Biochemistry

使用改良的酶联免疫吸附测定法检测和定量人血浆中的降钙素基因相关肽（CGRP）

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/64775

Pavan S. Krishnan^1,2, Fernando T. Zamuner^1,3, Carolyn M. Jenks¹, Johnny Y. Xie⁴, Lisa Zhang⁵, Mohammed Lehar¹, Neal S. Fedarko⁶, Mariana Brait^1,3, John P. Carey¹

¹Department of Otolaryngology-Head & Neck Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, ²Virginia Commonwealth University School of Medicine, ³Department of Oncology, The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, ⁴Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, University of Michigan Medical School, ⁵Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, The Ohio State University College of Medicine, ⁶ICTR Clinical Research Core Laboratory, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

关于人血浆中降钙素基因相关肽（CGRP）浓度的已发表数据不一致。这些不一致可能是由于缺乏标准化的，经过验证的方法来量化这种神经肽。在这里，我们描述了一种经过验证的酶联免疫吸附测定（ELISA）方案，用于纯化和定量人血浆中的CGRP。

Abstract

降钙素基因相关肽（CGRP）是一种血管活性神经肽，在偏头痛的病理生理学中起假定作用，可能是生物标志物状态的候选者。CGRP 在激活时从神经元纤维中释放出来，并在接受三叉神经传出神经支配的脉管系统中诱导无菌神经源性炎症和动脉血管舒张。外周脉管系统中CGRP的存在促使人们使用蛋白质组学测定（例如酶联免疫吸附测定（ELISA））检测和定量人血浆中的这种神经肽的研究。然而，其6.9 min的半衰期和测定方案技术细节的可变性（通常未完全描述）在文献中产生了不一致的CGRP ELISA数据。本文介绍了一种改进的ELISA方案，用于人血浆中CGRP的纯化和定量。程序步骤包括样品收集和制备、使用极性吸附剂作为纯化手段的提取、阻断非特异性结合的额外步骤以及通过 ELISA 进行定量。此外，该方案已通过加标和回收率以及稀释实验的线性进行了验证。从理论上讲，这种经过验证的方案可用于量化个体血浆中的CGRP浓度，不仅是偏头痛，还包括CGRP可能起作用的其他疾病。

Introduction

降钙素基因相关肽（CGRP）是一种37个氨基酸的神经肽，存在于具有血管周围定位的神经元纤维以及非神经元组织中。CGRP的两种形式，α-和β-CGRP，具有90%以上的同源性，并具有相同的生理功能;然而，αCGRP存在于中枢和周围神经系统中，而βCGRP存在于肠道神经系统¹^，²中。在伤害感受器激活和钙依赖性胞吐作用后，CGRP 从神经元释放，诱发涉及动脉血管扩张和血浆蛋白外渗的无菌神经源性炎症³，⁴，⁵，⁶^，⁷。从这里开始，CGRP出现在毛细血管后血管中，可能是引起传入伤害性激活的疾病的生物标志物，例如偏头痛⁸，⁹，¹⁰^，¹¹。值得注意的是，CGRP还通过其在血管生成和免疫调节中的作用与COVID-19有关，并可能预测不利的疾病演变¹²^，¹³。因此，准确定量人血浆中CGRP的方案可能具有广泛的价值。

CGRP在偏头痛中的作用可能受到最多关注。基于临床前和临床研究，CGRP已被提出作为偏头痛的可能生物标志物和治疗靶标³，⁴，⁵，⁶，⁷，⁸^，9^，¹⁰。一些研究发现，相对于对照组受试者，发作性偏头痛队列中的CGRP升高¹⁰，¹⁴^，¹⁵。CGRP抑制剂在偏头痛治疗临床试验中的成功似乎表明CGRP升高是偏头痛的致病因素。然而，并非所有研究人员都证实了这些结果¹⁶，¹⁷，¹⁸^，¹⁹。此外，CGRP在偏头痛非头痛症状中的作用尚未阐明;目前的工作是出于了解CGRP在偏头痛前庭症状中的作用的愿望。

文献中CGRP免疫测定数据不一致可能是由于多种原因造成的。首先，由于丝氨酸蛋白酶21，胰岛素降解酶和其他金属蛋白酶22，中性内肽酶23和内皮素转换酶-1 24的活性，CGRP在外周脉管系统中的半衰期为6.9分钟²⁰。其次，用于量化CGRP的免疫测定的可变技术细节在此类研究中没有充分描述。最后，免疫测定方法缺乏标准化使情况更加复杂。

本文介绍了一种改进的酶联免疫吸附测定（ELISA）方案，该方案允许纯化和准确定量人血浆中的 α 和 βCGRP。该试剂盒的抗体与胰岛淀粉样蛋白、降钙素或P物质不发生交叉反应。该协议经过了必要的验证实验，例如加标和回收率以及稀释的线性，此处提供了其数据。这种经过验证的CGRP ELISA协议以前在文献中没有完全描述。该协议可用于量化偏头痛以及心脏病学²，^25，皮肤科26，产科27，风湿病学²⁸，²⁹，肌肉骨骼^30，31，内分泌32，³³和病毒性疾病¹²，¹³的背景下人血浆中的CGRP^，其中CGRP涉及。

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Protocol

该协议是使用来自约翰霍普金斯机构审查委员会（NA_00092491）批准同意的个人的人血浆样本开发的。

1. 样品采集和制备

通过标准静脉穿刺方法从肘前静脉收集 5 mL 全血³⁴ 到 6 mL 真空容器乙二胺四乙酸（EDTA）收集管中。
收集后向管中加入 0.5 mL 抑肽酶（10，000 KIU/mL）竞争性丝氨酸蛋白酶抑制剂，以阻断目标肽的裂解。将试管倒置10次，使抑肽酶与血液充分混合。之后，将试管存放在冰上，直到下一步。
在采血后60分钟内以604× g 离心管在4°C下离心4分钟。
用移液管取出血浆级分并转移到 2 mL 圆底无菌冷冻管中。
立即将冷冻管在-80°C下储存长达2周。

2. 血浆样品的提取

将提取盒放入 15 mL 锥形离心管内，柱的外脊由管的外脊支撑。
首先通过 5 mL 100% 甲醇，然后通过 10 mL 超纯水通过滤芯来激活滤芯。
1. 当流体通过重力驱动的流动通过滤芯时，它将聚集在管中。
2. 在积聚时倒出多余的液体，以确保液体不会吞没墨盒。
3. 确保小柱在实验过程中不会干燥。
用 750 μL 4% 乙酸稀释 250 μL 血浆。
将 1 mL 血浆和乙酸溶液缓慢通过墨盒。
注意：每毫升通过重力驱动流 ，此步骤 大约需要 30 秒。
用 10 mL 4% 乙酸清洗墨盒。如前所述，在积聚时扔掉多余的液体，以确保液体不会吞没墨盒。
最后一滴乙酸从滤芯中释放出来后，从管中取出滤芯并将其放入新的 15 mL 锥形离心管中。
通过混合 2.7 mL 4% 乙酸和 0.3 mL 100% 甲醇制备 100% 甲醇和 4% 乙酸的 10：1 溶液。使用此功能通过一次将溶液通过小柱 1 mL 来洗脱 CGRP。在每毫升溶液通过之间暂停25分钟。不要扔掉淋洗液。
在最后一毫升甲醇和乙酸溶液通过后25分钟，试管将包含3mL洗脱液。将每 1 mL 洗脱液放入 1.7 mL 微量离心管中。
注意：这应该从每个滤芯中产生三个微量离心管。
将每个试管放入小型离心机中1秒，以确保所有淋洗液都在每个试管的底部。
通过4°C真空离心干燥所有样品（设置为浓缩器功能，对于水溶液，在1，400rpm下;g力根据管的位置而变化，因此范围为130-250× g）。
注意：真空离心机干燥样品所需的时间取决于所使用的微量离心管的类型。
在进行测定程序（步骤4.1）之前，立即用酶免疫测定（EIA）缓冲液（参见 材料表）解冻至室温（RT）或20°C重新配制先前干燥的样品。
注意：用于复溶干燥样品的EIA缓冲液体积应等于原始样品体积或250μL。

3.ELISA板的制备 - 封闭以限制非特异性结合

向板上的每个孔中加入 250 μL 三缓冲盐水（TBS）/鱼明胶封闭缓冲液。
将盖板放在板上，并在室温下孵育2小时。
取下盖板并使用多通道移液器倒置或抽吸清空板。然后，将盘子吸干在纸巾上以丢弃任何微量液体。
通过将板留在层流罩中10分钟来干燥板。
板明显干燥后，将其放入带有硅胶干燥剂袋的抓握密封箔袋中，并将袋子在-20°C下储存24小时。
注意：板应在板孵育后4周内使用。

4. 在检测程序之前

按照试剂盒说明制备试剂（EIA缓冲液，CGRP标准品，CGRP质量控制，CGRP示踪剂，洗涤缓冲液）。仅在16-20小时潜伏期结束后准备Ellman试剂。
在执行其余方案之前，将所有样品和试剂解冻至RT。

5. 检测程序

用试剂盒提供的洗涤缓冲液（300μL/孔）在封闭的板中冲洗每个孔五次。对于每次冲洗，将洗涤缓冲液放入孔中后暂停30秒，然后使用多通道移液器倒出液体或吸出物。
最终冲洗后，通过倒置（倒置板以排出孔内的液体）或使用多通道移液器抽吸从孔中取出所有缓冲液。将最后一滴吸干到纸巾上，然后轻敲倒置的板，直到所有液体都从孔中明显去除。
留出至少两个没有试剂或缓冲液的孔，称为“空白”孔。然后，留出至少两个其他孔用于非特异性结合（NSB）。
将 100 μL EIA 缓冲液分配到每个 NSB 孔中。
将 100 μL CGRP 标准品一式两份分配到适当的孔中。
将 100 μL 样品（在 EIA 缓冲液中复溶）和质量控制一式两份分配到适当的孔中。
将 100 μL CGRP 示踪剂（附着在乙酰胆碱酯酶上的抗 CGRP 抗体）分配到每个含有 NSB、CGRP 标准品、样品和质控的孔中。不要将示踪剂分配到“空白”孔中。
使用透明盖板盖住板，密封每个孔，使每个孔中的样品和试剂不会显着蒸发。将板在4°C孵育16-20小时。
孵育完成后，按照试剂盒说明重新配制Ellman试剂。
倒置板以除去所有液体。用 300 μL 洗涤缓冲液冲洗每个孔（如上所述）三次。
第三次冲洗后，从平板上除去液体，将板放在振动板上，并以120rpm摇动2分钟。
再洗盘子三次。最后一次冲洗后，使用多通道移液器倒置或抽吸从孔中取出所有缓冲液。将最后一滴液体吸干到纸巾上，轻敲倒置的板，直到所有液体都明显地从孔中取出。
注意：如果使用ELISA微孔板清洗机，则可能不需要此步骤中描述的额外三次洗涤。
将 200 μL 埃尔曼试剂分配到每个孔中（不包括“空白”孔）。
用新的盖板盖住板，并用铝箔包裹，以防止任何光线照射。在室温下在黑暗中孵育1小时。
用干纸巾擦拭背面，确保板背面没有液体可能会混淆分光光度计读数。
读取板在405nm处的吸光度（黄色）。

6. 数据分析

计算每个“空白”，NSB，标准品，质量控制和样品的平均吸光度。
从标准品、质量控制和样品吸光度值中减去NSB平均吸光度值。
在y轴上绘制吸光度，在x轴上绘制浓度。使用四参数逻辑回归模型构建标准曲线。
构建曲线后，使用曲线的方程确定质量控制和样品的插值浓度，可以在x轴上读取。
注意：仅当计算出的质量控制插值浓度在预期浓度的25%以内（通常为125 pg/mL，但请参阅质控瓶的标签）时，才验证标准曲线。

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Representative Results

协议中有几个关键步骤应该强调。首先，抑肽酶（一种丝氨酸蛋白酶抑制剂）必须在收集后立即添加到全血样品中，以防止CGRP的进一步酶降解。丝氨酸蛋白酶已被证明在CGRP代谢中发挥作用，之前的一项研究也使用抑肽酶定量人类的CGRP²¹^，³⁵。如果不使用蛋白酶抑制剂，并且样品制备需要超过 60 分钟，那么在进行 ELISA 时可以预期 CGRP 水平降低。其次，在进行ELISA之前的固相萃取将CGRP浓缩在淋洗液中，并从血浆基质中消除潜在的干扰分子。该提取步骤提高了加标和回收率实验中CGRP的产量（下一节将进一步讨论）。提取后在冷藏室中进行真空离心进一步限制了CGRP的损失。第三，在进行ELISA之前，必须使用封闭缓冲液封闭微量滴定板。这允许缓冲液中的非特异性蛋白质被动吸附到板中剩余的结合位点，从而减少背景信号。阻塞有助于降低不切实际的高 CGRP 产量。

加标和回收率实验确定CGRP检测是否受到标准曲线稀释剂（此处为EIA缓冲液）和实验样品基质（此处为血浆）之间差异的影响。血浆和/或血清可能含有阻断抗体与CGRP结合或降解肽的分子，从而干扰测定准确检测和定量CGRP起始浓度的能力。为此，我们将已知量的CGRP添加到血浆样品中 - “加标”步骤，并计算了提取和ELISA后“回收”了多少CGRP。CGRP原液从制造商处获得并储存在-20°C冰箱中直至使用。

在稀释线性测试中，连续稀释样品，并计算每次稀释的CGRP浓度。如果稀释的样品在CGRP浓度中没有表现出适当的线性下降，则表明EIA缓冲液或血浆在某些浓度下干扰了CGRP的检测，或者标准曲线在受影响的范围内不准确。在进行上述加标和回收实验时，我们连续稀释了“加标”样品;我们加标血浆样品，得到200 pg/mL的CGRP浓度，然后将样品稀释至100 pg/mL，然后稀释至50 pg/mL。

来自三名没有心血管、呼吸系统或近期头痛或神经系统症状病史的受试者的血浆样本中加标了不同浓度的CGRP。除了未加标的对照样品外，还对这些样品运行了该方案。图1显示了用于加标和回收率以及稀释实验线性的板图示例。执行四参数逻辑拟合以创建允许超出线性范围的拟合的标准曲线（表 1 和 图 2）。计算每个加标样品的回收率，并在可接受的范围内（表2）。在加标样品中证明了稀释的线性（图3）。表3 显示了按照制造商的说明以及在包含阻断非特异性结合的附加步骤之前进行的不成功的加标和回收实验的结果。这些数据显示回收率超过125%的上限，表明存在非特异性结合。在协议中添加使用封闭缓冲液封闭板的步骤（步骤3.1-3.5）后，我们能够减少这种影响并达到可接受的回收值（表2）。在三名没有偏头痛或前庭症状的患者中，我们发现血浆中CGRP的平均浓度为1.68±0.13pg/mL。未来的实验应旨在将目前的方法用于更大规模的对照患者。

图 1：示例板图。每个板应包含标准品、样品、空白和 NSB 孔，一式两份或一式三份。空白孔应不含液体，NSB孔应包含专有的酶免疫测定缓冲液、酶联二抗和Ellman试剂。在创建标准曲线之前，应从标准品的吸光度值中减去NSB孔的平均吸光度值。在计算回收率之前，还应从样品的吸光度值中减去NSB孔的平均吸光度值。没有板位置的影响。请点击此处查看此图的大图。

图 2：四参数逻辑（4PL）回归标准曲线示例。 该标准曲线由与表1所示类似的方程在数学上描述。与线性曲线相比，4PL 回归曲线更适合生物系统。该曲线和方程式用于在创建标准品的同一板上插入质量控制和样品。请点击此处查看此图的大图。

图 3：稀释线性折线图显示以 200 pg/mL 加标的样品，然后以 1：2 和 1：4 连续稀释。 该数据显示了宽稀释范围内的线性，表明该测定方法在广泛的CGRP浓度范围内是准确的。请点击此处查看此图的大图。

参数	价值
X₅₀	294.75
方程
等式形式

表 1：滴度为_{X 50} 的四参数逻辑（4PL）回归标准曲线方程示例。 4PL回归曲线适应了生物系统中的复杂性。该曲线用于分析ELISA的结果，因为它比线性回归更合适。

	吸光度（外径）	插值浓度（皮克/毫升）	收益率百分比
无尖峰控制	-0.0434	不会落在曲线上（即~0）
加标浓度为 200 pg/mL	0.2712	214.7 ± 23.4	107.40%
加标浓度为 100 pg/mL	0.0966	102.7 ± 2.35	102.70%
加标浓度为 50 pg/mL	0.0205	55.1 ± 12.65	110.20%

表2：由于缺乏固相萃取和板封闭，三名对照参与者的成功加标和回收实验的结果。 加标样品的产率均在理想100%产率的20%以内，表明CGRP检测不受等离子体实验样品基质的影响。

	吸光度（外径）	插值浓度（皮克/毫升）	收益率百分比
无尖峰控制	-0.2087	不会落在曲线上（即~0）
加标浓度为 200 pg/mL	2.371	264.2±104	132.10%
加标浓度为 100 pg/mL	1.134	167.5± 31.2	167.50%
加标浓度为 50 pg/mL	0.3218	80.55 ± 4.54	161.10%

表3：由于缺乏板阻塞，三名对照参与者的尖峰和恢复实验失败的结果。 加标样品的得率百分比均远高于120%产率的上限，表明该测定可能被NSB破坏。获得这些结果后，我们在实验方案中添加了步骤3.1-3.5，以在测定前阻断平板上的NSB。

	吸光度（外径）	插值浓度（皮克/毫升）	收益率百分比
无尖峰控制	0.0401	12.93
加标浓度为 100 pg/mL	0.0315	10.17±2.31	10.17%
加标浓度为 50 pg/mL	0.0152	4.895±15.4	9.79%
加标浓度为 25 pg/mL	0.0007	0.2177±6.43	0.87%

表4：三名对照参与者的不成功的峰值和恢复实验的结果。 加标样品的产率均远低于80%产率的下限，表明需要进一步优化以解决可能的降解和竞争性结合过程。这些结果来自另一家制造商的竞争性 ELISA 测定，检测下限为 2.23 pg/mL，测定内 cv < 10%，测定间 cv < 12%。

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Discussion

本文介绍了一种经过验证的方案，可用于检测和定量人血浆中的CGRP。该协议是在发现商业CGRP ELISA试剂盒不能准确定量该分子后合成的。在建立样品制备方案和有效的标准曲线后，加标和回收率以及稀释实验的线性表明，回收率远低于预期。使用不同的商用CGRPELISA试剂盒也发现了类似的结果（表4）。作为参考，广泛接受的标准回收率为80-120%³⁶。这些结果可能表明存在降解CGRP²¹，^22，23，²⁴的蛋白酶活性，其他分子与CGRP结合，从而限制了其与板抗体结合的可用性^，或非靶标蛋白与板抗体的竞争性结合。

为了控制这些可能的混杂因素，优化了提取方案，以在ELISA之前使用专有吸附剂提取血浆。这种吸附剂表面上分离极性分子，如CGRP。为了确定ELISA前提取的有效性，加标已知浓度CGRP作为阳性对照的人血浆样品进行提取，然后进行ELISA提取。这些加标样品的回收率仅为~50%-60%。这些结果表明，外源性添加的CGRP在血浆中没有像人们预期的那样检测到。

优化了方案的其他各种步骤：在离心前向全血样品中添加丝氨酸蛋白酶抑制剂以抑制降解²¹，降低提取后真空离心的温度，并调整离心后的重悬方法。这些变化后的加标和回收率实验显示，CGRP浓度高得不切实际，回收率大于120%（表3）。令人欣慰的是，最近在Messlinger等人使用类似测定提取后也报告了高于预期的值³⁷，这表明这仍然是一个问题。Messlinger等人承认，血浆提取后的测定不能再现现实的CGRP浓度，而没有提供这种现象的原因³⁷。

我们假设ELISA微量滴定板上的残留结合能力导致非特异性结合可能是高回收率的原因。在进行ELISA之前，将板与封闭缓冲液TBS/鱼明胶缓冲液一起孵育，以降低这种结合能力。这一额外的步骤使回收率更合适（表2）。因此，上面讨论的修改和优化，包括阻塞缓冲区的使用，仍然是协议中的关键步骤。与原始制造商试剂盒中列出的检测限为 2 pg/mL 相比，这些步骤允许检测下限为 1.05 pg/mL。

关于故障排除，步骤2.10要求真空离心以干燥淋洗液。已观察到该步骤的长度根据样品所在的微量离心管的类型而变化。使用 材料表中描述的微量离心管，此步骤通常持续5小时。然而，当使用更大体积的替代微量离心管时，此步骤可以持续长达11小时。真空离心的替代方法可能是冻干或冷冻干燥样品，这需要在提取后冷冻样品。然而，在该协议的构建中未测试冻干。此外，如果发现CGRP浓度低于预期，则应确保在使用前将所有试剂（尤其是抗体）解冻至室温。试剂（如抗体和示踪剂溶液）的不稳定性可能导致结合CGRP的系统误差。如果产量仍然不足，尽管使用缓冲液复溶，但与CGRP结合的抗体可能会受到淋洗液（甲醇和乙酸溶液）相对酸度的影响。在这种情况下，pH精馏步骤将是用缓冲液复溶后的合乎逻辑的添加。

该协议的局限性包括与任何ELISA方法相关的局限性，特别是抗体不稳定性³⁸。抗体试剂在用于测定之前必须解冻至室温;然而，长时间变暖可能导致变性，从而降低结合CGRP的有效性。此外，CGRP可能会被多种非丝氨酸蛋白酶降解，导致假阴性结果增加。尽管该协议通过添加丝氨酸蛋白酶并将样品处理时间限制在60分钟以下来限制降解，但仍可能发生降解。另一个限制是缺乏测试的冻融循环。Lee等人³⁹ 证明，冻融循环可以增加或减少血清和血浆蛋白的数量，这取决于蛋白质的敏感性。CGRP对冻融循环的敏感性尚未在文献中得到充分测试，尽管Messlinger等人指出，CGRP水平在冻融循环中降低³⁷。此外，该方案的产量可能受益于使用设计有亲水表面的蛋白质LoBond管，从而改善蛋白质回收率。

我们注意到，这些验证实验似乎不是由最近量化人血浆中CGRP的研究的作者进行的¹⁶，¹⁸，³⁵，⁴⁰^，⁴¹。Messlinger等人对ELISA方法的回顾³⁷强调了这种控制的必要性，并对没有使用它们的研究提出了质疑。我们相信，我们在验证和标准化协议方面的工作将使未来的CGRP研究有更好的基础。这种协议的含义是广泛的，理论上可以扩展到研究CGRP在神经系统和非神经系统疾病过程中的生物标志物状态²，^25，26，^27，28，²⁹，³⁰，³¹，³²^，³³。

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Disclosures

作者没有进一步的披露要补充。

Acknowledgments

我们要感谢Robert N. Cole，Lauren R. DeVine和Marcos Iglesias关于该协议的有益讨论。这部分得到了美国耳科学会（奖学金资助，PSK），美国听力研究基金会（90066548 / 90072266，JPC）和国家推进转化科学中心（NCATS）的资助，这是美国国立卫生研究院（NIH）的组成部分）和NIH医学研究路线图（UL1 TR003098，NSF）。出版物的内容完全由作者负责，并不一定代表约翰霍普金斯卢旺达问题国际法庭，NCATS或NIH的官方观点。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL Safeseal microcentrifuge tube	Sorenson Bioscience, Inc.	11510
99% methanol	ThermoFisher Scientific	L13255.0F
15 mL conical centrifuge tube	Falcon	14-959-49B
2 mL round bottom sterile cryovials	CRYO.S	122263
4% acetic acid	ThermoFisher Scientific	035572.K2
6.0 mL Vacutainer EDTA collection tube	BD	367863
Allegra 64R benchtop centrifuge	Beckman Coulter, Inc.	367586
Aprotinin	VWR	76344-814
CGRP (human) ELISA kit	Bertin Bioreagent	A05481
CGRP stock	Bertin Bioreagent
EIA Buffer	Bertin Bioreagent	A07000
Ellman's Reagent	Bertin Bioreagent	A09000_49+1
Multichannel pipettes	ThermoFisher Scientific	4661180N
Oasis HLB 3 cc Vac Cartridges	Waters	WAT094226
Orbital Shaker	Bellco	7744-01010
Precision micropipettes	ThermoFisher Scientific	F144055MG
SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate reader	Molecular Devices	Part Number M2
TBS/Fish Gelatin	Bioworld, from Fischer Scientific	50-199-167
Ultrapure water ELISA Grade	Bertin Bioreagent	A07001
Vacufuge plus - Centrifuge Concentrator	Eppendorf	22820109
Wash Buffer	Bertin Bioreagent	A17000