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Summary

Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono associate a varie malattie e l’immunofluorescenza viene spesso utilizzata per la loro visualizzazione. Tuttavia, esistono vari protocolli di colorazione e, in molti casi, viene esaminato un solo tipo di tessuto. Qui, stabiliamo un protocollo generalmente applicabile per la colorazione dei NET nel topo e nel tessuto umano.

Abstract

Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) vengono rilasciate dai neutrofili in risposta a un’infezione batterica o a un danno tissutale traumatico, ma svolgono anche un ruolo nelle malattie autoimmuni e nell’infiammazione sterile. Sono strutture simili a ragnatele composte da filamenti di DNA a doppio filamento, istoni e proteine antimicrobiche. Una volta rilasciati, i NET possono intrappolare e uccidere i patogeni extracellulari nel sangue e nei tessuti. Inoltre, i NET partecipano alla regolazione omeostatica stimolando l’adesione piastrinica e la coagulazione. Tuttavia, la produzione disregolata di NET è stata anche associata a varie malattie, tra cui la sepsi o le malattie autoimmuni, il che li rende un bersaglio promettente per l’intervento terapeutico. Oltre alla microscopia elettronica, la visualizzazione dei NET mediante imaging a immunofluorescenza è attualmente uno dei pochi metodi noti per dimostrare le interazioni NET nei tessuti. Pertanto, sono stati utilizzati vari metodi di colorazione per visualizzare i NET. In letteratura, sono descritti diversi protocolli di colorazione e sono stati identificati quattro componenti chiave che mostrano un’elevata variabilità tra i protocolli: (1) i tipi di anticorpi utilizzati, (2) l’uso di agenti autoriducenti l’autofluorescenza, (3) i metodi di recupero dell’antigene e (4) la permeabilizzazione. Pertanto, i protocolli di colorazione in immunofluorescenza in vitro sono stati sistematicamente adattati e migliorati in questo lavoro per renderli applicabili a diverse specie (topo, uomo) e tessuti (pelle, intestino, polmone, fegato, cuore, disco spinale). Dopo la fissazione e l’inclusione in paraffina, sezioni spesse 3 μm sono state montate su vetrini. Questi campioni sono stati colorati con anticorpi primari per la mieloperossidasi (MPO), l’istone citrullinato H3 (H3cit) e l’elastasi neutrofila (NE) secondo un protocollo di colorazione modificato. I vetrini sono stati colorati con anticorpi secondari ed esaminati utilizzando un microscopio a fluorescenza ad ampio campo. I risultati sono stati analizzati secondo una scheda di valutazione e le differenze sono state registrate in modo semi-quantitativo.

Qui presentiamo un protocollo di colorazione NET ottimizzato adatto a diversi tessuti. Abbiamo utilizzato un nuovo anticorpo primario per colorare H3cit e ridotto la colorazione non specifica con un agente autofluorescente. Inoltre, abbiamo dimostrato che la colorazione NET richiede una temperatura elevata costante e un’attenta manipolazione dei campioni.

Introduction

Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono state visualizzate per la prima volta da Brinkmann et al. come una via di morte cellulare diversa dall’apoptosi e dalla necrosi nel 2004¹. In questo percorso, i neutrofili rilasciano la loro cromatina decondensata nello spazio extracellulare per formare grandi strutture simili a ragnatele ricoperte di proteine antimicrobiche che erano precedentemente immagazzinate nei granuli o nel citosol. Queste proteine antimicrobiche includono l’elastasi neutrofila (NE), la mieloperossidasi (MPO) e l’istone citrullinato H3 (H3cit), comunemente usati per la rilevazione in immunofluorescenza indiretta dei NET². Questo metodo non solo identifica la presenza quantitativa di queste proteine; infatti, ha il vantaggio di rilevare in modo specifico strutture simili a NET. Nei NET, le proteine menzionate co-localizzano con il DNA extracellulare, che può essere rilevato da una sovrapposizione dei segnali di fluorescenza di ciascuna proteina colorata e del DNA extracellulare. In contrasto con i segnali sovrapposti dovuti alla co-localizzazione extracellulare di DNA e proteine nei NET, i neutrofili intatti non mostrano alcuna co-localizzazione. In questo caso, i componenti NET sono solitamente immagazzinati separatamente nei granuli, nei nuclei e nel citosol³.

Sin dalla loro prima scoperta, è stato dimostrato che i NET svolgono un ruolo centrale in numerose malattie, in particolare quelle che coinvolgono l’infiammazione. I NET mostrano funzioni antimicrobiche durante l’infezione attraverso l’intrappolamento e l’uccisione di patogeni extracellulari nel sangue e nei tessuti ^4,5. Tuttavia, i NET sono stati anche collegati a malattie autoimmuni e risposte iperinfiammatorie, come il lupus eritematoso sistemico, l’artrite reumatica e l’asma allergica ^6,7,8. I NET promuovono la vaso-occlusione e l’infiammazione nell’aterosclerosi, nell’adesione piastrinica e si ipotizza che svolgano un ruolo nel cancro metastatico 9,10,11. Tuttavia, si ritiene che abbiano proprietà antinfiammatorie riducendo i livelli di citochine proinfiammatorie¹². Mentre i NET stanno guadagnando sempre più interesse in un campo di ricerca più ampio, un solido metodo di rilevamento dei NET è fondamentale per la ricerca futura.

Anche se la visualizzazione dei NET in diversi tessuti mediante imaging a immunofluorescenza è complessa e richiede personalizzazione, a parte la microscopia elettronica, è attualmente uno dei metodi più rinomati per visualizzare le interazioni tra NET e cellule ed è utilizzato prevalentemente nei tessuti inclusi in paraffina fissati in formalina (FFPE)^13,14. Tuttavia, il confronto tra l’imaging NET è difficile, poiché diversi laboratori utilizzano i propri protocolli personalizzati. Questi protocolli si differenziano per l’uso di anticorpi, il recupero dell’antigene o il metodo di permeabilizzazione e sono spesso ottimizzati per un tipo specifico di tessuto 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ^,27.

Dopo che Brinkmann et al. hanno pubblicato il primo studio metodico che utilizza la visualizzazione immunofluorescente di NET nel tessuto FFPE, abbiamo voluto ottimizzare questo protocollo per una più ampia varietà di tessuti e specie¹⁵. Inoltre, per stabilire un protocollo di immunofluorescenza ampiamente applicabile, abbiamo testato diversi protocolli modificati da studi che utilizzavano metodi di immunofluorescenza nel tessuto FFPE per rilevare i NET 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26,27}. Inoltre, abbiamo provato un nuovo anticorpo H3cit per una colorazione extracellulare più specifica²⁸. Ipotizziamo che adattando sistematicamente gli attuali protocolli di colorazione a diverse specie e tessuti, l’imaging in vitro possa essere migliorato, con conseguente migliore rappresentazione dell’interazione tra neutrofili e NET sia a livello locale che sistemico.

Protocol

Questo studio ha incluso tessuti di topo derivati da esperimenti approvati dall’Amministrazione statale di Amburgo per la ricerca sugli animali, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Amburgo, Germania (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). I tessuti utilizzati erano polmone e colon di topo da un modello settico e pelle ustionata. Abbiamo usato topi maschi e femmine di 8 settimane. Per tutti gli esperimenti è stata seguita la Direttiva Europea 2010/63/UE sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici. I campioni umani anonimizzati includevano tessuti di enterocolite neonatale, pelle ustionata, atresia biliare, spondilodiscite e miocardio. Secondo il Comitato etico per la ricerca medica di Amburgo, i campioni non avevano bisogno del consenso informato, ma lo studio è stato approvato dal comitato (WF-026/21).

1. Fissaggio del campione

1. Utilizzare il seguente protocollo derivato da Abu Abed e Brinkmann per la fissazione del campione, la disidratazione, l’inclusione della paraffina, il sezionamento e il montaggio ^3,15.
   1. Preparare una soluzione di formaldeide al 4% sciogliendo 40 g di paraformaldeide (PFA) in 800 mL di soluzione salina tamponata con Tris, pH 7,4 (TBS).
   2. Mescolare la miscela a 60 °C sotto una cappa aspirante fino a quando il PFA non si è sciolto. Portare la soluzione a temperatura ambiente (RT) e regolare il volume con TBS a 1.000 ml.
   3. Regolare il pH a 7,4. Conservare a 4 °C per 2-3 settimane o a -20 °C per un massimo di 1 anno.
2. Per la fissazione del campione, posizionare il tessuto fresco nel tampone TBS e sezionarlo in pezzi di dimensioni inferiori a 20 mm x 30 mm x 3 mm. Immergere le sezioni di tessuto in una soluzione di paraformaldeide al 4% per 12-24 ore.
   NOTA: Il protocollo originale utilizzava una soluzione di PFA al 2% e un tempo di fissazione di 8-20 ore. Con questo metodo, alcune sezioni di tessuto non sono state completamente fissate dopo 20 ore, quindi la concentrazione di PFA è stata aumentata al 4% di PFA.
3. Trasferire i campioni in cassette per il trattamento dei tessuti etichettati. Utilizzare pennarelli o matite resistenti ai solventi per l’etichettatura.
4. Iniziare la disidratazione del campione immergendo le cassette in etanolo al 70% per 1 ora. Quindi, immergere in etanolo all’80%, etanolo al 90%, etanolo al 96% e due volte all’etanolo al 100%, con ogni passaggio della durata di 1 ora.
5. Immergere due volte in xilene al 100% (dimetilbenzene) e poi due volte in paraffina a 60 °C per 1 ora ogni volta.
6. Utilizzare stampi da incasso per il montaggio e lasciare che la paraffina si solidifichi prima di rimuovere lo stampo.
7. Utilizzare un microtomo per tagliare sezioni di tessuto spesse 3 μm.
8. Utilizzare una pinzetta per stendere le sezioni tagliate a bagnomaria a 37 °C e lasciarle galleggiare sulla superficie per allungare i tagli di tessuto.
9. Posizionare le sezioni su vetrini adesivi (Tabella dei materiali) e lasciarle asciugare per una notte in una camera termica a 40 °C.

2. Reidratazione del campione

1. Per la deparaffinazione, impilare i vetrini in un rack per vetrini e immergerli due volte per 5 minuti ciascuno nel mezzo sostitutivo dello xilene limonene (Tabella dei materiali) e una volta per 5 minuti in una miscela 1:1 limonene/etanolo.
   ATTENZIONE: Il limonene è infiammabile a 50 °C e può causare reazioni allergiche. Utilizzare sotto una cappa aspirante con protezione per gli occhi e guanti. Tenere lontano dal fuoco aperto.
2. Reidratare i campioni in una serie di etanolo discendente immergendo il rack dei vetrini due volte in etanolo al 100% e una volta in etanolo al 96%, etanolo al 90%, etanolo all’80% ed etanolo al 70% per 5 minuti ciascuno.
3. Immergere la griglia per vetrini per 5 minuti in acqua deionizzata (acqua deionizzata) per rimuovere eventuali residui di etanolo.

3. Blocco dell’autofluorescenza e recupero dell’antigene

1. Preparare la soluzione di recupero del bersaglio del citrato (TRS) a pH 6 (Tabella dei materiali) secondo la scheda tecnica. Questo TRS è concentrato 10 volte. Pertanto, diluire 1:10 con acqua deionizzata. Preriscaldare in un barattolo di plastica a 96 °C.
   NOTA: TRS rompe i ponti di metilene formati durante la fissazione del campione per esporre gli epitopi dell’antigene. Ciò consente agli anticorpi primari di legarsi al loro antigene bersaglio. Conservare TRS concentrato a 2-8 °C per 8 mesi. Prepara sempre TRS fresco.
2. Estrarre i vetrini dalla rastrelliera e riporli in una camera umida. Pipettare una o due gocce di agente autofluorescente (tabella dei materiali) su ciascun campione. Incubare per 5 min.
   NOTA: L’agente riducente dell’autofluorescenza blocca l’autofluorescenza intrinseca del tessuto causata da fluorofori e fissativi endogeni. Conservare l’agente autofluorescente a RT per un massimo di 1 anno.
   NOTA: Lavorare solo con piccole sezioni di tessuti per evitare che i campioni si secchino o superino il tempo di incubazione.
3. Impilare nuovamente i vetrini nella griglia per vetrini e risciacquare per 1 minuto in etanolo al 60% con movimenti verso l’alto e verso il basso fino a quando tutto il reagente per la riduzione dell’autofluorescenza non utilizzato non è stato lavato via.
4. Immergere la griglia per vetrini per 5 minuti in acqua deionizzata.
5. Per il prelievo dell’antigene, trasferire i vetrini in un barattolo di colorazione con il TRS preriscaldato. Incubare per 10 minuti a 96 °C a bagnomaria.
   NOTA: Il bagnomaria a 96 °C può essere sostituito con un forno a microonde o una vaporiera se il TRS è preriscaldato a 96 °C e sono garantiti 10 minuti di incubazione a 96 °C.
6. Estrarre il barattolo di colorazione e lasciarlo raffreddare lentamente a RT per circa 60-90 minuti.
   NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui per un massimo di 4 ore, lasciando le diapositive nel TRS.
7. Rimuovere il TRS, ma conservare i vetrini nel barattolo. Risciacquare due volte con soluzione salina tamponata Tris con Tween allo 0,05% (TBST, pH 7,4) per 3 minuti ciascuno per lavare via eventuali residui di TRS rimanenti.
8. Per la permeabilizzazione, preparare Triton allo 0,2% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4, e riempirlo nel barattolo di colorazione per permeabilizzare i campioni per 10 minuti.
   NOTA: La permeabilizzazione migliora il legame degli anticorpi primari con le proteine bersaglio intracellulari nei campioni fissati.
9. Sciacquare nuovamente i vetrini due volte in TBST per 3 minuti ogni volta.
10. Preparare la camera umida e stendere i vetrini. Pulire l’acqua in eccesso dai vetrini con fazzoletti di carta. Circondare ogni campione con una penna barriera idrofobica per evitare che la soluzione anticorpale fuoriesca.
    NOTA: Non lasciare che i campioni si asciughino. È meglio lavorare con piccole sezioni.

4. Blocco del legame anticorpale non specifico

1. Prelevare una soluzione bloccante pronta all’uso con siero d’asina (Tabella dei materiali) e pipettare una goccia su ogni campione. Incubare per 30 minuti a RT.
   NOTA: Questa fase di blocco riduce al minimo il legame dell’anticorpo secondario a siti di legame non specifici sul campione. Dopo aver bloccato questi epitopi aspecifici e aver applicato l’anticorpo primario, l’anticorpo secondario si legherà all’anticorpo primario e non interagirà con la superficie del tessuto. Questo reagente bloccante pronto all’uso viene conservato a 2-8 °C per 6 mesi.
2. Rimuovere la soluzione bloccante in eccesso dai vetrini picchiettando il bordo dei vetrini contro una superficie dura. Non risciacquarli.

5. Anticorpo primario

1. Diluire gli anticorpi primari in tampone di diluizione degli anticorpi (Tabella dei materiali). Utilizzare circa 100 μL della soluzione finale per ogni campione. Per l’anticorpo NE e H3cit (R8) e l’isocontrollo, diluire a una concentrazione di 5 μg/mL. Per l’MPO e l’isocontrollo corrispondente, utilizzare 10 μg/mL. Preparare una provetta per ogni anticorpo primario e una per ogni anticorpo isocontrollato.
   NOTA: H3cit (R8)/MPO o NE/MPO e i loro isocontrolli possono essere combinati per la colorazione dei NET. Per la combinazione di H3cit (R8)/MPO, diluire a una concentrazione finale di 5 μg/mL per H3cit (R8) e 10 μg/mL per MPO a un volume finale di 100 μL per campione. Per NE/MPO, diluire a una concentrazione finale di 5 μg/mL per NE e 10 μg/mL per MPO fino a un volume finale di 100 μL per campione. Per l’isocontrollo, utilizzare la stessa concentrazione di ciascun anticorpo corrispondente. Utilizzare sempre un nuovo puntale per pipetta per ogni anticorpo utilizzato. Gli anticorpi primari possono essere conservati a 4 °C per 1-2 settimane e a -20 °C o -80 °C per un massimo di 1 anno.
2. Con due campioni su un vetrino, utilizzarne uno per gli anticorpi isocontrol e uno per la diluizione degli anticorpi MPO/H3cit o MPO/NE. Utilizzare circa 100 μL per ogni campione e distribuire uniformemente la soluzione anticorpale.
   NOTA: Non lasciare che i campioni si asciughino. Fare attenzione a non confondere l’isocontrollo con gli anticorpi primari.
3. Conservare in camera umida per una notte a 4 °C.
4. Il giorno successivo, prelevare la soluzione di anticorpi primari in eccesso dai vetrini e impilare i vetrini in una cuvetta. Risciacquare tre volte per 5 minuti ogni volta con TBST per lavare via la soluzione anticorpale primaria rimanente.

6. Anticorpo secondario

1. Preparare la soluzione anticorpale secondaria. Utilizzare due diversi anticorpi secondari fluorescenti: asino-anti-capra per MPO e asino-anti-coniglio per la colorazione H3cit. Diluire ciascuno di essi a una concentrazione di 7,5 μg/mL con tampone di diluizione anticorpale (Tabella dei materiali).
   NOTA: Per la doppia colorazione, utilizzare due anticorpi fluorescenti con aree di eccitazione diverse e sovrapposizione spettrale minima. Combinare entrambi gli anticorpi secondari e diluire a una concentrazione finale di 7,5 μg/mL per ciascun anticorpo per un volume finale di 100 μL per campione. Proteggere gli anticorpi dalla luce. Gli anticorpi secondari possono essere conservati a 2-8 °C per 6-8 settimane o a -80 °C per un massimo di 1 anno.
2. Tenere i vetrini nella camera umida e aggiungere 100 μL della soluzione anticorpale secondaria su ogni campione. Lasciarli incubare per 30 minuti a RT e al riparo dalla luce.
3. Picchiettare la soluzione di anticorpi secondari in eccesso e impilare i vetrini nel rack per vetrini. Immergere tre volte per 5 minuti ciascuna in un barattolo colorante riempito di PBS per lavare via eventuali anticorpi non legati rimanenti.
4. Preparare la soluzione di DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo) (Tabella dei materiali) e diluire a una concentrazione di 1 μg/mL con acqua deionizzata. Immergere il rack per vetrini in un barattolo di colorazione con la soluzione DAPI e incubare per 5 minuti a RT al buio.
   NOTA: DAPI è usato come colorante fluorescente per il DNA a doppio filamento. La soluzione DAPI preparata può essere utilizzata più volte. Conservare la soluzione DAPI preparata presso RT. Il concentrato DAPI può essere conservato a -20 °C per un massimo di 1 anno.
5. Immergere il rack per vetrini per 5 minuti in un barattolo colorante con PBS per lavare via la soluzione DAPI in eccesso.

7. Montaggio e conservazione dei campioni, analisi microscopica

1. Montare i campioni con vetrini coprioggetti e mezzo di montaggio (Tabella dei materiali).
   NOTA: Utilizzare solo piccole quantità di mezzo di montaggio e rimuovere il mezzo in eccesso con fazzoletti bagnati. Indossare guanti ed evitare di rimuovere accidentalmente qualsiasi mezzo dai vetrini coprioggetti o dai vetrini. Evitare la formazione di bolle e utilizzare tamponi di cotone per premere delicatamente sui vetrini coprioggetti per rimuovere eventuali bolle dai vetrini.
2. Per l’imaging, utilizzare un microscopio a campo largo o un microscopio confocale.
   NOTA: Scattare prima un’immagine dell’isocontrollo. Ridurre il tempo di esposizione per i filtri a fluorescenza (ad eccezione del filtro blu per DAPI) fino a quando non viene rilevato quasi nessun segnale. Quindi, utilizzare questa impostazione per esaminare i campioni corrispondenti. Cerca le aree in cui è possibile rilevare un segnale fluorescente in ogni singolo campione utilizzando il canale di fluorescenza. Dopo aver scattato un’immagine dell’area, il programma genera un’immagine composta di tutti i canali e mostra i diversi segnali di fluorescenza come una sovrapposizione di diversi colori. L’immagine può quindi essere ulteriormente analizzata per la co-localizzazione con un software di imaging come ImageJ.
3. Conservare i vetrini a 4 °C per un massimo di 6 mesi.

Representative Results

Discussion

In questo lavoro, abbiamo cercato di adattare e ottimizzare i protocolli esistenti per l’imaging dei NET a più tipi di tessuto, a partire dal processo di colorazione vero e proprio. Il primo passo fondamentale per questo metodo è la selezione degli anticorpi più adatti. Per NE, abbiamo provato un anticorpo NE da un ospite di topo su tessuto umano, che non ha mostrato alcuna colorazione affidabile rispetto a NE da un ospite di coniglio. Inoltre, Thålin et al. hanno proposto H3cit (R8) come anticorpo più specifico per la colorazione extracellulare. Abbiamo confrontato questo anticorpo con il triH3cit ampiamente utilizzato (R2, R8, R17). Il nostro studio ha dimostrato che l’anticorpo H3cit (R8) si colora solo per un segnale extracellulare alle concentrazioni utilizzate, consentendo un più facile riconoscimento dei NET sui vetrini. Questa scoperta supporta le affermazioni di Thålin et al. secondo cui il clone di H3cit (R8) può fornire un buon segnale NET con una ridotta cross-reattività off-target agli istoni non citrullinati²⁸. Abbiamo anche confrontato gli anticorpi MPO per il tessuto umano e di topo per la colorazione MPO. I nostri risultati mostrano che l’anticorpo MPO di topo/uomo ha mostrato una colorazione più affidabile e può essere utilizzato contemporaneamente su campioni umani e di topo, semplificandone l’uso in laboratorio. Di conseguenza, raccomandiamo di utilizzare questa combinazione di anticorpi, H3cit (R8) e MPO di topo/uomo, per ricerche future e di implementarla nel nostro protocollo.

Tuttavia, c’è una limitazione per i tentativi multipli di colorazione con questa selezione di anticorpi. Questo protocollo è stato modificato per utilizzare anticorpi primari provenienti da diversi ospiti. In caso contrario, un anticorpo secondario potrebbe legarsi a entrambi gli anticorpi primari. L’anticorpo H3cit proviene dallo stesso ospite dell’anticorpo NE, quindi non abbiamo potuto colorare NE e H3cit insieme. Anche se in questo studio non è stata eseguita alcuna tripla colorazione (NE, H3cit, MPO), questo protocollo potrebbe servire come base per esperimenti di tripla colorazione in futuro. Una possibile opzione per la tripla colorazione o la doppia colorazione di NE e H3cit potrebbe essere la sostituzione di uno di questi anticorpi con un anticorpo affidabile di un ospite diverso. In questo caso, un possibile partner di combinazione potrebbe essere l’anticorpo NE (Santa Cruz; sc-55549) di pecora utilizzato da Knackstedt et ^al.24. Un’altra opzione di Duler et al. è stata pubblicata nel 2021, dove hanno utilizzato un metodo di doppia colorazione consecutiva e hanno combinato NE e H3cit da un ospite di coniglio²⁶. Un’ulteriore applicazione promettente di un metodo di colorazione multipla è la discriminazione tra formazione di NET intra ed extravascolare. Invece della tripla colorazione per i marcatori NET, la doppia colorazione NET potrebbe essere combinata con un’ulteriore colorazione vascolare. Inoltre, un numero crescente di studi ha esaminato la distribuzione intra ed extravascolare dei NET per acquisire maggiori conoscenze sui meccanismi patogenetici di malattie specifiche, come il morbo di Alzheimer. Smyth et ^al.31 hanno descritto un protocollo promettente e approfondito simile al nostro per differenziare tra le due possibili localizzazioni. Hanno modificato il loro protocollo di colorazione NET esistente aggiungendo una lectina biotinilata per marcare le cellule endoteliali e hanno utilizzato una streptavidina coniugata con fluoroforo per la colorazione a immunofluorescenza della lectina. Esaminando la co-localizzazione dei marcatori di lectina e NET nella stessa immagine, sono stati in grado di identificare i NET intravascolari³¹. In questo contesto, sono necessari ulteriori studi per ampliare l’applicazione del nostro protocollo.

Dopo aver trovato la combinazione di anticorpi più adatta, il passo successivo è l’introduzione di un agente autofluorescente. Fattori esogeni come la fissazione del campione mediante fissativi di formaldeide e fattori endogeni come gli eritrociti possono provocare un’elevata autofluorescenza, che rende difficile determinare la co-localizzazione³². Questo problema si verifica principalmente negli spettri di fluorescenza blu (area di eccitazione: 430-480 nm) e verde (area di eccitazione: 500-550 nm) e può portare a risultati di colorazione inconcludenti quando viene utilizzato un anticorpo di fluorescenza con la stessa area di eccitazione³. La letteratura riporta che Sudan Black è un agente efficace per ridurre l’autofluorescenza intrinseca^{dei tessuti 33}. Sudan Black consente di ottenere risultati di colorazione più chiari utilizzando i canali di fluorescenza blu o verde. Quest’area di eccitazione sarà necessaria per i futuri tentativi di colorazione multipla perché i canali blu e verde sono necessari quando si utilizza un quarto colorante fluorescente. Il nostro studio dimostra che il tempo di incubazione ottimale dipende dal tipo di tessuto e di anticorpo utilizzati nel processo di colorazione. Tuttavia, in questo lavoro, 5 minuti di agente autofluorescente hanno generalmente dato buoni risultati su tutti i tipi di tessuto e hanno avuto il vantaggio di colorare il campione di nero, rendendolo così più facile da vedere sui vetrini. In questo modo si evitava la mancanza di parti dei tessuti nel processo di colorazione, soprattutto con campioni di piccole dimensioni.

Un altro fattore essenziale per il successo di questo protocollo è una temperatura elevata costante per la fase di recupero dell’antigene. La nostra ricerca ha dimostrato che 10 dei 15 studi precedenti hanno utilizzato temperature superiori a 96 °C per il recupero dell’antigene 13,15,16,17,19,21,22,25,26,27. Ciò è stato coerente con i nostri risultati, in cui l’incubazione dei campioni in un bagno d’acqua a 96 °C o in un forno a microonde ha dato buoni risultati senza differenze significative. Tuttavia, si consiglia di utilizzare un bagnomaria per una distribuzione uniforme del calore. Quando si utilizza il microonde, abbiamo riscontrato un gradiente di temperatura nel tampone fino a 5 °C tra la parte superiore e inferiore del barattolo di colorazione. Inoltre, il bagnomaria è più facile da usare e ha un minor rischio di ebollizione del tampone. Per la permeabilizzazione, abbiamo scoperto che il Triton X-100 ha avuto un effetto minore sulla colorazione. Quindi, saltare questo passaggio nel protocollo è possibile senza influire negativamente sul risultato. In generale, i campioni umani hanno dato risultati migliori rispetto ai campioni di topo. Una ragione di ciò potrebbe essere che gli esseri umani hanno una percentuale più alta di neutrofili rispetto ai topi^34,35. Inoltre, i campioni polmonari di topo non hanno mostrato alcuna infiammazione macroscopica visibile e un minor numero di neutrofili, mentre i campioni di intestino di topo erano macroscopicamente infiammati e hanno mostrato buoni risultati di colorazione. Pertanto, i punteggi più bassi nel nostro studio potrebbero essere il risultato della bassa infiammazione e non a causa del protocollo che non funziona in modo ottimale.

Per la risoluzione dei problemi, piccoli errori nel protocollo o la mancata manipolazione dei campioni con attenzione possono avere effetti enormi sui risultati della colorazione. Uno dei principali problemi che abbiamo identificato è stata la disidratazione del campione. In questo caso, abbiamo scoperto che la gestione di più di 10-15 vetrini contemporaneamente era fondamentale perché ogni passaggio richiede molto tempo e può comportare la disidratazione dei campioni. I campioni disidratati non sono più utilizzabili a causa dell’elevata colorazione di fondo e dell’assenza di un segnale di fluorescenza specifico rilevabile (vedere la Figura 4A). Inoltre, i campioni devono essere completamente deparaffinati prima di iniziare il protocollo di colorazione. I residui di paraffina hanno provocato un forte segnale di fondo e le linee di taglio potevano essere viste nella paraffina colorata (vedi Figura 4B). Inoltre, dopo più di 20 cicli di gelo-disgelo, non è stato possibile rilevare alcun segnale per l’anticorpo secondario contro MPO (vedere Figura 4C). Un altro passaggio importante con un grande impatto sulla qualità dell’immagine è la gestione della fase finale di montaggio. In questo lavoro, le bolle d’aria sotto il vetrino coprioggetto hanno provocato la dispersione del segnale fluorescente e, quindi, un’immagine sfocata (vedi Figura 4D).

Figura 4: Suggerimenti per la risoluzione dei problemi . (A) Questo pannello mostra le conseguenze di un campione essiccato. La colorazione di fondo rosso solido ostacola qualsiasi valutazione del campione. (B) Qui, la freccia rossa mostra residui di paraffina, caratterizzati dall’aspetto ondulato, dopo un’insufficiente deparaffinazione. Questi residui si traducono in un segnale di fondo elevato e immagini di qualità inferiore. (C) Una conservazione inadeguata degli anticorpi o più di 20 cicli di congelamento-scongelamento provocano l’aggregazione dell’anticorpo secondario (frecce verdi) e nessun legame con MPO. (D) Un montaggio non eseguito con cura può causare bolle d’aria e, quindi, dispersione della luce fluorescente (freccia blu). Ciò può influire in modo significativo sulla qualità dell’immagine, soprattutto quando la dispersione sfoca il bersaglio. Per il controllo dell’isotipo, vedere la figura supplementare Isocontrol 4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Anche se i NET stanno guadagnando sempre più popolarità nella ricerca scientifica, non ci sono ancora abbastanza studi incentrati sui metodi per il rilevamento dei NET 3,13,17,26. Per quanto ne sappiamo, presentiamo il primo studio che confronta i protocolli di diversi studi per l’imaging in immunofluorescenza di NET nel tessuto FFPE. I protocolli personalizzati pubblicati in precedenza differivano nei loro metodi di recupero degli anticorpi o dell’antigene ed erano spesso progettati per un solo tipo di tessuto, rendendo più difficile il confronto dei risultati dell’imaging NET. Pertanto, in questo studio, abbiamo identificato i passaggi critici e stabilito un protocollo adatto a diversi tessuti di topo e umani. Abbiamo ottenuto questo risultato utilizzando un nuovo anticorpo primario per la colorazione H3cit e riducendo la colorazione di fondo con un agente autofluorescente. Inoltre, abbiamo dimostrato che una temperatura elevata costante è fondamentale e che un’attenta manipolazione dei campioni è fondamentale per il successo della colorazione NET. Pertanto, questo studio fornisce i passaggi essenziali per lo sviluppo di un protocollo generalmente applicabile per la colorazione dei NET.

Materials

&nbsp;&nbsp;	&nbsp;&nbsp;	&nbsp;&nbsp;	<strong>Dilution</strong>
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100&micro;g	abcam	Ab 68672&nbsp;	1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody&nbsp; 100&micro;g	abcam	Ab 5103	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 &micro;g	abcam	Ab 25989	1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 &micro;g	abcam	Ab 90810	1:50
Axiovision Microscopy Software&nbsp;	Zeiss	4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml	GeneTex	&nbsp;GTX30972
Coverslips	Marienfeld	0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10)	Dako	S2369
DAPI 25 mg	Roth	6335.1	1:25000
DCS antibody dilution 500 mL	DCS diagnostics	DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3	JacksonImmunoResearch	705-165-147	1:200
Donkey anti rabbit AF647	JacksonImmunoResearch	711-605-152	1:200
Donkey anti rabbit Cy3	JacksonImmunoResearch	711-165-152	1:200
Fluoromount-G Mounting Medium	Invitrogen	00-4958-02
Glass slide rack	Roth	H552.1
Human/Mouse MPO Antibody	R&amp;D Systems	AF 3667&nbsp;	1:20
Hydrophobic Pen	KISKER	MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg	abcam	Ab 37415	1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml	Maxvision	MB-L
Microscopy camera	Zeiss	AxioCamHR3
Microwave	Bosch	HMT84M421
Mouse IgG1 negative control	Dako	X0931 Aglient	1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control	R&amp;D Systems	AB-108-C&nbsp;	1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)	Sigma-Aldrich	P-3813
PMP staining jar	Roth	2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100&micro;g	abcam	Ab 219406	1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] – Isotype Control 200&micro;g	abcam	Ab 172730	1:300
ROTI Histol	Roth	&nbsp;6640
SuperFrost Plus slides	R. Langenbrinck	03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Water bath	Memmert	830476
Water bath rice cooker	reishunger	RCP-30
Wet chamber	Weckert Labortechnik	600016
Zeiss Widefield microscope	Zeiss	Axiovert 200M