsplatsen med en elektrisk hårklippare.
- Rengör huvudet med sterila alkoholberedningskuddar och applicera en lokalbedövning på den rakade hårbotten minst 15 minuter före operationens början.
- Sätt tillbaka musen i en ren hållbur före operationen. Starta operationen efter minst 15 min lokalbedövning (induktionstid).
OBS: Tiden för anestesi kan variera beroende på bedövningsmedlet som används vid proceduren.
- Kontrollera en gång till att stereotaxisk ram, slaganordning och digital stereotaxisk display (se bild 1F) är redo att användas.
- För tillbaka musen till isofluraninduktionskammaren med 4%-5% isofluran i 100% syre i ca 3 min.
- Fixa musen i huvudstadiet.
3. Kirurgiskt ingrepp
- Fäst musen i den stereotaxiska ramen med lätta öronstänger med acetalharts, en bitstång och en musanestesimask (se figur 1G, H). Isoflurangasen levereras med 2%-3% i rumsluft vid 100-200 ml/min. Noggrant övervaka musens andning för att säkerställa djupet av anestesi och justera gasnivån efter behov.
- Applicera sterilt ögonsmörjmedel på ögonen för att förhindra torkning av hornhinnan.
- Sterilisera hårbotten med povidon-jodpinnar och sterila alkoholkuddar tre gånger.
- Se till att musen är djupt bedövad genom att verifiera avsaknaden av ett tå-nyp-svar.
- Gör ett snitt på cirka 1 cm i hårbotten mellan ögonen och halsen med en skalpell och exponera skallen (se figur 1I).
- Låt skallen torka i 1-2 min.
- Identifiera bregma (skärningspunkten för koronala och sagittala suturer) och lambda (skärningspunkten mellan sagittala och lambdoidsuturer) (se figur 1J).
OBS: En mushjärnatlas kan användas som referens. - Placera huvudstödsapparaten under huvudet och blås upp glödlampan med vatten tills den trycker mot botten av musens huvud men inte lyfter huvudet bort från bettstången.
OBS: Detta steg är viktigt för att minska eventuella öronproblem från CHI. Alla djur med skador på örat från öronstängerna, vilket resulterar i rullning eller blödning, bör elimineras från studien och avlivas. - Flytta slagkroppen på plats över djurets huvud.
- Förläng slaganordningen genom att placera omkopplaren Förläng/dra in (på kontrollboxen för slaganordningen) på Utsträck.
OBS: Var noga med att kontrollera att spetsen är helt utsträckt genom att dra ner på spetsen. - Rikta in slaganordningen tills den är centrerad över bregma (se figur 1K).
- Återställ de digitala stereotaxiska x- och y-koordinaterna i stereotaxic-läsaren till 0 (på pekskärmskontrollen)
- Rikta in sonden över islagsplatsen genom att flytta sonden från bregma över till målkoordinaterna: medial-lateral = 0,0 mm, främre-bakre = −1,6 mm.
- Fäst kontaktsensorn i djurets öra.
- Sänk långsamt ner sondspetsen med den förlängda sonden tills första kontakten med ytan görs. Stanna vid pipet.
- Återställ de digitala stereotaxiska z-koordinaterna i stereotaxic reader till 0.
- Kontrollera noggrant om spetsen är i linje med skallen (medial-lateral och anterior-posterior plan).
OBS: Placering av sondspetsen är det viktigaste steget i denna process för att förhindra skallfrakturer och öronskador. - Skjut in slaganordningen genom att placera vippomkopplaren på kontrollboxen i läget Infäll. Spetsen drar sig tillbaka och har inte mer kontakt med djurets huvud förrän tiden för påverkan.
- Ställ in slagdjupet genom att justera dorsal-ventraldjupet till -1,2 mm.
OBS: Slagets djup påverkar skadans allvarlighetsgrad. Djupet bör titreras för olika åldrar, vikter och stammar av möss till önskad skadans svårighetsgrad. Djupet kan behöva justeras/upprepas över tid för att bibehålla en konsekvent skadans allvarlighetsgrad. Svårighetsgraden kan bedömas neuropatologiskt: mikroglia och astrocyter (IHC), och beteendemässigt: den radiella armvattenlabyrinten och det aktiva undvikandetestet. - Övervaka noggrant musens andning för att säkerställa anestesidjupet och justera gasnivån efter behov.
OBS: Ofta bör andelen isoflurangas sänkas eller stängas av i 10-20 s före kollision. Titta noga på att andningen accelererar något. Om andningen är för långsam vid tidpunkten för påverkan kan djuret dö inom de första 60 s efter påverkan från apné. Detta kan förhindras genom att justera anestesidjupet sekunderna före kollisionen. - Inducera stöten genom att trycka på höger vippomkopplare för att påverka. Sondspetsen går ner med den visade hastigheten och stannar sedan nere under den inställda uppehållstiden och dras tillbaka.
OBS: Skenmöss får identisk hantering med CHI-mössen, men effekten levereras inte. - Starta timern omedelbart efter att CHI-stöten har levererats för att registrera rätningstiderna (tid för att återgå från sidopositionen till benägen position) eller starta timern när musen tas bort från den stereotaxiska ramen för skenmössen. Den genomsnittliga rätningsreflextiden är 5-15 min.
OBS: Rättningsreflextiderna kan variera beroende på musens töjning och ålder. - Utvärdera mössen för synliga skallfrakturer, blödningar och apné. Uteslut möss med en deprimerad skallfraktur eller synlig blödning från studien.
OBS: Det finns graderade nivåer av skallfrakturer. Djur med dekomprimerade skallfrakturer, där benet observerbart pressar in i hjärnvävnaden, avlivas (CO2 först och halshuggning används som sekundär metod). Om slaganordningens spets är korrekt inställd är dessa typer av skallfrakturer ytterst sällsynta. Om en skallfraktur inträffar är den vanligaste presentationen en liten droppe blod på skallen och en liten taktil grovbearbetning av skallen, ofta längs suturen som förbinder näsbenets bakre spets. Dessa möss noteras som möjliga skallfrakturer i journalerna men utesluts normalt inte från studien. - Ta bort djuret från den stereotaxiska ramen.
- Stäng hårbotten genom att häfta ihop huden.
OBS: Absorberbara eller icke-absorberbara suturer kan användas för att stänga hårbotten som ett alternativ till häftklamrar. - Applicera trippel antibiotisk salva med en steril bomullsspetsad applikator på det slutna snittet.
- Sätt tillbaka musen i en ren hållbur för återhämtning. Hälften av återhämtningsburen ligger på en värmedyna (låg inställning), vilket ger möjlighet att röra sig bort från värmen när den är vaken och bibehålla djurets temperatur medan den är medvetslös (se figur 1L).
Musen placeras på sidan i återhämtningsburen. För att förhindra kvävning, placera djuret i en återhämtningsbur utan sängkläder eller på en vävnad om sängkläder finns i buren. - Återställ omkopplaren Förläng/dra in till mitt/ av-läge .
OBS: Strömmen fortsätter att gå om omkopplaren lämnas i antingen förlängt eller infällt läge, vilket gör att kolven sväller. Slaganordningen kommer då inte att fungera förrän kolven svalnat. - Ta bort provkroppen från hållaren och placera den försiktigt på ispaketet.
OBS: Att hålla slagkroppen på ett ispaket hjälper till att minska den potentiella svullnaden av slaganordningen. - Övervaka djuret tills rätningsreflexen inträffar och dokumentera tiden fram till rätning (se figur 1M).
OBS: Rätningsreflexen definieras som det ögonblick musen återgår till en benägen position. Buren måste lämnas ostörd; Musen kan rätt om buren berörs, flyttas eller utsätts för vissa ljud. - Återför mössen till sin hembur när de är vakna och alerta. Vanligtvis, inom 1 h efter skada, är djuren fullt medvetna och ambulerande. Lägg också till lite fuktig mat längst ner i buret.
4. Vård efter operationen
- Övervaka djuren i 5 dagar efter operationen.
- Registrera deras vikt och eventuella fysiska / beteendemässiga förändringar som andningsfrekvens (kvalitativ andningsfunktion), gång, kropps- och hårpälstillstånd, äta, dricka, avföring och urinering.
- Observera musen för tecken på obehag och det kirurgiska såret för svullnad, utsöndringar eller röda kanter, ordehiscence. Kontakta en veterinär om djuret visar tecken på smärta och obehag (vokaliseringar, inte rör sig, hypotermi, dricker inte eller äter).
- Ta bort häftklamrarna 7-10 dagar efter operationen under anestesi och på en värmedyna.
OBS: Om icke-absorberbara suturer används måste de tas bort 7-10 dagar efter operationen under anestesi.
5. Rengöring
- Rengör och sterilisera det kirurgiska området och verktygen.
- Rengör sondspetsen efter varje användning och i slutet av dagen med alkoholberedningsdynor.
OBS: Slaganordningen kalibreras på fabriken och rapporteras vara stabil över tid och användning. Ingen rutinkalibrering behövs. Provkroppen och den stereotaxiska ramen bör dock inspekteras rutinmässigt. Dessutom bör modellens slutpunktsperimetrar såsom rätande reflextid, mortalitet och neuropatologi övervakas för att utvärdera eventuell experimentell drift.
6. Kriterier för uteslutning
- Uteslut djur före operation med dåligt hälsotillstånd, som dålig vikt <20 g för en 4 månader gammal mus, slöhet och dåligt pälstillstånd.
- Uteslut djur med komplikationer under operationen som en deprimerad skallfraktur, en synlig blödning relaterad till operation eller öronblödning.
- Exkludera djur från studien med följande symtom efter operationen: underlåtenhet att äta och/eller röra sig normalt, ovanliga läten, viktminskning eller sårets oförmåga att läka normalt efter operationen.
OBS: Denna modell kan användas som en repetitiv modell av mild TBI. Om mössen får den andra operationen 24 timmar från den första, kan häftklamrarna eller suturen tas bort, och samma snitt kan användas för att exponera skallen. Ett nytt snitt måste göras om det går längre tid mellan operationerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna stereotaktiska elektromagnetiska slaganordning är mångsidig. Det används för både en öppen skallekontrollerad kortikal påverkan (CCI) eller en sluten huvudskada (CHI) kirurgi. Dessutom kan skadans allvarlighetsgrad moduleras genom att ändra skadeparametrarna såsom slaghastighet, uppehållstid, slagdjup, slagspets och skademål. Här beskrivs en CHI-operation med en 5,0 mm slaganordning med stålspets. Denna skada anses vara mild eftersom det inte finns några strukturella hjärnskador. Dödligheten hos vuxna möss är mindre än 0,9 %11,14 och ökar något för att nå ~2,5 % hos äldre möss (>8 månader gamla)11. Dödlighet uppstår under de första 2 minuterna på grund av apné, vilket till stor del kan förhindras genom noggrann övervakning av anestesidjupet sekunderna före kollisionen.
Fördelen med denna CHI-modell är att effekten producerar bilateral diffus patologi utan att behöva exponera den kortikala duralytan (kraniotomi). En annan egenskap som gör detta till en effektiv TBI-modell är att mindre än 1% av mössen utesluts från studien på grund av skallfrakturer eller öronproblem efter det kirurgiska ingreppet. Viktigt är att modellen producerar neuropatologiska och beteendemässiga funktionsnedsättningar med en enda inverkan, vilket minskar den experimentella komplexiteten i samband med repetitiva milda CHI-modeller15. Till exempel identifieras ett reproducerbart tidsmönster av mikroglia och astrocytmorfologiska förändringar11 (figur 2A, B). Vid validering av modellen rekommenderas att använda startområdena för de främre och bakre koordinaterna som −1,5 mm ± 0,2 mm och slagdjupet som 1,0 ± 0,2 mm. Koordinaterna kan behöva justeras för mössens ålder och belastning, samt märke och modell på den utrustning som används. När inställningarna har validerats bör de hållas konstanta för ett experiment. För validering rekommenderas neuropatologisk karakterisering av mikroglia och astrocyter 3 dagar efter skada. Immunhistokemisk (IHC) färgning slutfördes enligt metoderna i Bachstetter et al.18. Specifikt färgades 30 μm koronala fritt flytande sektioner för glialaktivering med kanin anti-GFAP (1: 10 000) och för astrocyter med användning av en kanin anti-IBA1 (1: 10 000). En HRP-konjugerad getantikanin IgG (1:200) användes för att detektera både GFAP och IBA-1. Kvantifieringsprogramvara användes för att kvantifiera färgningen i varje berörd region. Dessutom hittades axonala skademarkörer 1 dag efter skada i neocortex och förändringar i mitokondriell metabolism hittades 28 dagar efter CHI16 (data visas inte).
De sekundära effektmåtten för validering av modellen skulle vara beteendeanalyser. Reproducerbara CHI-inducerade underskott i radiell armvattenlabyrint (RAWM)12 och aktivt undvikande13 beteenden hittades (figur 3). Mössen testades i en 8-armad RAWM, ett speciellt inlärningstest, som beskrivs i Macheda et al.12. Kortfattat testades mössen i totalt 28 försök under ett 4-dagars protokoll och hade 60 s för att lokalisera plattformen placerad i målarmen. Det totala antalet försök per dag var sju; Dag 1 och dag 2 betraktades som utbildningsdagar och dag 3 och 4 som testdagar. Under träningsdagarna tränades mössen att lokalisera plattformen och växla mellan synliga och dolda försök; Under testdagarna var plattformen dold under alla försök. Experimenten spelades in med hjälp av en kamera och ett spårningssystem användes för beteendeanalys (antal fel, totalt avstånd och latens). Mössen testades 2 veckor efter skadan. Även om det inte fanns någon effekt av kön, gjorde CHI-mössen fler fel för att framgångsrikt utföra uppgiften och nå plattformen (figur 3A). Dessutom har minnesnedsättningar upptäckts i ett 6-armat RAWM-test 11,14,15,16 också. Aktivt undvikande, ett associativt inlärningsbaserat test, har använts för att mäta de kognitiva underskotten i samband med denna milda modell av CHI. Mössen testades med ett 5-dagarsprotokoll och utsattes för 50 försök/dag13. Mössen tränades för att undvika en mild fotchock (okonditionerad stimulans, USA) genom att associera en konditionerad stimulans (CS, ljus) med den. Med tiden lärde sig mössen att undvika USA när CS presenterades. CHI-mössen hade nedsatt kognitiv funktion vid aktivt undvikande jämfört med skenmöss (figur 3B). De falska honmössen lärde sig betydligt snabbare jämfört med hanarna, men könet spelade ingen roll hos CHI-möss13. Beteendet registrerades med hjälp av aktiv/passiv undvikande programvara. Ett reproducerbart underskott i motorisk funktion utöver den första veckan efter skadan har inte upptäckts11.
I denna milda TBI-modell hittades inga grova strukturella skador på hjärnan, och en enda påverkan inducerade bilateral glialaktivering och förändringar i mikrogliamorfologin. Kognitiva underskott är också associerade med denna TBI-modell.
Figur 1: Steg 1: Inställning av kirurgiskt område. (A) Ett exempel på det kirurgiska området och de verktyg som behövs för att utföra CHI-kirurgi (ispaket för slaganordningen, stereotaxisk ram utrustad med slaganordningen, slaganordningens kontrollbox och kirurgiska verktyg) visas. (B) En närbild av 5 mm stålsondspetsen, bitstången och huvudstödsapparaten, som illustrerar den positionering som behövs för mittlinjens islag. (C) Huvudstödsapparaten är tillverkad av en 1 ml latexpipettlampa fäst vid slangen med parafilm. En 10 ml spruta fylls med vatten för att blåsa upp glödlampan, med en stoppkran för att hålla glödlampan uppblåst en gång på plats. (D) Kontrollbox för slaganordning: (1) en stor ratt för att justera islagshastigheten, (2) en uppehållsräknare, (3) en vippomkopplare för förlängning/indragning, (4) en vippströmbrytare som, när den trycks ned, kommer att leverera stöten. E) När provkroppen inte används ska den förvaras på en isklamp för att förhindra överhettning och eventuellt funktionsfel. (F) En digital stereotaxisk display används för att fastställa koordinaterna x (främre-bakre), y (medial-lateral) och z (dorsal-ventral). Steg 2: Kirurgiskt ingrepp. (G,H) Den bedövade och rakade musen fästs i den stereotaxiska ramen, (I) ett snitt i mittlinjen görs för att exponera (J) bregma, (K) som används under operationen för att ställa in slaganordningen. Steg 3: Återhämtning. (L) Musen tas bort från den stereotaxiska ramen. Efter att hårbotten har stängts genom häftning eller suturering av huden tillsammans, placeras den i en ren återhämtningsbur på sin sida. (M) Musen övervakas tills musen rullar över och rätningsreflexen uppstår. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: De tidsmässiga mönstren för morfologiska förändringar av astrocyt (GFAP) och mikroglia (IBA1) efter en CHI. (A) GFAP-färgning vid låg förstoring visar den regionala ökningen av färgning som ses i CHI-gruppens cortex. Astrocyternas morfologiska utseende visas i de högre förstoringsinfällningarna, som togs från de mellersta hjärnsektionerna och från samma regioner i cortexen. (B) IBA1-positiv färgning i cortex vid 1 dag, 7 dagar och 2 månader efter skada visar förändringar i mikroglia morfologi i neocortex efter CHI (n = 7-14, 50/50 hane / kvinna). Mössen (CD-1/129 bakgrund) var 8 månader gamla vid operationstillfället. Denna siffra har anpassats från 11 och reproducerats med tillstånd. Skalstång = 1 mm, 50 μm och 100 μm enligt figuren. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: CHI-inducerade minnesunderskott i RAWM och aktivt undvikande. (A) Vid 2 veckor efter skadan kunde både de CHI- och bluff-opererade mössen lära sig RAWM-uppgiften, men CHI-mössen gjorde fler fel jämfört med skenmössen (*** p < 0,0005); sham (n = 20/20 man / kvinna); CHI (n = 20/20 hane/hona). Mössen (C57BL/6J) var 3-4 månader gamla vid operationstillfället. (B) Vid 4 veckor efter skadan kunde CHI och skenopererade möss lära sig den aktiva undvikande uppgiften, men CHI-mössen undvek färre fotchocker jämfört med skenmössen (*** p = 0,0005; **** p < 0,0001); sham (n = 10/10 man / kvinna); CHI (n = 9/10 hane/hona). Mössen (C57BL/6J) var 3-5 månader gamla vid operationstillfället. Data visas som medelvärde ± SEM. (A) Denna siffra har anpassats från 12 och återgivits med tillstånd. (B) Denna siffra har anpassats från 13 och återgivits med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera steg är inblandade i att återskapa en konsekvent skademodell med hjälp av den beskrivna modellen. För det första är det viktigt att korrekt säkra djuret i den stereotaxiska ramen. Djurets huvud ska inte kunna röra sig i sidled, och skallen ska vara helt platt med bregma och lambda som läser samma koordinater. Korrekt placering av öronstängerna är den svåraste aspekten av denna operation, och detta kan bara läras med övning. Om skallen inte är jämn bör huvudet justeras innan CHI induceras. Underlåtenhet att justera huvudets positionering kommer att orsaka en skallfraktur. För att utvärdera att skallen är platt bör man titta på gapet mellan skallen och träffspetsen från alla vinklar runt spetsen. Möss med deprimerade skallfrakturer bör uteslutas från experiment, eftersom de har ett mycket starkare inflammatoriskt svar och en allvarligare skada jämfört med möss som inte drabbades av skallfrakturer19. Dessutom visar möss med skallfrakturer allvarligare TBI-resultat, såsom posttraumatisk andningsdepression, sekundär reboundskada och så småningom död20.
I denna studie säkrades djurets huvud med öronstänger. I synnerhet rekommenderas endast musspecifika acetalhartsöronstänger med en avsmalnande punkt att användas, inte stora råttörstänger. Det är möjligt att använda öronstänger utan punktering utan gummispets, men dessa öronstänger kommer att komprimera skallen, förändra biomekaniken hos CHI och är mindre reproducerbara. Dessutom finns det en begränsning för att använda öronstänger, eftersom det inte tillåter några rotationskrafter. Ändå uppväger öronstängernas större reproducerbarhet det begränsade antalet rotationskrafter som kan genereras om huvudet är ofixerat.
Att fixera huvudet med öronstänger kan dock också orsaka skada på örat vid stötar om alla slagkrafter placeras vid öronen. En huvudstödsapparat placerad under huvudet för att förskjuta krafterna bort från öronen utvecklades. Efter att ha testat flera kuddliknande föremål var den som fungerade bäst 1 ml latexpipettlampa fylld med vatten. Pipettlampan under djurets huvud kan expanderas efter att djuret befinner sig i den stereotaxiska ramen, så att den kan ha en tät passform och ge fullt stöd under huvudet. När den placeras korrekt bör det inte finnas någon blödning från öronen eller beteendemässiga indikationer på öronskador (rullande / huvudlutning) efter skadan.
Vissa versioner av CHI-modellen använder en gummispetssond 21,22 eller metallhjälm 23,24 för att minska förekomsten av skallfrakturer. Så länge 5 mm slagspetsen är i jämnhöjd med skallen behöver du inte använda någon av dem. Det kan vara frestande för nya användare som inte har stor erfarenhet av stereotaxisk kirurgi att inducera skadan med spetsen inte spola med skallen i det mediala laterala planet. Om skallen inte är jämn i det mediala sidoplanet beror det på att öronstängerna inte är korrekt placerade. Den enda lösningen för detta problem är att ta bort djuret från slaganordningen och tilldela musen till en skenskada. Om spetsen inte spolas på det främre-bakre planet, måste höjden på bettstången justeras och spetsen justeras med bregma. Användningen av en 5 mm slaganordning med en plan spets minskar också risken för skallfrakturer19 jämfört med slagspetsar med mindre diametrar. Andra viktiga faktorer att tänka på är ämnets ålder och vikt, liksom skalltjockleken25 och mössens stammar26.
Hos människor är en mild TBI inte förknippad med döden under de första minuterna efter skadan. Hos djur kan även en mild skada orsaka dödsfall. Men i denna modell är dödligheten nästan alltid förknippad med kirurgiska komplikationer, inte skadan ensam. Den vanligaste orsaken till att en mus skulle dö efter påverkan är anestesidjupet. Detta kan inträffa om operationen tog längre tid än förväntat eller om isoflurangasen var i en högre koncentration än vad som behövs för det djuret. Om djurets andning är långsam eller ansträngd kan detta vara ett tecken på att anestesidjupet bör minskas innan påverkan levereras. Om djurets andedräkt är långsam eller ansträngd vid tidpunkten för påverkan, kommer djuret sannolikt att ha apné och kan dö.
Det finns många modeller av mild TBI. Var och en har styrkor och svagheter, och den här modellen är inte annorlunda. Som rapporterat beskrivs här en enda träffmodell av TBI, men modellen har använts för att orsaka en repetitiv TBI15. Stegen som beskrivs i detta protokoll kan upprepas för att inducera en repetitiv TBI-skada. Vid utvärdering av de olika TBI-modellerna är det viktigt att överväga om modellen har den önskade patologin som man försöker modellera. Man bör också överväga hur reproducerbar modellen är. Det rekommenderas starkt att utgångspunkten för att använda denna eller någon TBI-modell är att oberoende validera och karakterisera att modellen fungerar som tidigare rapporterats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av National Institutes of Health under prisnummer R01NS120882, RF1NS119165 och R01NS103785 och försvarsdepartementets prisnummer AZ190017. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte de officiella åsikterna från National Institutes of Health eller försvarsdepartementet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9 mm Autoclip Applier | Braintree scientific | ACS- APL | Surgery |
| 9 mm Autoclip Remover | Braintree scientific | ACS- RMV | Surgery |
| 9 mm Autoclip, Case of 1,000 clips | Braintree scientific | ACS- CS | Surgery (Staples) |
| Aperio ImageScope software | Leica BioSystems | NA | IHC |
| BladeFLASK Blade Remover | Fisher Scientific | 22-444-275 | Surgery |
| Cotton tip applicator | VWR | 89031-270 | Surgery |
| Digitial mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730D | Surgery |
| Dumont #7 Forceps | Roboz | RS-5047 | Surgery |
| Ear bars | Stoelting | 51649 | Surgery |
| EthoVision XT 11.0 | Noldus Information Technology | NA | RAWM |
| Fiber-Lite | Dolan-Jeffer Industries | UN16103-DG | Surgery |
| Fisherbrand Bulb for Small Pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | Head support apparatus |
| Gemini Avoidance System | San Diego Instruments | NA | Active avoidance |
| Heating Pad | Sunbeam | 732500000U | Surgery prep |
| HRP conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immuno Research laboratories | 111-065-144 | IHC |
| Induction chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530XS | Surgery prep |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC: 11695-6777-2 | Surgery |
| Mouse gas anesthesia head holder | Stoelting | 51609M | Surgery |
| Neuropactor Stereotaxic Impactor | Neuroscience Tools | n/a | Surgery: Formally distributed by Lecia as impact one |
| NexGen Mouse 500 | Allentown | n/a | Post-surgery, holding cage |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Head support apparatus |
| Peanut - Professional Hair Clipper | Whal | 8655-200 | Surgery prep |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) available Iodine, for laboratory | Ricca | 3955-16 | Surgery |
| Puralube Vet Oinment,petrolatum ophthalmic ointment, Sterile ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Surgery |
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | IHC |
| Rabbit anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | IHC |
| 8-arm Radial Arm Water Maze | MazeEngineers | n/a | RAWM |
| Scale | OHAUS CS series | BAL-101 | Surgery prep |
| Scalpel Handle #7 Solid 6.25" | Roboz | RS-9847 | Surgery |
| Sterile Alcohol Prep Pads (isopropyl alcohol 70% v/v) | Fisher Brand | 22-363-750 | Surgery prep |
| SumnoSuite low-flow anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Surgery |
| 10 mL syringe Luer-Lok Tip | BD Bard-Parker | 302995 | Head support apparatus |
| Timers | Fisher Scientific | 6KED8 | Surgery |
| Topical anesthetic cream | L.M.X 4 | NDC 0496-0882-15 | Surgery prep |
| Triple antibiotic ointment | Major | NDC 0904-0734-31 | Post-surgery |
| Tubing | MasterFlex | 96410-16 | Head support apparatus |
| Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Surgery prep |
References
- Capizzi, A., Woo, J., Verduzco-Gutierrez, M. Traumatic brain injury: An overview of epidemiology, pathophysiology, and medical management. The Medical Clinics of North America. 104 (2), 213-238 (2020).
- Bodnar, C. N., Roberts, K. N., Higgins, E. K., Bachstetter, A. D. A systematic review of closed head injury models of mild traumatic brain injury in mice and rats. Journal of Neurotrauma. 36 (11), 1683-1706 (2019).
- Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: Translational challenges and strategies. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 76, 396-414 (2017).
- Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M.
- Albert-Weissenberger, C., Varrallyay, C., Raslan, F., Kleinschnitz, C., Siren, A. L. An experimental protocol for mimicking pathomechanisms of traumatic brain injury in mice. Experimental and Translational Stroke Medicine. 4, 1 (2012).
- Chen, Y., Constantini, S., Trembovler, V., Weinstock, M., Shohami, E. An experimental model of closed head injury in mice: pathophysiology, histopathology, and cognitive deficits. Journal of Neurotrauma. 13 (10), 557-568 (1996).
- Dixon, C. E., Clifton, G. L., Lighthall, J. W., Yaghmai, A. A., Hayes, R. L. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 39 (3), 253-262 (1991).
- Schwulst, S. J., Islam, M. Murine model of controlled cortical impact for the induction of traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. (150), e60027 (2019).
- Cole, J. T., et al. Craniotomy: True sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
- Brody, D. L., et al. Electromagnetic controlled cortical impact device for precise, graded experimental traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 24 (4), 657-673 (2007).
- Webster, S. J., Van Eldik, L. J., Watterson, D. M., Bachstetter, A. D. Closed head injury in an age-related Alzheimer mouse model leads to an altered neuroinflammatory response and persistent cognitive impairment. The Journal of Neuroscience. 35 (16), 6554-6569 (2015).
- Macheda, T., Roberts, K. N., Morganti, J. M., Braun, D. J., Bachstetter, A. D. Optimization and validation of a modified radial-arm water maze protocol using a murine model of mild closed head traumatic brain injury. PLoS One. 15 (8), 0232862 (2020).
- Macheda, T., Snider, H. C., Watson, J. B., Roberts, K. N., Bachstetter, A. D. An active avoidance behavioral paradigm for use in a mild closed head model of traumatic brain injury in mice. Journal of Neuroscience Methods. 343, 108831 (2020).
- Bachstetter, A. D., et al. Attenuation of traumatic brain injury-induced cognitive impairment in mice by targeting increased cytokine levels with a small molecule experimental therapeutic. Journal of Neuroinflammation. 12, 69 (2015).
- Bachstetter, A. D., et al. The effects of mild closed head injuries on tauopathy and cognitive deficits in rodents: Primary results in wild type and rTg4510 mice, and a systematic review. Experimental Neurology. 326, 113180 (2020).
- Lyons, D. N., et al. A mild traumatic brain injury in mice produces lasting deficits in brain metabolism. Journal of Neurotrauma. 35 (20), 2435-2447 (2018).
- Yanckello, L. M., et al. Inulin supplementation mitigates gut dysbiosis and brain impairment induced by mild traumatic brain injury during chronic phase. Journal of Cellular Immunology. 4 (2), 50-64 (2022).
- Bachstetter, A. D., et al. Early stage drug treatment that normalizes proinflammatory cytokine production attenuates synaptic dysfunction in a mouse model that exhibits age-dependent progression of Alzheimer's disease-related pathology. The Journal of Neuroscience. 32 (30), 10201-10210 (2012).
- Zvejniece, L., et al. Skull fractures induce neuroinflammation and worsen outcomes after closed head injury in mice. Journal of Neurotrauma. 37 (2), 295-304 (2020).
- Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
- Yang, Z., et al. Temporal MRI characterization, neurobiochemical and neurobehavioral changes in a mouse repetitive concussive head injury model. Scientific Reports. 5, 11178 (2015).
- Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. Journal of Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
- Laskowitz, D. T., et al. COG1410, a novel apolipoprotein E-based peptide, improves functional recovery in a murine model of traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 24 (7), 1093-1107 (2007).
- Lloyd, E., Somera-Molina, K., Van Eldik, L. J., Watterson, D. M., Wainwright, M. S. Suppression of acute proinflammatory cytokine and chemokine upregulation by post-injury administration of a novel small molecule improves long-term neurologic outcome in a mouse model of traumatic brain injury. Journal of Neuroinflammation. 5, 28 (2008).
- Lillie, E. M., Urban, J. E., Lynch, S. K., Weaver, A. A., Stitzel, J. D. Evaluation of skull cortical thickness changes with age and sex from computed tomography scans. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (2), 299-307 (2016).
- Kawakami, M., Yamamura, K. Cranial bone morphometric study among mouse strains. BMC Evolutionary Biology. 8, 73 (2008).
