Summary
여기에서는 레이저로 인한 상처 시 장의 이미지를 얻는 방법을 제시합니다. 마우스 장을 다광자 레이저에 노출시킴으로써, 단일 또는 다중 crypt(들)의 손실이 국소적으로 유도된다. 수개월에 걸쳐 손상된 부위를 반복적으로 이미징하여 장 회복의 실시간 역학을 캡처합니다.
Abstract
생체 내에서 장 회복을 조사하는 것은 절묘한 기술적 과제입니다. 종단 이미징 프로토콜의 부족으로 인해 장 재생을 조율하는 세포 및 조직 규모 역학에 대한 더 깊은 통찰력을 얻을 수 없었습니다. 여기에서 우리는 단일 음와 규모에서 국소적으로 조직 손상을 유도하고 살아있는 마우스에서 장 상피의 재생 반응을 따르는 생체 내 현미경 방법을 설명합니다. 단일 선와(crypt) 또는 더 큰 장 필드(intestinal field)는 시간과 공간에 의해 제어되는 방식으로 고강도 다광자 적외선 레이저에 의해 절제되었습니다. 후속 장기간의 반복적인 생체내 이미징을 통해 시간 경과에 따른 손상 부위를 추적할 수 있었고 여러 주에 걸쳐 조직 회복 중 음와역학을 모니터링할 수 있었습니다. 선와분열, 융합 및 소실과 같은 선와(crypt) 리모델링 사건은 레이저로 유도된 손상 시 인접 조직에서 관찰되었습니다. 이 프로토콜은 노화 및 종양 개시와 같은 항상성 및 병태생리학적 설정 모두에서 선와역학을 연구할 수 있습니다.
Introduction
장의 상피 내벽은 상피 장벽을 파괴할 수 있는 위산, 독소 및 미생물군에 의해 지속적으로 도전을 받습니다. 장 구조와 조직 조직은 지속적으로자가 재생되고 손상을 복구하는 데 특화되어 있습니다. 소장의 단층 상피는 crypt-villus units1로 구성됩니다. 항상성에서 자와(制國)의 기저부에 상주하는 자가 재생 Lgr5+ 장 줄기 세포는 분화된 자손을 생성합니다. 분화된 딸 세포는 컨베이어 벨트 방식으로 융모 축의 끝으로 이동하여 3-5일 안에 장 내벽이 보충되도록 흘립니다 2,3. 장기적으로 모든 Lgr5+ 세포가 조직 재생에 동등하게 기여하는 것은 아니며, 이는 또한 세포가 컨베이어 벨트를 상대로 지하실의 기저부로 이동하는 능력(즉, 역행 이동)에 달려 있기 때문입니다4,5. 실제로, 예를 들어, 방사선에 의한 Lgr5+ 세포의 절제 시, 선와(城)의 기저부 외부에 있는 전구 세포(progenitor cell)는 기저부로 이동하여 줄기 세포 풀을 탈분화시키고 보충한다 6,7,8.
급성 염증은 Lgr5+ 줄기 세포의 손실을 유발할 수 있습니다 9,10. 줄기 세포 손실 외에도 많은 외부 요인이 선와 규모에서 상피에 급성 손상을 일으킬 수 있습니다. 방사선, 화학 물질 및 항생제는 장의 섬와와 융모를 손상시키는 것으로 나타났다11. 더 큰 밭의 지하실과 융모는 박테리아, 바이러스 및 기생충 감염의 영향을 받을 수 있다12. 장은 지하실(지하)에 의한 지하실 규모에서 내부 및 외부 손상으로부터 회복할 수 있는 놀라운 능력을 가지고 있습니다.13. 상처를 입으면 피해에 인접한 지역의 지하실이 핵분열을 일으켜 지하실의 번호를 보충합니다. 이 현상은 항상성14,15 동안에도 발생합니다. 항상성 동안 지하실 수의 잠재적 증가를 상쇄하기 위해 지하실은 융합(두 개의 지하실을 하나로 병합)할 수도 있습니다16,17. 토굴 융합이 상처 후 크립트 번호를 재설정하는 역할도 하는지 여부는 알려져 있지 않습니다. 또한, 이 과정의 역학 및 규제 요인은 아직 밝혀지지 않았습니다.
부상 모델은 생체 내에서 조직 재생을 연구하는 데 없어서는 안될 필수 요소입니다. 장 조직 재생을 연구하기 위해 다양한 손상 모델이 활용되었습니다. 이전의 실험 전략은 줄기 세포 풀을 고갈시키기 위해 고용량 방사선을 사용했거나18 덱스트란 설페이트 나트륨(DSS)으로 처리하여 생쥐에서 만성 및 급성 대장염 및 선와 소실을 유도했다19,20. 유전적 또는 광학적 수단에 의한 단세포 절제술은 조직 손상을 정제하는 데 사용되어 왔으며 줄기 세포와 전구 세포의 역할을 풀고21,22 혈관 재생을 연구하는 매력적인 도구로 여겨져 왔다 23. 또한, 생검 손상 시스템이 개발되어 여러 지하실과 융모24의 더 큰 들판에서 손상을 유도합니다. 중요하게도, 손상 손상에 대한 반응은 방사선에 대해 보고된 바와 같이 장의 근위-원위 축을 따라 변할 수 있으며, 이는 결장보다 소장에서 더 많은 손상을 일으켰습니다25. 이것은 해로운 모욕의 정도와 장에서의 국소화를 모두 제어하는 표적 방법의 필요성을 강조합니다.
손상 범위 및 회복은 통상적으로 조직 회복의 역학에 대한 제한된 정보를 제공하는 정적 수단에 의해 평가되었습니다. 생체 내 현미경 검사 (IVM)는 많은 기관에서 줄기 세포 행동, 상피 리모델링 및 재생을 정량화 할 수있는 독특한 기회를 열었습니다 26,27,28,29,30, 장 생물학에 대한 영향력 있는 통찰력을 제공했습니다 4,5,21,31,32,33,34, 35,36.
여기서는 시공간적으로 정의된 장 손상을 일으키고 장 상피 내벽의 회복을 포착하는 방법을 설명합니다. 우리는 두 개의 광자 기반 레이저 절제를 사용하여 장 선와를 손상시키고 반복적인 생체 내 현미경으로 즉각적인 상처 반응과 장기 회복을 추적합니다. 우리의 프로토콜을 사용하면 국소 조직 손상에 대한 반응으로 장 조직 구조의 재생 리모델링을 매핑할 수 있습니다. 핵분열 및 핵융합 사건을 포함한 크립트 역학은 시간이 지남에 따라 쉽게 정량화되고 추적될 수 있습니다. 레이저 절제 및 반복적인 생체 내 이미징의 적용은 항상성 및 종양 개시와 같은 병태생리학 동안 장 구조의 조직 규모 역학을 조사하기 위한 플랫폼으로 활용될 수 있습니다.
Protocol
본 연구에 기술된 모든 동물실험은 네덜란드암연구소(NKI)의 동물복지기구(AWB)의 가이드라인 및 승인에 따라 수행하였다.
참고: 동물 실험을 수행하기 전에 연구소의 동물 윤리 위원회에 문의하십시오.
1. 수술 준비 및 생체 내 영상
- 수술 전 치료
- 수술 4-6주 전에 해바라기유에 용해된 타목시펜을 복강 주사하여 8-12주령 K19-CreERT2 37: Rosa26-mTmG38 및 Lgr5eGFP-IRES-CreERT218: Rosa26-Confetti39 마우스를 유도한다(그림 1).
- 진통제를 바르십시오. 수술 30분 전에 마우스 30g당 NaCl 0.9%로 희석한 부프레노르핀 200μL(체중 kg 0.1)를 피하 주사합니다. 수술 24시간 전에 산성화되지 않은 오토클레이브 음용수 125mL가 들어 있는 병에 카르프로펜(0.067mg/mL)을 투여합니다. 또는 수술 시작 30분 전에 카프로펜 주사를 피하(5mg/kg) 투여합니다.
- 수술 준비
- 생물학적 위험 캐비닛에 고압 증기 멸균 수술 도구를 도입하십시오.
- 가열 패드를 켜고 온도를 37 °C로 설정합니다.
- 생체 내 영상 준비
- 온도 안정화를 위한 충분한 시간을 허용하기 위해 이미징하기 최소 4시간 전에 현미경의 온도 제어 챔버를 켭니다.
알림: 필요한 시간은 사용하는 기계에 따라 다를 수 있습니다. - 기후 챔버 내부의 온도를 37°C로 안정적으로 유지하십시오.
- 이광자 현미경, 스캐너 및 레이저를 켭니다.
- 이미징 소프트웨어를 실행합니다.
- 레이저의 파장을 960nm로 조정하고 셔터를 엽니다.
- 온도 안정화를 위한 충분한 시간을 허용하기 위해 이미징하기 최소 4시간 전에 현미경의 온도 제어 챔버를 켭니다.
2. 수술 및 생체 내 영상
- 장의 외과적 노출
- 2%-3% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취시키고 멸균 천으로 덮인 가열 패드에 놓습니다. 호흡의 빈도와 질(1회/초)을 평가하고 마우스의 반사를 확인하여 마취 깊이를 확인합니다.
- 눈 연고로 마우스의 눈을 가리십시오.
- 200μL의 미리 데워진 멸균 식염수를 피하 주사합니다.
- 복부를 면도하고 머리카락을 제거하십시오. 수술 부위의 멸균 천을 교체하십시오.
- 직장 프로브를 삽입하여 마우스의 온도를 모니터링합니다.
알림: 온도는 약 37°C여야 합니다. - 새 멸균 장갑을 착용하십시오.
- 소독액을 번갈아 가며 문지른 다음 80% 에탄올을 세 번 사용하여 수술 부위를 원형으로 청소합니다. 멸균 면봉으로 과도한 에탄올을 제거하십시오.
알림: 이 시점에서 마우스의 저체온증을 모니터링하는 것이 중요합니다. - 멸균 수술용 드레이프로 마우스를 덮습니다.
- 마우스의 반사를 확인하십시오.
- 멸균 메스를 사용하여 피부를 통해 ~10mm 수직 정중선을 절개합니다.
- 가위로 linea alba를 절개하여 복직근을 분리하고 복부를 엽니다.
- 멸균 된 미리 데운 식염수에 흠뻑 적신 멸균 면봉을 사용하여 마우스의 맹장을 찾아 기준점으로 사용하십시오.
- 멸균 거즈 조각을 작게 자르고 예열 된 멸균 식염수에 적셔 절개 부위 위에 놓습니다.
- 미리 데워진 멸균 식염수에 흠뻑 적신 멸균 면봉으로 장을 꺼냅니다. 미리 데워진 멸균 식염수를 추가하여 장을 수분을 유지하십시오.
- 멸균된 맞춤형 이미징 챔버를 마우스 옆에 놓습니다.
- 마우스를 예열된 멸균 이미징 박스로 옮깁니다.
- 이미징 상자의 멸균 유리에 장을 놓습니다. 그림 1과 같이 이미징 상자의 흡입 튜브 안에 마우스 머리를 넣습니다.
- 필요한 경우 멸균 플렉시블 필름과 테이프로 마우스를 고정합니다.
- 마우스가 들어 있는 이미징 상자를 현미경 챔버에 넣습니다.
- 생체 내 영상
- 15분마다 직장 프로브를 통해 호흡 빈도와 깊이 및 온도를 확인하여 이미징 중에 마우스를 모니터링합니다. 이소플루란의 비율은 1%-2% 사이로 유지되어야 합니다. 필요한 경우 조정합니다.
- 현미경의 접안렌즈를 사용하여 장의 영역을 찾습니다.
- 그림 2A에서 볼 수 있듯이 현미경의 내부 카메라를 사용하여 관심 영역의 광시야를 확보합니다.
- 다광자 현미경의 960nm 레이저를 사용하여 관심 영역을 이미지화합니다. 실험에 사용된 형광단에 따라 레이저 출력과 파장을 조정합니다.
- 관심 영역의 3μm의 10-20단계 z-스택을 획득합니다.
- 레이저 절제
- 이전에 이미지화된 타일에서 단일 위치 또는 여러 위치를 선택합니다.
- 32Hz의 스캔 속도로 124 및 400 x 400 픽셀 해상도의 줌에서 이미징 소프트웨어의 표백점 보정 기능을 사용하고 목표로 하는 손상의 크기에 따라 3-10초 동안 양방향 스캐닝 속성을 사용합니다. 지하실 영역에서의 손상의 시작은 녹색 및 적색 채널 모두에서자가 형광의 증가에 의해 인식 될 수 있습니다.
- 동일한 마우스의 여러 영역에 대해 앞의 두 단계를 반복합니다.
- 절제 후 손상된 부위의 z-스택을 획득하여 손상 위치와 정도를 확인합니다.
- 수술 부위 폐쇄
- 마우스를 마취 상태에서 멸균 봉합 부위에 놓습니다.
- 예열된 멸균 식염수에 흠뻑 적신 멸균 면봉을 사용하여 노출된 장을 복부에 다시 삽입합니다.
- 흡수성 5-0 봉합사를 사용하여 간단한 연속 봉합을 수행하여 linea alba를 봉합합니다. 수술 매듭으로 봉합사의 사지를 닫으십시오.
- 스킨 레이어와 동일한 단계를 반복하십시오.
- 이소플루란 스테이션을 끄고 이미징 박스와 인레이를 청소하고 살균합니다.
- 수술 기구 클리너, 효소 클리너 및 수술 기구 윤활제로 수술 도구를 청소하십시오. 건조되면 오토클레이브에 있는 수술 상자와 함께 수술 도구를 소독합니다.
- 수술 후 관리
- 케이지가 ~1시간 동안 가열 패드에 놓이는 동안 마우스가 수술에서 회복되도록 합니다.
알림: 가능하면 마우스를 다른 케이지 메이트와 함께 놓습니다. 회복을 위해 독방 주택이 필요하지 않습니다. - 회복하는 동안 15분마다 마우스의 온도를 확인하십시오.
- 수술 후 6-12시간 동안 마우스 30g당 NaCl 0.9%로 희석한 부프레노르핀 200μL(체중 kg 0.1mg)를 피하 주사합니다.
- 수술 후 0.067시간 동안 125mL의 산성화되지 않은 오토클레이브 음용수가 들어 있는 병에 카프로펜(72mg/mL)을 투여합니다.
- 마우스의 체중을 측정하고 수술 후 1주일 동안 매일 복지를 모니터링합니다.
- 케이지가 ~1시간 동안 가열 패드에 놓이는 동안 마우스가 수술에서 회복되도록 합니다.
3. 반복적인 수술 및 생체 내 영상
- 외과
- 두 번째 시점(첫 번째 이미징 세션 후 최소 1주일 후)에 1.1.2, 1.2, 1.3 및 2.1단계를 반복합니다.
- 생체 내 영상
- 2.2.1-2.2.3단계를 반복합니다.
- 혈관 패턴을 사용하여 첫 번째 시점에서 이미지화된 동일한 관심 영역을 찾습니다.
- 2.2.4단계와 2.2.5단계를 반복합니다.
- 수술 부위 폐쇄
- 2.4.1단계를 반복합니다.
- 마우스가 다른 시점에서 이미지화되지 않는 경우 말단 마취 하에 자궁경부 탈구를 수행하여 마우스를 희생합니다. 그렇지 않으면 다음 단계를 계속합니다.
알림: EU 지침 2010/63/EU, 부록 IV의 지침에 따르면 경추 탈구는 허용되는 방법입니다. - 2.4.2-2.4.6단계를 반복합니다.
- 수술 후 관리
- 2.5.1-2.5.5단계를 반복합니다.
Representative Results
생체 내 이미징과 결합된 레이저 절제 방법에서 얻을 수 있는 결과의 유형을 입증하기 위해 그림 1과 같은 실험을 수행했습니다. 먼저 K19-CreERT2;mTmG(K19cre-mTmG) 및 Lgr5eGFP-IRES-CreERT2를 주입했습니다. Rosa26-Confetti(Lgr5cre-Confetti) 마우스와 타목시펜을 사용하여 색종이 색상 중 하나(또는 mTmG 마우스의 경우 녹색 형광 단백질[GFP])로 세포를 확률적으로 라벨링합니다. K19-cre는 모든 상피 세포에서 계통 추적을 유도하는 반면, Lgr5-cre는 줄기 세포에서만 8,18,37 추적을 유도합니다. 타목시펜 주사는 수술 4-6 주 전에 투여되었고 모든 세포가 특정 색상에 대해 단일 클론 인 크립트를 얻기 위해 첫 번째 이미징 세션을 실시했습니다. 몇 주에 걸쳐 동일한 조직 영역을 확실하게 식별하는 것은 시간이 지남에 따라 동일한 지하실의 운명을 추적하는 데 필수적입니다. 혈관구조와 같은 고유한 조직 구조적 특징은 신뢰할 수 있는 조직 랜드마크로 사용될 수 있으며, 여기에서 현미경의 내부 카메라로 기록되었습니다. 또한 (최소 2개) 서로 다른 색상으로 지하실의 작은 부분에 레이블을 지정하면 각 이미징 세션에서 동일한 지하실을 인식하고 레이저 손상 후 재생 과정에서 그 동작을 추적하는 데 도움이 되었습니다. 마우스의 장을 외과적으로 노출시키고 관심 영역의 카메라와 형광 이미지를 모두 획득하면(그림 2A) 다광자 레이저의 표백점 설정을 사용하여 하나 이상의 선와를 절제할 수 있습니다(그림 2B, C). 손상의 시작은 녹색 및 적색 채널 모두에서 자가 형광의 증가로 인식될 수 있습니다. 선와 회복의 역학을 연구하기 위해 첫 번째 영상 세션 후 수술 및 영상 절차를 몇 주/몇 달 후에 반복했으며 조직 고유 구조(혈관 구조 및 클론 라벨이 붙은 선와)를 랜드마크로 사용하여 정확히 동일한 손상 위치를 찾았습니다(그림 2). 이 방법을 Lgr5-eGFP가 고르지 못한 방식으로 발현되는 Lgr5Cre-Confetti 마우스에 적용했을 때 레이저 유도 손상에 따른 크립트 번호와 모양의 변화를 포착할 수 있었습니다(그림 3). 일부 지역은 지하실의 수와 구조에 변화가 없었지만(그림 3B), 다른 지역에서는 자와핵분열 및 핵융합 사건의 수(그림 3C)와 레이저 유발 손상 후 2주 후 지하실의 손실(그림 3D)에서 볼 수 있듯이 광범위한 지하실 리모델링을 보였습니다. (그림 3E)에 표시된 예에서와 같이 다양한 크기의 손상을 도입하고 절제 후 핵분열, 융합 및 소실 사건을 정량화함으로써 부상으로 인한 재생의 역학을 다른 마우스 모델에서 매핑할 수 있습니다.
그림 1: 실험 설정의 개략도. 장 세포의 생체 내 표지는 장 선와에서 Cre 매개 재조합을 유도하기 위해 유전자 변형 마우스 모델에 타목시펜을 복강 내 주사함으로써 달성됩니다. 며칠 또는 몇 주 후(지하실이 특정 색상에 대해 단클론성인 경우) 장을 외과적으로 노출시키고 온도 조절 챔버가 있는 다광자 현미경을 사용하여 레이저 절제를 받습니다. 지하실 손상의 정도는 절제 직후에 특징지어지며 마우스는 절차에서 회복할 수 있습니다. 반복적인 외과적 노출과 IVM은 시간 경과에 따른 장 회복을 모니터링하는 데 사용됩니다. 혈액 혈관 구조와 다른 색상의 선와로의 패턴과 분포는 절제 후 몇 주 또는 몇 달 후에 동일한 영역을 찾는 데 사용됩니다. 선와(crypt) 리모델링(예: 핵분열 또는 융합)은 절제 후 몇 주 후에 손상 부위에서 관찰할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 장에서 레이저로 인한 손상에 따른 조직 재생의 세로 영상. 장이 정확히 같은 방식으로 위치하면 장의 혈관을 지도로 사용하여 정확히 동일한 영역을 찾고 이미지화할 수 있습니다. (A) 장의 카메라 개요 이미지. 흰색 점선은 손상 부위(흰색 상자)에 인접한 맥관 구조의 패턴을 나타내며, 다른 시점에서 동일한 레이저 절제 영역을 찾기 위한 랜드마크로 사용됩니다. 아래쪽 두 이미지는 흰색 상자의 확대 보기를 보여줍니다. 화살표는 1일째와 1개월 후의 정확한 레이저 절제 부위를 나타냅니다. (B) 다광자 현미경으로 캡처한 단일 선와 손상의 형광 이미지. 파란색 상자의 화살표는 1일째와 1개월 후의 손상 부위를 나타냅니다. (C) 손상된 지하실의 형광 이미지. 파란색 상자의 화살표는 1일과 1개월 후의 손상 영역을 표시합니다. 스케일 바: 1 mm (A, 상단); 0.25mm(A, 하단); 200 μm (큰 개요 B 및 C); 및 50μm(확대된 이미지 B 및 C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 레이저 절제 후 선와(crypt) 운명의 생체 내 이미징. (A) 색종이 조각 모델을 사용하여 시간이 지남에 따라 다른 색상으로 표시된 지하실을 추적하여 회복의 역학을 매핑할 수 있습니다. 흰색 화살표는 레이저 절제 부위를 나타냅니다. 노란색 상자는 인접 영역(손상 부위에서 <100μm)을 나타내고 파란색 및 보라색 상자는 레이저 절제 영역에서 멀리 떨어진 영역(>100μm)을 나타냅니다. 다양한 재생 모드가 관찰됩니다. (B) 일부 지역은 보라색 상자에서와 같이 변경되지 않은 상태로 유지됩니다. (C) 다른 지역은 지하 핵분열 또는 융합의 형태로 지하 리모델링을 나타냅니다. 흰색 점선과 화살표는 지하 핵분열 사건을 나타내고 주황색 점선과 화살표는 지하실 융합 사건을 나타냅니다. (D) 일부 지역에서는 주황색 점선으로 강조 표시된 지하실이 사라진 노란색 상자에서와 같이 지하실이 사라지는 것이 관찰됩니다. (E) 손상 부위에 인접한(즉, 100μm 미만) 영역과 멀리 떨어진 영역(즉, 100μm 이상)에서 관찰된 자와실 리모델링 이벤트의 수를 보여주는 예시적인 정량화. 스케일 바: 200 μm (A); 50 μm (B-D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜은 현미경 레이저 절제와 세로 생체 내 현미경을 결합하여 초기 손상 반응에서 장기 조직 리모델링에 이르기까지 장 재생을 추적합니다. 이 기술은 현미경 레이저 절제를 유도하고 이미지화하기 위한 윤리적 고려 사항을 엄격하게 준수하여 확립되었으며 정확하게 따를 때 동물의 웰빙을 유지할 수 있습니다. 수술 중 장의 완전성이 잘 보존되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이것은 멸균 된 젖은 면봉으로 조직을 부드럽게 처리하여 조직에서 출혈이나 건조를 방지함으로써 달성 할 수 있습니다. 레이저로 인한 현미경 손상의 정도는 레이저 절제 후 해당 부위의 여러 장층을 이미징하여 신중하게 평가해야 합니다. 연구자가 이 프로토콜에 설명된 실험 단계의 빈도를 조정하고자 하는 경우, 복지에 대한 결과를 확립하기 위해 실험 전에 연구소의 동물 윤리 위원회와 상의해야 합니다.
반복적인 생체 내 현미경을 통해 시간 경과에 따른 동일한 마우스의 조직 회복을 모니터링할 수 있습니다. 장의 반복적인 외과적 노출은 전체 장에 대한 광학적 접근을 쉽게 허용합니다. 혈관 구조와 같은 조직 고유의 특징은 각 이미징 세션에서 동일한 장 영역을 식별하는 랜드마크 역할을 합니다. 따라서, 동일한 조직 영역을 수주에 걸쳐 이미지화할 수 있으며, 이를 통해 동일한 마우스의 동일한 장 영역에서 장기 조직 재생을 정량화할 수 있습니다. 결합된 수술 및 이미징 방법에 의해 제공되는 시공간 제어는 동일한 마우스에서 항상성 및 재생 조건 모두에서 동일한 장기를 이미지화할 수 있다는 이점을 제공하며, 이는 대조군 및 재생 샘플이 다른 마우스에서 유래한 이전의 전체 장기 손상 모델과 대조됩니다 11,12,18,19,20 . 따라서 우리의 실험 설정은 실험에 필요한 동물 수를 최소화하고 동물 내 변이를 줄입니다.
프로토콜 문제 해결은 마우스 및 장 취급 기술 검토와 현미경 장비 및 설정 제어로 시작해야 합니다. 이 프로토콜에는 각별한 주의가 필요한 중요한 단계가 많이 있습니다. 첫째, 동물의 웰빙과 지속적인 높은 데이터 품질을 보장하기 위해 모든 작업은 무균 기술을 사용하여 깨끗한 무균 환경에서 수행되어야 하며 수술 및 각 이미징 세션 동안 마우스 온도를 유지해야 합니다. 이미징 중에 미리 데워진 멸균 식염수로 조직을 수분을 유지하는 것이 필수적이며 조직 섬유증을 예방합니다.
실험이 재현 가능한 방식으로 수행되도록 하려면 최적의 획득을 위해 사용하기 전에 레이저를 정렬하고 각 세션이 시작될 때 다광자 레이저의 출력을 측정하는 것이 중요합니다. 대물렌즈의 유형, 배율, 체류 시간, 레이저 출력 및 파장과 같은 매개변수는 현미경 레이저 절제의 정도에 영향을 미치므로 고려해야 합니다. 이 연구에서 레이저 절제와 이미징은 모두 Fluotar VISIR 25x/0.95 WATER 대물렌즈를 통해 960nm 파장에서 1.2W(렌즈 외부)의 레이저 출력으로 수행됩니다. 파장 또는 광학 스캐닝 특성을 변경하면 미세한 손상 정도에 영향을 미칩니다. 더 낮은 파장(예: 840nm)은 더 높은 에너지 광자로 변환되고 종종 레이저의 더 높은 출력으로 변환되며 미세한 손상을 향상시킬 수 있습니다. 확대/축소가 높을수록 지역당 더 많은 에너지가 발생하므로 지하실을 제거하는 시간이 줄어들고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 픽셀 체류 시간은 또한 절제 속도와 손상 정도를 변경하기 위해 증가하거나 감소할 수 있습니다. 영상화된 조직이 안정적이지 않은 경우(예: 연동 운동으로 인해) 절제를 신속하게 수행해야 합니다. 이를 위해 절제 속도는 예를 들어 줌 및/또는 레이저 출력을 증가시켜 최적화해야 합니다.
여러 이미징 세션에서 동일한 장 영역을 찾는 것은 실험의 성공을 보장하기 위해 적절하게 실행되어야 하는 또 다른 중요한 단계입니다. 그렇게 하려면 장이 모든 시점에서 정확히 같은 방식으로 위치해야 합니다. 소장과 대장에서 동일한 부위를 찾기 위해 항상 맹장을 기준점으로 사용하는 것이 좋습니다. 면봉으로 관심 조직을 부드럽게 늘리면 관심 영역이 객관적인 작동 거리 범위 내에 있는지 확인하고 추적할 수 있는 영역의 수를 최대화합니다. 또한 이후 이미징 세션에서 다시 국소화되지 않을 수 있는 영역을 설명하기 위해 항상 각 마우스의 여러 현미경 위치를 제거하고 이미지화하는 것이 좋습니다. 장의 위치가 정확하더라도 영역을 찾을 수 없는 경우 마우스의 위치를 변경하고 노출된 영역의 방향을 변경하는 데 도움이 될 수 있습니다. 시간이 지남에 따라 지하실을 추적하는 것은 인접한 여러 지하실의 더 큰 장 필드가 절제되는 실험에서 번거로울 수 있습니다. 이러한 손상 모욕은 상피 단층을 넘어 조직 리모델링을 유발할 수 있으며, 이는 시간 경과에 따른 영역 추적에 사용되는 조직 랜드마크의 변형으로 절정에 달할 수 있습니다. 손상된 부위까지 충분한 거리에 있는 랜드마크를 선택하고 손상된 부위를 수백 마이크로미터 능가하는 더 큰 시야를 포착하면 성공적인 장기 실험의 가능성이 높아집니다. 현미경 단계에서 장의 잘못된 위치 외에도 위장관의 연동 운동은 이미징을 방해 할 수 있습니다. 이 문제는 두 가지 방법으로 개선될 수 있습니다. 움직임의 빈도가 너무 높지 않으면 노출 시간이 증가하여 동일한 영역에서 프로세스가 반복 될 수 있습니다. 또는 연동 운동을 줄이기 위해 더 많은 양의 마취를 사용할 수 있습니다. 고용량의 이소플루란을 짧은 조정으로 제한하는 것이 좋습니다. 전체적으로 이미징 세션은 빠른 복구를 위해 가능한 한 짧게, 최적으로 3시간 미만으로 유지되어야 합니다.
결합된 레이저 절제와 세로 생체내 현미경 접근법은 다른 손상 모델과 비교할 때 몇 가지 장점이 있습니다. 이전의 (화학적) 손상 모델은 손상 모욕 6,11,12,19,20을 국부적으로 제한하는 능력이 부족했습니다. 레이저 절제술은 손상을 정의된 관심 영역으로 제한함으로써 이러한 단점을 극복합니다. 이를 통해 연구원은 부상 위치와 손상 정도를 제어 할 수 있습니다. 손상 심각도를 조절하여 지하비 또는 전체 미세한 장 필드를 제거하여 지하 규모에서 재생 반응에 대해 알릴 수 있습니다. 공간 제어 외에도 레이저 절제는 손상 시작 시간을 정확하게 측정하여 이전 약물, 화학 및 감염 모델9,10,11,12,19,20의 정밀도를 능가합니다. 우리의 프로토콜은 장에서 국소 손상을 유도하는 방법으로 레이저 유도 열 절제를 사용한 이전 연구를 확장합니다21,23. 이전의 레이저 유도 손상 모델은 소장(21) 또는 원위 결장(23)의 내강 표면의 국소 영역을 이미지화했습니다. 수술과 레이저 절제술을 병행하면 장 상피(특히 선와)를 고해상도로 시각화하고 소장, 맹장 및 근위 결장의 모든 위치에서 조직 회복에 대한 레이저 절제 및 추적 영상을 수행할 수 있습니다. 시간이 지남에 따라 동일한 장 영역의 회복을 캡처하여 실험 설정에 따라 장의 다른 층(점막, 점막하층, 근섬유 및 장막)을 시각화할 수 있습니다. 우리의 기술은 주로 여러 주/개월 동안 장기간 반복되는 이미징에 맞게 조정되었습니다. 지하실의 단기 회복 역학을 연구하기 위해(예: 손상 후 연속 며칠 동안) 여기에 설명된 레이저 절제 접근법을 생체 내 이미징 창(27,28,40)과 결합할 수 있습니다.
이 프로토콜은 재생, 면역학 및 암 연구를 아우르는 다양한 과학 분야의 다양한 연구 응용 분야에 활용될 수 있습니다. 장 재생의 종단 영상은 상피 무결성과 장벽 기능을 보존하고, 장 내강의 병원체에 대한 숙주 방어를 가능하게 하며, 발암성 돌연변이의 제거 및 확산의 기초가 되는 세포 역학을 조명합니다. 각 과학적 질문은 레이저로 인한 손상의 정도와 이미징 지속 시간에 대한 고유한 요구 사항을 제시합니다. 형광 리포터 마우스와 주입된 염료는 관심 있는 모든 세포 및 구조를 시각화하여 획득할 수 있는 데이터를 크게 확장하고 정제할 수 있습니다. 예를 들어, Lgr5-CreERt2:Rosa26-Confetti 마우스를 사용하여 줄기 세포 자손을 시각화할 수 있으며 Rosa26-mTmG 리포터는 조직 구조에 대해 알려줍니다. 이러한 최근의 기술 발전은 생체 내 장 실험을 장 생물학 및 질병에 대한 이해를 높이는 수익성 있는 도구로 만듭니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 네덜란드 과학 연구 기구 NWO(Vici grant 09150182110004 to JVR 및 Veni grant 09150161910151 to H.A.M), OCENW. GROOT.2019.085 (JVR로) 및 EMBO 박사후 연구원 (HAM에 ALTF 452-2019 부여).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia induction box | Veterinary Technics | ||
| Autoclave | Certoclav | ||
| Betadine | Mylan | 202809 | |
| Diaper (underpad) | Absorin comfort | ||
| Dumont forceps | Fine Scientific Tools | 11255-20 or 11272-40 | Inox, style #55, used to hold the peritoneum |
| Enzymatic instrument cleaner | Roboz | EC-1000 | |
| Ethanol 80% | homemade | NA | |
| Eye ointment | Duratears Z (Alcon) | 288/28282-6 | |
| Fine Scissors Straight 9 cm | Fine Scientific Tools | 14060-09 | Used to cut skin and peritoneum of the mouse |
| Gauze 5 cmX5 cm | Cutisoft (Bsn medical) | 45847-00 | |
| Graefe Forceps Curved Serrated | Fine Scientific Tools | 11051-10 | Used to hold the skin |
| Hartman Hemostat Straight | Fine Scientific Tools | 13002-10 | Used for suturing |
| Heating pad | Comfort | T5-5000 | |
| Imaging box | Custom made | ||
| Incision film | Nobafilm | 172215 | |
| Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
| Isoflurane (vetflurane) | Pharmachemie BV, Haarlem, Netherlands | 305788 | |
| Isoflurane vaporizer | Penlon sigma delta | ||
| Micropore paper tape | Micropore | ||
| NaCl 0.9% | Braun | Other brands available | |
| Needle 25G | BD | 300600 | |
| Paper tape tesa | Tesa | NA | |
| Parafilm | Bemis | PM-994 | semi-transparent tape |
| Razor blades | Supermax stainless steel | Other brands available | |
| Rectal probe | Kent Scientific | 20250-91 | |
| Rimadyl Cattle (carprofen) | Zoetis B.V | Registration# REG NL 10130 | |
| Student Fine Scissors Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | Used to cut gauze |
| Surgical instrument cleaner | Roboz | IC-1000 | |
| Surgical instrument lubricant | Roboz | IL-1000 | |
| Syringes (1 ml) | BD | 303172 | Other brands available |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Indivior UK Limited/Reckitt Benckiser Healthcare | Registration# RVG 08725 | |
| Vicryl polyglactin suture 5-0 FS-2 needle | Ethicon | V292ZH | |
| VirkonS | Bio-services | antiseptic solution | |
| Wooden cotton swab (sterile) | Klinion | 531530 | Other brands available |
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