Summary
이 프로토콜은 전체 및 조직학적 변화와 상관관계가 있는 초음파 영상을 사용하여 자궁내막암의 유도성 마우스 모델에서 시간 경과에 따른 형태학적 변화의 진행을 모니터링하는 방법을 설명합니다.
Abstract
자궁암은 이러한 모델에서 취급 및 유전자 조작의 용이성으로 인해 생쥐에서 연구될 수 있습니다. 그러나 이러한 연구는 종종 다른 코호트에서 여러 시점에서 안락사된 동물의 사후 병리를 평가하는 것으로 제한되며, 이는 연구에 필요한 마우스의 수를 증가시킵니다. 종단 연구에서 이미징 마우스는 개별 동물의 질병 진행을 추적하여 필요한 마우스의 수를 줄일 수 있습니다. 초음파 기술의 발전으로 조직의 마이크로미터 수준의 변화를 감지할 수 있게 되었습니다. 초음파는 난소의 난포 성숙과 이종 이식 성장을 연구하는 데 사용되었지만 마우스 자궁의 형태학적 변화에는 적용되지 않았습니다. 이 프로토콜은 유도된 자궁내막암 마우스 모델에서 병리학과 생체 내 이미징 비교의 병치를 조사합니다. 초음파로 관찰된 특징은 육안적 병리학 및 조직학에서 볼 수 있는 변화의 정도와 일치했습니다. 초음파는 관찰 된 병리를 매우 예측하는 것으로 밝혀졌으며, 생쥐의 암과 같은 자궁 질환의 종단 연구에 초음파 검사의 통합을 지원합니다.
Introduction
마우스는 생식 장애에 대한 가장 중요한 동물 모델 중 하나이다 1,2,3. 난소암과 자궁암의 여러 유전자 변형 또는 유도 설치류 모델이 있습니다. 이러한 연구는 일반적으로 형태학적 및 병리학적 변화의 종단적 경향을 포착하기 위해 서로 다른 시점에서 안락사된 여러 코호트에 의존합니다. 이것은 개별 마우스에서 암 발병에 대한 지속적인 데이터를 획득하는 능력을 방지합니다. 추가적으로, 개별 마우스의 질병 진행 상태를 알지 못하면, 개입 연구는 특정 동물에서 진행을 검출하기 위한 개별 역치보다는 미리 결정된 시점과 이전 코호트의 평균 소견을 기반으로 한다 4,5. 따라서 신약 또는 화합물 테스트를 위한 전임상 모델을 용이하게 하고 병리학에 대한 이해를 가속화하는 동시에 엄격함과 재현성을 높이기 위해 살아있는 동물에서 종단적 평가를 허용하는 이미징 접근법이 필요합니다6.
초음파 영상(US)은 다른 영상 방법에 비해 상대적으로 쉽고 저렴하며 수행하기 쉽고 놀라운 해상도를 가질 수 있기 때문에 마우스 자궁암 진행의 종단 모니터링에 매력적인 방법입니다 6,7. 이 비침습적 방식은 깨어 있는 생쥐 또는 5-10분 검사를 사용하여 짧은 진정 상태에서 생쥐에서 미크론 규모의 특징을 포착할 수 있습니다. 초음파 현미경은 마우스 난포 발달 8 및 이식 또는 유도된 신생물의 성장을 측정하는 방법으로 검증되었다 9,10,11. 고주파 US는 또한 경피적 자궁내 주사12 및 발정 주기13 동안 쥐의 자궁 변화 관찰에 사용되었다. 고주파 US는 표준화된 위치와 압력으로 고해상도 이미지를 캡처하기 위해 변환기/프로브를 고정하는 레일 시스템을 사용하여 특수 고정 플랫폼에 고정된 마우스와 함께 사용할 수 있습니다. 그러나 이 장비는 모든 기관에서 사용할 수 있는 것은 아닙니다. 휴대용 변환기 스캐닝 방법은 덜 전용 장비로 채택할 수 있으며 마우스의 임상 진단 및 연구 응용 프로그램 모두에 사용할 수 있습니다.
휴대용 고주파 프로브를 사용한 미국 이미징을 사용하여 여러 주에 걸쳐 자궁암 발병을 모니터링할 수 있는지 여부에 대한 의문이 남아 있습니다. 내장과 유사하게 설치류 자궁은 복부 내에서 매우 움직이고 여러 조직 깊이를 통해 인접해 있는 얇고 가느다란 구조로 신장과 같이 상대적으로 움직이지 않는 기관보다 이미징이 더 어렵습니다. 이 연구는 초음파로 관찰된 조직과 조직병리학 사이의 상관관계를 확립하고, 마우스 자궁을 찾기 위한 랜드마크를 정의하고, 자궁내막암의 종단적 평가의 타당성을 결정하고자 했습니다. 이 연구는 미국에 의해 이미지화된 자궁의 모양과 조직 병리학 사이의 질적 일치를 보여주는 데이터와 몇 주에 걸친 마우스의 연속 이미징을 보여줍니다. 이러한 결과는 휴대용 US가 마우스의 자궁내막암 발병을 모니터링하는 데 사용될 수 있음을 나타내며, 따라서 전용 장비 없이 자궁암을 연구하기 위해 개별 마우스 종단 데이터를 수집할 수 있는 기회를 제공합니다.
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Protocol
마우스를 포함하는 모든 절차 및 실험은 존스 홉킨스 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다. 모든 절차에 대해 장갑과 일회용 격리 가운을 포함하여 적절한 PPE를 착용했습니다. 날카로운 물건을 취급할 때 예방 조치를 취했으며, 사용 직후 빨간색 상자 날카로운 물건 용기에 적절하게 폐기했습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 독시사이클린을 이용한 iPAD(inducible Pten, Arid1a double deletion) 마우스에서 자궁내막암 유도
- 앞서 설명한 대로 혼합 유전적 배경(129S, BALB/C, C57BL/6)에서 10마리의 Pax8-Cre-Arid1a-Pten 이중 결실(iPAD) 형질전환 마우스(그림 1)를 유지합니다14.
- 독시사이클린 치료 전에 각 마우스의 난소, 난관 및 자궁의 기본 초음파(2D) 이미지를 수집합니다.
- 유전자 결실을 유도하기 위해 7-8주령부터 최소 2주 동안 암컷 iPAD 마우스에 독점적으로 독점적으로 감소시킨 독시사이클린 하이클레이트 사료 7-8주령부터 시작하여 최소 2주 동안 암컷 iPAD 마우스에 제공합니다.
2. 장비 설정
- 가열 패드를 켜고 깨끗한 흡수 패드로 덮습니다(목표 온도: 38°C).
- 이소플루란 기화기와 O2 탱크가 적절하게 채워졌는지 확인하십시오. 내용물이 부족하면 다시 채우고 교체하십시오.
- 유도 챔버, 노즈 콘 및 청소 시스템을 기화기에 연결합니다.
- 초음파 기계를 설치합니다.
- 자궁 또는 난소 이미징을 위해 각각 32-56MHz 또는 최대 70MHz 범위의 변환기(프로브)를 선택하십시오.
- 프로브를 부착하고 기기의 전원을 켭니다.
- 시스템 부팅 후 제어판을 사용하여 사용자 자격 증명으로 로그인하고 홈 화면에 액세스합니다.
- 홈 화면에서 Applications(응용 프로그램 ) 탭으로 이동하여 Mouse (small) abdomen mode(마우스(작은) 복부 모드)를 선택합니다.
- 스캔을 클릭하여 홈 화면으로 돌아가 라이브 이미지가 표시될 때까지 기다립니다.
- 왼쪽 도구 모음의 옵션에서 B 모드를 선택합니다.
- 추가 컨트롤을 클릭하여 이미지 게인 및 심도와 같은 이미지 미세 조정을 위한 추가 도구를 보거나 초당 프레임 수와 같은 클립 획득 설정을 조정합니다.
- 이미지 설정이 선택되면 스캔을 클릭하여 홈 화면으로 돌아갑니다.
- O2 탱크를 켜고 유량을 유도실로 향하게 하고 유량을 1L/min으로 설정합니다.
3. 제모를 포함한 초음파 스크리닝을 위한 마우스의 준비
- 유도 챔버에 마우스를 놓습니다. 마취 유도를 위해 이소플루란 기화기를 2%-3% vol/vol로 설정합니다.
- 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족과 약 1-2회 호흡/초의 호흡수로 적절한 마취 깊이를 결정합니다.
- 멸균 안과 윤활제를 각 눈에 바릅니다. 적절한 크기의 가위로 마지막 갈비뼈와 골반 사이의 등쪽과 복부에서 털을 제거합니다.
- 이미지를 촬영할 복부 및 등쪽 부위에 제모 크림을 얇게 바르십시오(필요한 경우).
- 제모 크림이 모발을 제거하는 동안 적절한 마취 깊이를 유지하기 위해 마우스를 약 3-5분 동안 유도 챔버에 다시 넣습니다. ≤4분 후 깨끗하고 촉촉한 종이 타월로 크림을 부드럽게 닦아냅니다.
알림: 제모 크림에 장시간 노출되면 자극적이며 피부 병변을 유발할 수 있습니다.
4. 장기 간의 대비를 높이기 위해 체액을 복강 주사합니다.
- 멸균 등장성 유체 용액(예: 멸균 0.9% NaCl 또는 젖산 링거 용액)으로 채워진 3-10mL 주사기를 가열 패드와 흡수 패드 사이에 몇 분 동안 배치하여 35-40°C로 따뜻하게 합니다. 기계에 워머가 없는 경우 가열 패드에 초음파 젤 한 병을 놓습니다.
- 20-25g 마우스의 경우 1-2mL의 용액을 복강에 주입합니다.
- 한 손으로 스크러프를 잡고 복부를 노출시킵니다.
- 마우스를 ~20° 각도로 잡고 코가 바닥을 향하도록 하여 중력으로 인해 장기를 두개골로 향하게 합니다.
- 작은 게이지 바늘 (25G, 길이 5/8, 투베르쿨린 주사기)을 사용하여 복부의 꼬리 오른쪽 사분면의 피부와 복벽을 뚫습니다.
- 체액을 주입하기 전에 혈관 구조나 위장관에 주입되는 것을 방지하려면 최소한의 압력으로 뒤로 당깁니다. 혈액이나 다른 물질이 주사기에 들어가면 바늘을 제거하십시오. 새 바늘과 주사기를 사용하고 약간 다른 위치에서 다시 시도하십시오.
- 주사 중에 마우스가 깨어나면 2%-3% vol/vol 이소플루란으로 마취를 위해 작은 유도 챔버에 다시 넣습니다.
5. 등쪽 접근에서 초음파 영상
- 가열 패드 위의 흡수 패드에 복부 누운 상태로 마우스를 놓습니다(그림 2A-C).
- 설치류 노즈 콘을 마우스의 코와 위에 단단히 놓습니다. 노즈 콘을 통해 전달되는 이소플루란으로 마취 깊이를 100% O 2에서 1%-2% vol/vol로 유지합니다. 필요에 따라 멸균 안과용 윤활제를 각 눈에 바릅니다.
- 마우스에서 규칙적인 호흡수(1-2/s)와 발가락 꼬임 반응이 없는지 모니터링하여 마취를 조정해야 하는지 여부를 나타냅니다.
- 소량(~0.5-1mL)의 예열 초음파 젤을 마지막 갈비뼈와 골반 사이의 마취된 마우스의 양쪽에 있는 척추에 축(측면)으로 놓습니다.
- 초음파 프로브에 소량의 젤을 넣으십시오.
- 프로브의 전면이 두개골 쪽에 오도록 프로브를 척추와 평행하게 놓습니다. 적절한 프로브 방향을 나타내기 위해 프로브 헤드에 표시기 표시가 있습니다. 수집되는 각각의 새로운 이미지 세트에 대해 날짜, 시간, 동물 ID, 프로브 방향 및 동물 측면(오른쪽, 왼쪽, 등쪽, 복부)을 기록합니다.
- 복부 누운 상태(등쪽 피부가 프로브에 닿음)에 마우스를 놓고 신장 랜드마크가 있는지 해당 부위를 천천히 스캔합니다(그림 2B 및 그림 3). 신장을 바라보고 프로브 꼬리를 당겨 난소를 찾습니다.-약간 고에코 타원형에서 둥근 구조(그림 4A, B) 신장에 의해 두개골-복부와 등쪽 복벽에 의해 등쪽-외측으로 경계를 이루는 매우 고에코 난소 지방 패드 내에서.
참고: 꼬리와 난소의 측면 압력은 난소를 복벽에 더 가깝게 유도하고 장의 고리에서 멀어지게 할 수 있습니다. 난소는 해부학적으로 등쪽 복벽에 맞닿아 있으며, 복부와 외측은 축근, 꼬리는 신장에 위치합니다. - 컨트롤 화면 하단의 슬라이더를 사용하여 신호 게 인을 조정하여 이미지 대비를 개선합니다.
- 신장의 영상을 개선하려면 반대쪽 복부에 손가락으로 압력을 가하십시오. 압력과 각도를 척추와 직접 평행한 것에서 복부 ~20°까지 변경합니다.
- 관심 기관이 view, 클립 저장 또는 녹화 시작을 클릭한 다음 완료되면 녹화 중지 를 클릭하여 비디오를 수집하여 미리 설정된 프레임 수로 이미지를 유지합니다.
- 라이브 이미지 또는 Save Frame 버튼을 사용하여 녹화에서 단일 프레임을 저장합니다.
- 자궁을 이미지화하려면 난소가 시야의 가장 두개골 측면에 올 때까지 프로브를 꼬리쪽으로 당깁니다. 자궁이 보일 때까지 프로브 압력과 각도를 변경하십시오.
- 관심 있는 각 기관에 대해 비디오 및 프레임 수집을 반복합니다.
- 외측 다리 근육도 볼 수 있는 등쪽 복벽을 따라 세로로 달리는 자궁을 찾습니다(그림 4B).
참고: 자궁 크기와 내강 직경은 발정 단계와 질병 상태에 따라 달라질 수 있습니다. - 연동 운동에 대해 조직을 모니터링하여 장 루프와 자궁 고정 뿔을 구별합니다.
6. 복부 접근에서 이미지 수집
- 마우스를 등쪽 누운 자세로 놓고 눈 윤활이 충분하고 주둥이가 코 콘에 단단히 고정되어 있는지 확인합니다(그림 2A).
- 소량(~0.5-1mL)의 예열 초음파 젤을 복부 복부에 바르고 치골의 정중선 두개골에 프로브를 적용하여 방광을 저에코 랜드마크로 찾습니다(그림 5).
참고: 방광이 너무 커서 자궁 영상이 가려지면 하복부에 부드러운 압력을 가하여 소변을 표현할 수 있습니다. - 탐침을 방광 옆으로 당겨 자궁 뿔을 찾습니다. 마우스의 한쪽 또는 양쪽에서 가벼운 디지털 압력을 가하여 뿔을 시야로 가져옵니다. 프로브를 마우스에 수직으로 잡고 복부의 양쪽을 스캔하여 양쪽 뿔의 가로 모습(단면)을 캡처합니다. 프로브를 돌려 시상 뷰를 캡처합니다.
- 초음파 검사 후 종이 타월로 마우스의 젤을 깨끗이 닦고 케이지로 돌려 보내 회복시킵니다. 마우스는 2-5 분 안에 완전히 깨어납니다. 완전히 깨어나고 보행이 가능하면 마우스를 동물 방으로 되돌립니다.
알림: 저온의 가열 패드를 케이지 아래에 놓아 회수를 위해 케이지를 따뜻하게 할 수 있습니다. - 실험적 또는 인도적 종점에서 마우스를 안락사시킵니다. 이상적으로는 스트레스를 줄이기 위해 홈 케이지에서 마우스를 안락사시키는 것이 좋습니다. 또는 마우스를 깨끗한 챔버에 넣습니다. 분당 챔버 부피의 10%-30%의 변위 속도로 가압된 CO2 를 전달합니다. 약 5분 동안 눈에 보이는 호흡이 없으면 경추 탈구로 인한 사망을 확인합니다. 종양 채취를 위해 복부 부검을 진행하십시오.
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Representative Results
Pax8-Cre-Arid1a-Pten 이중 결실(iPAD) 형질전환 마우스는 이전에 기술된 바와 같이 혼합 유전적 배경(129S, BALB/C, C57BL/6)에서 유지되었다14. 마우스는 모두 Cre 재조합 효소를 유도하기 위해 2 주 동안 독시사이클린 사료를 공급 받았다. 우리 그룹의 이전 연구에서 독시사이클린은 위관 영양14에 의해 투여되었습니다. 그러나 이 현재 연구에서 독시사이클린 사료 유도 방법은 효율적으로 작동하여 마우스의 위관영양 스트레스를 감소시켰습니다. 독시사이클린 투여 방법이 자궁과 같은 Pax8 발현 세포에서 종양 억제 인자 (Arid1a 및 Pten)에 대한 DNA를 절제하는 데 필요한 Cre 재조합 효소 발현을 유도하는 데 적합한지 확인하는 것이 중요합니다. ARID1a 및 pTEN14에 대한 항체를 사용한 면역조직화학을 사용하여 그림 6에서 볼 수 있듯이 인접한 간질 조직과 비교하여 자궁 상피 세포에서 적절한 종양 억제 단백질 손실이 달성되었는지 확인했습니다. 마우스 모델 및 종양 억제인자 발현 조절의 개략도가 도 1에 제시되어 있다.
독시사이클린 투여 2주 후, 자궁은 대조군 또는 독시사이클린 투여 전에 영상화된 동일한 마우스에 비해 크기가 크게 변하지 않았습니다. 그러나 독시사이클린 후 다음 2-6 주 동안 초음파 검사는 생쥐가 증식으로 시작하여 선암으로 진행되는 다양한 자궁 병리를 일으킨 것으로 나타났습니다. 그림 7A, B는 독시사이클린 치료 3주 후 초기 병리학적 변화가 나타난 마우스 자궁의 미국 이미지를 나타냅니다. 도 7C,D는 3주째 영상화 직후 마우스를 안락사시킨 후 도 7A,B에 영상화된 동일한 자궁의 육안적 병리 및 조직병리학을 나타낸다. 더 작은(그러나 확장된) 얇은 벽의 자궁과 뚜렷한 내강(중심 고에코 자궁액)이 보존된 초기 자궁내막 증식이 관찰될 수 있습니다. 나중에 안락사된 쥐에서 자궁은 훨씬 더 크고 내강이 더 작으며 벽이 두꺼워졌습니다(그림 8 및 그림 9). 확장된 내강 및 과형성 자궁내막의 미묘한 변화의 예는 그림 8 및 그림 9에서 자궁의 조밀한 조직 및 결절성 암 성장과 비교됩니다. 초음파 및 총 이미지는 표현된 모든 마우스에 대해 서로 매우 일치했습니다. 그림 9는 시간 경과 연구에서 동일한 마우스의 여러 자궁 이미지를 제시하고 선암이 발생함에 따라 6주 동안 관찰된 형태학적 변화를 보여줍니다. 그림 5는 저에코 방광에 인접한 자궁 뿔의 단면을 가진 복부 접근 방식을 보여줍니다.
복부의 조영제를 향상시키기 위해 영상 촬영 직전에 식염수를 복강에 주입하면 자궁과 난소를 포함한 복부 장기의 시각화가 향상되었습니다. 그림 3 은 식염수 1mL를 주입하기 전과 후의 동일한 마우스의 초음파 비교를 보여줍니다. 식염수를 사용하면 신장, 지방 패드, 난소, 자궁 뿔, 내장 및 비장이 서로 더 쉽게 개별화될 수 있도록 기관 사이에 저에코 공간(검은색)이 증가했습니다. 여기에 제시된 다른 모든 그림에서는 이미지 선명도를 향상시키기 위해 이미징 전에 식염수 주입을 수행했습니다.
종합하면, 이 프로토콜은 이 유도성 마우스 모델이 6주 동안 선암을 발생시키고 초음파로 모니터링하여 기준선을 설정하고 암이 진행됨에 따라 자궁의 형태학적 변화를 관찰할 수 있음을 보여줍니다. 여기에서 비침습적 초음파를 사용하면 실제 자궁 병리학적 변화를 예측하는 이미지로 마우스의 자궁 뿔을 여러 주에 걸쳐 연속적으로 평가할 수 있음이 입증되었습니다.
그림 1: Pax8-Cre 유도성 이중 KO 형질전환 마우스의 생성을 위한 전략. (A) Pax8 발현 자궁 상피 세포에서 역 테트라사이클린 제어 transactivator(rtTA)의 구성적 생산은 테트라사이클린 반응 요소(TRE)에 결합하여 테트라사이클린 또는 그 유사체 독시사이클린의 존재 하에서 Cre 재조합효소의 유도성 활성화를 초래합니다. 엑손 8(Arid1a) 및 엑손 5(Pten)의 상류 및 하류에 위치한 Flox 부위는 Cre 재조합효소의 표적이 됩니다. Arid1a에서 엑손 8의 Cre-표적 결실은 프레임시프트 돌연변이와 조기 정지 코돈(p.Gly809Hisfs*6)을 초래합니다. Pten에서 엑손 5의 Cre-targeted 결실은 프레임시프트 돌연변이를 초래합니다(p.Val85Glyfs*14). (B) Pax8-rtTA 마우스는 Pax8 프로모터의 제어 하에 역 테트라사이클린 제어 transactivator(rtTA)를 발현합니다. 이 마우스는 테트라사이클린 의존적 방식으로 Cre 재조합효소를 발현하는 TetO-Cre 마우스와 교배됩니다. 이 교배의 자손은 Pax8 발현 자궁 상피 세포(Pax8-Cre transactivator)에 특이적인 테트라사이클린(또는 독시사이클린) 활성화 Cre 재조합효소를 발현합니다. (C) 129S1 배경의 Arid1a flox/flox 마우스를 BALB/C 배경의 Pten flox/flox(균주 C;129S4-Ptentm1Hwu/J)와 교배하여 Arid1a flox/flox/Pten flox/flox transresponder 마우스를 생성했습니다. (D) Pax8-Cre transactivator 마우스는 Arid1a flox/flox/Pten flox/flox Transresponder 마우스와 교차됩니다. 이 교배로부터의 자손은 자궁 상피 세포에 특이적인 독시사이클린 유도성 Arid1a 및 Pten 결실(iPAD)을 갖는 형질전환 쥐 모델을 생성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 이미징 절차 . (A) 클리퍼와 제모 크림으로 복부와 등털을 제거한 마취된 마우스. 마우스는 노즈 콘을 통해 흡입제 이소플루란 마취를 유지하고 흡수 패드로 덮인 열 패드 위에 놓습니다. (B) 소량의 예열 된 초음파 젤을 마우스와 프로브의 관심 영역 위에 놓습니다. 여기에서 마우스는 복부 누운 상태에 있으며 프로브는 난소에 직접 두개골 모양의 해부학적 랜드마크인 신장을 찾기 위해 올바르게 배치됩니다. (C) 등쪽 누운 상태에서 자궁 뿔의 대략적인 위치를 찾기 위해 먼저 방광과 같은 랜드마크를 찾기 위해 프로브를 수동으로 조작할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 식염수 주입에 의한 가시성 및 장기 정의의 개선 . (A) 1.5mL의 따뜻하고 멸균된 식염수를 IP 주사하기 전의 신장 및 위장관 루프(왼쪽 아래)의 이미지. 이미지의 왼쪽은 신장의 두개골입니다. (B) 식염수 주입 후 신장의 이미지, 기관 사이의 증가(저에코 공간, 검은색)를 보여줍니다. 두 이미지 모두 방향 측면에서 마우스는 등쪽 표면이 위로 향하고 두개골에서 꼬리는 왼쪽에서 오른쪽입니다. (씨, 디) 강조 표시된 빨간색 부분은 A 와 B에 표시된 2D 이미지에서 신장 랜드마크를 보여줍니다. 이미지는 MS550 변환기를 사용하여 촬영되었습니다. 스케일 바 = 각 이미지에서 2mm. 약어: GI TRACT = 위장관; IP = 복강 내. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 랜드마크가 있는 생식 기관 . (A) 난소(화살표)는 신장의 바로 꼬리에서 꼬리 극에 위치합니다. (B) 자궁 뿔(좁은 화살)은 깊고 근위 뒷다리(화살촉)의 등쪽 근육까지 두개골에서 시작되며 난소도 보입니다(큰 화살). 스케일 바 = 2mm. 모든 이미지에서 방향 측면에서 마우스는 등쪽 표면이 위로 향하고 두개골에서 꼬리는 왼쪽에서 오른쪽입니다. 이미지는 MS550 변환기를 사용하여 촬영되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 등쪽 누운 자세에서 촬영한 자궁 뿔과 방광. 암 유도 전 두 마리의 생쥐의 초음파 이미지. (A) 방광 내강은 고에코 점막이 있는 저에코성 난형 구조로 보입니다. 두 자궁 뿔이 함께 보이며 각각의 경계가 연한 파란색으로 표시됩니다. (B) 방광이 훨씬 더 꽉 찬 다른 마우스에서 동일한 보기. 두 이미지 모두 방향 측면에서 마우스는 복부 표면이 위로 향하고 왼쪽 이미지는 마우스 왼쪽입니다. 각 자궁 뿔의 경계는 연한 파란색으로 그려지며 영역은 인접한 텍스트 상자(MS550 변환기)에 표시됩니다. 스케일 바 = 3mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: iPAD 마우스에서 유도 후 6주째 자궁 절편의 H&E 및 면역조직화학의 예. (a) iPAD 마우스 자궁 조직의 대표적인 H&E. (B) 대표적인 ARID1a 면역조직화학. 염색은 Pax8 발현 자궁 상피 세포의 핵에 특이적인 Arid1a의 손실(검은색 화살표)을 보여주며, 자궁 기질 세포의 핵(흰색 화살표)에 Arid1a가 남아 있음을 보여줍니다. (C) 대표적인 pTEN 면역조직화학. 염색은 자궁 간질 세포의 세포질에서 pTEN의 보유와 함께 Pax 8 발현 자궁 상피 세포의 세포질에서 pTEN의 손실을 보여줍니다 (흰색 화살표). 상세한 IHC 방법은 이전에 발표되었다14. 스케일 바 = 100 μm. 약어: iPAD = 유도성 Pten, Arid1a 이중 결실; H & E = 헤마톡실린과 에오신. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 병리학의 초기 변화가 있는 생쥐의 초음파 이미지의 예. (A,B) 자연적으로 고반향을 일으키는 자궁액으로 채워진 자궁의 부검 전 초음파 영상 좁은 화살표는 자궁의 저반향, 확장된 내강을 나타냅니다. 화살촉은 자궁벽의 두꺼운 영역을 나타냅니다. (C) B에서 이미지화된 마우스의 전체 자궁의 전체 이미지. 흰색 별표는 A에서 이미지화 된 것과 거의 같은 위치에 있습니다. (D) 이 동일한 마우스에서 자궁을 처리하고 H & E로 염색했습니다. 조직학 섹션은 자궁 내막 증식으로 인한 자궁벽의 두꺼움을 보여줍니다. 예제 영역은 화살촉으로 표시됩니다. 모든 미국 이미지에서 방향 측면에서 마우스는 등쪽 표면이 위로 향하고 두개골에서 꼬리는 왼쪽에서 오른쪽입니다(MS550 변환기). 스케일 바 = (A,B) 3mm; (D) 500 μm. 약어: US = 초음파; H & E = 헤마톡실린과 에오신. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 초음파로 볼 수 있는 자궁 병리의 다양성 . (A) ~2.5mm의 직경으로 내강 팽창을 일으키는 증식 및 체액 팽창이 있는 자궁. (B) 더 크게 팽창된 증식이 있는 두 번째 자궁. (C) 확장되고 연조직 덩어리로 채워진 자궁. 스케일 바 = 3mm. 모든 이미지에서 화살표는 자궁 뿔의 복부 쪽에 있고 이미지 방향 측면에서 마우스는 등쪽 표면이 위로 향하고 두개골에서 꼬리가 왼쪽에서 오른쪽입니다(MS550 변환기). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 한 마우스에서 시간 경과에 따른 자궁의 신생물 발달 변화. (A) 신장(넓은 화살표), 난소(꼬리에서 신장까지) 및 자궁(좁은 화살표)을 보여주는 iPAD 마우스의 초음파 이미지, 다리 근육도 볼 수 있음(화살촉), 세 시점에서 캡처: 마우스가 독시사이클린 식이를 시작한 후(0주), 그리고 다시 5 주와 6 주 후에. 독시사이클린은 종양 억제 인자 손실과 함께 Cre 발현을 유도하여 시간이 지남에 따라 자궁내막암을 촉진합니다. (B) A와 동일한 초음파 이미지이지만 자궁 뿔이 빨간색으로 강조 표시되어 있습니다. (C) 6주 시점에서 제자리 자궁의 육안(좁은 화살표); 조직은 복부 표면에서 볼 수 있습니다. (D) 생체 외에서 해부된 C에서와 동일한 자궁; 조직은 복부 표면에서 볼 수 있습니다. (E) 자궁 덩어리의 조직학(H&E 염색), 이 예에서 선암을 나타냅니다. A와 B의 경우 방향 측면에서 마우스는 등쪽 표면이 위로 향하고 두개골에서 꼬리가 왼쪽에서 오른쪽입니다(MS550 변환기). 스케일 바 = (A, B, 각 행의 처음 두 이미지) 1mm; (A,B, 세 번째 이미지) 2mm; (E) 500 μm. 약어: iPAD = 유도성 Pten, Arid1a 이중 결실; H & E = 헤마톡실린과 에오신. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 생쥐의 자궁 내 선암 진행에서 자궁 형태학적 변화를 평가하기 위한 초음파의 유용성을 조사합니다. 본 연구에서는 생쥐에서 자궁내막암의 유도를 종단으로 추적하여 초음파로 검출된 해부학적 세부 사항이 육안적 및 조직학적 병리의 지표임을 밝혀냈다. 이것은 생쥐에서 자궁암의 진행을 추적하기 위해 여러 시점에서 초음파로 모니터링되는 더 적은 수의 생쥐를 대상으로 종단 연구를 사용할 수 있는 문을 열어줍니다. 이 세로 검출은 레일 시스템 초음파 장비를 사용하지 않고 휴대용 프로브를 사용하여 수행되었습니다. 사용되는 고주파 프로브(변환기)는 널리 사용 가능하므로 전 세계 여러 기관에서 이 접근 방식을 재현할 수 있습니다. 프로토콜의 중요한 단계에는 실험에 필요한 분해능 수준에 맞는 올바른 프로브를 사용하고 초음파 전에 이미징을 위해 마우스를 준비하는 것이 포함됩니다.
마우스를 준비하는 중요한 단계는 연구 영역에서 모든 모발을 제거하고 복강에 체액을 주입하는 것입니다. 피부에 남아있는 모피는 초음파 젤에 기포를 가두어 이미지에 인공물을 생성 할 수 있습니다. 따라서 연구 부위에서 머리카락을 고르게 제거하도록 주의해야 합니다. 제모 크림은 피부 전체에 고르게 털을 제거하기 때문에 제모 방법으로 선택되었습니다. 크림이 과도한 시간 (>3-4 분) 동안 피부에 남아 있으면 피부 손상이 발생할 수 있습니다. 탈모 크림에 더 민감한 생쥐의 경우 크림을 피부에 1-2 분 동안 그대로 두어 머리카락을 제거해야합니다. 다음으로, 마우스는 일련의 젖은 종이 타월로 닦아 크림을 완전히 제거해야합니다. 연구 영역에서 모든 모발을 제거한 후 멸균되고 따뜻한 등장액을 복강내로 주입하여 대비를 높이고 복부 장기의 경계를 정의하는 데 도움을 줍니다. 이 연구에서는 1-2mL의 체액을 주입하면 난소, 난관 및 자궁 뿔을 구별하기에 충분했습니다. 유체는 서서히 흡수되며 이미징 직전에 주입하는 것이 가장 좋습니다. 마우스는 isoflurane 마취 하에서 빠르게 저체온증이됩니다. 이것은 따뜻한 식염수 (가열 패드의 주사기에 보관)를 주입하고 마우스를 가열 패드에 놓고 가능하면 초음파 젤을 예열함으로써 예방할 수 있습니다. 숙련된 초음파 기사와의 영상 세션은 마우스당 5-10분으로 실행되며 이 짧은 시간 동안 심각한 저체온증이 발생하지 않았습니다. 필요한 경우 장기를 더 잘 분리하기 위해 최대 2mL의 식염수를 복부에 추가로 주입할 수 있습니다.
여기에 설명된 방법은 초음파 기계 및 프로브 이외의 특수 장비 없이 쉽게 재현할 수 있도록 고안되었습니다. 제시된 방법에서, 프로브는 레일 시스템의 도움없이 수동으로 조작됩니다. 이 수동 방법은 더 빠르며 작은 형상을 강조하기 위해 적용되는 각도와 압력에 뛰어난 유연성을 제공합니다. 프로브를 복부 위로 수동으로 향하게 하고 저해상도 트랜스듀서를 사용하면 레일 시스템에 고정된 트랜스듀서의 이미지와 비교하여 획득한 개별 이미지의 품질이 제한될 수 있습니다4. 레일 시스템은 자궁 주사 (태아) 또는 더 많은 안정성이 필요할 때 심장 내 주사에 유용합니다. 그러나 특수 초음파 시설이 부족한 광범위한 기관에 대한 최소한의 조작 시간과 접근성 향상에 대한 절충안이 있습니다. 이 단순화 된 방법의 성공은 초음파가 다양한 연구에 어떻게 활용 될 수 있는지를 보여줍니다. 제안된 방법은 전용 장비 없이 자궁암 모델에서 세로 조직 변화를 포착하는 데 매우 적합하며 다른 진행성 질병 모델에도 적용할 수 있습니다. 이미징 중 마우스를 수동으로 조작하면 정확한 조직 깊이와 위치의 가변성이 증가할 수 있지만 이러한 요인에 의존하지 않는 연구의 경우 이미지 품질은 병리학적 변화를 감지하기에 충분합니다.
이미징하는 동안 비디오를 저장하는 것이 중요합니다. 나중에 사용자의 워크스테이션에서 캡처 및 측정해야 하는 해부학적 구조를 나타내는 모든 프레임에서 비디오를 중지할 수 있습니다. 장기의 이미지(직경, 둘레 또는 길이)를 측정할 수 있으며(그림 5, 자궁 뿔 단면 측정) 종양 면적을 계산할 수 있습니다. 비디오는 단일 프레임보다 더 큰 해부학적 맥락에서 장기를 식별하는 데 도움이 됩니다. 비디오는 또한 소장과 대장의 움직임을 결정하는 데 유용하며, 이는 장과 자궁을 구별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 고품질 이미지를 얻는 것은 또한 마우스 해부학에 대한 친숙도에 달려 있습니다. 움직일 수 있는 자궁을 영상화하는 것과 더 고정된 조직(예: 이식된 이종이식 종양, 난소)을 영상화하는 경우 수동 방법을 사용하면 자궁 뿔을 근위부에서 원위부까지 스캔하고 추적할 수 있는 이점이 있습니다. 스캔하는 동안 손 각도를 점진적으로 조정하여 경적을 따라갈 수 있습니다. MS550 프로브는 본 연구의 모든 영상에 사용되었으며 난소에 더 좋은 고해상도 MS700 프로브에 비해 자궁에 더 좋습니다. MS700을 사용하여 마우스 갑상선을 이미지화하는 작업이 최근에 발표되었으며, 다른 조직에서도 가능한 고해상도를 보여줍니다15. 휴대용 프로브 이미징은 난소와 방광 사이의 자궁 조직 깊이의 정도가 다양하기 때문에 유용합니다. 이 작업에서 신장과 근위 뒷다리 해부학과 같이 쉽게 알아볼 수 있는 해부학적 랜드마크 사이를 이동하는 것은 신체의 등쪽에서 자궁을 이미징할 때 다양한 시점에서 비교 가능한 이미지를 캡처하는 데 도움이 되었습니다.
종양 형성 동안 시간 경과에 따른 자궁의 해부학적 변화를 추적하는 이 고해상도 초음파 방법은 서로 다른 시점에서 여러 코호트의 동물을 안락사시키는 현재 방법보다 우수합니다. 초음파는 모델을 개선하고 실험에 필요한 마우스 수를 줄여 비용과 시간을 줄입니다. 중요하게도, 이 방법을 사용하면 개별 수준에서 질병 진행을 추적할 수 있으며, 이는 질병 단계가 아닌 시점에 의해 희생된 코호트에 의존하는 연구에서 가려진 통찰력으로 이어질 수 있습니다. 비침습적 특성으로 인해 마우스 초음파는 자궁암이나 난소암 연구를 위한 많은 잠재적인 응용 분야를 가지고 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
NCI 난소암 포자 프로그램 P50CA228991, 박사후 과정 교육 프로그램 5T32OD011089 및 존스 홉킨스 대학의 Richard W. TeLinde Endowment의 자금 지원에 감사드립니다. 이 프로젝트는 또한 일본 사립 학교 진흥 및 상호 원조 공사 (Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan)의 사립 고등 교육 기관에 대한 경상 지출에 대한 보조금으로 부분적으로 자금을 조달 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
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