Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה למעקב אחר התקדמות שינויים מורפולוגיים לאורך זמן ברחם במודל עכברי מושרה של סרטן רירית הרחם באמצעות הדמיית אולטרסאונד עם קורלציה לשינויים גסים והיסטולוגיים.
Abstract
סרטן הרחם יכול להיחקר בעכברים בשל קלות הטיפול והמניפולציה הגנטית במודלים אלה. עם זאת, מחקרים אלה מוגבלים לעתים קרובות להערכת פתולוגיה לאחר המוות בבעלי חיים שהומתו בנקודות זמן מרובות בקבוצות שונות, מה שמגדיל את מספר העכברים הדרושים למחקר. הדמיה של עכברים במחקרי אורך יכולה לעקוב אחר התקדמות המחלה בבעלי חיים בודדים, ולהפחית את מספר העכברים הדרושים. ההתקדמות בטכנולוגיית האולטרסאונד אפשרה זיהוי של שינויים ברמת המיקרומטר ברקמות. אולטרסאונד שימש לחקר הבשלת זקיקים בשחלות וצמיחת קסנוגרפט, אך לא יושם על שינויים מורפולוגיים ברחם העכבר. פרוטוקול זה בוחן את הסמיכות של פתולוגיה עם השוואות הדמיה in vivo במודל עכבר סרטן רירית הרחם המושרה. המאפיינים שנצפו על ידי אולטרסאונד היו עקביים עם מידת השינוי שנצפתה על ידי פתולוגיה גסה והיסטולוגיה. אולטרסאונד נמצא כמנבא מאוד את הפתולוגיה הנצפית, ותומך בשילוב אולטרה-סאונד במחקרי אורך של מחלות רחם כגון סרטן בעכברים.
Introduction
עכברים נותרו אחד המודלים החשובים ביותר של בעלי חיים להפרעות רבייה 1,2,3. ישנם מספר מודלים מהונדסים גנטית או מושרית מכרסמים של סרטן השחלות והרחם. מחקרים אלה מסתמכים בדרך כלל על קבוצות מרובות שהומתו בנקודות זמן שונות כדי ללכוד מגמות אורך בשינויים מורפולוגיים ופתולוגיים. זה מונע את היכולת לרכוש נתונים רציפים על התפתחות סרטן בעכבר בודד. בנוסף, מבלי לדעת את מצב התקדמות מחלת העכבר הבודד, מחקרי התערבות מבוססים על נקודות זמן קבועות מראש וממצאים ממוצעים של קבוצות קודמות ולא על סף בודד לזיהוי התקדמות בחיה ספציפית 4,5. לכן, יש צורך בגישות הדמיה המאפשרות הערכת אורך בבעלי חיים כדי להקל על מודלים פרה-קליניים לבדיקת תרופות או תרכובות חדשות ולהאיץ את הבנת הפתולוגיה תוך הגברת ההקפדה והשכפול6.
הדמיית אולטרסאונד (US) היא שיטה מושכת לניטור אורכי של התקדמות סרטן הרחם בעכבר מכיוון שהיא קלה יחסית וזולה בהשוואה לשיטות הדמיה אחרות, קלה לביצוע ויכולה להיות ברזולוציה יוצאת דופן 6,7. שיטה לא פולשנית זו יכולה ללכוד תכונות בקנה מידה מיקרוני בעכברים ערים או עם עכברים תחת טשטוש קצר באמצעות בדיקה של 5-10 דקות. מיקרוסקופ אולטרסאונד אומת כשיטה למדידת התפתחות זקיק השחלות של עכבר 8 וצמיחת ניאופלזיה מושתלת או מושרית 9,10,11. US בתדירות גבוהה שימש גם לזריקות תוך רחמיות מלעוריות12 ולצפייה בשינוי רחם חולדה במהלך מחזור הייחום13. ניתן להשתמש בארה"ב בתדר גבוה עם עכברים המוחזקים על פלטפורמות נייחות מיוחדות באמצעות מערכת מסילות להחזקת המתמר / הגשושית כדי לצלם תמונות ברזולוציה גבוהה עם מיקום ולחץ סטנדרטיים; עם זאת, ציוד זה אינו זמין בכל המוסדות. ניתן לאמץ שיטות סריקת מתמרים ידניות עם ציוד פחות ייעודי ולהשתמש בהן הן לאבחון קליני והן ליישומי מחקר בעכברים.
נשאלת השאלה האם ניתן להשתמש בהדמיה אמריקאית עם בדיקות ידניות בתדירות גבוהה כדי לעקוב אחר התפתחות סרטן הרחם במשך שבועות רבים. בדומה למעיים, הרחם המכרסם הוא מבנה דק ודק שהוא נייד מאוד בתוך הבטן והוא רציף דרך עומקי רקמות מרובים, מה שהופך את ההדמיה למאתגרת יותר מאשר עם איברים חסרי תנועה יחסית כמו הכליות. מחקר זה ביקש לקבוע את המתאם בין רקמות שנצפו על ידי אולטרסאונד והיסטופתולוגיה, להגדיר ציוני דרך לאיתור רחם העכבר ולקבוע את היתכנות ההערכה האורכית של סרטן רירית הרחם. מחקר זה מציג נתונים המראים התאמה איכותית בין הופעת הרחם שצולם על ידי US לבין היסטופתולוגיה, כמו גם הדמיה סדרתית של עכברים במשך מספר שבועות. תוצאות אלה מצביעות על כך שניתן להשתמש ב- US ידני כדי לעקוב אחר התפתחות סרטן רירית הרחם בעכברים, ובכך ליצור הזדמנות לאיסוף נתוני אורך של עכברים בודדים לחקר סרטן הרחם ללא צורך בציוד ייעודי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים והניסויים בעכברים בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של ג'ונס הופקינס. לכל ההליכים נלבש ציוד הגנה אישי מתאים, כולל כפפות וחלוקי בידוד חד פעמיים. ננקטו אמצעי זהירות בעת הטיפול בחדים, אשר הושלכו כראוי במיכלי חדים בקופסה אדומה מיד לאחר השימוש. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.
1. השראת סרטן רירית הרחם בעכברי iPAD ( inducible Pten, Arid1a Double Deletion) עם דוקסיציקלין
- שמרו על 10 עכברים טרנסגניים מסוג Pax8-Cre-Arid1a-Pten (iPAD) על רקע גנטי מעורב (129S, BALB/C, C57BL/6), כפי שתואר קודם לכן14.
- אסוף תמונות אולטרסאונד בסיסיות (2D) של השחלות, האובידוקט והרחם של כל עכבר לפני הטיפול בדוקסיציקלין.
- ספקו באופן בלעדי דיאטות צ'או עכברים המכילות דוקסיציקלין (דוקסיציקלין היקלט במינון 625 מ"ג/ק"ג מזון) לנקבות עכברי iPAD למשך שבועיים לפחות החל מגיל 7-8 שבועות כדי לגרום למחיקת גנים.
2. הגדרת ציוד
- הפעילו את כרית החימום וכסו בכרית סופגת נקייה (טמפרטורת יעד: 38°C).
- ודא כי אידוי isoflurane ומיכל O2 מלאים כראוי. מלא מחדש והחלף אם התוכן נמוך.
- חברו את תא האינדוקציה, חרוט האף ומערכת הנבלות לוופורייזר.
- הגדר את מכשיר האולטרסאונד.
- בחר מתמר (בדיקה) עם טווח של 32-56 MHz או עד 70 MHz עבור הדמיה של הרחם או השחלה, בהתאמה.
- חבר את הגשושית והפעל את המכונה.
- לאחר אתחול המערכת, השתמש בלוח הבקרה כדי להיכנס באמצעות אישורי המשתמש ולגשת למסך הבית.
- ממסך הבית, עבור אל הכרטיסיה יישומים ובחר מצב בטן (קטן) של עכבר.
- לחץ על סריקה כדי לחזור למסך הבית, והמתן להצגת תמונה חיה.
- בחרו B-Mode מהאפשרויות בסרגל הכלים השמאלי.
- לחץ על פקדים נוספים כדי להציג כלים נוספים לעידון תמונה, כגון רווח ועומק תמונה, או כדי להתאים את הגדרות רכישת הקליפ, כגון מספר הפריימים לשנייה.
- לאחר בחירת הגדרות התמונה, חזור למסך הבית על ידי לחיצה על סרוק.
- הפעל את מיכל O2 , כוון את הזרימה לתא האינדוקציה והגדר את קצב הזרימה ל- 1 L/min.
3. הכנת עכברים לבדיקת אולטרסאונד, כולל הסרת שיער
- מקם עכבר בתא האינדוקציה. הגדר את וופורייזר isoflurane על 2%-3% vol/vol להשראת הרדמה.
- לקבוע את עומק ההרדמה המתאים על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן וקצב נשימה סביב 1-2 נשימות / שנייה.
- החל חומר סיכה אופתלמי סטרילי על כל עין. הסר את הפרווה מן dorsum ו ventrum בין הצלע האחרונה ואת האגן עם קוצץ בגודל מתאים.
- יש למרוח שכבה דקה של קרם דפילטורי על אזורי הגחון והגב לצורך הדמיה (במידת הצורך).
- החזירו את העכבר לתא האינדוקציה למשך כ-3-5 דקות כדי לשמור על עומק ההרדמה המתאים בזמן שקרם ההרדמה פועל להסרת השיער. לאחר ≤4 דקות, נגבו בעדינות את הקרם במגבת נייר לחה ונקייה.
הערה: חשיפה ממושכת יותר לקרם מסיר שיער מגרה ועלולה לגרום לנגעים בעור.
4. הזרקה intraperitoneal של נוזל כדי להגדיל את הניגוד בין איברים
- חממו מזרק בנפח 3-10 מ"ל מלא בתמיסת נוזל איזוטוני סטרילי (למשל, תמיסת רינגרים סטרילית 0.9% NaCl או Lactated Ringers) לטמפרטורה של 35-40°C על ידי הנחתו בין כרית חימום לפד סופג למשך מספר דקות. הניחו בקבוק ג'ל אולטרסאונד על כרית החימום אם אין במכשיר מחמם.
- עבור עכבר 20-25 גרם, להזריק 1-2 מ"ל של פתרון לתוך חלל הצפק.
- אבטח את העכבר על ידי קשקוש ביד אחת, חושף את הוונטרום.
- החזק את העכבר בזווית ~ 20 מעלות, כאשר האף מכוון לרצפה כדי לכוון את האיברים באופן גולגולתי עקב כוח הכבידה.
- באמצעות מחט מד קטנה (25 גרם, 5/8 אורך, מזרק שחפת), לנקב דרך העור ואת דופן הבטן של הרביע הימני הקאודלי של הבטן.
- לפני הזרקת נוזלים, כדי למנוע הזרקה לתוך כלי הדם או מערכת העיכול, למשוך אחורה עם לחץ מינימלי. אם דם או חומר אחר נכנס מזרק, להסיר את המחט. השתמש מחט חדשה מזרק, ולנסות שוב במיקום שונה במקצת.
- אם העכבר מתעורר במהלך ההזרקות, החזירו אותו לתא האינדוקציה הקטן להרדמה עם 2%-3% vol/vol isoflurane.
5. הדמיית אולטרסאונד בגישה גבית
- מקמו את העכבר בשכיבה גחונית על כרית הספיגה מעל כרית חימום (איור 2A-C).
- הניחו חרוט אף מכרסם היטב על אפו ולוע העכבר. שמור על עומק ההרדמה עם איזופלורן המועבר דרך חרוט האף ב 1%-2% vol/vol ב 100% O2. יש למרוח חומר סיכה אופתלמי סטרילי, לפי הצורך, על כל עין.
- עקוב אחר קצב נשימה רגיל (1-2/s) וחוסר תגובה של צביטת בוהן כדי לציין אם יש צורך להתאים את ההרדמה.
- מניחים כמות קטנה (~ 0.5-1 מ"ל) של ג'ל אולטרסאונד שחומם מראש abaxial (לרוחב) לעמוד השדרה משני צדי העכבר המרדים, בין הצלע האחרונה לאגן.
- שים כמות קטנה של ג'ל על הבדיקה אולטרסאונד.
- מקם את הבדיקה במקביל לחוליות עם החלק הקדמי של הבדיקה בצד הגולגולת. סימן חיווי קיים על ראש הבדיקה כדי לציין את כיוון הבדיקה הנכון. תעד את היום, השעה, מזהה בעל החיים, כיוון הגשושית וצד החיה (ימין, שמאל, גבי, גחון) עבור כל קבוצה חדשה של תמונות שנאספות.
- עם עכבר בשכיבה גחונית (העור הגבי נוגע בבדיקה), סרוק באיטיות את האזור בחיפוש אחר ציון הדרך בכליות (איור 2B ואיור 3). כאשר הכליה במבט כולל, משכו את הגשושית כדי למצוא את השחלה – מבנה אליפטי מעט היפראקואי עד עגול (איור 4A, B) בתוך כרית שומן שחלתית היפראקואית מאוד הגובלת בקרניו-ונטרלית על ידי הכליה ובגב-לטרלית על ידי דופן הבטן הגבית.
הערה: לחץ קאודלי ורוחבי לשחלה יכול לכוון את השחלה קרוב יותר לדופן הבטן והרחק מלולאות המעי. השחלה ממוקמת אנטומית כנגד דופן הבטן הגבית, רק גחונית וצידית לשרירים האפקסיאליים וקאודלית לכליה. - התאם את עוצמת האות באמצעות המחוון בתחתית מסך הבקרה כדי לשפר את ניגודיות התמונה.
- כדי לשפר את ההדמיה של הכליה, להפעיל לחץ עם אצבע על הבטן contralateral. שנה את הלחץ והזווית ממקביל ישירות לעמוד השדרה ל~ 20° גחון.
- ברגע שהאיבר המעניין מוצג, אסוף סרטון על ידי לחיצה על שמור קליפ או התחל להקליט ואז הפסק להקליט בסיום כדי לשמור על תמונות במספר מוגדר מראש של מסגרות.
- שמור מסגרות בודדות מתמונה חיה או מהקלטה באמצעות הלחצן Save Frame .
- כדי לדמיין את הרחם, משוך את הבדיקה באופן קאודלי עד שהשחלה נמצאת בהיבט הגולגולתי ביותר של שדה הראייה. שנו את לחץ הבדיקה ואת הזווית עד שהרחם יהיה גלוי.
- חזור על אוסף וידאו ומסגרות עבור כל איבר מעניין.
- מצאו את הרחם רץ לאורך דופן הבטן הגבית, כשגם שרירי הרגל הצידית נראים לעין (איור 4B).
הערה: גודל הרחם וקוטר הלומן עשויים להשתנות עם שלב הייחום ומצב המחלה. - לפקח על הרקמה עבור תנועה פריסטלטית כדי להבדיל את לולאות המעי מן הקרניים נייחות הרחם.
6. אסוף תמונות מגישה גחונית
- הניחו את העכבר בשכיבה גבית, ובדקו שסיכוך העיניים מספיק והלוע נמצא היטב בחרוט האף (איור 2A).
- יש למרוח כמות קטנה (~0.5-1 מ"ל) של ג'ל אולטרסאונד שחומם מראש על הבטן הגחון, ולמרוח את הבדיקה בקו האמצע של הערווה כדי לאתר את שלפוחית השתן כנקודת ציון היפואקואית (איור 5).
הערה: אם שלפוחית השתן גדולה מדי ומסתירה את הדמיית הרחם, ניתן להפעיל לחץ עדין על הבטן התחתונה כדי לבטא שתן. - משוך את הבדיקה לרוחב לשלפוחית השתן כדי למצוא את קרני הרחם. הפעל לחץ דיגיטלי קל משני צידי העכבר או משני צדי העכבר כדי להביא את הקרניים לשדה הראייה. החזק את הגשושית בניצב לעכבר, וסרוק את שני צידי הבטן כדי ללכוד מבטים רוחביים (חתכים) של שתי הקרניים. סובב את הגשושית כדי ללכוד תצוגות קשת.
- לאחר האולטרסאונד, נגבו את העכבר מג'ל עם מגבת נייר, והחזירו אותו לכלוב שלו כדי להתאושש. עכברים ערים לחלוטין תוך 2-5 דקות. ברגע שהוא ער לחלוטין אמבולטורי, להחזיר את העכבר לחדר החיות.
הערה: ניתן להניח כרית חימום בחום נמוך מתחת לכלוב כדי לחמם את הכלוב להתאוששות. - בנקודת הקצה הניסיונית או האנושית, הרדימו את העכבר. באופן אידיאלי, להרדים את העכבר בכלוב הביתי כדי להפחית את הלחץ; לחלופין, הניחו את העכבר בתא נקי. יש לספק CO2 בלחץ בקצב תזוזה של 10%-30% מנפח התא לדקה. לאחר כ-5 דקות ללא נשימה נראית לעין, יש לוודא מוות כתוצאה מנקע צוואר הרחם. המשך עם נקרופסי בטן לקצירת גידולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pax8-Cre-Arid1a-Pten מחיקה כפולה (iPAD) עכברים טרנסגניים נשמרו על רקע גנטי מעורב (129S, BALB/C, C57BL/6), כפי שתואר קודם לכן14. כל העכברים קיבלו מזון דוקסיציקלין במשך שבועיים כדי לגרום ל-Cre recombinase. בעבודה קודמת של הקבוצה שלנו, דוקסיציקלין קיבל מינון על ידי gavage14; עם זאת, במחקר הנוכחי, שיטת השראת הזנת דוקסיציקלין עבדה ביעילות והפחיתה את הלחץ של Gavage עבור העכברים. חשוב לבדוק כי שיטת מתן דוקסיציקלין מספיקה כדי לגרום לביטוי Cre recombinase הדרוש כדי להוציא את הדנ"א עבור מדכאי גידולים (Arid1a ו- Pten) בתאים המבטאים Pax8, כגון הרחם. אימונוהיסטוכימיה עם נוגדנים המכוונים נגד ARID1a ו-pTEN14 שימשה כדי לבדוק אם אובדן חלבון מדכא גידול מספיק הושג בתאי האפיתל של הרחם בהשוואה לרקמת הסטרומה השכנה, כפי שניתן לראות באיור 6. הסכימה של מודל העכבר וויסות ביטוי מדכא הגידול מוצגת באיור 1.
לאחר שבועיים של דוקסיציקלין, הרחם לא השתנה באופן משמעותי בגודלו בהשוואה לבקרות או לאותו עכבר שצולם לפני מתן דוקסיציקלין. עם זאת, במהלך 2-6 השבועות הבאים לאחר דוקסיציקלין, אולטרסאונד הראה כי העכברים פיתחו מגוון של פתולוגיות ברחם, החל מהיפרפלזיה ועד אדנוקרצינומה. איור 7A,B מתאר תמונות אמריקאיות של רחם עכבר עם שינויים פתולוגיים מוקדמים שנצפו לאחר 3 שבועות של טיפול בדוקסיציקלין. איור 7C,D מראה את הפתולוגיה הגסה וההיסטופתולוגיה של אותו הרחם שצולמו באיור 7A,B לאחר שהעכבר עבר המתת חסד מיד לאחר ההדמיה בגיל 3 שבועות. ניתן להבחין ברחם דק דופן קטן יותר (אך מורחב) ובהיפרפלזיה מוקדמת של רירית הרחם עם שימור הלומן המובהק (נוזל הרחם ההיפראקואי המרכזי). בעכברים שעברו המתת חסד בנקודות זמן מאוחרות יותר, הרחם היה הרבה יותר גדול, היה לו לומן קטן יותר והיה לו דופן מעובה (איור 8 ואיור 9). דוגמאות של לומן מורחב ושינויים עדינים ברירית הרחם ההיפרפלסטית מושוות לגידול צפוף של רקמות וסרטן נודולרי ברחם באיור 8 ובאיור 9. תמונות האולטרסאונד והגס היו עקביות מאוד זו עם זו עבור כל העכברים המיוצגים. איור 9 מציג תמונות רחם מרובות מאותו עכבר במחקר של קורס זמן, ומדגים את השינויים המורפולוגיים שנצפו במשך 6 שבועות עם התפתחות אדנוקרצינומה. איור 5 מציג גישה גחונית עם חתכים של קרני הרחם הסמוכות לשלפוחית השתן ההיפואקואית.
כדי לשפר את הניגודיות בבטן, הזרקת מי מלח לחלל הבטן ישירות לפני ההדמיה שיפרה את ההדמיה של איברי הבטן, כולל הרחם והשחלות. איור 3 מראה השוואות אולטרסאונד מאותו עכבר לפני ואחרי הזרקה של 1 מ"ל מי מלח. עם מלוחים, היה רווח היפואקואי מוגבר (שחור) בין האיברים שאיפשר לכליה, כרית השומן, השחלה, קרני הרחם, המעיים והטחול להיות אינדיבידואליים בקלות רבה יותר זה מזה. בכל שאר הנתונים המוצגים כאן, הזרקות מי מלח נעשו לפני ההדמיה כדי לשפר את בהירות התמונה.
יחד, פרוטוקול זה מראה כי מודל עכבר מושרה זה מפתח אדנוקרצינומה על פני תקופה של 6 שבועות וניתן לעקוב אחריו באמצעות אולטרסאונד כדי לקבוע קו בסיס ולצפות בשינויים מורפולוגיים ברחם עם התפתחות הסרטן. כאן, הוכח כי אולטרסאונד לא פולשני מאפשר להעריך באופן סדרתי את קרני הרחם בעכבר במשך מספר שבועות עם תמונות המנבאות את השינויים הפתולוגיים ברחם בפועל.
איור 1: אסטרטגיה ליצירת עכברים טרנסגניים מסוג Pax8-Cre עם KO כפול. (A) הייצור המכונן של טרנסאקטיבטור מבוקר טטרציקלין הפוך (rtTA) בתאי אפיתל רחמי המבטאים Pax8 גורם להפעלה מושרית של Cre recombinase בנוכחות טטרציקלין, או דוקסיציקלין אנלוגי שלו, על ידי קשירה לרכיבי תגובה טטרציקלין (TRE). אתרי Flox הממוקמים במעלה ובמורד הזרם של אקסון 8 (Arid1a) ואקסון 5 (Pten) נמצאים על הכוונת של Cre recombinase. מחיקה ממוקדת של אקסון 8 ב-Arid1a גורמת למוטציה של הסטת מסגרת ולקודון עצירה מוקדם (p.Gly809Hisfs*6). מחיקה ממוקדת Cre של אקסון 5 ב-Pten גורמת למוטציה frameshift (p.Val85Glyfs*14). (B) עכבר Pax8-rtTA מבטא טרנסאקטיבטור מבוקר טטרציקלין הפוך (rtTA) תחת שליטתו של מקדם Pax8. עכבר זה מוצלב עם עכבר TetO-Cre המבטא Cre recombinase באופן תלוי טטרציקלין. הצאצאים ממעבר זה מבטאים טטרציקלין (או דוקסיציקלין) המופעל על ידי Cre recombinase ספציפי לתאי אפיתל רחם המבטאים Pax8 (Pax8-Cre transactivator). (C) עכברי Arid1a flox/flox על רקע 129S1 הוצלבו עם Pten flox/flox על רקע BALB/C (זן C;129S4-Ptentm1Hwu/J) כדי ליצור את עכבר הטרנסresponder Arid1a flox/flox/Pten flox/flox. (D) עכבר הטרנסאקטיבטור Pax8-Cre מוצלב עם עכבר Transresponder Arid1a flox/flox/Pten flox/flox. צאצאים ממעבר זה יוצרים מודל מורין מהונדס עם מחיקה מושרית של דוקסיציקלין Arid1a ו-Pten (iPAD) ספציפית לתאי אפיתל הרחם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הליך הדמיה . (A) עכבר מורדם שפרוות הבטן והגב הוסרו ממנו בעזרת קוצץ וקרם מסיר שיער. העכבר נשמר בהרדמה איזופלורנית ממסים נדיפים דרך חרוט אף ומונח על כרית חום המכוסה בפד סופג. (B) כמות קטנה של ג'ל אולטרסאונד שחומם מראש מונחת על אזור העניין על העכבר ועל הבדיקה. כאן, העכבר נמצא בשכיבה גחון, והבדיקה ממוקמת כראוי כדי לאתר את הכליה, ציון הדרך האנטומי ישירות גולגולת לשחלה. (C) בשכיבה גבית, ניתן לבצע מניפולציה ידנית על הבדיקה כדי למצוא תחילה ציוני דרך כגון שלפוחית השתן על מנת למצוא את המיקום המשוער של קרני הרחם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: שיפור הראות והגדרת האיברים על-ידי הזרקת מי מלח. (A) תמונה של כליה ולולאות של מערכת העיכול (למטה משמאל) לפני הזרקת IP של 1.5 מ"ל של מי מלח מחוממים וסטריליים. הצד השמאלי של התמונה הוא גולגולתי לכליה. (B) תמונה של הכליה לאחר הזרקת המלח, המראה רווח מוגבר (היפואקואי, שחור) בין האיברים. עבור שתי התמונות, מבחינת הכיוון, העכבר הוא פני השטח הגביים למעלה, והגולגולת לקאודלית משמאל לימין. (ג,ד) החלק האדום המודגש מציג ציוני דרך בכליות בתמונות הדו-ממדיות המוצגות ב-A וב-B. התמונות צולמו באמצעות מתמר MS550. פסי קנה מידה = 2 מ"מ בכל תמונה. קיצורים: מערכת העיכול = מערכת העיכול; IP = intraperitoneal. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מערכת הרבייה עם ציוני דרך . (A) השחלה (החץ) ממוקמת מיד בין קוטב קאודלי לקוטב קאודלי של הכליה. (B) קרן הרחם (חץ צר) עמוקה ומתחילה גולגולת לשרירים הגביים של הגפה האחורית הפרוקסימלית (ראש החץ), כאשר השחלה גם היא במבט (חץ גדול יותר). פסי קנה מידה = 2 מ"מ. עבור כל התמונות, במונחים של אוריינטציה, העכבר הוא פני השטח הגבי למעלה, וגולגולת לקאודל הוא משמאל לימין. התמונות צולמו באמצעות מתמר MS550. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: קרני הרחם ושלפוחית השתן בתמונה משכיבה גבית. תמונות אולטרסאונד משני עכברים לפני השראת סרטן. (A) לומן שלפוחית השתן נראה כמבנה היפואקואי, ביצתי עם רירית היפראקואית. שתי קרני הרחם נראות יחד, כאשר גבולותיה של כל אחת מהן מסומנים בכחול בהיר. (B) אותה תצוגה בעכבר אחר עם שלפוחית הרבה יותר מלאה. עבור שתי התמונות, במונחים של התמצאות, העכבר הוא משטח הגחון למעלה, והתמונה השמאלית היא העכבר שמאל. הגבולות של כל קרן רחם משורטטים בכחול בהיר, עם אזורים המופיעים בתיבות הטקסט השכנות (מתמר MS550). פסי קנה מידה = 3 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: דוגמאות של H&E ואימונוהיסטוכימיה של מקטעי רחם לאחר 6 שבועות לאחר השראת הרחם בעכבר iPAD. (A) H&E מייצג של רקמת הרחם של עכבר iPAD. (B) נציג ARID1a אימונוהיסטוכימיה. הצביעה מראה אובדן של Arid1a ספציפי לגרעינים של תאי אפיתל רחם המבטאים Pax8 (חץ שחור), עם שימור של Arid1a בגרעיני תאי הסטרומה של הרחם (חץ לבן). (C) נציג pTEN אימונוהיסטוכימיה. הצביעה מראה אובדן pTEN בציטופלסמה של תאי אפיתל רחם המבטאים Pax 8 (חץ שחור), עם שימור pTEN בציטופלסמה של תאי סטרומה ברחם (חץ לבן). שיטות מפורטות של IHC פורסמו בעבר14. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: iPAD = inducible Pten, Arid1a מחיקה כפולה; H&E = hematoxylin ו eosin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: דוגמאות לתמונות אולטרסאונד מעכברים עם שינויים מוקדמים בפתולוגיה. (A,B) תמונת אולטרסאונד אנטמורטם של רחם מלא בנוזל רחם שהוא היפראקואי באופן טבעי החיצים הצרים מציינים את לומן היפואקואי, מורחב של הרחם. ראש החץ מציין את האזור המעובה של דופן הרחם. (C) תמונה גסה של הרחם כולו מהעכבר המצולם ב-B. הכוכבית הלבנה נמצאת בערך באותו מיקום כמו זה המצולם ב-A. (D) באותו עכבר, הרחם עובד והוצבע ב-H&E. החלק ההיסטולוגיה מראה עיבוי של דופן הרחם עקב היפרפלזיה רירית הרחם; האזור לדוגמה מצוין בראש חץ. עבור כל התמונות בארה"ב, במונחים של התמצאות, העכבר הוא פני השטח הגבי למעלה, וגולגולת לקאודלית משמאל לימין (מתמר MS550). מוטות קנה מידה = (A,B) 3 מ"מ; (D) 500 מיקרומטר. קיצורים: US = אולטרסאונד; H&E = hematoxylin ו eosin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: מגוון פתולוגיה של הרחם הנראה באולטרסאונד . (A) רחם עם היפרפלזיה והתנפחות נוזלים הגורמים להתרחבות לומינלית לקוטר של ~2.5 מ"מ. (B) רחם שני עם היפרפלזיה המנופחת במידה רבה יותר. (C) רחם שהוא גם מורחב וגם מלא במסת רקמה רכה. מוטות קנה מידה = 3 מ"מ. עבור כל התמונות, החצים הם לצד הגחוני של קרן הרחם, ומבחינת כיוון התמונה, העכבר הוא פני השטח הגבי למעלה, והגולגולת לקאודלית משמאל לימין (מתמר MS550). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: שינויים בהתפתחות הניאופלסטית של הרחם לאורך זמן בעכבר אחד. (A) תמונת אולטרסאונד של עכבר iPAD המראה את הכליה (חץ רחב יותר), השחלה (קאודלית לכליה) והרחם (חץ צר), כאשר שריר הרגל נראה גם הוא (ראש חץ), שנלכדו בשלוש נקודות זמן: לאחר שהעכבר התחיל בדיאטת דוקסיציקלין (שבוע 0), ואז שוב לאחר 5 שבועות ו 6 שבועות. דוקסיציקלין גרם לביטוי Cre עם אובדן מדכא גידול, אשר מקדם סרטן רירית הרחם לאורך זמן. (B) אותן תמונות אולטרסאונד כמו A אבל עם קרן הרחם מודגשת באדום. (C) תמונות גסות של הרחם באתרו (חץ צר) מנקודת הזמן של 6 שבועות; הרקמה מתבוננת מפני השטח הגחונים. (D) אותו רחם כמו ב-C מנותח ex vivo; הרקמה מתבוננת מפני השטח הגחונים. (E) היסטולוגיה של מסת הרחם (כתם H&E), המציין אדנוקרצינומה מדוגמה זו. עבור A ו- B, במונחים של התמצאות, העכבר הוא פני השטח הגבי למעלה, וגולגולת לקאודלית משמאל לימין (מתמר MS550). פסי קנה מידה = (A,B, שתי התמונות הראשונות בכל שורה) 1 מ"מ; (A,B, תמונה שלישית) 2 מ"מ; (E) 500 מיקרומטר. קיצורים: iPAD = inducible Pten, Arid1a מחיקה כפולה; H&E = hematoxylin ו eosin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה בוחן את התועלת של אולטרסאונד להערכת שינויים מורפולוגיים ברחם בהתקדמות אדנוקרצינומה ברחם בעכברים. במחקר זה, על ידי מעקב אחר השראת סרטן רירית הרחם בעכברים לאורך זמן, הפרטים האנטומיים שזוהו על ידי אולטרסאונד נמצאו כאינדיקטורים לפתולוגיה גסה והיסטולוגית. זה פותח את הדלת לשימוש במחקרי אורך עם מספר קטן יותר של עכברים המנוטרים על ידי אולטרסאונד בנקודות זמן מרובות כדי לעקוב אחר התקדמות סרטן הרחם בעכברים. גילוי אורכי זה נעשה באמצעות בדיקה ידנית וללא שימוש בציוד אולטרסאונד של מערכת מסילות. הגשושיות בתדר גבוה (מתמרים) המשמשות זמינות באופן נרחב, מה שהופך גישה זו לניתנת לשחזור במספר מוסדות ברחבי העולם. שלבים קריטיים בפרוטוקול כוללים שימוש בבדיקה הנכונה לרמת הרזולוציה הנדרשת לניסוי והכנת העכבר לדימות לפני האולטרסאונד.
שלבים קריטיים בהכנת העכבר הם הסרת כל השיער מאזורי המחקר והזרקת נוזל לחלל הצפק. פרווה שנותרה על העור יכולה להוביל למלכודת של בועות בג'ל אולטרסאונד, אשר יכול לייצר ממצאים בתמונות; לפיכך, יש להקפיד להסיר את השיער באופן שווה מעל אזור המחקר. קרם Depilatory נבחר כשיטה להסרת שיער כפי שהוא מסיר את הפרווה באופן שווה על פני העור. פגיעה בעור יכולה להתרחש אם הקרם נשאר על העור למשך זמן רב מדי (>3-4 דקות). בעכברים רגישים יותר קרם depilatory, קרם צריך להישאר רק על העור במשך 1-2 דקות כדי להסיר את השיער. לאחר מכן, העכבר צריך להיות ניגב עם סדרה של מגבות נייר רטוב כדי להסיר לחלוטין את הקרם. לאחר הוצאת כל השיער מאזור המחקר, מוזרקים נוזלים איזוטוניים סטריליים וחמים לחלל התוך צפקי כדי להגביר את הניגודיות ולסייע בהגדרת גבולות איברי הבטן. במחקר זה, הזרקת 1-2 מ"ל נוזל הספיקה כדי להבדיל בין השחלה, האובידוקט וקרניים הרחם. הנוזל נספג בהדרגה, ועדיף להזריק מיד לפני ההדמיה. עכברים הופכים היפותרמיים במהירות תחת הרדמה isoflurane. ניתן למנוע זאת על ידי הזרקת מי מלח חמים (מאוחסנים במזרקים על כרית חימום) וגם על ידי מיקום העכבר על כרית חימום וחימום מראש של ג'ל האולטרסאונד במידת האפשר. מפגשי הדמיה עם סונוגרפים מנוסים נמשכים 5-10 דקות לעכבר, ובזמן קצר זה, היפותרמיה משמעותית לא התרחשה. במידת הצורך, עד 2 מ"ל נוספים של מלוחים ניתן להזריק לתוך הבטן עבור הפרדה גדולה יותר של האיברים.
השיטות המתוארות כאן נועדו להיות ניתנות לשחזור בקלות ללא ציוד מיוחד מעבר למכשיר האולטרסאונד והבדיקה. בשיטה המוצגת, הבדיקה מופעלת באופן ידני לכל אורכה ללא סיוע ממערכת מסילות. שיטה ידנית זו מהירה יותר ומספקת גמישות רבה בזוויות ובלחץ המופעלים כדי להדגיש תכונות קטנות. כיוון ידני של הגשושיות מעל הבטן ושימוש במתמרים ברזולוציה נמוכה יותר עלולים להגביל את האיכות של כל תמונה בודדת שנרכשה בהשוואה לתמונות ממתמר הקבוע במערכת המסילות4. מערכת מסילות תהיה שימושית עבור זריקות לתוך הרחם (לתוך עוברים) או זריקות תוך לבביות כאשר יש צורך ביציבות רבה יותר. עם זאת, יש פשרה לגבי זמן מניפולציה מינימלי ונגישות מוגברת למגוון רחב של מוסדות שאין להם מתקני אולטרסאונד מיוחדים. ההצלחה של שיטה פשוטה זו מדגימה כיצד ניתן להשתמש באולטרסאונד למגוון מחקרים. השיטה המוצעת מתאימה היטב ללכידת שינויים אורכיים ברקמה במודלים של סרטן הרחם ללא צורך בציוד ייעודי וניתן ליישם אותה במודלים אחרים של מחלות פרוגרסיביות. מניפולציה ידנית של העכברים במהלך ההדמיה יכולה להגדיל את השונות בעומק הרקמה ובמיקום המדויק, אך עבור מחקרים שאינם מסתמכים על גורמים אלה, איכות התמונה מספיקה כדי לזהות שינויים פתולוגיים.
חשוב לשמור קטעי וידאו במהלך הצילום; מאוחר יותר בתחנת העבודה של המשתמש, ניתן לעצור את הסרטונים בכל פריים שמייצג את האנטומיה שצריך לצלם ולמדוד. ניתן למדוד תמונות של האיברים (קוטר, היקף או אורך) (איור 5, נמדד חתך קרן הרחם), וניתן לחשב את אזור הגידול. קטעי וידאו, יותר מאשר מסגרות בודדות, להקל על זיהוי של איברים בהקשר אנטומי גדול יותר. קטעי וידאו שימושיים גם לקביעת התנועה של המעי הדק והגס, אשר יכול לעזור להבדיל את המעיים מן הרחם. קבלת תמונות באיכות גבוהה תלויה גם בהיכרות עם אנטומיה של עכבר. לצורך הדמיה של הרחם הנע לעומת הדמיה של רקמות נייחות יותר (למשל, גידול קסנוגרפט מושתל, שחלות), לשימוש בשיטה הידנית יש יתרון של סריקה ומעקב אחר קרני הרחם מפרוקסימלי לדיסטלי. במהלך הסריקה, ניתן להשתמש בהתאמה הדרגתית של זוויות היד כדי לעקוב אחר הצופר. בדיקת MS550 שימשה לכל ההדמיה במחקר זה והיא עדיפה לרחם בהשוואה לבדיקה MS700 ברזולוציה גבוהה יותר, שהיא טובה יותר לשחלות. עבודה באמצעות MS700 כדי לצלם את בלוטת התריס של העכבר פורסמה לאחרונה, ומציגה את הרזולוציה הגבוהה האפשרית ברקמותאחרות 15. הדמיית בדיקה ידנית מועילה בשל דרגות שונות של עומק הרקמה של הרחם בין השחלה לשלפוחית השתן. בעבודה זו, המעבר בין ציוני דרך אנטומיים הניתנים לזיהוי בקלות, כגון הכליה והאנטומיה הפרוקסימלית של הגפה האחורית, סייע בלכידת תמונות דומות על פני נקודות הזמן השונות בעת הדמיה של הרחם מהאספקט הגבי בגוף.
שיטת אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה זו לעקוב אחר השינויים האנטומיים ברחם לאורך זמן במהלך הגידול עדיפה על השיטות הנוכחיות הכוללות המתת חסד של בעלי חיים מקבוצות מרובות בנקודות זמן שונות. אולטרסאונד משכלל את המודל ומפחית את מספר העכברים הדרושים לניסוי, ובכך מפחית עלויות וזמן. חשוב לציין כי שיטה זו מאפשרת לעקוב אחר התקדמות המחלה ברמה האישית, מה שעשוי להוביל לתובנות המוסוויות במחקרים התלויים בקבוצות שהוקרבו לפי נקודת זמן ולא לפי שלב המחלה. בשל אופיו הלא פולשני, לאולטרסאונד עכברים יש יישומים פוטנציאליים רבים למחקר בסרטן הרחם או השחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
אנו אסירי תודה על המימון מתוכנית SPORE לסרטן השחלות של NCI P50CA228991, תוכנית הכשרה לפוסט-דוקטורט 5T32OD011089, וקרן ריצ'רד וו. TeLinde, אוניברסיטת ג'ונס הופקינס. הפרויקט מומן בחלקו גם על ידי סובסידיות להוצאות שוטפות למוסדות פרטיים להשכלה גבוהה מהתאגיד לקידום ועזרה הדדית לבתי ספר פרטיים של יפן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Kim, S. W., Kim, Y. Y., Kim, H., Ku, S. Y. Animal models closer to intrauterine adhesive pathology. Annals of Translational Medicine. 8 (18), 1125 (2020).
- Shi, D., Vine, D. F. Animal models of polycystic ovary syndrome: a focused review of rodent models in relationship to clinical phenotypes and cardiometabolic risk. Fertility and Sterility. 98 (1), 185-193 (2012).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 519238 (2012).
- Palsdottir, K., et al. Interobserver agreement of transvaginal ultrasound and magnetic resonance imaging in local staging of cervical cancer. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. 58 (5), 773-779 (2021).
- Gabrielson, K., et al. In vivo imaging with confirmation by histopathology for increased rigor and reproducibility in translational research: A review of examples, options, and resources. ILAR Journal. 59 (1), 80-98 (2018).
- Peterson, R. A., et al. Continuing education course #1: Non-invasive imaging as a problem-solving tool and translational biomarker strategy in toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 39 (1), 267-272 (2011).
- Pfeifer, L. F., Adams, G. P., Pierson, R. A., Singh, J. Ultrasound biomicroscopy: A non-invasive approach for in vivo evaluation of oocytes and small antral follicles in mammals. Reproduction, Fertility and Development. 26 (1), 48-54 (2013).
- Cheung, A. M., et al. Three-dimensional ultrasound biomicroscopy for xenograft growth analysis. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (6), 865-870 (2005).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Wu, G., Wang, L., Yu, L., Wang, H., Xuan, J. W. The use of three-dimensional ultrasound micro-imaging to monitor prostate tumor development in a transgenic prostate cancer mouse model. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 207 (3), 181-189 (2005).
- Rinaldi, S. F., et al. Ultrasound-guided intrauterine injection of lipopolysaccharide as a novel model of preterm birth in the mouse. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1201-1206 (2015).
- Wang, T., et al. Ultrasonography in experimental reproductive investigations on rats. Journal of Visualized Experiments. 130, e56038 (2017).
- Suryo Rahmanto, Y., et al. Inactivation of Arid1a in the endometrium is associated with endometrioid tumorigenesis through transcriptional reprogramming. Nature Communications. 11, 2717 (2020).
- Pani, F., et al. Pre-existing thyroiditis ameliorates papillary thyroid cancer: Insights from a new mouse model. Endocrinology. 162 (10), bqab144 (2021).
