Summary
Este protocolo descreve um método para monitorar a progressão das alterações morfológicas ao longo do tempo no útero em um modelo induzível de câncer de endométrio em camundongos usando imagens ultrassonográficas com correlação com alterações macroscópicas e histológicas.
Abstract
Os cânceres uterinos podem ser estudados em camundongos devido à facilidade de manuseio e manipulação genética nesses modelos. No entanto, esses estudos são frequentemente limitados a avaliar patologia post-mortem em animais eutanasiados em vários momentos em diferentes coortes, o que aumenta o número de camundongos necessários para um estudo. Imagens de camundongos em estudos longitudinais podem rastrear a progressão da doença em animais individuais, reduzindo o número de camundongos necessários. Os avanços na tecnologia de ultrassom têm permitido a detecção de alterações no nível micrométrico dos tecidos. A ultrassonografia tem sido usada para estudar a maturação dos folículos nos ovários e o crescimento do xenoenxerto, mas não tem sido aplicada às alterações morfológicas no útero de camundongos. Este protocolo examina a justaposição de patologia com comparações de imagens in vivo em um modelo de camundongo com câncer de endométrio induzido. As características observadas pela ultrassonografia foram consistentes com o grau de alteração observado pela patologia macroscópica e histologia. A ultrassonografia mostrou-se altamente preditiva da patologia observada, apoiando a incorporação da ultrassonografia em estudos longitudinais de doenças uterinas, como câncer em camundongos.
Introduction
Camundongos continuam sendo um dos modelos animais mais importantes para distúrbios reprodutivos 1,2,3. Existem vários modelos de roedores geneticamente modificados ou induzidos de câncer de ovário e útero. Esses estudos tipicamente se baseiam em múltiplas coortes eutanasiadas em diferentes momentos para capturar tendências longitudinais em alterações morfológicas e patológicas. Isso impede a capacidade de adquirir dados contínuos sobre o desenvolvimento do câncer em um camundongo individual. Além disso, sem conhecer o estado de progressão da doença individual em camundongos, os estudos de intervenção são baseados em pontos de tempo predeterminados e achados médios de coortes anteriores, em vez de limiares individuais para a detecção de progressão em um animalespecífico4,5. Portanto, abordagens de imagem que permitam a avaliação longitudinal em animais vivos são necessárias para facilitar modelos pré-clínicos para testar novos fármacos ou compostos e acelerar o entendimento da fisiopatologia, além de aumentar o rigor e a reprodutibilidade6.
A ultrassonografia (US) é um método atraente para o monitoramento longitudinal da progressão do câncer uterino de camundongos, pois é relativamente fácil e barato em comparação com outros métodos de imagem, é fácil de realizar e pode ter resolução notável 6,7. Esta modalidade não invasiva pode capturar características à escala de mícrons em camundongos acordados ou com camundongos sob sedação breve usando um exame de 5-10 minutos. A microscopia ultrassônica foi validada como método para medir o desenvolvimento de folículos ovarianos de camundongos 8 e o crescimento de neoplasias implantadas ou induzidas 9,10,11. A US de alta frequência também tem sido utilizada para injeções intrauterinas percutâneas12 e observação de alterações uterinas em ratas ao longo do ciclo estral13. O US de alta frequência pode ser usado com ratos mantidos em plataformas estacionárias especializadas usando um sistema de trilho para segurar o transdutor/sonda para capturar imagens de alta resolução com posição e pressão padronizadas; no entanto, esse equipamento não está disponível em todas as instituições. Os métodos de varredura por transdutor portátil podem ser adotados com equipamentos menos dedicados e usados tanto para diagnósticos clínicos quanto para aplicações de pesquisa em camundongos.
Resta saber se as imagens dos EUA com sondas portáteis de alta frequência poderiam ser usadas para monitorar o desenvolvimento do câncer uterino ao longo de várias semanas. Semelhante aos intestinos, o útero do roedor é uma estrutura de paredes finas e delgadas, que é muito móvel dentro do abdômen e é contígua através de múltiplas profundidades de tecido, tornando a imagem mais desafiadora do que com órgãos relativamente imóveis, como os rins. Este estudo buscou estabelecer a correlação entre os tecidos observados pela ultrassonografia e histopatologia, definir pontos de referência para a localização do útero de camundongos e determinar a viabilidade da avaliação longitudinal do câncer de endométrio. Este estudo apresenta dados que mostram uma correspondência qualitativa entre a aparência das imagens uterinas por US e a histopatologia, bem como imagens seriadas de camundongos ao longo de várias semanas. Esses resultados indicam que o US portátil pode ser usado para monitorar o desenvolvimento do câncer de endométrio em camundongos, criando assim uma oportunidade para coletar dados longitudinais individuais de camundongos para estudar o câncer uterino sem a necessidade de equipamentos dedicados.
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Protocol
Todos os procedimentos e experimentos envolvendo camundongos foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal da Johns Hopkins. Para todos os procedimentos, foram utilizados EPIs adequados, incluindo luvas e aventais de isolamento descartáveis. Precauções foram tomadas ao manusear materiais perfurocortantes, que foram descartados corretamente em recipientes de caixa vermelha de materiais perfurocortantes imediatamente após o uso. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais e equipamentos utilizados neste protocolo.
1. Indução de câncer de endométrio em camundongos iPAD (Pten induzível , deleção dupla Arid1a) com doxiciclina
- Manter 10 camundongos transgênicos Pax8-Cre-Arid1a-Pten de dupla deleção (iPAD) (Figura 1) em um fundo genético misto (129S, BALB/C, C57BL/6), conforme descrito anteriormente14.
- Coletar imagens de ultrassom basais (2D) dos ovários, oviduto e útero de cada camundongo antes do tratamento com doxiciclina.
- Fornecer exclusivamente dietas de ração de camundongo contendo doxiciclina (hiclato de doxiciclina a 625 mg/kg de ração) para camundongos iPAD fêmeas por um mínimo de 2 semanas a partir de 7-8 semanas de idade para induzir a deleção gênica.
2. Configuração do equipamento
- Ligue a almofada de aquecimento e cubra com uma almofada absorvente limpa (temperatura alvo: 38 °C).
- Confirme se o vaporizador de isoflurano e o tanque O2 estão adequadamente cheios. Recarregue e substitua se o conteúdo estiver baixo.
- Conecte a câmara de indução, o cone nasal e o sistema de limpeza ao vaporizador.
- Configure o aparelho de ultrassom.
- Selecione um transdutor (sonda) com uma faixa de 32-56 MHz ou até 70 MHz para imagens do útero ou ovário, respectivamente.
- Conecte a sonda e ligue a máquina.
- Após a inicialização do sistema, use o painel de controle para fazer login com as credenciais do usuário e acessar a tela inicial.
- Na tela inicial, vá para a guia Aplicativos e selecione Modo de abdômen do mouse (pequeno).
- Clique em Digitalizar para retornar à tela inicial e aguarde até que uma imagem ao vivo seja exibida.
- Selecione Modo B nas opções na barra de ferramentas à esquerda.
- Clique em Mais controles para exibir ferramentas adicionais para refinamento de imagem, como ganho e profundidade de imagem, ou para ajustar as configurações de aquisição de clipe, como o número de quadros por segundo.
- Quando as configurações de imagem estiverem selecionadas, retorne à tela inicial clicando em Digitalizar.
- Ligue o tanque O2 , direcione o fluxo para a câmara de indução e ajuste a vazão para 1 L/min.
3. Preparação de ratos para triagem por ultrassom, incluindo depilação
- Coloque um rato na câmara de indução. Ajustar o vaporizador de isoflurano para 2%-3% vol/vol para a indução anestésica.
- Determinar a profundidade apropriada da anestesia por uma falta de resposta ao pinçamento dos dedos dos pés e uma frequência respiratória em torno de 1-2 respirações/s.
- Aplique lubrificante oftálmico estéril em cada olho. Retire o pelo do dorso e ventrum entre a última costela e a pelve com cortadores de tamanho adequado.
- Aplicar uma fina camada de creme depilatório nas regiões ventral e dorsal a serem fotografadas (se necessário).
- Coloque o mouse de volta na câmara de indução por aproximadamente 3-5 min para manter a profundidade adequada da anestesia enquanto o creme depilatório trabalha para remover o cabelo. Após ≤4 minutos, limpe suavemente o creme com uma toalha de papel limpa e úmida.
NOTA: A exposição prolongada ao creme depilatório é irritante e pode causar lesões na pele.
4. Injeção intraperitoneal de líquido para aumentar o contraste entre os órgãos
- Aqueça uma seringa de 3-10 mL cheia de solução de fluido isotônico estéril (por exemplo, NaCl 0,9% estéril ou solução de ringers lactato) a 35-40 °C colocando-a entre uma almofada de aquecimento e uma almofada absorvente por vários minutos. Coloque um frasco de gel de ultrassom na almofada de aquecimento se a máquina não tiver um aquecedor.
- Para um rato de 20-25 g, injecte 1-2 ml de solução na cavidade peritoneal.
- Segure o rato pelo scruff em uma das mãos, expondo o ventrum.
- Segure o mouse em um ângulo de ~20°, com o nariz apontado para o chão para direcionar os órgãos cranialmente devido à gravidade.
- Com agulha de pequeno calibre (25 G, 5/8 de comprimento, seringa tuberculínica), punção através da pele e parede abdominal do quadrante direito caudal do abdome.
- Antes da injeção de líquidos, para evitar a injeção na vasculatura ou no trato gastrointestinal, puxe para trás com pressão mínima. Se entrar sangue ou outro material na seringa, remova a agulha. Use uma nova agulha e seringa e tente novamente em uma posição ligeiramente diferente.
- Se o rato acordar durante as injeções, coloque-o de volta na pequena câmara de indução para anestesia com isoflurano a 2%-3% vol/vol.
5. Ultrassonografia por via dorsal
- Posicione o mouse em decúbito ventral sobre a almofada absorvente sobre uma almofada de aquecimento (Figura 2A-C).
- Coloque um cone de nariz de roedor firmemente sobre o nariz e o focinho do rato. Manter a profundidade anestésica com isoflurano administrado através do cone nasal a 1%-2% vol/vol em 100% deO2. Aplique lubrificante oftálmico estéril, conforme necessário, em cada olho.
- Monitore o mouse para uma frequência respiratória regular (1-2/s) e uma falta de resposta de pinça do dedo do pé para indicar se a anestesia precisa ser ajustada.
- Coloque uma pequena quantidade (~0,5-1 mL) de gel de ultrassom pré-aquecido abaxial (lateral) na coluna vertebral de cada lado do camundongo anestesiado, entre a última costela e a pelve.
- Coloque uma pequena quantidade de gel na sonda de ultrassom.
- Coloque a sonda paralela às vértebras com a frente da sonda no lado cranial. Uma marca indicadora está presente na cabeça da sonda para indicar a orientação adequada da sonda. Registre o dia, a hora, a identificação do animal, a orientação da sonda e o lado do animal (direito, esquerdo, dorsal, ventral) para cada novo conjunto de imagens coletadas.
- Com um camundongo em decúbito ventral (pele do dorso tocando a sonda), varrer lentamente a área para o ponto de referência renal (Figura 2B e Figura 3). Com o rim em vista, truxe a sonda caudal para encontrar o ovário - uma estrutura oval a redonda levemente hiperecoica (Figura 4A, B) dentro de um coxim adiposo ovariano muito hiperecoico que é limitado crânio-ventralmente pelo rim e dorso-lateralmente pela parede abdominal dorsal.
OBS: A pressão caudal e lateral ao ovário pode direcionar o ovário para mais perto da parede abdominal e para longe das alças do intestino. O ovário é posicionado anatomicamente contra a parede abdominal dorsal, apenas ventral e lateral aos músculos epaxiais e caudal ao rim. - Ajuste o ganho de sinal usando o controle deslizante na parte inferior da tela de controle para melhorar o contraste da imagem.
- Para melhorar a imagem do rim, aplique pressão com um dedo no abdome contralateral. Varie a pressão e o ângulo de diretamente paralelo à coluna vertebral para ~20° ventral.
- Quando o órgão de interesse estiver à vista, colete um vídeo clicando em Salvar Clipe ou Iniciar Gravação e, em seguida, em Parar Gravação quando concluído para reter imagens em um número predefinido de quadros.
- Salve quadros únicos de uma imagem ao vivo ou gravação com o botão Salvar quadro .
- Para obter imagens do útero, puxe a sonda caudalmente até que o ovário esteja no aspecto mais cranial do campo de visão. Varie a pressão e o ângulo da sonda até que o útero esteja à vista.
- Repita a coleta de vídeos e quadros para cada órgão de interesse.
- Localiza-se o útero longitudinalmente ao longo da parede abdominal dorsal com a musculatura lateral da perna também em vista (Figura 4B).
NOTA: O tamanho do útero e o diâmetro do lúmen podem variar com a fase do estro e o estado da doença. - Monitorar o tecido quanto ao movimento peristáltico para diferenciar as alças intestinais dos cornos estacionários uterinos.
6. Coletar imagens de uma abordagem ventral
- Coloque o camundongo em decúbito dorsal e verifique se a lubrificação ocular é suficiente e se o focinho está firmemente no cone nasal (Figura 2A).
- Aplicar uma pequena quantidade (~0,5-1 mL) de gel de ultrassom pré-aquecido no abdome ventral e aplicar a sonda na linha média apenas cranial do púbis para localizar a bexiga como um marco hipoecoico (Figura 5).
NOTA: Se a bexiga for muito grande e obscurecer a imagem do útero, uma pressão suave pode ser colocada no abdômen inferior para expressar a urina. - Puxe a sonda lateralmente à bexiga para encontrar os cornos uterinos. Aplique uma leve pressão digital de um ou ambos os lados do mouse para trazer os chifres para o campo de visão. Segure a sonda perpendicularmente ao mouse e escaneie ambos os lados do abdômen para capturar vistas transversais (seções transversais) de ambos os chifres. Gire a sonda para capturar visualizações sagitais.
- Após o ultrassom, limpe o mouse de gel com um papel toalha e devolva-o à gaiola para se recuperar. Os ratos estão totalmente acordados em 2-5 min. Quando estiver totalmente acordado e deambulando, devolva o rato ao biotério.
NOTA: Uma almofada de aquecimento em fogo baixo pode ser colocada sob a gaiola para aquecer a gaiola para recuperação. - No ponto final experimental ou humano, eutanasiar o rato. O ideal é eutanasiar o rato na gaiola caseira para reduzir o estresse; alternativamente, coloque o mouse em uma câmara limpa. Forneça CO2 pressurizado a uma taxa de deslocamento de 10%-30% do volume da câmara por minuto. Após aproximadamente 5 min sem respiração visível, verificar óbito por luxação cervical. Proceder à necropsia abdominal para retirada do tumor.
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Representative Results
Camundongos transgênicos Pax8-Cre-Arid1a-Pten de dupla deleção (iPAD) foram mantidos em um background genético misto (129S, BALB/C, C57BL/6), como descrito anteriormente14. Todos os camundongos foram alimentados com uma ração de doxiciclina por 2 semanas para induzir Cre recombinase. Em trabalhos anteriores de nosso grupo, a doxiciclina foi dosada por gavagem14; No entanto, neste estudo, o método de indução alimentar com doxiciclina funcionou eficientemente e reduziu o estresse de gavagem para os camundongos. É importante verificar se o método de administração de doxiciclina é adequado para induzir a expressão de Cre recombinase necessária para excisar o DNA de supressores tumorais (Arid1a e Pten) em células que expressam Pax8, como o útero. A imuno-histoquímica com anticorpos direcionados contra ARID1a e pTEN14 foi utilizada para verificar se houve adequada perda proteica supressora tumoral nas células epiteliais uterinas em relação ao tecido estromal vizinho, como pode ser observado na Figura 6. O esquema do modelo murino e a regulação da expressão do supressor tumoral são apresentados na Figura 1.
Após 2 semanas de doxiciclina, o útero não mudou significativamente de tamanho em comparação com os controles ou o mesmo camundongo fotografado antes da administração de doxiciclina. No entanto, nas próximas 2-6 semanas após a doxiciclina, o ultrassom mostrou que os camundongos desenvolveram uma série de patologias uterinas, começando com hiperplasia e progredindo para adenocarcinoma. A Figura 7A,B mostra imagens ultrassonográficas de útero de camundongo com alterações patológicas precoces observadas após 3 semanas de tratamento com doxiciclina. A Figura 7C,D mostra a patologia macroscópica e histopatológica do mesmo útero fotografada na Figura 7A,B após a eutanásia do camundongo imediatamente após a aquisição de imagens com 3 semanas. Observa-se útero de paredes finas menor (mas dilatado) e hiperplasia endometrial precoce com preservação da distinta luz (líquido uterino hiperecoico central). Nos camundongos eutanasiados em momentos posteriores, o útero era muito maior, tinha lúmen menor e parede espessada (Figura 8 e Figura 9). Exemplos de lúmens dilatados e alterações sutis no endométrio hiperplásico são comparados ao tecido denso e ao crescimento nodular do câncer no útero nas Figuras 8 e 9. A ultrassonografia e as imagens macroscópicas foram altamente consistentes entre si para todos os camundongos representados. A Figura 9 apresenta múltiplas imagens do útero de um mesmo camundongo em um estudo de curso temporal e demonstra as alterações morfológicas observadas ao longo de 6 semanas à medida que o adenocarcinoma se desenvolveu. A Figura 5 apresenta uma abordagem ventral com cortes transversais dos cornos uterinos adjacentes à bexiga hipoecoica.
Para aumentar o contraste no abdome, a injeção de soro fisiológico na cavidade abdominal diretamente antes da aquisição de imagens melhorou a visualização dos órgãos abdominais, incluindo o útero e os ovários. A Figura 3 mostra as comparações ultrassonográficas do mesmo camundongo antes e após a injeção de 1 mL de solução salina. Com soro fisiológico, houve um aumento do espaço hipoecoico (preto) entre os órgãos, o que permitiu que o rim, o coxim gorduroso, o ovário, os cornos uterinos, os intestinos e o baço fossem mais prontamente individualizados uns dos outros. Em todas as outras figuras aqui apresentadas, injeções de soro fisiológico foram feitas antes da aquisição de imagens para melhorar a clareza da imagem.
Em conjunto, este protocolo mostra que este modelo induzível do rato desenvolve adenocarcinoma durante um período de 6 semanas e pode ser monitorado com ultrassom para estabelecer uma linha de base e observar as alterações morfológicas no útero à medida que o cancro se desenvolve. Aqui, demonstra-se que a ultrassonografia não invasiva permite que os cornos uterinos de camundongos sejam avaliados em série ao longo de várias semanas com imagens que são preditivas das alterações patológicas uterinas reais.
Figura 1: Estratégia para a geração de camundongos transgênicos duplos KO induzíveis Pax8-Cre. (A) A produção constitutiva de um transativador controlado por tetraciclina reversa (rtTA) em células epiteliais uterinas que expressam Pax8 resulta na ativação induzível da Cre recombinase na presença de tetraciclina, ou sua doxiciclina analógica, ligando-se a elementos de resposta de tetraciclina (TRE). Sítios de flox localizados a montante e a jusante do éxon 8 (Arid1a) e do éxon 5 (Pten) são alvo da recombinase Cre. A deleção cre-direcionada do éxon 8 em Arid1a resulta em uma mutação frameshift e um códon stop precoce (p.Gly809Hisfs*6). A deleção cre-direcionada do éxon 5 em Pten resulta em uma mutação frameshift (p.Val85Glyfs*14). (B) O camundongo Pax8-rtTA expressa um transativador controlado por tetraciclina reversa (rtTA) sob o controle do promotor Pax8. Este camundongo é cruzado com o camundongo TetO-Cre que expressa a Cre recombinase de forma dependente de tetraciclina. A progênie desse cruzamento expressa uma recombinase Cre ativada por tetraciclina (ou doxiciclina) específica para células epiteliais uterinas que expressam Pax8 (transativador Pax8-Cre). (C) Camundongos Arid1a flox/flox no fundo 129S1 foram cruzados com Pten flox/flox no fundo BALB/C (Strain C;129S4-Ptentm1Hwu/J) para gerar o mouse Arid1a flox/flox/Pten flox/flox transresponder. (D) O mouse transativador Pax8-Cre é cruzado com um mouse Arid1a flox/flox/Pten flox/flox Transresponder. A progênie desse cruzamento resulta em um modelo murino transgênico com deleção Arid1a e Pten induzível por doxiciclina (iPAD) específica para células epiteliais uterinas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Procedimento de imagem . (A) Camundongo anestesiado com os pelos abdominais e dorsais removidos com clipper e creme depilatório. O camundongo é mantido sob anestesia inalatória com isoflurano através de um cone nasal e colocado em uma almofada térmica coberta com uma almofada absorvente. (B) Uma pequena quantidade de gel de ultrassom pré-aquecido é colocada sobre a região de interesse no camundongo e na sonda. Aqui, o camundongo está em decúbito ventral, e a sonda é colocada corretamente para localizar o rim, o ponto anatômico diretamente cranial ao ovário. (C) Na decúbito dorsal, a sonda pode ser manipulada manualmente para encontrar primeiro pontos de referência, como a bexiga, a fim de encontrar a localização aproximada dos cornos uterinos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Melhora da visibilidade e definição do órgão pela injeção de soro fisiológico. (A) Imagem de um rim e alças do trato gastrointestinal (canto inferior esquerdo) antes da injeção IP de 1,5 mL de soro fisiológico aquecido e estéril. O lado esquerdo da imagem é cranial ao rim. (B) Imagem do rim após a injeção de soro fisiológico, mostrando aumento (espaço hipoecoico, preto) entre os órgãos. Para ambas as imagens, em termos de orientação, o camundongo é de superfície dorsal para cima, e cranial para caudal é da esquerda para a direita. (C,D) A seção vermelha destacada mostra pontos de referência renais nas imagens 2D apresentadas em A e B. As imagens foram obtidas com transdutor MS550. Barras de escala = 2 mm em cada imagem. Abreviações: trato gastrointestinal = trato gastrointestinal; IP = intraperitoneal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Aparelho reprodutivo com pontos de referência . (A) O ovário (seta) localiza-se imediatamente caudal ao polo caudal do rim. (B) O corno uterino (seta estreita) é profundo e começa cranialmente à musculatura dorsal do membro posterior proximal (cabeça de seta), com o ovário também à vista (seta maior). Barras de escala = 2 mm. Para todas as imagens, em termos de orientação, o camundongo é a superfície dorsal para cima, e cranial para caudal é da esquerda para a direita. As imagens foram obtidas com transdutor MS550. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Cornos uterinos e bexiga fotografados a partir do decúbito dorsal. Imagens de ultrassom de dois camundongos antes da indução do câncer. (A) A luz vesical é visível como uma estrutura hipoecoica, ovoide, com mucosa hiperecoica. Ambos os chifres uterinos são visíveis juntos, com os limites de cada um traçados em azul claro. (B) A mesma visão em outro mouse com a bexiga muito mais cheia. Para ambas as imagens, em termos de orientação, o mouse é superfície ventral para cima, e a imagem esquerda é o mouse esquerdo. Os limites de cada corno uterino são desenhados em azul claro, com áreas dadas nas caixas de texto vizinhas (transdutor MS550). Barras de escala = 3 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Exemplos de H&E e imunohistoquímica de cortes do útero 6 semanas após a indução em um camundongo iPAD. (A) H&E representativo do tecido uterino de camundongos iPAD. (B) Imuno-histoquímica representativa da ARID1a. A coloração mostra perda de Arid1a específica para os núcleos das células epiteliais uterinas expressando Pax8 (seta preta), com retenção de Arid1a nos núcleos das células do estroma uterino (seta branca). (C) Imuno-histoquímica representativa do pTEN. A coloração mostra perda de pTEN no citoplasma das células epiteliais uterinas que expressam Pax 8 (seta preta), com retenção de pTEN no citoplasma das células do estroma uterino (seta branca). Métodos detalhados de IHQ foram previamente publicados14. Barras de escala = 100 μm. Abreviações: iPAD = Pten induzível, dupla deleção Arid1a; H&E = hematoxilina e eosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Exemplos de imagens de ultrassom de camundongos com alterações precoces na patologia. (A,B) Imagem de ultrassom antemortem de um útero cheio de líquido uterino naturalmente hiperecoico As setas estreitas indicam o lúmen hipoecoico e dilatado do útero. A cabeça de seta indica a área espessada da parede uterina. (C) Imagem macroscópica de todo o útero do camundongo fotografada em B. O asterisco branco está aproximadamente no mesmo local que o fotografado em A. (D) Neste mesmo camundongo, o útero foi processado e corado com H&. O corte histológico mostra espessamento da parede uterina devido à hiperplasia endometrial; A região de exemplo é indicada com uma ponta de seta. Para todas as imagens de US, em termos de orientação, o mouse é a superfície dorsal para cima, e cranial para caudal é da esquerda para a direita (transdutor MS550). Barras de escala = (A,B) 3 mm; (D) 500 μm. Abreviações: US = ultrassom; H&E = hematoxilina e eosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Diversidade da patologia uterina visível pela ultrassonografia . (A) Útero com hiperplasia e distensão hídrica causando dilatação luminal a um diâmetro de ~2,5 mm. (B) Um segundo útero com hiperplasia que está distendido em maior grau. (C) Um útero que está dilatado e preenchido com uma massa de tecidos moles. Barras de escala = 3 mm. Para todas as imagens, as setas estão para o lado ventral do corno uterino e, em termos de orientação da imagem, o camundongo é a superfície dorsal para cima, e cranial para caudal é da esquerda para a direita (transdutor MS550). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Alterações no desenvolvimento neoplásico do útero ao longo do tempo em um camundongo. (A) Imagem ultrassonográfica de um camundongo iPAD mostrando o rim (seta mais larga), ovário (caudal ao rim) e útero (seta estreita), com o músculo da perna também visível (cabeça de seta), capturado em três momentos: após o início da dieta com doxiciclina (semana 0), e novamente após 5 semanas e 6 semanas. A doxiciclina induziu a expressão de Cre com perda do supressor tumoral, o que promove o câncer de endométrio ao longo do tempo. (B) As mesmas imagens ultrassonográficas de A, mas com o corno uterino destacado em vermelho. (C) Imagens macroscópicas do útero in situ (seta estreita) a partir do período de 6 semanas; O tecido é visualizado a partir da superfície ventral. (D) O mesmo útero que em C dissecado ex vivo; O tecido é visualizado a partir da superfície ventral. (E) Histologia da massa uterina (coloração H&E), indicando adenocarcinoma a partir deste exemplo. Para A e B, em termos de orientação, o camundongo é a superfície dorsal para cima, e cranial para caudal é da esquerda para a direita (transdutor MS550). Barras de escala = (A,B, duas primeiras imagens em cada fileira) 1 mm; (A,B, terceira imagem) 2 mm; (E) 500 μm. Abreviações: iPAD = Pten induzível, dupla deleção Arid1a; H&E = hematoxilina e eosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo examina a utilidade da ultrassonografia para avaliar alterações morfológicas uterinas na progressão do adenocarcinoma no útero em camundongos. Neste estudo, ao acompanhar a indução do câncer de endométrio em camundongos longitudinalmente, os detalhes anatômicos detectados pela ultrassonografia mostraram-se indicadores de patologia macroscópica e histológica. Isso abre a porta para o uso de estudos longitudinais com um número menor de camundongos monitorados por ultrassom em vários pontos de tempo para acompanhar a progressão do câncer uterino em camundongos. Essa detecção longitudinal foi realizada utilizando-se uma sonda manual e sem o uso de equipamento de ultrassom do sistema ferroviário. As sondas de alta frequência (transdutores) utilizadas estão amplamente disponíveis, tornando esta abordagem reprodutível em várias instituições em todo o mundo. As etapas críticas do protocolo incluem o uso da sonda correta para o nível de resolução necessário para o experimento e a preparação do mouse para a aquisição de imagens antes do ultrassom.
Etapas críticas na preparação do mouse são remover todo o cabelo das áreas de estudo e injetar fluido na cavidade peritoneal. Os pelos deixados na pele podem levar ao aprisionamento de bolhas no gel de ultrassom, o que pode produzir artefatos nas imagens; portanto, deve-se tomar cuidado para remover os pelos uniformemente sobre a área de estudo. O creme depilatório foi escolhido como método para a depilação, pois remove os pelos uniformemente em toda a pele. Lesão na pele pode ocorrer se o creme é deixado na pele por uma quantidade excessiva de tempo (>3-4 min). Em ratos mais sensíveis ao creme depilatório, o creme só deve ser deixado na pele por 1-2 min para remover o cabelo. Em seguida, o mouse deve ser limpo com uma série de toalhas de papel molhadas para remover completamente o creme. Após a retirada de todo o cabelo da área de estudo, fluidos isotônicos estéreis e quentes são injetados na cavidade intraperitoneal para aumentar o contraste e auxiliar na definição dos limites dos órgãos abdominais. Neste estudo, a injeção de 1-2 mL de líquido foi suficiente para diferenciar ovário, oviduto e cornos uterinos. O líquido é gradualmente absorvido, e é melhor injetar imediatamente antes da imagem. Camundongos tornam-se hipotérmicos rapidamente sob anestesia com isoflurano. Isso pode ser evitado injetando soro fisiológico morno (armazenado em seringas em uma almofada de aquecimento) e também posicionando o mouse em uma almofada de aquecimento e pré-aquecendo o gel de ultrassom quando possível. As sessões de imagem com ultrassonografistas experientes ocorrem em 5-10 min/mouse e, com esse curto espaço de tempo, não ocorreu hipotermia significativa. Se necessário, até 2 mL adicionais de soro fisiológico podem ser injetados no abdômen para maior separação dos órgãos.
Os métodos aqui descritos destinam-se a ser facilmente reprodutíveis sem equipamento especializado além do aparelho de ultrassom e da(s) sonda(s). No método apresentado, a sonda é manipulada manualmente sem a ajuda de um sistema ferroviário. Este método manual é mais rápido e proporciona grande flexibilidade nos ângulos e pressão aplicados para destacar pequenas características. O direcionamento manual das sondas sobre o abdome e o uso de transdutores de baixa resolução poderiam limitar a qualidade de qualquer imagem individual adquirida em comparação com as imagens de um transdutor fixado no sistema ferroviário4. Um sistema ferroviário seria útil para injeções no útero (em fetos) ou injeções intracardíacas quando mais estabilidade é necessária. No entanto, há um trade-off em relação ao tempo mínimo de manipulação e maior acessibilidade para a ampla gama de instituições que carecem de instalações especializadas em ultrassonografia. O sucesso desse método simplificado exemplifica como a ultrassonografia pode ser utilizada em uma variedade de estudos. O método proposto é adequado para capturar alterações teciduais longitudinais em modelos de câncer uterino sem a necessidade de equipamentos dedicados e pode ser aplicado a outros modelos de doença progressiva. A manipulação manual dos camundongos durante a aquisição de imagens pode aumentar a variabilidade na profundidade e localização exatas do tecido, mas para estudos que não dependem desses fatores, a qualidade da imagem é suficiente para detectar alterações patológicas.
É importante salvar vídeos durante a geração de imagens; Mais tarde, na estação de trabalho do usuário, os vídeos podem ser parados em qualquer quadro que seja representativo da anatomia que precisa ser capturada e medida. Imagens dos órgãos podem ser medidas (diâmetro, circunferência ou comprimento) (Figura 5, corte transversal do corno uterino medido) e a área tumoral pode ser calculada. Os vídeos, mais do que quadros isolados, facilitam a identificação de órgãos em maior contexto anatômico. Os vídeos também são úteis para determinar o movimento dos intestinos delgado e grosso, o que pode ajudar a diferenciar os intestinos do útero. A obtenção de imagens de alta qualidade também depende da familiaridade com a anatomia do rato. Para a obtenção de imagens do útero móvel versus a obtenção de imagens de tecidos mais estacionários (por exemplo, um tumor de xenoenxerto implantado, ovários), o uso do método manual tem a vantagem de escanear e seguir os cornos uterinos de proximal a distal. Durante a varredura, o ajuste gradual dos ângulos das mãos pode ser usado para seguir a buzina. A sonda MS550 foi usada para todas as imagens neste estudo e é preferível para o útero em comparação com a sonda MS700 de maior resolução, que é melhor para ovários. Recentemente, foi publicado um trabalho utilizando o MS700 para obter imagens da tireoide de camundongos, mostrando a alta resolução possível em outros tecidos15. A imagem de sonda portátil é útil devido aos diferentes graus de profundidade do tecido do útero entre o ovário e a bexiga. Neste trabalho, mover-se entre pontos anatômicos facilmente reconhecíveis, como o rim e a anatomia proximal dos membros posteriores, auxiliou na captura de imagens comparáveis nos diferentes momentos ao obter imagens do útero a partir da face dorsal do corpo.
Este método de ultrassom de alta resolução para acompanhar as mudanças anatômicas no útero ao longo do tempo durante a tumorigênese é superior aos métodos atuais que envolvem a eutanásia de animais de várias coortes em diferentes momentos. O ultrassom refina o modelo e reduz o número de camundongos necessários para o experimento, reduzindo custos e tempo. É importante ressaltar que esse método permite que a progressão da doença seja acompanhada em um nível individual, o que pode levar a insights que são mascarados em estudos dependentes de coortes sacrificadas por ponto de tempo em vez de estágio da doença. Devido à sua natureza não invasiva, o ultrassom em camundongos tem muitas aplicações potenciais para pesquisa em câncer de útero ou ovário.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Somos gratos pelo financiamento do NCI Ovarian Cancer SPORE Program P50CA228991, do programa de treinamento de pós-doutorado 5T32OD011089 e do Richard W. TeLinde Endowment, Johns Hopkins University. O projeto também foi parcialmente financiado pelos subsídios para despesas correntes para Instituições Privadas de Ensino Superior da Corporação de Promoção e Ajuda Mútua para Escolas Privadas do Japão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Kim, S. W., Kim, Y. Y., Kim, H., Ku, S. Y. Animal models closer to intrauterine adhesive pathology. Annals of Translational Medicine. 8 (18), 1125 (2020).
- Shi, D., Vine, D. F. Animal models of polycystic ovary syndrome: a focused review of rodent models in relationship to clinical phenotypes and cardiometabolic risk. Fertility and Sterility. 98 (1), 185-193 (2012).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 519238 (2012).
- Palsdottir, K., et al. Interobserver agreement of transvaginal ultrasound and magnetic resonance imaging in local staging of cervical cancer. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. 58 (5), 773-779 (2021).
- Gabrielson, K., et al. In vivo imaging with confirmation by histopathology for increased rigor and reproducibility in translational research: A review of examples, options, and resources. ILAR Journal. 59 (1), 80-98 (2018).
- Peterson, R. A., et al. Continuing education course #1: Non-invasive imaging as a problem-solving tool and translational biomarker strategy in toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 39 (1), 267-272 (2011).
- Pfeifer, L. F., Adams, G. P., Pierson, R. A., Singh, J. Ultrasound biomicroscopy: A non-invasive approach for in vivo evaluation of oocytes and small antral follicles in mammals. Reproduction, Fertility and Development. 26 (1), 48-54 (2013).
- Cheung, A. M., et al. Three-dimensional ultrasound biomicroscopy for xenograft growth analysis. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (6), 865-870 (2005).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Wu, G., Wang, L., Yu, L., Wang, H., Xuan, J. W. The use of three-dimensional ultrasound micro-imaging to monitor prostate tumor development in a transgenic prostate cancer mouse model. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 207 (3), 181-189 (2005).
- Rinaldi, S. F., et al. Ultrasound-guided intrauterine injection of lipopolysaccharide as a novel model of preterm birth in the mouse. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1201-1206 (2015).
- Wang, T., et al. Ultrasonography in experimental reproductive investigations on rats. Journal of Visualized Experiments. 130, e56038 (2017).
- Suryo Rahmanto, Y., et al. Inactivation of Arid1a in the endometrium is associated with endometrioid tumorigenesis through transcriptional reprogramming. Nature Communications. 11, 2717 (2020).
- Pani, F., et al. Pre-existing thyroiditis ameliorates papillary thyroid cancer: Insights from a new mouse model. Endocrinology. 162 (10), bqab144 (2021).
