Summary
Offentliggjorte data vedrørende calcitonin gen-relaterede peptid (CGRP) koncentrationer i humant plasma er inkonsekvente. Disse uoverensstemmelser kan skyldes manglen på en standardiseret, valideret metode til kvantificering af dette neuropeptid. Her beskriver vi en valideret enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) protokol til oprensning og kvantificering af CGRP i humant plasma.
Abstract
Calcitonin genrelateret peptid (CGRP) er et vasoaktivt neuropeptid, der spiller en formodet rolle i patofysiologien af migrænehovedpine og kan være en kandidat til biomarkørstatus. CGRP frigives fra neuronale fibre ved aktivering og inducerer steril neurogen inflammation og arteriel vasodilatation i vaskulaturen, der modtager trigeminal efferent innervering. Tilstedeværelsen af CGRP i den perifere vaskulatur har ansporet undersøgelser til at detektere og kvantificere dette neuropeptid i humant plasma ved hjælp af proteomiske assays, såsom enzymbundet immunosorbentassay (ELISA). Imidlertid har dens halveringstid på 6,9 min og variabiliteten i tekniske detaljer i analyseprotokoller, som ofte ikke er fuldt beskrevet, givet inkonsekvente CGRP ELISA-data i litteraturen. Her præsenteres en modificeret ELISA-protokol til oprensning og kvantificering af CGRP i humant plasma. De proceduremæssige trin omfatter prøveindsamling og -forberedelse, ekstraktion ved hjælp af en polær sorbent som rensningsmiddel, yderligere trin til blokering af ikke-specifik binding og kvantificering via ELISA. Endvidere er protokollen blevet valideret med spike og genopretning og linearitet af fortyndingseksperimenter. Denne validerede protokol kan teoretisk bruges til at kvantificere CGRP-koncentrationer i plasma hos individer, ikke kun med migræne, men også med andre sygdomme, hvor CGRP kan spille en rolle.
Introduction
Calcitonin genrelateret peptid (CGRP) er et 37-aminosyre neuropeptid, der er til stede i neuronale fibre med perivaskulær lokalisering såvel som ikke-neuronalt væv. De to former for CGRP, α- og β-CGRP, deler mere end 90% homologi og deler fysiologiske funktioner; aCGRP findes dog i det centrale og perifere nervesystem, mens βCGRP findes i det enteriske nervesystem 1,2. Ved nociceptoraktivering og calciumafhængig exocytose frigives CGRP fra neuroner, hvilket inducerer steril neurogen inflammation, der involverer arteriel vasodilatation og plasmaproteinekstravasation 3,4,5,6,7. Herfra vises CGRP i postkapillærkarrene og kan være en biomarkør for sygdomme, der forårsager afferent nociceptiv aktivering, såsom migræne 8,9,10,11. Det skal bemærkes, at CGRP også har været impliceret i COVID-19 gennem sin rolle i angiogenese og immunmodulering og kan forudsige ugunstig sygdomsudvikling12,13. Således kunne en protokol til nøjagtig kvantificering af CGRP i humant plasma have en bred værdi.
Den største opmærksomhed har måske været givet til CGRPs rolle i migræne. Baseret på prækliniske og kliniske studier er CGRP blevet fremsat som en mulig biomarkør for migræne og som et mål for behandling 3,4,5,6,7,8,9,10. Nogle undersøgelser har fundet en forhøjelse af CGRP i kohorter med episodisk migræne i forhold til kontroldeltagere10,14,15. Succesen med CGRP-hæmmere i kliniske forsøg med migrænehovedpine synes at implicere forhøjet CGRP som en årsagsfaktor for migrænehovedpine. Imidlertid har ikke alle efterforskere bekræftet disse resultater16,17,18,19. Desuden er CGRP's rolle i ikke-hovedpine symptomer på migræne endnu ikke belyst; det nuværende arbejde var motiveret af et ønske om at forstå CGRP's rolle i vestibulære symptomer på migræne.
Inkonsistente CGRP-immunoassaydata i litteraturen kan skyldes flere årsager. For det første er halveringstiden for CGRP i den perifere vaskulatur 6,9 min 20 på grund af aktiviteten af serinproteaser 21, insulinnedbrydende enzymer og andre metalloproteases 22, neutrale endopeptidaser 23 og endothelinkonverterende enzym-1 24. For det andet er de variable tekniske detaljer i de immunoassays, der anvendes til kvantificering af CGRP, ikke fuldt ud beskrevet i sådanne undersøgelser. Endelig komplicerer manglen på standardisering af immunoassaymetoden billedet endnu mere.
Denne artikel beskriver en modificeret enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) protokol, der muliggør oprensning og nøjagtig kvantificering af α- og βCGRP i humant plasma. Sættets antistoffer er ikke krydsreaktive med amylin, calcitonin eller stof P. Denne protokol har gennemgået de nødvendige valideringseksperimenter, såsom spike og genopretning og linearitet af fortynding, hvis data præsenteres her. En sådan CGRP ELISA-protokol, der har gennemgået validering, er ikke tidligere blevet beskrevet fuldt ud i litteraturen. Denne protokol kan bruges til at kvantificere CGRP i humant plasma i forbindelse med migræne samt kardiologisk2,25, dermatologisk 26, obstetrisk 27, reumatologisk28,29, muskuloskeletale 30,31, endokrine 32,33 og virussygdomme 12,13, hvor CGRP har været impliceret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol blev udviklet ved hjælp af humane plasmaprøver fra samtykkede personer med godkendelse fra Johns Hopkins Institutional Review Board (NA_00092491).
1. Indsamling og klargøring af prøver
- Opsaml 5 ml fuldblod fra den antecubitale vene via standard venipunkturmetoder34 i et 6 ml vacutainer ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) opsamlingsrør.
- Tilsæt 0,5 ml aprotinin (10.000 KIE / ml) kompetitiv serinproteasehæmmer til røret efter opsamling for at blokere lysen af målpeptidet. Vend røret 10 gange for at lade aprotinin blandes tilstrækkeligt med blodet. Opbevar derefter rørene på is indtil næste trin.
- Centrifuger røret ved 604 x g i 4 minutter ved 4 °C inden for 60 minutter efter blodindsamling.
- Plasmafraktionen aftages med en pipette og overføres til 2 ml sterile kryoialer med rundbund.
- Kryoialerne opbevares straks ved -80 °C i op til 2 uger.
2. Ekstraktion af plasmaprøverne
- Anbring en ekstraktionspatron inde i et 15 ml konisk centrifugerør med patronens ydre riller understøttet af rørets ydre riller.
- Aktivér cylinderampullen ved først at føre 5 ml 100% methanol og derefter 10 ml ultrarent vand gennem cylinderampullen.
- Når væske ledes gennem patronen via tyngdekraftsdrevet flow, samles det i røret.
- Smid overskydende væske ud, da det akkumuleres for at sikre, at væsken ikke opsluger patronen.
- Sørg for, at cylinderampullen ikke tørrer under forsøget.
- 250 μL plasma fortyndes med 750 μL 4% eddikesyre.
- Før 1 ml plasma- og eddikesyreopløsningen langsomt gennem cylinderampullen.
BEMÆRK: Dette trin skal tage ca. 30 s via tyngdekraftsdrevet flow for hver milliliter passeret. - Vask cylinderampullen med 10 ml 4% eddikesyre. Som tidligere gjort skal du smide overskydende væske ud, da den akkumuleres for at sikre, at væsken ikke opsluger patronen.
- Når den sidste dråbe eddikesyre er frigivet fra cylinderampullen, skal du fjerne cylinderampullen fra røret og placere den i et nyt 15 ml konisk centrifugeglas.
- Forbered en 10:1 opløsning af 100% methanol og 4% eddikesyre ved at blande 2,7 ml 4% eddikesyre og 0,3 ml 100% methanol. Brug dette til at eluere CGRP ved at føre denne opløsning gennem cylinderampullen 1 ml ad gangen. Hold pause i 25 minutter mellem hver milliliter opløsning, der passeres. Smid IKKE elueringsmidlet ud.
- Røret vil indeholde 3 ml elueret væske 25 minutter efter, at den sidste milliliter af methanol- og eddikesyreopløsningen er passeret. Hver 1 ml elueringsmiddel anbringes i et 1,7 ml mikrocentrifugeglas.
BEMÆRK: Dette skulle give tre mikrocentrifugerør fra hver patron. - Hvert rør anbringes i en minicentrifuge i 1 s for at sikre, at alt elueringsmidlet er i bunden af hvert rør.
- Alle prøverne tørres ved vakuumcentrifugering ved 4 °C (indstillet til koncentratorfunktion for vandige opløsninger ved 1.400 o/min.; g-kraften varierer afhængigt af glassenes position og varierer derfor fra 130-250 x g).
BEMÆRK: Den tid, det tager for vakuumcentrifugen at tørre prøverne, afhænger af den anvendte type mikrocentrifugerør. - Umiddelbart før analyseproceduren (trin 4.1) rekonstitueres den tidligere tørrede prøve med enzymimmunoassay (EIA) buffer (se materialetabellen), optøet til stuetemperatur (RT) eller 20 °C.
BEMÆRK: Den mængde VVM-buffer, der anvendes til at rekonstituere den tørrede prøve, skal være lig med det oprindelige prøvevolumen eller 250 μL.
3. Klargøring af ELISA-pladen - blokering for at begrænse uspecifik binding
- Der tilsættes 250 μL tris-bufret saltvand (TBS)/fiskegelatineblokerende buffer til hvert hul på pladen.
- Der anbringes et dækark over pladen og inkuberes i 2 timer ved RT.
- Fjern dækpladen, og tøm pladen ved invertering eller aspiration ved hjælp af en multikanalpipette. Tør derefter pladen på et køkkenrulle for at kassere ethvert spor af væske.
- Tør pladen ved at lade pladen stå i en laminar strømningshætte i 10 min.
- Når pladen er synligt tør, anbringes den i en grebsforseglet foliepose med et silicageltørremiddelbrev, og posen opbevares ved -20 °C i 24 timer.
BEMÆRK: Pladerne skal anvendes inden for 4 uger efter pladeinkubation.
4. Forud for analyseproceduren
- Forbered reagenser (VVM-buffer, CGRP-standard, CGRP-kvalitetskontrol, CGRP-sporstof, vaskebuffer) i henhold til kitinstruktionerne. Forbered Ellmans reagens først efter 16-20 timers inkubationsperioden slutter.
- Optø alle prøver og reagenser til RT, før resten af protokollen udføres.
5. Procedure for analyse
- Hvert hul skylles i den blokerede plade fem gange med en vaskebuffer (300 μL/hul). For hver skylning skal du holde pause 30 s efter anbringelse af vaskebufferen i brøndene og derefter smide væsken eller aspirere ud ved hjælp af en multikanalpipette.
- Efter den sidste skylning fjernes al bufferen fra hullerne ved invertering (invertering af pladen for at udvise væsken i hullerne) eller aspiration ved hjælp af en multikanalpipette. Blot de sidste dråber på et køkkenrulle og bank på den omvendte plade, indtil al væsken er synligt fjernet fra brøndene.
- Der afsættes mindst to huller uden reagenser eller buffer, der kaldes "blindhuller". Derefter afsættes mindst to andre brønde til ikke-specifik binding (NSB).
- Dispenser 100 μL VVM-buffer i hver NSB-brønd.
- 100 μL CGRP-standarderne fordeles i to eksemplarer i passende huller.
- Der udleveres 100 μL prøver (rekonstitueret i VVM-buffer) og kvalitetskontrol i to eksemplarer i passende brønde.
- Dispenser 100 μL CGRP-sporstof (anti-CGRP-antistof bundet til acetylcholinesterase) til hvert hul, der indeholder NSB, CGRP-standarder, prøver og kvalitetskontrol. Dispenser ikke sporstof til "Blank" hullerne.
- Pladen dækkes med en klar dækplade, der forsegler hvert hul, således at prøverne og reagenserne i hvert hul ikke fordamper signifikant. Pladen inkuberes i 16-20 timer ved 4 °C.
- Når inkubationen er afsluttet, skal du rekonstituere Ellmans reagens i henhold til kitinstruktionerne.
- Vend pladen om for at fjerne al væske. Hvert hul (som beskrevet ovenfor) skylles tre gange med 300 μL vaskebuffer.
- Efter den tredje skylning fjernes væsken fra pladerne, placeres pladen på en rysteplade og rystes ved 120 o / min i 2 minutter.
- Vask pladen yderligere tre gange. Efter den sidste skylning fjernes al buffer fra hullerne ved invertering eller aspiration ved hjælp af en multikanalpipette. Blot de sidste dråber væske på et køkkenrulle og bank på den omvendte plade, indtil al væsken er synligt fjernet fra brøndene.
BEMÆRK: De yderligere tre vaske, der er beskrevet i dette trin, er muligvis ikke nødvendige, hvis du bruger en ELISA-mikropladevasker. - Der hældes 200 μL af Ellmans reagens i hvert hul (ekskl. "Blank"-hullerne).
- Dæk pladen med et nyt dækark og pakk den ind i aluminiumsfolie for at forhindre lyseksponering. Inkuber i mørke ved RT i 1 time.
- Sørg for, at der ikke er væske på bagsiden af pladen, der kan forvirre spektrofotometeraflæsningen ved at tørre bagsiden af med et tørt køkkenrulle.
- Absorbanspladen aflæses ved 405 nm (gul farve).
6. Analyse af data
- Den gennemsnitlige absorbans beregnes for hver "blindprøve", NSB, standard, kvalitetskontrol og prøver.
- Træk NSB's gennemsnitlige absorbansværdier fra standard-, kvalitetskontrol- og prøveabsorbansværdierne.
- Afbildningsabsorbans på y-aksen og koncentration på x-aksen. Konstruer en standardkurve ved hjælp af en logistisk regressionsmodel med fire parametre.
- Når kurven er konstrueret, skal du bruge kurvens ligning til at bestemme de interpolerede koncentrationer til kvalitetskontrol og prøver, som kan læses på x-aksen.
BEMÆRK: Standardkurven valideres kun, hvis den beregnede interpolerede koncentration for kvalitetskontrol ligger inden for 25 % af den forventede koncentration (normalt 125 pg/ml, men se etiketten på hætteglasset med kvalitetskontrol).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der er flere vigtige trin i protokollen, der bør fremhæves. For det første skal aprotinin, en serinproteasehæmmer, tilsættes til fuldblodprøver umiddelbart efter indsamling for at forhindre yderligere enzymatisk nedbrydning af CGRP. Serinproteaser har vist sig at spille en rolle i CGRP-metabolisme, og en tidligere undersøgelse har også brugt aprotinin til kvantificering af CGRP hos mennesker21,35. Hvis proteasehæmmere ikke anvendes, og prøveforberedelsen tager længere tid end 60 minutter, kan man forvente nedsatte niveauer af CGRP ved udførelse af ELISA. For det andet koncentrerer fastfaseekstraktion før ELISA CGRP i elueringsmidlet og eliminerer potentielt interfererende molekyler fra plasmamatrixen. Dette ekstraktionstrin øger udbyttet af CGRP i spike- og genopretningseksperimenter (yderligere diskuteret i næste afsnit). Vakuumcentrifugering i et kølerum efter ekstraktion begrænser yderligere tabet af CGRP. For det tredje skal mikrotiterpladerne blokeres ved hjælp af en blokerende buffer inden ELISA. Dette muliggør passiv adsorption af ikke-specifikke proteiner i bufferen til de resterende bindingssteder i pladerne, hvilket reducerer baggrundssignalet. Blokering hjælper med at reducere urealistisk høje udbytter af CGRP.
Spike- og genvindingseksperimenter bestemmer, om CGRP-detektion påvirkes af forskellene mellem standardkurvefortyndingsmidlet (her VVM-buffer) og eksperimentel prøvematrix (her plasma). Plasma og/eller serum kan indeholde molekyler, der blokerer antistofbinding til CGRP eller nedbryder peptidet og dermed forstyrrer assayets evne til at detektere og kvantificere startkoncentrationen af CGRP nøjagtigt. Til dette formål tilføjede vi kendte mængder CGRP til plasmaprøver - "spiking" -trinnet - og beregnede, hvor meget CGRP der blev "genvundet" efter ekstraktion og ELISA. CGRP-materialet blev købt hos producenten og opbevaret i en -20 °C fryser indtil brug.
Ved linearitet af fortyndingstest fortyndes en prøve serielt, og koncentrationerne af CGRP beregnes for hver fortynding. Hvis de fortyndede prøver ikke udviser passende lineære fald i CGRP-koncentrationen, tyder dette på, at VVM-bufferen eller plasmaet interfererer med påvisningen af CGRP ved nogle koncentrationer, eller at standardkurven ikke er nøjagtig i det område, der påvirkes. Ved udførelsen af det ovenfor beskrevne spike- og genopretningseksperiment fortyndede vi serielt de "spikede" prøver; vi spikede en plasmaprøve for at give en koncentration af CGRP på 200 pg / ml og fortyndede derefter prøven til 100 pg / ml og derefter 50 pg / ml.
Plasmaprøver fra tre deltagere uden tidligere kardiovaskulær, respiratorisk eller nylig hovedpine eller neurologiske symptomer blev spiket med forskellige koncentrationer af CGRP. Protokollen blev kørt for disse prøver ud over ikke-spikede kontrolprøver. Figur 1 viser et eksempel på et pladekort for spike og genfinding og linearitet af fortyndingseksperimenter. En logistisk tilpasning med fire parametre blev udført for at skabe en standardkurve, der tillod tilpasning ud over det lineære område (tabel 1 og figur 2). Genfindingsprocenterne blev beregnet for hver stikprøve med tilsætning og lå inden for det acceptable interval (tabel 2). Fortyndingens linearitet blev påvist i de spikede prøver (figur 3). Tabel 3 viser resultater opnået fra et mislykket spike- og genvindingseksperiment, der blev udført efter fabrikantens anvisninger og før medtagelsen af de tilføjede trin til blokering af ikke-specifik binding. Disse data viser genfindingsprocenter, der overstiger den øvre grænse på 125%, hvilket indikerer tilstedeværelsen af ikke-specifik binding. Efter at have tilføjet trinene i protokollen for at blokere pladen ved hjælp af en blokerende buffer (trin 3.1-3.5), var vi i stand til at reducere denne effekt og opnå acceptable genfindingsværdier (tabel 2). Hos tre patienter uden migræne eller vestibulære symptomer fandt vi, at den gennemsnitlige koncentration af CGRP i plasma var 1,68 ± 0,13 pg/ml. Fremtidige forsøg bør sigte mod at udnytte den nuværende metode i større skala af kontrolpatienter.
Figur 1: Eksempel på pladekort. Hver plade skal indeholde standarder, prøver, emner og NSB-brønde, alt sammen i to eller tre eksemplarer. Tomme brønde bør ikke indeholde væske, og NSB-brønde bør indeholde proprietær enzymimmunoassaybuffer, enzymbundet sekundært antistof og Ellmans reagens. De gennemsnitlige absorbansværdier for NSB-brøndene bør trækkes fra absorbansværdierne for standarden, før standardkurven oprettes. De gennemsnitlige absorbansværdier for NSB-brøndene bør også trækkes fra absorbansværdierne for prøverne, inden genvindingsprocenten beregnes. Der er ingen effekt af pladeposition. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksempel på en fire-parameter logistisk (4PL) regressionsstandardkurve. Denne standardkurve beskrives matematisk ved en ligning i en form, der ligner den, der ses i tabel 1. En 4PL regressionskurve passer bedre til biologiske systemer sammenlignet med lineære kurver. Denne kurve og ligning bruges til at interpolere kvalitetskontrol og prøver på samme plade, som standarden blev oprettet på. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Linearitet af fortyndingslinjediagram, der viser prøver spiket ved 200 pg / ml og derefter serielt fortyndet 1: 2 og 1: 4. Disse data viser linearitet over en lang række fortyndinger, hvilket indikerer, at analysemetoden er nøjagtig på tværs af en lang række CGRP-koncentrationer. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Parameter | Værdi |
| X50 | 294.75 |
| Ligning |  |
| Ligning form |  |
Tabel 1: Eksempel på afour-parameter logistisk (4PL) regressionsstandardkurveligning med titere X50. En 4PL regressionskurve tager højde for den kompleksitet, der ses i biologiske systemer. Denne kurve blev brugt til at analysere resultaterne af ELISA, da den er mere egnet end lineær regression.
| Absorbans (OD) | Interpoleret koncentration (pg/ml) | Procent udbytte | |
| Kontrol uden spids | -0.0434 | Falder ikke på kurve (dvs. ~0) | |
| Spiked ved 200 pg / ml | 0.2712 | 214,7 ± 23,4 | 107.40% |
| Spidset ved 100 pg / ml | 0.0966 | 102,7 ± 2,35 | 102.70% |
| Spidset ved 50 pg/ml | 0.0205 | 55,1 ± 12,65 | 110.20% |
Tabel 2: Resultater af et vellykket spike- og genopretningseksperiment med tre kontroldeltagere på grund af mangel på fastfaseekstraktion og pladeblokering. Procentdelen af udbyttet for spikede prøver faldt alle inden for 20% af det ideelle 100% udbytte, hvilket indikerer, at CGRP-detektion ikke påvirkes af plasmaets eksperimentelle prøvematrix.
| Absorbans (OD) | Interpoleret koncentration (pg/ml) | Procent udbytte | |
| Kontrol uden spids | -0.2087 | Falder ikke på kurve (dvs. ~0) | |
| Spiked ved 200 pg / ml | 2.371 | 264,2 ± 104 | 132.10% |
| Spidset ved 100 pg / ml | 1.134 | 167,5 ± 31,2 | 167.50% |
| Spidset ved 50 pg/ml | 0.3218 | 80.55 ± 4.54 | 161.10% |
Tabel 3: Resultater af et mislykket spike- og restitutionseksperiment med tre kontroldeltagere på grund af manglende pladeblokering. Procentdelen af udbyttet for spikede prøver faldt alle langt over den øvre grænse på 120% udbytte, hvilket indikerer, at analysen kan være ødelagt af NSB. Efter at have opnået disse resultater tilføjede vi trin 3.1-3.5 i protokollen for at blokere NSB på pladen før analysen.
| Absorbans (OD) | Interpoleret koncentration (pg/ml) | Procent udbytte | |
| Kontrol uden spids | 0.0401 | 12.93 | |
| Spidset ved 100 pg / ml | 0.0315 | 10.17±2.31 | 10.17% |
| Spidset ved 50 pg/ml | 0.0152 | 4.895±15.4 | 9.79% |
| Spidset ved 25 pg / ml | 0.0007 | 0,2177±6,43 | 0.87% |
Tabel 4: Resultater af et mislykket spike- og restitutionseksperiment med tre kontroldeltagere. Udbytteprocenten for spikede prøver faldt alle et godt stykke under den nedre grænse på 80% udbytte, hvilket indikerer, at der var behov for yderligere optimering for at imødegå mulig nedbrydning og konkurrencedygtige bindingsprocesser. Disse resultater er fra en anden producents konkurrencedygtige ELISA-assay med en nedre detektionsgrænse på 2,23 pg/ml og intra-assay cv < 10% og inter-assay cv < 12%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikel beskrives en valideret protokol, der muliggør påvisning og kvantificering af CGRP i humant plasma. Denne protokol blev syntetiseret, efter at kommercielle CGRP ELISA-sæt viste sig ikke nøjagtigt at kvantificere dette molekyle. Efter etablering af en prøveforberedelsesprotokol og en gyldig standardkurve viste spike og genfinding og linearitet af fortyndingseksperimenter, at procentdelen af genvindinger var meget lavere end forventet. Lignende resultater blev fundet ved hjælp af et andet kommercielt CGRP ELISA-sæt (tabel 4). Til reference er den bredt accepterede standardgendannelse 80-120%36. Disse resultater kan tyde på tilstedeværelsen af proteaseaktivitet, der nedbryder CGRP21,22,23,24, andre molekyler, der binder til CGRP, hvilket begrænser dets tilgængelighed til binding til pladens antistoffer eller kompetitiv binding af ikke-målproteiner til pladens antistoffer.
For at kontrollere for disse mulige confoundere blev en ekstraktionsprotokol optimeret til at rense plasma gennem ekstraktion med en proprietær sorbent før ELISA. Denne sorbent isolerer tilsyneladende polære molekyler, såsom CGRP. For at bestemme ekstraktionens effektivitet før ELISA blev humane plasmaprøver tilsat kendte koncentrationer af CGRP som positive kontroller ekstraheret og derefter ELISA. Disse spikede prøver gav kun ~ 50% -60% genopretning. Disse resultater indikerede, at eksogent tilsat CGRP ikke påvises i plasma, som man kunne forvente.
Forskellige andre trin i protokollen blev optimeret: tilsætning af serinproteasehæmmer til fuldblodsprøver før centrifugering for at hæmme nedbrydning21, sænkning af vakuumcentrifugeringstemperaturen efter ekstraktion og justering af resuspensionsmetoder efter centrifugering. Et spike- og genopretningseksperiment efter disse ændringer afslørede urealistisk høje CGRP-koncentrationer, en genopretning på mere end 120% (tabel 3). Det er betryggende, at der også for nylig blev rapporteret højere værdier end forventet efter ekstraktion ved hjælp af et lignende assay af Messlinger et al.37, hvilket indikerer, at dette fortsat er et problem. Messlinger et al. erkender, at analysen efter plasmaekstraktion ikke reproducerer realistiske CGRP-koncentrationer, uden at give en grund til dette fænomen37.
Vi antog, at restbindingskapaciteten på ELISA-mikrotiterpladerne, der forårsager ikke-specifik binding, kan være ansvarlig for de høje genvindingshastigheder. Før ELISA blev pladen inkuberet med en blokerende buffer, TBS/fiskegelatinebuffer, for at reducere denne bindingskapacitet. Dette yderligere trin resulterede i mere hensigtsmæssige inddrivelsesprocenter (tabel 2). Således forbliver de ændringer og optimeringer, der er diskuteret ovenfor, herunder brugen af blokeringsbufferen, kritiske trin i protokollen. Disse trin har givet mulighed for en lavere detektionsgrænse på 1,05 pg/ml sammenlignet med den oprindelige producents sæt, der er angivet som 2 pg/ml.
Med hensyn til fejlfinding kræver trin 2.10 vakuumcentrifugering for at tørre elueringsmidlet. Længden af dette trin er blevet observeret at variere afhængigt af typen af mikrocentrifugerør, som prøverne er i. Ved hjælp af mikrocentrifugerørene beskrevet i materialetabellen varer dette trin normalt 5 timer. Men når der anvendes alternative mikrocentrifugerør med større volumener, kan dette trin vare op til 11 timer. Et alternativ til vakuumcentrifugering kan være frysetørring eller frysetørring af prøverne, hvilket ville kræve, at prøverne fryses efter ekstraktion. Imidlertid blev lyofilisering ikke testet i konstruktionen af denne protokol. Hvis der systematisk findes lavere koncentrationer af CGRP end forventet, bør det desuden sikres, at alle reagenser, især antistofferne, optøes til stuetemperatur før brug. Ustabiliteten af reagenser, såsom antistof- og sporstofopløsningerne, kan bidrage til systematiske fejl i bindingen af CGRP. Hvis udbyttet fortsat er utilstrækkeligt, kan antistofbindingen mod CGRP påvirkes af elueringsmidlets relative surhedsgrad (methanol og eddikesyreopløsning) på trods af rekonstitution med buffer. I dette tilfælde vil et pH-korrektionstrin være en logisk tilføjelse efter rekonstitution med buffer.
Begrænsningerne i denne protokol omfatter de begrænsninger, der er forbundet med enhver ELISA-metode, specifikt antistofustabilitet38. Antistoffereagenser skal optøs til stuetemperatur før brug i analysen; opvarmning i en længere periode kan dog forårsage denaturering og en følgelig nedsat effektivitet i binding af CGRP. Derudover kan CGRP undergå nedbrydning af en række ikke-serinproteaser, hvilket fører til øgede falske negative resultater. Selvom denne protokol begrænser nedbrydning ved at tilføje en serinprotease og begrænse prøvebehandlingstiden til mindre end 60 minutter, kan nedbrydning stadig forekomme. En anden begrænsning er manglen på testede fryse-optøningscyklusser. Lee et al.39 viste, at fryse-optøningscyklusser kan øge eller mindske serum- og plasmaproteinmængder, afhængigt af proteinets modtagelighed. CGRP's modtagelighed for fryse-optøningscyklusser er ikke blevet fuldt testet i litteraturen, selvom Messlinger et al. har bemærket, at niveauerne af CGRP falder efter en cyklus med frysning og optøning37. Yderligere, denne protokols udbytte kan drage fordel af brugen af protein LoBind-rør, designet med en hydrofil overflade, hvilket fører til forbedret proteingenvinding.
Vi bemærker, at disse valideringseksperimenter ikke syntes at være udført af forfattere af nylige undersøgelser, der kvantificerede CGRP i humant plasma 16,18,35,40,41. En gennemgang af ELISA-metoden foretaget af Messlinger et al.37 understreger behovet for sådanne kontroller og sætter spørgsmålstegn ved undersøgelser, der ikke har anvendt dem. Vi mener, at vores arbejde med at validere og standardisere en protokol vil give fremtidig CGRP-forskning et bedre grundlag. Implikationerne af en sådan protokol er vidtrækkende og kan teoretisk udvides til at undersøge biomarkørstatus for CGRP i neurologiske og ikke-neurologiske sygdomsprocesser 2,25,26,27,28,29,30,31,32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen yderligere oplysninger at tilføje.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Robert N. Cole, Lauren R. DeVine og Marcos Iglesias for deres nyttige diskussioner vedrørende denne protokol. Dette blev delvist støttet af finansiering fra American Otological Society (Fellowship Grant, PSK), American Hearing Research Foundation (90066548/90072266, JPC) og National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), en del af National Institutes of Health (NIH) og NIH Roadmap for Medical Research (UL1 TR003098, NSF). Publikationens indhold er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis den officielle opfattelse af Johns Hopkins ICTR, NCAT eller NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube | Sorenson Bioscience, Inc. | 11510 | |
| 99% methanol | ThermoFisher Scientific | L13255.0F | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-959-49B | |
| 2 mL round bottom sterile cryovials | CRYO.S | 122263 | |
| 4% acetic acid | ThermoFisher Scientific | 035572.K2 | |
| 6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube | BD | 367863 | |
| Allegra 64R benchtop centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 367586 | |
| Aprotinin | VWR | 76344-814 | |
| CGRP (human) ELISA kit | Bertin Bioreagent | A05481 | |
| CGRP stock | Bertin Bioreagent | ||
| EIA Buffer | Bertin Bioreagent | A07000 | |
| Ellman's Reagent | Bertin Bioreagent | A09000_49+1 | |
| Multichannel pipettes | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges | Waters | WAT094226 | |
| Orbital Shaker | Bellco | 7744-01010 | |
| Precision micropipettes | ThermoFisher Scientific | F144055MG | |
| SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader | Molecular Devices | Part Number M2 | |
| TBS/Fish Gelatin | Bioworld, from Fischer Scientific | 50-199-167 | |
| Ultrapure water ELISA Grade | Bertin Bioreagent | A07001 | |
| Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator | Eppendorf | 22820109 | |
| Wash Buffer | Bertin Bioreagent | A17000 |
References
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. -J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
- Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., McCulloch, J., Uddman, R. Calcitonin gene-related peptide and cerebral blood vessels: distribution and vasomotor effects. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 7 (6), 720-728 (1987).
- Donnerer, J., Stein, C. Evidence for an increase in the release of CGRP from sensory nerves during inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 657, 505-506 (1992).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
- Markowitz, S., Saito, K., Moskowitz, M. A. Neurogenically mediated leakage of plasma protein occurs from blood vessels in dura mater but not brain. The Journal of Neuroscience. 7 (12), 4129-4136 (1987).
- Saito, K., Markowitz, S., Moskowitz, M. A. Ergot alkaloids block neurogenic extravasation in dura mater: proposed action in vascular headaches. Annals of Neurology. 24 (6), 732-737 (1988).
- Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
- Cady, R. K., Vause, C. V., Ho, T. W., Bigal, M. E., Durham, P. L. Elevated saliva calcitonin gene-related peptide levels during acute migraine predict therapeutic response to rizatriptan. Headache. 49 (9), 1258-1266 (2009).
- Cernuda-Morollón, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
- Messlinger, K. The big CGRP flood-sources, sinks and signalling sites in the trigeminovascular system. The Journal of Headache and Pain. 19, 22 (2018).
- Ochoa-Callejero, L., et al. Circulating levels of calcitonin gene-related peptide are lower in COVID-19 patients. Journal of the Endocrine Society. 5 (3), (2021).
- Rizzi, M., et al. CGRP plasma levels correlate with the clinical evolution and prognosis of hospitalized acute COVID-19 patients. Viruses. 14 (10), 2123 (2022).
- Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
- Sarchielli, P., et al. Clinical-biochemical correlates of migraine attacks in rizatriptan responders and non-responders. Cephalalgia. 26 (3), 257-265 (2006).
- Greco, R., et al. Plasma levels of CGRP and expression of specific microRNAs in blood cells of episodic and chronic migraine subjects: towards the identification of a panel of peripheral biomarkers of migraine. The Journal of Headache and Pain. 21 (1), 122 (2020).
- Tvedskov, J. F., et al. No increase of calcitonin gene-related peptide in jugular blood during migraine. Annals of Neurology. 58 (4), 561-568 (2005).
- Pellesi, L., et al. Plasma levels of CGRP during a 2-h infusion of VIP in healthy volunteers and patients with migraine: An exploratory study. Frontiers in Neurology. 13, 871176 (2022).
- Kruuse, C., Iversen, H. K., Jansen-Olesen, I., Edvinsson, L., Olesen, J. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) levels during glyceryl trinitrate (GTN)-induced headache in healthy volunteers. Cephalalgia. 30 (4), 467-474 (2010).
- Kraenzlin, M. E., Ch'ng, J. L., Mulderry, P. K., Ghatei, M. A., Bloom, S. R. Infusion of a novel peptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP) in man. Pharmacokinetics and effects on gastric acid secretion and on gastrointestinal hormones. Regulatory Peptides. 10 (2-3), 189-197 (1985).
- Brain, S. D., Williams, T. J. Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene-related peptide. Nature. 335 (6185), 73-75 (1988).
- Kim, Y. -G., Lone, A. M., Nolte, W. M., Saghatelian, A. Peptidomics approach to elucidate the proteolytic regulation of bioactive peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8523-8527 (2012).
- Katayama, M., et al. Catabolism of calcitonin gene-related peptide and substance P by neutral endopeptidase. Peptides. 12 (3), 563-567 (1991).
- Hartopo, A. B., et al. Endothelin-converting enzyme-1 gene ablation attenuates pulmonary fibrosis via CGRP-cAMP/EPAC1 pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 465-476 (2013).
- Mair, J., et al. Plasma CGRP in acute myocardial infarction. Lancet. 335 (8682), 168 (1990).
- Antúnez, C., et al. Calcitonin gene-related peptide modulates interleukin-13 in circulating cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive T cells in patients with atopic dermatitis. The British Journal of Dermatology. 161 (3), 547-553 (2009).
- Gangula, P. R., et al. Pregnancy and steroid hormones enhance the vasodilation responses to CGRP in rats. The American Journal of Physiology. 276 (1), H284-H288 (1999).
- Hernanz, A., Medina, S., de Miguel, E., Martín-Mola, E. Effect of calcitonin gene-related peptide, neuropeptide Y, substance P, and vasoactive intestinal peptide on interleukin-1beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha production by peripheral whole blood cells from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Regulatory Peptides. 115 (1), 19-24 (2003).
- Takeba, Y., Suzuki, N., Kaneko, A., Asai, T., Sakane, T. Evidence for neural regulation of inflammatory synovial cell functions by secreting calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal peptide in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism. 42 (11), 2418-2429 (1999).
- Ahmed, M., Srinivasan, G. R., Theodorsson, E., Schultzberg, M., Kreicbergs, A. Effects of surgical denervation on substance P and calcitonin gene-related peptide in adjuvant arthritis. Peptides. 16 (4), 569-579 (1995).
- Neugebauer, V., Rümenapp, P., Schaible, H. G. Calcitonin gene-related peptide is involved in the spinal processing of mechanosensory input from the rat's knee joint and in the generation and maintenance of hyperexcitability of dorsal horn-neurons during development of acute inflammation. Neuroscience. 71 (4), 1095-1109 (1996).
- Wang, L. H., et al. Serum levels of calcitonin gene-related peptide and substance P are decreased in patients with diabetes mellitus and coronary artery disease. The Journal of International Medical Research. 40 (1), 134-140 (2012).
- Zelissen, P. M., Koppeschaar, H. P., Lips, C. J., Hackeng, W. H.
- World Health Organization. WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. 3, Blood-sampling systems. World Health Organization. , Geneva. (2010).
- Raffaelli, B., et al. Plasma calcitonin gene-related peptide (CGRP) in migraine and endometriosis during the menstrual cycle. Annals of Clinical and Translational Neurology. 8 (6), 1251-1259 (2021).
- Andreasson, U., et al. A practical guide to immunoassay method validation. Frontiers in Neurology. 6, 179 (2015).
- Messlinger, K., et al. CGRP measurements in human plasma-a methodological study. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (13), 1359-1373 (2021).
- Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
- Lee, J. -E., Kim, S. Y., Shin, S. -Y. Effect of repeated freezing and thawing on biomarker stability in plasma and serum samples. Osong Public Health and Research Perspectives. 6 (6), 357-362 (2015).
- Fan, P. -C., Kuo, P. -H., Lee, M. T., Chang, S. -H., Chiou, L. -C. Plasma calcitonin gene-related peptide: A potential biomarker for diagnosis and therapeutic responses in pediatric migraine. Frontiers in Neurology. 10, 10 (2019).
- Raffaelli, B., et al. Change of CGRP plasma concentrations in migraine after discontinuation of CGRP-(receptor) monoclonal antibodies. Pharmaceutics. 15 (1), 293 (2023).
